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- 骨、軟骨、歯などの硬組織評価 -
骨検査のご案内
http://www.kureha-bunseki.co.jp
受託サービスのご案内
クレハ分析センター の骨検査は、多彩な検査項目を揃え、
骨・歯をはじめとする硬組織に関わる研究の総合的なサポートが可能です。
また長年の経験から、研究・開発の目的に応じて最適な検査方法を御提案いたします。
どうぞ私たちにお気軽にご相談ください。
一 般 検 査
○ 骨構造解析/μCT
○ 骨構造解析/軟X線写真撮影・CMR
○ 骨密度・骨塩量測定/DXA
○ 骨灰分分析/ICP発光分光分析
○ 骨強度試験
○ 分光分析/FT-IR・顕微ラマン
○ 非脱灰薄切標本
○ 非脱灰研磨標本
○ 脱灰パラフィン標本
○ 免疫組織化学染色標本
○ 凍結標本
○ 骨格標本
○ 骨形態計測
1
標 本 作 製
骨形態計測
お手続きの流れ
2
■ μCT ■
・骨の透視画像
・二次元断層画像
・三次元回転ムービー画像
・三次元切断ムービー画像
・断層画像における海綿骨構造の定量解析
(Node-strut法)
・多重断面画像からの三次元画像構築
■ 軟X線撮影 ■ 極めて単純な解析ですが情報量は大きく、ファースト スクリーニングとして大変有用です。
・骨の形態学的(マクロ)構造の観察
・小動物(マウス・ラット)の全身写真撮影
・埋植された金属・インプラント類の確認
・骨折位置・状況の観察
■ CMR ■ (contact micro-radiography)
試料(骨・歯の場合研磨試料)をフィルムに密着させて X線を照射することにより撮影します。
・骨の石灰化度の観察
骨梁構造の観察:
3次元切断ムービーの例
骨構造解析
マイクロフォーカスX線CT (μCT)
摘出骨内部の微細構造を非破壊的に観察・計測できます。
多重断層画像からの3次元画像構築の例
骨梁構造の観察:ラット大腿骨横断
A C
B
海綿骨の部分抽出
骨の形態学的(マクロ)構造の観察に適しています。
軟X線写真撮影 ・ CMR
マウス下顎骨臼歯 ラット大腿骨近位端
マウス全身軟X線 3
任意の部位における骨の体積密度(mg/cm³)を測定する場合には、
pQCT(peripheral Quantitative Computed Tomography)を用います。
pQCTは、X線管と対をなす検出器が三軸方向に動作することから、立体
的な断層測定が可能です。そのため、DXAでは算出できない皮質骨・海綿
骨それぞれの体積骨密度を測定することができます。
KSLでは、動物研究用のpQCT骨密度測定装置 XCT Researchシリーズ:
STRATEC Medizintechnic GmbH(販売: キヤノンライフケアソリューション
ズ株式会社(旧 株式会社エルクコーポレーション))を用いて、マウスやラッ
トなどの小動物の摘出骨および全身と、ウサギ、イヌ、サルなどの中動物
の摘出骨に対するpQCTによる骨密度測定を受託しています。
ICP分析は、骨だけでなく他の動植物の生物試料に対しても
微量元素の定量を承っております。
骨中のカルシウム(Ca)、無機リン(Pi)などの
骨灰分の成分定量分析を行う場合、 KSLでは
ICP発光分光分析を適用します。
カルシウム、リン、マグネシウムなど骨に多量
に含まれる元素の他に、含有される微量元素
についても高感度定量(検出限界10ppb程度)
が可能です 。
この分析を行う場合は、試料を灰化することが
必要となります。上記の灰化重量測定を予め
実施しておきます。
■ DXA ■ (Dual Energy X-ray Absorptiometry)
骨灰分中のCa、P、Mgのほか、骨中に含まれる微量元素を10ppbレベルまで定量します。
骨塩量・骨密度の測定
はじめに骨全体を測定して骨塩量(mg)・骨密度
(mg/cm²)を算出し、次に分割して骨端部、骨幹部
等の部位別の解析をすることも可能です。
この方法は、短時間で多数の検体を測定出来るため
ファーストスクリーニングとしても用いられます。
骨密度・骨塩量測定
DXA
小動物摘出骨の骨密度、骨塩量をX線で非破壊的かつ迅速に測定します。
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
骨密
度(
mg/c
m2)
sham
ovx
■ 骨灰分量測定 ■
骨を灰化し、骨中に含まれる無機質成分を測定し
ます。骨中の複数の無機微量元素を同時に高感度
で定量することができます。
ICP発光分光分析 (誘導結合プラズマ分光分析)
DXA測定結果例
← 遠位 マウス大腿骨 近位 →
OVXまたはsham手術を施したマウス大腿骨の骨密度を
測定し、長軸方向に全長を20分割した値をプロットした。
遠位端および近位端の海綿骨が豊富な部分(骨幹端部)
で、OVXによる骨密度の明らかな低下が認められた。
4
骨灰分分析
強度試験、分光分析(FT-IR)
長管骨を用いた、3点曲げ試験(破断試験)で、
主に皮質骨の強度についての情報が得られます。
マウス大腿骨3点曲げ試験(破断)試験例
時間 [sec.]
荷重
[N
]
変位
[m
m]
破断点
ラット大腿骨3点曲げ試験のイメージ
■ 長管骨3点曲げ試験 ■
得られる骨力学パラメータ例
最大荷重 [N]
破断変位 [mm]
剛性(Stiffness) [N/mm]
破断エネルギー [N・mm]
強度試験
骨強度試験
体の支持器官としての骨の物理的強度を検討します。
3点曲げ試験、圧縮試験、動的粘弾性試験を用意しております。
FT-IR、ラマン
分光分析
FT-IR イメージング
骨を非脱灰で樹脂包埋し、切り出した切片表面を解析します。
赤外吸収スペクトルのみならず、骨薄片上の分子の分布がイメージ画像として得られます。
■ FT-IR 吸収イメージング ■ FT-IR Absorbance Imaging
1800 1600 1400 1200 1000 800 cm-1
PO43-
A
CO32-
AmideⅠ
■ FT-IR スペクトル ■ FT-IR Spectrum
PO43-
マウス脛骨 MMA包埋切片
正常
骨軟化症
PO43-
連続V.Goldner 染色標本
リン酸基など、骨(切片)表面の分子種をIRスペクトルの
特定吸収波長の強度に注目して、二次元のイメージ画像
に再構築します。
未染切片
リン酸基の IR吸収イメージング画像
5
ラマン
分光分析
顕微ラマン分光分析
樹脂包埋や薄切片にする必要はなく、骨の表面を直接分析します。
比較的小さい領域の官能基や分子構造など組成に関する情報が得られます。
■ ラマン イメージング ■ Raman Imaging
■ ラマン スペクトル ■ Raman Spectrum
1070 CO32-
1243, 1320
AmideⅢ
1665
AmideⅠ
959 PO43-
【 Wave length : 780 nm 】
Ram
an I
nte
nsi
ty (
cps)
Raman shift (cm-1)
921 Proline 1665
AmideⅠ
876 Hydroxyproline
1070 CO32-
1243-1320
AmideⅢ
1450 CH2
腹側
骨では、ハイドロキシアパタイト由来の
リン酸(PO43-)、炭酸(CO3
2-)、タンパク質
(主にⅠ型コラーゲン)由来のアミドⅠ(C=O)
などの振動に起因する光が検出されます。
5.0
4.0
3.0
2.0
2.0
1.5
1.0
0.038
0.037
0.036
0.034
0.035
骨孔
皮質骨
30 μm
18 μm
結晶化度 コラーゲン成熟度
【 リン酸/アミドⅠ 】
組織の石灰化度
【 リン酸ピーク半値幅の逆数 】
アパタイト結晶の成熟度
【 成熟架橋(1660cm-1) /未成熟架橋(1690cm-1) 】
コラーゲン架橋の成熟度
石灰化度
骨孔 骨孔 骨孔
骨孔辺縁を拡大
ラマン分光はFT-IRに比べ高い測定の空間分解能(数μm径)を
示します。狭い領域に注目した測定では、FT-IRでは検出でき
ない骨質の変化を捉えることができます。
5/6腎摘ラット 大腿骨横断面 腹側
背側
皮質骨中に認められた骨孔
腎不全ラットの皮質骨中に発生した骨孔の辺縁を解析。分子種によるラマン散乱光の強
度比を画像として再構成した。皮質骨内のごく限られた面積内でも、骨孔に近い部分と
離れた部分で分布が異なり、骨質の組成が一様でないことがわかる。
ラマンイメージングによる骨質解析例
6
MMA(Methylmethacrylate)樹脂は包埋に時間がかかりますが、硬度が骨に
近く硬組織用のミクロトームで薄切します。骨形態計測をはじめ、骨の中の
細胞観察を主目的にする場合に最も適しています。
ラット脛骨近位端海綿骨 MMA樹脂包埋 非脱灰薄切標本 Villanueva’s Goldner染色 ×4 (左)正常モデル (右)副甲状腺機能亢進症モデル
×2
×10
ラット脛骨GMA樹脂包埋 TRAP染色
マウス脛骨MMA樹脂包埋 V. Goldner染色
×10
×200
TRAP (酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ)染色
ALP(アルカリフォスファターゼ) 染色
TRAP/ALP 重染色 (以上、酵素染色)
トルイジン・ブルー染色 (蛍光観察可)
HE染色
フォン・コッサ染色
ー 繁用される染色 -
非脱灰標本作製 骨や歯などの硬組織を脱灰せずに、硬度のある樹脂に包埋して作製します。 インプラントなどの医療材料も一緒に包埋できます。薄切標本と研磨標本があります。
■ MMA樹脂包埋薄切標本 ■
■ GMA樹脂包埋薄切標本 ■
非脱灰薄切標本
硬組織の石灰化状態と細胞を観察するのに有用です。
骨形態計測により、骨代謝回転の評価が可能です。
GMA(Glycolmethacrylate) 樹脂はMMA樹脂に比べ、やや硬度が劣
りますが、染色のバラエティが広がります。重合熱の発生が比較的少
なく、MMA樹脂ではできない酵素染色なども可能です。
Villanueva's Bone 染色 ラット大腿骨 海綿骨
カルセイン標識蛍光観察 (暗視野)
7
トルイジンブルー 染色 サル腸骨 海綿骨
von Kossa 染色 サル脛骨 近位端
黒~黒褐色:石灰化骨
(明視野) 薄青色:類骨 青色:軟骨基質
Villanueva's Goldner 染色
サル腸骨 海綿骨
緑色:石灰化骨、赤色:類骨
(明視野)無色~薄桃色:石灰化骨 濃赤紫色:類骨
カルセイン標識蛍光観察 (暗視野)
Villanueva‘s Bone 染色 研磨標本 蛍光観察 ラット大腿骨 骨幹部 横断面 (左)正常モデル (右)副甲状腺機能亢進症モデル
皮質骨のカルセイン骨標識が観察できる.
カルセイン標識
ビーグル大腿骨骨幹部横断面研磨標本 Villanueva’s Bone染色 ×40
暗視野(蛍光)
テトラサイクリン標識
ハーバス管
非脱灰標本作製
非脱灰研磨標本
非脱灰研磨標本は、本来の形状を保持したまま観察できる手段です。
30~50 μm程度の厚みの標本を作製します。
歯、顎骨や皮質骨などの緻密構造組織の観察に有用です。
内部に金属や人工物を含む検体からも、標本を作製することができます。
ラット大腿骨 骨幹部研磨標本 蛍光観察 Villanueva’s .Bone 染色 上:正常対照
下:副甲状腺機能更新症モデル
8
Villanueva‘s Bone 染色 研磨標本 ラット脛骨+インプラント
Villanueva‘s Bone 染色 研磨標本 イヌ大腿骨 骨幹部
無色~薄桃色:石灰化骨 濃赤紫色:類骨
Villanueva‘s Goldner 染色 研磨標本 イヌ下顎骨+インプラント
緑色:石灰化骨、赤色:類骨
Villanueva‘s Bone 染色 研磨標本 ラット下顎骨
脱灰標本作製
パラフィン標本
硬組織をEDTAや酸を用いて脱灰し、パラフィンに包埋します。
一般染色、酵素染色や免疫組織化学染色に対応でき、細胞の詳細な観察に適しています。
9
硬組織以外のパラフィン標本もお引き受けいたします。
トルイジンブルー染色 ラット腰椎 成長板軟骨
濃青色:軟骨基質
ボディアン染色 ラット脛骨 皮質骨
骨細管が黒~黒褐色に染め出される.
TRAP 染色:酵素染色 マウス脛骨 海綿骨
赤色:破骨細胞の細胞質
HE 染色 ラット脛骨近位端
サフラニンO 染色 イヌ脛骨 膝関節
赤色:関節軟骨の軟骨基質
アルシアンブルー染色 ラット脛骨 近位端 成長板軟骨
青色:軟骨基質
免疫組織化学染色標本作製
硬組織の脱灰パラフィン切片、非脱灰凍結切片、脱灰凍結切片の
免疫組織化学染色標本を作製します。
免疫組織化学染色標本
市販抗体の他、お客様お持込みの抗体による検討も承ります。
10
SOST ラット脛骨 皮質骨
陽性部位:骨小腔、骨細管 von Willebrand Factor (Factor Ⅷ) イヌ下顎骨
陽性部位:血管内皮細胞
免疫組織化学の実施例
Ⅰ型コラーゲン、 Ⅱ型コラーゲン、
Ⅹ型コラーゲン、オステオカルシン、
オステオポンチン、カテプシンK、
RANKL、CD3、CD4、CD34、
von Willebrand Factor (Factor Ⅷ)、
SOST、PCNA、その他
Ⅱ型コラーゲン マウス脛骨 近位端
陽性部位:軟骨基質
オステオカルシン ラット脛骨
陽性部位:骨芽細胞
カテプシンK ラット脛骨 海綿骨
陽性部位:破骨細胞
凍結標本作製
凍結標本
短時間での標本の作製が可能で、酵素染色や免疫組織化学染色にも適した標本作製法です。
フィルム法による硬組織の非脱灰凍結切片も作製できます。
骨格標本
小動物の全身の骨格をそのまま観察することができます。
免疫染色:オステオカルシン (非脱灰凍結切片) ラット皮質骨
骨芽細胞
皮質骨
骨膜
骨髄側
トルイジンブルー染色 (非脱灰凍結切片) ラット脛骨
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トルイジンブルー染色 (非脱灰凍結切片) ラット下顎骨
骨格標本作製
マウス新生仔2日齢 アリザリンレッド・アルシアンブルー 重染色標本
赤色:石灰化骨、 青色:軟骨
目安としてラット程度の大きさまでの骨格標本作製を承ります。
動物種、作製日数はご相談ください。
脱灰
MMA (薄切)
MMA (研磨)
GMA (薄切)
凍結 (薄切)
パラフィン (薄切)
切片の厚さ(μm) 6 30~50 3 5~10 3
標本作製にかかる時間(目安※1) 8週間 12週間 8週間 1週間 3週間
一般染色 Villanueva's Bone ・石灰化骨と類骨の判別が可能 ・骨形態計測に向く、蛍光観察可能
○ ○ ― ― ―
Villanueva's Goldner ・石灰化骨と類骨の判別が可能 ・骨形態計測に向く、蛍光観察不可
○ ○ ○※2 ― ―
HE ・最も一般的な染色 ・組織の全体像をつかむのに有効
○ ○ ○ ○ ○
トルイジンブルー ・骨形態計測に用いる ・軟骨の染色に向く
○ ○ ○ ○ ○
von Kossa ・石灰化骨を黒く染める ○ ○ ○ ○ ○
アルシアンブルー ・軟骨基質を青く染める ― ― ○ ○ ○
サフラニンO ・軟骨基質を赤く染める ― ― ○ ○ ○
マッソン・トリクローム ・膠原線維を染める ― ― ― ○ ○
ボディアン ・骨細管を染める ― ― ― ― ○
酵素染色 TRAP ・破骨細胞で陽性 ― ― ○ ○ ○
ALP ・骨芽細胞で陽性 ― ― △ ○ ―
免疫染色 ― ― ― ○ ○
※1:検体数、ご依頼状況に応じて変動いたします。
※2:One-Step Goldner 染色を適用します。(通常のV. Goldner 染色に比べ、若干色合いが変わります。)
この表にない染色でも、ご相談を承ります。お気軽にお問合せください。
硬組織標本作製
硬組織標本の種類と染色
よく用いられる硬組織標本の包埋方法と染色法の特徴を簡単にまとめました。
非脱灰 脱灰
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HE : Hematoxylin Eosin TRAP : Tartrate Resistant Acid Phosphatase ALP : Alkaline Phosphatase
ラット脛骨 近位端 海綿骨骨梁 MMA樹脂包埋 非脱灰薄切標本 Villanueva's Bone 染色
左と同じ視野を蛍光顕微鏡下観察 カルセインを7日間あけて2回皮下投与。 この2本の石灰化前線の間隔の平均値を7日間で除 し石灰化速度とする。
破骨細胞
骨芽細胞
カルセイン標識 1回目
7days
骨組織標本を顕微鏡下で観察し、その組織構造や代謝・動態に関わる情報を骨形態計測システムに
より定量化することができます。複雑な骨代謝異常を示す病態モデルや、薬剤の骨に対する影響を
評価するために大変有用です。骨標本に限らず、他の病理標本や画像からの数値化も可能です。
「OsteoMeasure(OsteoMetrics, Inc.)」(左)と「Histometry RT CAMERA(システムサプライ社)」(右)、
2つの骨形態計測システムにより対応いたします。
採骨前の動物にあらかじめ蛍光カルシウムキレート剤を投与しておくことによって、石灰化
速度、骨形成速度など骨の代謝動態の情報が得られます。
骨形態計測
骨形態計測
骨形態計測は、骨の代謝機能を評価する最も確実な手段です。
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ラット大腿骨 遠位端 海綿骨 MMA樹脂包埋 非脱灰薄切標本 Villanueva's Goldner 染色
サル大腿骨 遠位端 海綿骨 MMA樹脂包埋 非脱灰薄切標本 Villanueva's Bone 染色
繁用される海綿骨形態計測の2次パラメーター
用語(英語) (日本語) 略語 単位
骨構造パラメーター
Bone volume
/Tissue volume 骨量 BV/TV %
Trabecular thickness 骨梁幅 Tb.Th μm
Trabecular number 骨梁数 Tb.N /mm
Trabecular separation 骨梁間隙 Tb.Sp μm
骨形成パラメーター
Osteoid volume
/Bone volume 類骨量 OV/BV %
Osteoid surface
/Bone surface 類骨面 OS/BS %
Osteoblast surface
/Bone surface 骨芽細胞面 Ob.S/BS %
Osteoid thickness 類骨幅 O.Th μm
Mineralizing surface
/Bone surface 骨石灰化面(骨表面) MS/BS %
Mineral apposition rate 石灰化速度 MAR μm/d
Bone formation rate
/Bone surface 骨形成速度(骨表面) BFR/BS μm3/μm2/d
骨吸収パラメーター
Eroded surface
/Bone surface 浸食面 ES/BS %
Osteoclast surface
/Bone surface 破骨細胞面 Oc.S/BS %
Osteoclast number
/Bone surface 破骨細胞数 N.Oc/BS (個) /100mm
骨形態計測
代表的な海綿骨形態計測の2次パラメーター
14
*: American Society for Bone and Mineral Research
ASBMR*の命名法に基づいた以下のような2次パラメーターを算出します。
裏表紙
E-mail: [email protected]
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お問い合わせ・検体発送先
株式会社クレハ分析センター 東京事業所
医薬本部 医薬部 骨検査室
〒169-8503 東京都新宿区百人町3-26-2
TEL: 03-3362-7408
FAX: 03-3362-7433
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KSL STB L001(02-4) 2017年12月
東京事業所
カフェ
クレハ分析センター 東京事業所
(㈱クレハ 本社別館内)
↓新宿 ↓新宿
新宿サンパークホテル
カフェ
コンビニ
公務員住宅
東京都健康安全 研究センター
東京山手 メディカルセンター
たばこ屋
大久保通り
ドラッグストア
コンビニ
テニス
コート
淀橋
市場前
北新宿
一丁目
区間 車の通行困難
徒歩のみ