カイコ遺伝資源の凍結保存法:

カイコの生殖巣凍結保存技術の現状と応用の可能性

竹村 洋子 ・持 田 裕司

(財)大 日本蚕糸会 蚕業技術研究所

蚕糸 ・昆虫バイオテック

第77巻 第1号(平 成20年4月)別 刷

Reprinted from

SANSHI-KONCHU BIOTEC

Volume 77, Number 1(April 2008)

蚕糸 ・昆 虫バ イオ テ ック77(1)、

SANSHI-KONCHUBIOTEC

9-16(2008;

カイコ遺伝資源の凍結保存法:

カイコの生殖巣凍結保存技術の現状と

応用の可能性

竹 村 洋 子 ・持 田 裕 司*

(財)大日本蚕糸会 蚕業技術研究所

は じめに

地球上には,微 生物,植 物,動 物など多種多様な生物

が存在しています。これらは,私 たちにとって有用な遺

伝資源として,地 球的規模で重要視されています。我が

国においても有用生物の遺伝資源の収集 ・保存 ・利用が

文部科学省のナシ ョナルバイオ リソースプロジェク ト

(NBRP)を はじめ,多 方面での収集 ・保存 ・利用が検

討されています。NBRPで は2007年 度 よ り第2期 が始

まり,動 物でマウスやラットなど9件,植 物でシロイヌ

ナズナやイネなど8件,微 生物で大腸菌な ど3件 な ど合

計22件 が採択されています。その中にカイコも第1期

に続いて採択されています。

カイコについては,古 くから有用な品種が数多く育成

され,現 在保存:されている品種系統の総数は1,000を 超

えています。農家で飼育される交雑品種の元 となる育種

素材や地理的品種は(独)農 業生物資源研究所で約460

品種,突 然変異系統を利用 した遺伝分析のための標識系

統などは九州大学で約600品 種が保存されています(白

田ら,2007,伴 野 ら,2005)。 また最近では,2000年 に

田村氏 によって トランスジ ェニ ック技術が開発 され

(Tamuraθ ∫鳳,2000),そ の進展により多くの系統が作出

され,新 たに保存を必要 とするカイコ系統数が増えてい

ます。 これらは,今 後も飛躍的に増大することは確実で

しょう。

一般に,カ イコ品種系統の保存 ・維持は,通 常年1回

*〒300-0324茨 城 県 稲 敷 郡 阿 見 町 飯 倉1053

連 絡 先:take@silk.orjp

mochida@silk.or.jp

の飼育によって行われ ます。 しかしながら,個 々の品種

の特徴を維持 していくためには,非 常に専門化 した技術

や知識が必要 とされてお り,継 代中における形質変化の

危険性の回避,系 統途絶の防止など,単 に飼育するだけ

では済まされない面があります。また,飼 育による系統

維持は,必 要な労力や飼育施設 ・機材等のための莫大な

経費を必要 とします。そこで,液 体窒素による凍結保存

を用いた系統維持がそれらの問題点を有効に克服できる

という大きな利点を持った技術 として期待されているわ

けです。

液体窒素による凍結保存は,動 植物の培養細胞・組織・

胚などで行われてきた長年の凍結研究の成果から安全 ・

確実である見通 しがつけられてきました。ウシの精子で

は,20年 間液体窒素に保存 しても受精率にはほ とん ど

変化がない という報告 もあ り(白 山ら,1986),「 液体窒

素での保存は半永久的である」 とも言われています。ま

た,不 時の事故による喪失や変異による性状変化な どの

危険性へのセイフティーネットとしての役 目も果たして

くれます。凍結保存の技術を上手に利用することで,資

源の有効活用 と共 に飼育にかかる経費と時間を節約する

ことができます。

凍結保存による遺伝資源の保存方法 としては,精 子,

卵,胚,細 胞など様々な発育相における方法が考えられ

ますが,カ イコの場合,雄 と雌が交尾した後に産卵する

受精卵の凍結保存が理想的です。 しかしながら,受 精卵

の凍結保存は,こ れまで多 くの研究者が試みましたが成

功にいたっていません。本総説では現在まで確立してい

る凍結精液と凍結卵巣について,保 存技術の現状と将来

の期待を,私 たちが行ってきた研究を中心に紹介したい

と思います。

凍結精液の利用

SANSHI-KONCHU

1)人 工授精

人工授精(artificial insemination)と は,精 液を人為的

に雌の体内に挿入することによって,生 殖の手助けを行

うことです。人工授精 と似た言葉に,人 工受精と言 うも

のがあ ります。ここでの受精は,精 子 と卵子が結合する

ことを意味 し,人 工授精や体外受精を示す総称として使

BIOTEC Vol.77 No.1

われています。人工受精は 「じんこうじゅせい」の読み

が 「人工授精」 と誤認を招きやすいため,体 外受精(in

vitro fertilization)や顕微受精(intracytoplasmic spe㎜ in

jection)と して人工授精 とは区別 しています(図1)。

私たちがカイコで行 っているのは人工授精で,雌 蛾の

交尾嚢に精液を注入 して,受 精卵を得ることを目的とし

ます。人工授精法は,精 液の凍結 と同様にウシやウマな

どほ乳類ではすでに実用化されてお り,家 畜人工授精士

とい う国家資格まであります。昆虫では,ミ ツバチだけ

が実用化されてお り,系 統維持 ・品種改良などに利用す

るための人工授精装置も市販され,精 液の凍結などの研

究も盛んに行われています(図2上,吉 田,1994)。

カイコの人工授精は,約70年 前に北海道大学の大村

先生が雄蛾の貯精嚢から得た無凍結の精液を雌蛾に注入

図2,ミ ツバ チ(上)と カイ コ(下)の 人工 授 精装 置

上:ミ ツバチ の人 工授 精装 置(ド イ ツ製 の市 販品)

下:カ イ コの 人工 授精 装置

することによ り受精卵の産下に成功 しています(Omura,

1936)。 しか しなが ら,こ の方法は自転車の空気ポンプ

を使い,二 人一組で行 うとい う作業で技術的に難 しい面

もあ り,そ の後ほとんど研究が行われませんでした。私

た ち は1996年 にDNA微 量注 射 装 着(神 田 ・田村,

199Dを 改良し,窒 素ガスボンベ,圧 力調整器,足 踏み

スイッチ,三 方電磁弁,キ ャピラリー(細 いガラス製の

注射針)か らなる新たなカイコ用人工授精装置を開発 し

ま した(図2下,竹 村 ら,1996)。 本装置において窒素

ガス圧は圧力調整器を通 じて自在 に調節できるので,

キ ャピラリーに予め充填 しておいた約10μ1の 精液を微

少な圧力で適正かつ簡単に雌蛾へ注入することが可能に

な りました(図3)。

2)採 取精液の取り扱い

カイコ雄蛾の生殖器官は主に精巣,貯 精嚢,前 立腺

ペニスか ら成 り立 ってお り(図4),貯 精嚢 には有核精

子束 と無核精子の2種 類の精子が蓄積されています。貯

精嚢の2種 の精子は,交 尾時に前立腺を通って雌蛾の交

尾嚢に移行 します。通常の交尾においては,前 立腺液に

より無核精子が運動性を獲得 し,有 核精子束が解離し始

めます。その後,無 核精子 と束から解離 した有核精子は

お互いに絡み合って受精嚢に移動し,産 卵管を通過する

際の卵に有核精子が入 り,受精卵 とな り産下されます(図

5)。 人工授精の場合,貯 精嚢から採取 した精液はそのま

までは上記のようなプロセスが進 まないため受精せず,

精子を活性化させることが必要です。私たちは,精 液を

前立腺液あるいは トリプシン溶液を混合することで精子

が活性化され受精卵を得ることができることを明 らかに

しました(Takemura et al.,1999)。 また,前 述 した人工

授精装置を用いて1人 で簡単に人工授精操作を行 うこと

ができ,そ の成功率および再現性 も極めて高く,自 然交

尾 とほぼ同等 の産卵成績 が得 られるよ うにな りま した

(表1)。

3)精 液の凍結方法

カイコ精液の凍結は比較的容易です。採取 した精液 と

凍結保護剤(セ ルバンカー2, 十 慈フィール ド株式会社)

を等量混合 し,0.25mlの 凍結用ス トローに封入 します。

このス トローをそのまま-80℃ のディープフリーザー

に10分 間冷却 し,液 体窒 素 中に投 入す る だけで す

(Takemura et al.,2000)。 なお,人 工授精にあたっては凍

結 した精液も活性化処理が必要です。ス トロー のまま

図3,雌 蛾の生殖器官における人工授精の様子左:キ ャピラリーで精液を貯精嚢に注入右:精 液が注入され膨らんだ交尾嚢

図5嵯 峨交尾嚢内における精子上 交尾嚢と受精嚢に精液が貯まっている様子

下 交尾嚢内における精子の活性化(有 核精子束の解離)A活 性化する前の有核精子束と無核精子B解 離し始める有核精子束C絡 み合っている解離した有核精子と無核精子

表1.人 工授精と産卵の受精率およびふ化率

図4,雄 蛾の主な生殖器官人工授精に用いる精液は貯精嚢から採取したのち,前 立腺分泌液を混合して行う

SANSHI-KONCHU BIOTECVo1.77No.

37。Cの 温湯中で融解 した後,ト リプシン溶液を加え活

性化 します。交雑品種の場合,凍 結融解 した精液でも自

然交尾 とほぼ同等の受精卵率,ふ 化率が得 られました(表

1)。 また,こ の受精卵か らふ化 したカイコの飼育成績は

通常 と変わ りありませんでした。

4)精 液の人工授精と凍結保存の今後

精液の凍結保存に関 しては,で きるだけ数多くのカイ

コ品種をスクリーニングして,品 種による凍結耐性の有

無を調べる とい う,い わゆる力技的な部分が残されてい

ます。 この仕事は各品種の精子凍結耐性が明 らかになる

だけでなく,そ れに伴 う,イ列えば凍結耐性のメカニズム

解明のきっかけな ど面白い現象の発見が期待されます。

また,現 在,私 たちは凍結精子の受精率の向上のために

3倍 体精子の利用を検討 しています。これは形態機能学

的な基礎研究 と一体 として進めているものです(Take-

mura et al., 2006)。 カイコの人工授精法は,単 にカイコ

の系統保存に有効な方法 として受精卵を産下させるため

の技術であるばか りではなく,様 々な生殖生理現象など

を明らかにできる重要な研究手段にな りつつあ ります。

私たちが開発 した人工授精法は,カ イコに限らず他の昆

虫にも応用が可能で,天 蚕でも人工授精で受精卵を得 ら

れることがわかりました。さらに将来,カ イ コの精子に

外来遺伝子を導入できるようになれば,遺 伝子導入精子

を人工授精する方式で,新 しい遺伝形質を付与するため

のベクター としての精子利用も期待されます。現在は

もっと多 くの人に人工授精法を利用 してもらえるように

装置の簡易化や精液採取の機械化など,よ り簡易な人工

授精法を模索 しているところです。

凍結卵巣の利用

移植法の確立を目指 しました。卵巣は,幼 虫のサイズが

齢によって異なるのと同様に3,4,5齢 で著 しく大きさ

が異な ります(図6)。 当然,移 植される卵巣(ド ナー)

と移植を受ける宿主の発育(齢 期)に よ り移植卵巣と宿

主輸卵管 との結合の程度が異なることが考 えられます。

そ こで,3齢 ～5齢 期幼虫を用い,そ れ らの腹部星状紋

部分をメスで切開 し,卵 巣をピンセットで摘出し,他 の

幼虫から取 り出した卵巣を移植 しました。その後,移 植

された幼虫を飼育し,羽 化させ雄蛾 と交配 し産卵で得ら

れる受精卵を調査 しました。その結果,ド ナーと宿主の

齢期によって結合率が変わ り,4齢 幼虫の卵巣を3齢 に

移植する異齢期卵巣移植でも卵巣が結合 し,受 精卵が得

られることが判明 しました(表2,図7)。

2)卵 巣凍結

卵巣を凍結する際の保護剤には,ジ メチルスルポキシ

ド(DMSO)を 用います。DMSOを0.5,1.0お よび15M

の濃度になるようにグレース昆虫培地で調製 しておき,

卵巣を0.5,1.C,1.5Mの 順でそれぞれ10分 間浸漬 した

後,2mlの エッペ ン ドルフチ ューブにDMSOご と移 し

ます。 このチューブを液体窒素の蒸気中に30分 間置い

た後(こ の場合約1～2。C/分 の速さで温度が下が りま

す),チ ューブを液体窒素中に浸漬 します。融解は37。C

の温湯中でチューブごと行います。融解後は,凍 結の場

合 と逆の順序で1.OMか らDMSO濃 度を10分 間隔で希

釈 していき,最 終的にはグレース液に戻 して移植を行い

ます。凍結融解した卵巣を移植 した結果,産 卵蛾率 ・平

均産卵数 とも凍結による障害が著 しいことが明らかにな

りました(表2)。 しかしながら,4齢 の卵巣を3齢 に移

植する異齢期卵巣移植で産卵蛾率20%,平 均産卵数84

粒 と最も良好な成績を得 られています。

1)異 齢期卵巣移植

上で紹介 したように精子の凍結,つ まり雄性の生殖質

についての凍結は,な んとか道筋がついてきました。 し

か し,現 時点で受精卵の凍結保存技術が確立されていな

いので,雌 性の生殖質の凍結保存が残されています。雌

の卵巣の凍結保存を考えた場合,一 旦体外に取 り出した

卵巣を再度別な個体に移植して成熟卵として発達させる

必要があ ります。卵巣移植は,卵 休眠を誘導する物質の

解明を目的に古 くから行われました(梅 谷,1925)。 また,

1989年 には凍結 した卵巣を移植することによってもそ

の卵巣が宿主輸卵管 と結合 し,羽 化後受精卵を産下させ

ることに成功 していますが,そ の率は非常に低 く実用化

の段階にまで至っていません(Shinbo,1989)。 そ こで,

凍結卵巣の保存を検討するまえに,ま ず効率の良い卵巣

3)卵 巣移植と人工授精の組み合わせ

以上 述べてきたように,カ イコでは,精 液の人工授精

と卵巣移植によって,雌 雄それぞれの生殖質の保存 と利

用ができることが明 らかにな りました。そこで,そ れぞ

れの手法を同時に用いた場合,つ まり,凍 結融解した卵

巣を移植 した雌蛾に凍結融解精液の人工授精を試みまし

た。その結果,得 られた受精卵は極めて少数でしたが,雄

雌両方の生殖質由来の受精卵を得ることができました

(図8.表3)。 また,卵 巣 を平 均997日,精 液 を平均

812日 とい う長期に保存 した組み合わせでも産卵蛾率や

受精卵数はほとんど低下することなく次代蚕を得られる

ことが確 かめられま した(表3,Mochida et al.,2007)。

またその次代蚕の遺伝的形質には変化がなく,飼 育成績

も通常 とほぼ変わ りないことが明らかになりま した。 し

か し,問 題点が残されました。まず,得 られた受精卵数

は極めて少ないことです。 また卵巣移植を行 っても,ど

表2.異 なる齢期のカイコ幼虫への卵巣移植と羽化雌蛾の産卵成績

発蛾率:供 試頭数に対する割合産卵蛾率:発 蛾頭数に対する割合卵巣の発育:発 蛾したものを全て調査宿主が5齢 の場合,切 開した傷の回復が困難であった

A

B

C

D

E

F

G

図7移 植された卵巣の発育対照約2個 分の卵巣が発達し(+++),そ の卵巣が輸卵管と結合約1個 分 の卵 巣 が発達 し(++),

僅 かに発 達 し(十),

〃〃

約2個 分の卵巣が発達したが(+++),卵 巣と輸卵管が不結合約1個 分 の卵 巣が発 達 した が(++),

僅 かに発 達 した が(+),

SANSHI-KONCHU BIOTEC Vol.77No.1

の雌蛾の輸卵管が結合 しているか人工授精の際に外部か

らは判定できないので,全 ての雌蛾に人工授精を行 うこ

とになり,精液のロスが膨大なものになってしまいます。

そこで,注 目しているのは,卵 の単為発生です(Mochida

et al.,2003,

4)単 為発生と人工授精

単為発生とは,卵 が精子 との受精を経ずに発生を始め

ることで,ミ ツバチでは雄バチの誕生がその例に当ては

まります。カイコの単為発生は,例 外的に起 こるとされ

ていますが,未 受精卵で人為的に単為発生を起 こす方法

が報告されています(Astaurov,1940)。 この方法は,ま

図8,移 植卵巣を宿主輸卵管に結合させ,受 精卵を得る遺伝資源保存法

(1)凍 結卵巣を宿主幼虫へ移植(2)羽 化した宿主雌蛾へ凍結精液を人工授精(3)両 性凍結生殖質からの崖下卵を得る成功率は低いが,現 時点では理想的なカイコ凍結遺伝資源保存法

図9.移 植凍結卵巣卵の単為発生による遺伝資源保存法(1)凍 結卵巣を宿主幼虫へ移植する(2)羽 化した宿主雌蛾から卵を取得し温湯処理により単為発生させる(3)単 為発生した次代蚕離職へ凍結精液を人工授精する(4)両 性凍結生殖質から崖下卵を得る図8の 代替え技術として単為発生を用いた凍結遺伝資源保存法

ず雌蛾を解剖 して成熟卵を摘出し,卵 管組織を除去 して

得 られた卵を460Cの 温湯 中に18分 間浸漬 します。 そ

の後15。Cに3日 間置 くことによって,未 受精卵が発育

を始め,着 色するようにな ります。この方法で得 られた

カイコは,遺 伝子構成が母親とまったく同じ,ク ロー ン

のようなもので,す べて雌になります。卵巣移植は,輸

卵管が結合 していな くても卵巣が発育し,一 部成熟卵に

なる場合があります(表2,図7)。 このような成熟卵を

有効に利用するための方法として考えたのが単為発生法

です。以前にも,単 為発生を利用 して雌の凍結卵巣につ

いて行われていますが(Kusuda et al.,1985),単 に雌性

生殖質を保存する試みだけに留まっていました。しかし,

人工授精法が確立されている現在では,凍 結融解 した卵

巣から発達 した成熟卵を単為発生処理 し,発 生 した個体

を飼育することによって,雌 蛾が得 られます。その雌蛾

に凍結融解精液を人工授精することで,効 率よく雌雄そ

れぞれの生殖質が回収されま した(図9)。 この方法 の

問題点 としては,単 為発生による幼虫のふ化が遺伝的要

因による影響が大き く,そ のため品種間 ・蛾区間で大き

な差が出ることです。この点が改善されれば,そ の利用

価値は計り知れないものになるで しょう。

まとめ 残された課題と未来への期待

カイコにおける凍結保存による系統維持の究極的目標

は,受 精卵の凍結保存だと私たちは考えています。受精

卵の凍結保存については,こ れまで多くの研究者が試み

ていますが,成 功に至っていません。現在は卵殻を取 り

除いた除殻卵の凍結融解培養が主流 となっており,方 法

確立にあと一歩のところまできています。また,カ イコ

では他の動物種で成功している核移植や顕微受精などが

成功 していません。例えば,顕 微受精が成功すれば,凍

結融解卵巣から得 られた成熟卵に凍結精液を顕微受精す

るな どカイコ系統の凍結保存法の選択の幅が大きく広が

り,近 い将来の成功 と実用化を期待 しています。

謝 辞

執筆の機会を くださった,蚕 糸 ・昆虫バイオテック誌

4齢 の凍結卵巣を融解後3齢 宿主に移植し,

発蛾率:供 試頭数に対する割合産卵蛾率:発 蛾頭数に対する割合

羽化 した離職 に凍 結 融解梢 孜 を人⊥ 伎相 し7こ

受 精 卵

理想:受 精卵をそのまま凍結保存

現実:-2.5℃ ～10℃ の温度を多用 しての2年 間低温保存

(持田ら,2006)

除殻卵凍結;受 精卵凍結の中で実現に1番近いと思われる受精卵を卵殻を除去し,漿膜を維持したまま凍結し,培養することで幼虫を得る

無凍結培養 飼育可能

凍結培養:凍 結しても成長するが摂食まで至らない

除殻卵内の胚子

生 殖 巣

幼虫期に採取し液体窒素に凍結,移 植により回収卵巣:輸 卵管の結合による産卵と単為発生の2つ の回収法がある精巣:可 能であるが,結 合率が卵巣と比較すると格段に低い

(精管結合以外に回収法は確立されていない)

精子 雄蛾貯精嚢から採取,人 工授精により回収

企画委員長の竹田敏博±および財団法人大日本蚕糸会 ・

蚕業技術研究所の井上元所長に感謝致します。また,謝

辞に書ききれないほどの多 くの皆様の惜しみないご協力

と古 くからの基礎研究に支えられてこれまでの研究を続

けることが出来ました。御礼申し上げるとともに,こ れ

からも皆様のご支援をよろしくお願いいた します。

引 用 文 献

Astaurov,B.L.(1940):"ArtificialParthenogenesisintheSilkworm

(Bombyxmori).AnExperimentalStudy",pp.221-240,Academic

Press,Moscow

伴 野 豊 ・藤 井 博 ・河 口 豊 ・山 本 幸 治 ・西 川 和 弘 ・西 阪 章 文 ・

田 村 桂 ・江 口 誠 一(2005)「 カ イ コ突 然 変 異 体 利 用 の 手 引

き2005遺 伝 子 名 と遺 伝 子 記 号 一 」,九 州 大 学 大 学 院 農

学 研 究 院 遺 伝 子 資 源 研 究 セ ン タ ー,福 岡 。

神 田 俊 男 ・田 村 俊 樹(1991):空 気 圧 を 利 用 し た カ イ コ 初 期

胚 へ のDNAの 微 量 注 射 法.蚕 糸 昆 虫 研 報.,2,31-46.

Kusuda, J., Noguchi, T., Onimaru, K., and Yamashita, O. (1985): Maturation and hatching of eggs from silkworm ovaries pre-

served in liquid nitrogen. J. Insect Physiol., 31, 963-967.

Mochida, Y, Takemura, Y., Kanda, T., and Horie, Y. (2003) : Fer- tilized eggs obtained from transplantation of frozen ovaries and

parthenogenesis in combination with artificial insemination of frozen semen of the silkworm, Bombyx mori. Cryobiology, 46,

153-160.

Mochida, Y., Takemura, Y., Ohnuma, A., Kanekatsu, R., and Kigu-

chi, K. (2007): Fertilization of eggs developed from the cryopre-

served and transplanted ovaries by artificial insemination with cryopreserved semen in the silkworm, Bombyx mori. J. Insect

Biotechnol. Sericol., 76, 97-100.

持 田裕司 ・竹 村洋 子 ・松 本 正江 ・金勝 廉介 ・木 口憲 爾(2006):

蚕 受精 卵 の低温 長期 保 存 とそれ に よ る後代 への 影響 につ い

て.蚕 糸 ・昆 虫バイ オ テ ック,75,37-43.

Omura, S. (1936): Artificial insemination of Bombyx mori. J. Facul. Agr. Hokkaido Imp. Univ., 38, 135-150.

Shinbo, H. (1989): Survival of larval ovaries and testes frozen in

liquid nitrogen in the silkworm, Bombyx mori. Cryobiology, 26,

SANSHI-KONCHUBIOTECVo1.77No.1

389-396

白 山勝 彦 ・入 谷 明 ・西 川義 正 ・大西 宏(1986):液 体 窒 素 で

長 期(20年)保 存 し た牛 凍 結 精 液 に よ る受 胎 試 験 成 績

日本 人工 授精 研究 会誌,8,18-20.

白 田和 人 ・新 野孝 男 ・長 峰司(2007):遺 伝 資 源 をめ ぐる 国

際情 勢 とわ が 国にお け る クワ,カ イ コ遺 伝資 源 の保存 農

業生 物資 源 ジー ンバ ンク事業 の紹 介,蚕 糸 ・昆 虫バ イ オ

テ ッ ク,76,41-47.

竹 村洋 子 ・神 田俊男 ・田村 俊樹 ・新 保博 ・堀 江保宏(1996):

家 蚕 の新 しい 人 工 授 精 法 の 開 発.日 本 蚕 糸 学 雑 誌,65,

456-463

Takemura Y., Kanda T. and Horie Y. (1999): Artificial insemination

using trypsin-treated sperm in the silkworm, Bombyx mori. J. In-

sect Physiol., 45, 471-477. Takemura, Y., Kanda, T., and Horie, Y. (2000) : Artificial insemi-

nation using cryopreserved sperm in the silkworm, Bombyx mori.

J. Insect Physiol., 46, 491-497. Takemura, Y., Sahara, K., Mochida Y., and Ohnuma A. (2006)

Apyrene sperm from the triploid donors restore fecundity of

cryopreserved semen in Bombyx mori. J. Insect Physiol., 52, 1021-1026

Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba,

M., Komoto, N., Thomas, JL., Mauchamp, B., Chavancy, G.,

Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, JC., and Couble, P. (2000): Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using

a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 181,81-84.

梅 谷與 七 郎(1925):家 蚕 に於 け る移 植 卵巣 及 び 血液 移 注 の

実験,特 に化性 変化 に就 て.遺 伝 学雑 誌,3,155-183.

吉 田忠 晴(1994):ミ ツ バチ の 人工 授 精 昆 虫 の 中 で人 工授

精 技術 が確 立 した唯 一 の例.科 学 と生物,32,564-56f.