Elektronenmikroskopische Untersuchungen der strukturellen Veränderungen im Rindenbereich des Amphibieneies im Ovar und nach der Befruchtung

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    10-Aug-2016

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  • Zeitschrift fiir Zellforschung 54, 118--146 (1961)

    Aus dem Anatomischen Institut der Universitgt Hamburg (Direktor: Prof. Dr. med. et phil. E. HO~STMA~N)

    ELEKTRONENMIKR0 SKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER STRUKTURELLEN VERANDERUNGEN IM R INDENBEREICH DES AMPHIB IENEIES IM 0VAR UND NACH DER BEFRUCHTUNG

    Von

    HUBERT WARTENBERG und WALTER SCHMIDT

    Mit 16 Textabbildungen

    (Eingegangen am 23. November 1960)

    Einleitung In frfiheren Arbeiten haben wir den Aufbau des Rindenbereiches der Am-

    phibienoocyte untersucht (WARTENBERG ] 959, WARTENBERG un d GUSEX 1960 a, b). Die elektronenmikroskopischen Ergebnisse hatten aber keine befriedigende Ant- wort auf die Frage ergeben, in weleher Weise der Rindenbereich w~hrend der ovariellen Entwieklung und im Zeitraum naeh der Befruchtung bis zur Furchung vers wird. Dabei interessierte der als Zona radiata bezeichnete Rinden- abschnit t der 0ocyte und seine Beziehungen zu dem spi~ter gebi ldeten Dotter- hi~utchen. Weiterhin sollte das Verhalten gewisser subkort ikaler Granula oder Vakuolen beobachtet werden, in denen Mucopolysaccharide histoehemisch nach- gewiesen worden waren (WARTE~BERG 1956, 1959). AuBerdem wollten wir auf diesem Wege versuehen, etwas fiber die St ruktur und die Entstehung des Holt- freterschen ,,surface coat" zu erfahren. Nach HOLTFRETER (1943a, b) entsteht diese Bildung, nachdem das Ei den 0v idukt durchwandert hat ; she soll aber schon vor der Befruehtung vorhanden sein und sps im Blastula- und Gastrula- s tad ium als ein , ,syncytialer Mantel" den Keim zusammenhalten.

    Material und Methode Um die Oocyten verschiedenen Reifegrades zu gewinnen, entnahmen wir dem dekapi-

    tierten Tier (Rana temporaria) ein Ovar und fixierten Teile davon 30 min lang in isotonischer, gepufferter 1%iger OsO4-LSsung (RHODIN 1954) bei Pn 7,2. Die gewiinschten Ooeytenstadien konnten unter der binokularen Lupe herausgetrennt werden und einzeln 2 Std in eisgekfihlter LSsung fixiert werden. Das fibrige Material wurde durch kfinstliche Befruchtung in der von Ro~IEIs (1948, S. 547) angegebenen Weise gewonnen. Unbefruchtete Eier entnahmen wir dem Uterus sofort nach 0ffnen des Tieres. Bei allen Eiern entfernten wir nach lstiindiger OsO4-Einwirkung die Gallerthfille und fixierten die Eier anschlieI~end eine weitere Stunde.

    Das Material ffir die Untersuchungen an Tritoneiern (Triton alpestris) wurde in der glei- chen Weise gewonnen, mit dem Unterschied, dab normal abgelaichte Eier verwendet und die Gallerthfille vor der Fixierung entfernt wurde. Nach Einbettung fiber Alkohol und Aceton in Methaerylat (Methylester:Butylester:l:3) wurden die Schnitte auf einem Porter-Blum-Ultramikrotom hergestellt. Die Aufnahmen wurden mit einem Siemens- Elektronenmikroskop Typ Elmiskop I bei 80 kV gemacht.

    Untersuehungsergebnisse

    1. VerMiltnisse wdhrend der ovarieUen Entwiclclung a) Z0na radiata mit Mikravilli und Fol[ikelepithel. Elektronenmikroskopische Beobach-

    tungen an Amphibienooeyten sines sehr frtihen Stadiums (Rana pipiens) liegen yon K~.M~ (1956a, b) vor; etwas Mtere Stadien (Zeitpunkt der Pigmentbildung, Rana esculenta) wurden yon uns untersucht (WARTE~BERG und GUSEK 1960a, b). In beiden F~llen konnte die Struktur

  • Rindenbereieh des Amphibieneies 119

    der Zona radiata (Rindenhaut) gekli~rt werden: In eine nur leicht strukturierte ,,Grundsub- stanz" liegen zahlreiche Mikrovilli der Ooeyte und einzelne Forts/~tze der Follikelzellen ein- gebettet. Die ,,Grundsubstanz" der Zona radiata - - nach histochemischen Befunden ein neutral reagierender Mucopolysaeeharidkomplex (WARTE::BERO 1959) - - nimmt mit fort- schreitender Reifung des Eies an Menge zu, so dal3 die Mikrovilli schlieBlieh nur noch den inneren Bereieh einnehmen.

    Von DOLLANDER (1956) wurde die elektronenmikroskopische Struktur der Urodelen- ooeyte (Triton alpestris und T. helveticus) beschrieben. Er finder ebenfalls Mikrovilli, die ,,in die innere Partie des Chorions hineinragen". Der Autor vergleieht diesen Aufbau mit dem der ,,zone fibrillaire", welcher von C1gAUDn~Y (1956) an Teleosteern erkannt wurde.

    hnliche VerhMtnisse wurden bei der Saugeroocyte von YAlgADA, MUTA, MOTOMURA und KooA (1957) am Mdiuseei, yon SOTELO und PORTER (1959) und yon ODOR (1960) am Rattenei, yon TRUJILLO-C]::~6Z und SOTELO (1959) am Kaninchenei gefunden. Die Zona pellucida enth/~lt zahlreiche fingerfSrmige Mikrovilli yon seiten der Oocyte und einzelne lange Forts~tze der Follikelzellen, die z.T. die Mikrovilli oder die Eioberfl~ehe zwischen den Mikro- villi beriihren, aber niemals in kontinuierlichem, syncytialem Zusammenhang mit dem Ei stehen. Aueh die menschliche Oocyte zeigt diese Struktur (WARTE:~BERO und STEO:~ER 1960).

    Bei unseren Untersuchungen wurden Ovarialeier unterschiedlicher Reife herangezogen. Im Rindenbereich der heranwachsenden Oocyte vom Grasfrosch Rana temporaria bilden kurze, fingerf6rmige Mikrovilli gemeinsam mit einzelnen, z.T. verzweigten Forts/~tzen der Follikelzellen eine noch recht dfinne, an Grund- substanz arme ,,Zona radiata ''z. Das Follikelepithel bedeckt mit 3 Schichten die Eioberfl/~che, wobei die Zellagen durch jeweils eine Basalmembran voneinander getrennt sind. Die Basalmembran zwischen oberfl/~chlicher und mittlerer Schicht ist relativ dfinn (250--500 A), w/~hrend die Membran zwischen mittlerer und tiefer Sehicht kr/~ftiger entwickelt ist (1000--1500 A). Beide Basalmembranen sind der oberfl~ehlichen bzw. tiefen Zellage zugeordnet, indem sie den Plasmalemmata der jeweiligen Zelle dicht anliegen, vonder mittleren Zellschicht aber durch einen mehr oder weniger breiten, Gitterfasern enthaltenden Interzellularspalt getrennt sind.

    Die Oocyte w/~chst heran und die Zona radiata n immt an Breite zu. Dabei vermehrt sich vor allem die Grundsubstanz, so dab nur noch die innere H/flfte yon den Mikrovilli eingenommen wird. Die Grundsubstanz besteht aus einer Menge dicht gelagerter und unscharf begrenzter Balken, die z. T. radi/~r angeordnet sind, z.T. tangential verlaufen und damit eine Art Flechtwerk bilden (Abb. 1, 2). Zwischen diesen relativ dichten Anteilen findet man bei hoher Aufl6sung feine subfibrill/ire Elemente (Abb. 2). Gegen das Plasmalemm der Follikelzelle schliel3t die Zona radiata mit einer unregelm/~Big begrenzten, aber in sich homogenen Schicht von Grundsubstanz ab. Aus den Ergebnissen histochemischer Reaktionen kann man schlieBen, dab die gesamte Grundsubstanz neutrale Mucopolysaccharide enth/flt (WARTENBERG 1959).

    Ist die Eizelle im Ovar vol lkommen ausgereift, d.h. hat sie ihre maximale Gr6$e erreieht, dann bietet die Rindenhaut ein anderes Bild (Abb. 3). Die enge Verbindung mit der Eioberfl/~che ist durch Rfickbildung der Mikrovilli gel6st, das Plasmalemm schlieBt die Oocyte fast glatt gegen die Rindenhaut ab. Zwar findet man noch h/~ufig kleine warzen- oder fingerf6rmige Ausstfilpungen des Plasmalemms, doch ragen diese in einen Spalt hinein, der sich als ein in der Struktur gelockerter Bereich zwischen Eioberfl/~che und eigentlieher Rindenhaut

    1 Siehe Anmerkung auf S. 137.

  • 120 HUBERT WARTENBERG und WALTER NCIIMIDT:

    ibb . 1. Junge Oocyte yon Rana temporarla. 1 iiuBerc Schicht des Follikele!oithels =Per i toneum; 2 mitt lere Bindegcwebsschicht; 3 t it le Schicht--eigentl ichcs Follikclepithel; 4 BasaImembra.n I ;

    5 Basalmcmbran l I ; 6 Zona radiata mit MikroviHi in der inneren H~tlfte; 7 subkortikalc Polysaccharidvakuolen im Rindencytoplasma des Eies. Vcrgr. 16200mal

  • Rindenbere ich des Amphib iene ies 121

    Abb. 2. Zona rad iata einer waehsenden Oooyte yon Rana temporaria. 1 Follikelepithel mi t Kern; 2 micellares F leehtwerk der Grundsubstanz mit z. T. sehr feinen Fibril len; 3 ~$ikrovilli dot EioberfIi~ehe;

    4 1Rindencytoplasma der Oocyte. Vergr. 28000real

  • 1~2 HUBERT WARTENBERG undWALTER SCHMIDT:

    darstellt. Der kfinftige perivitelline Spalt ist hier bereits angedeutet. Dem Plasma- lemm liegt eine Schicht meist radigr gestellter, sehr feiner Elemente auf (Abb. 4 a).

    Die Rindenhaut enthiflt vorwiegend tangential orientierte und unscharf be- grenzte Elemente, die als Mucopolysaccharid-Micellen aufzufassen sind, wenn man zu ihrer Beurteilung histoehemische Ergebnisse heranzieht. Die Verbindung zum Follikelepithel fehlt jetzt, so dab sich das Ei bei der Pri~paration von diesem 15st und das Follikelepithel in unseren Schnitten nicht mehr anzutreffen ist.

    b) Subkortikale Granula (Vakuolen) und Rindeneytoplasma. Als subkortikale Granula oder Vakuolen (cortical granules) wurden bei versehiedenen Amphibien Gebilde beschrieben, die Mucopolysaceharide enthalten und die in ~hnlicher Form auch unter anderem bei Fischen und bei Seeigeln gefunden wurden (Amphibien: MOTOMURA 1952, VOSS und WARTEN~aO 1955, ROSENBAUM 1958, KEMP 1956a, b, WAaTENBnRO 1956, 1959, OSA~AI 1958, 1960a, KATAOIRI 1959, WART~RO und GUSEK 1960a, b; Fische: SPEK 1933, KONOPACKA 1935, 1937, K. YAMA~OTO 1951, T. YAMAMOTO 1956, KANO~ 1952, KUSA 1953, 1954, 1956, 1957a, b, 1958, AKATE 1954, OSANAI 1956, 1959, ARNDT 1956, 1960a, b, STEaBA 1957, T. S. YAMA- MOTO 1957a, b; Seeigel: HEI~DEE 1931 (nach ALLEle), !~r 1941, MO~ und H/~RDE 1951, McCVLLOeH 1952, AFZELIUS 1956, IMMERS 1956, RUlq~STRSM und IMMERS 1956, Y. TAKA- SHIMA 1960, OSANAI 1960b, BALINSKI 1960; Zusammenfassungen: ALLEI~ 1958, AFZELIUS 1957).

    Diese subkortikalen Granula entstehen sehr frfihzeitig, noch vor dem Auftreten des ersten Pigmentes im Cytoplasma der Oocyte. Ihre chemische Beschaffenheit wechselt von Froschart zu Frosehart. :Die Mucopolysaecharide kSnnen neutral oder auch sauer reagieren (WARTENBERG 1959). Da sie beim Krallen/rosch, Xenopu8 laevis, zuerst am sp~teren animalen Pol des Eies auftreten, wird dadurch schon zu diesem Zeitpunkt eine gewisse polare Dif- ferenzierung des Eies angelegt (Voss und WARTElqBERG 1955). Im ausgewaehsenen Ovarialei liegen die subkortikalen Granula dicht unter der Eioberfli~che. Am animalen Pol sind sie infolge der groi~en Pigmentdichte meist schlecht zu sehen, am vegetativen Pol dagegen recht gut.

    In elektronenmikroskopisehen Aufnahmen der Rindenregion junger Froschoocyten wurden yon KEMP (1956a, b) und von WARTENBERG und GUSEK (1960a, b) diese subkortikalen Gra- nula als wenig elektronendichte, sehr feingranulierte KSrper im Cytoplasma gefunden.

    Die 0ocyten yon Rana temporaria enthalten eine groge Anzahl runder oder l~nglich ovaler Anschnitte, die meist zwischen 0,5 und 1,5 # bemessen sind und welche teilweise sehr dicht gepaekt und gegenseitig abgeplattet im Rinden- cytoplasma liegen (Abb. 1, 3, 4a).

    Im voll ausgebildeten Ei liegen diese Granula direkt unter dem Plasmalemm. An eiaigen Stellen lagert eine sehr dfinne Membran dem Plasmalemm fast ohne Zwischenraum an. Der Inhalt der Granula ist etwas elektronendichter, zeigt aber sonst die gleiche, sehr feingranul~re Struktur (Abb. 4a).

    Am animalen Pol setzt sich das dichte Cytoplasma aus granul~rem Material zusammen, dessen Partikel mit 120--180 A noch im Bereich der Palade-Granula liegen. AuBerdem enth~lt das Cytoplasma verschiedenartig gestaltete Bl~schen mit einem durchschnittl ichen Durchmesser yon etwa 0,2/~ (Abb. 3). Darfiber hinaus ist diese Zone durch ihren Reichtum an Pigment und Lipoiden aus- gezeichnet. SehlieSlich finder man besonders diehte Cytoplasmabezirke (Abb. 3, 4b). Diese Bezirke, die als freie Stellen im Pigmentmuster auffa]len, sind bei hSherer AuflSsung als eine Ansammlung von feinen Bl~schen zu erkennen. Die Bl~sehen haben einen mittleren Durchmesser yon etwa 500 A, kSnnen aber auch 100--750 A messen. Zwischen ihnen liegen kompakte Granula, die mit etwa 100--180 A in der GrSBe den Palade-Granula im iibrigen Cytoplasma entsprechen. Die Plasmabezirke haben meist eine Ausdehnung von 1--1,5 #. Man findet aber

  • Rindenbereich des Amphibieneies ]23

    auch kleinere Ansammlungen, vor allem unter dem Plasmalemm zwischen den subkortikalen Granula.

    e) Die Feinstruktur der Pigmentgranula. Nachdem die Dotterbildung bereits begonnen hat, tritt das Pigment der Amphibienoocyte dicht unter der Rinde im Bereich des animalen Poles auf. Zusammenh~nge zwischen den subkortikalen Granula und der Bildung der Pig- mentgranula wurden nicht gefunden (WARTE~BERO und GUSEK 1960). Die Pigmentgranula entstehen im endoplasmatischen Retikulum aus fast homogenen, m~flig dichten Korpuskeln, die teilweise eine zentrale Aufhellung enthalten und nach und nach an Dichte zunehmen. Als Pigmentgranula yon Triton alpestris finder DOLLANDER (1954, 1956) 0,3 ~u grol3e Granula, die sich aus einer Ansammlung yon dichten Mikrogranula yon 0,03 # Durchmesser aufbauen. In dem Anschnitt eines Pigmentkornes z~hlte er etwa 20 solcher Mikrogranula. Das Pigment- granulum soll yon einer kaum sichtbaren Membran umgeben sein.

    Die Pigmentgranula der Oocyte yon Rana temporaria haben am animalen Pol einen Durchmesser zwischen 0,3 und 0,4/~. Am vegetativen Pol sind die Granula wesentlich seltener und etwa um das Doppelte gr6Ber. Innerhalb eines an sich schon sehr dichten Internums kann man an dfinn geschnittenen Stellen sehr dichte Mikrogranula in der Gr6Be von 200--300 A sehen (Abb. 4b). Eine feine Hfille ist nur an einigen Stellen, dort aber deutlich zu sehen (Abb. 4b, 6a).

    2. Das unbe/ruchtete Ei Wenn das Amphibienei in den Uterus gelangt, wird es in dem Ovidukt mit einer schleimig-

    z~hen Gallerthiille versehen. AuBerdem soll naeh HOLTFRET]~R (1943) ZU diesem Zeitpunkt der surface coat angelegt werden. Elektronenmikroskopiseh hat DOLLA~DER (1956) das unbefruchtete Ei von Triton alpestris und T. helveticus untersucht. Er findet am animalen Pol zahlreiehe Mikrovilli und eine Plasmamembran. Das kortikale Plasma soll aus globularen Strukturen zusammengesetzt sein.

    Das unbefruchtete Ei von Rana temporaria, das dem Uterus entnommen wurde und vor dem Fixieren nicht mit Wasser in Berfihrung gekommen ist, li~Bt keine Mikrovilli erkennen. Der ehemaligen Zona radiata, in deren eiw~rts gelegenen inneren Viertel noch Reste der Mikrovilli auszumachen sind, ist eine sehr breite Zone eines weniger dichten und vollst~ndig homogenen Materials aufgelagert, in der untersehiedlich breite Schichten von dichterer Beschaffenheit parallel zur Eioberfli~ehe verlaufen. Das Ei ist gegen die Eihfillen mit einem glatten Plasmalemm begrenzt, das an einigen Stellen kurze Ausstfilpungen wie beim reifen Ovarialei zeigt. Unter dem Plasmalemm linden sich alle ffir die Oocyte bereits erw~hnten Elemente : subkortikale Granula, Pigment und Lipoide sowie die dichten Plasmabezirke.

    Zwischen den Dotterschollen sind grol3e Bezirke mit einem wenig dichten, nur ganz rein granulierten Inhalt ausgespart. Nach den Ergebnissen der histo- chemischen Polysaccharid-Reaktionen enthalten diese Bezirke Glykogen. Es ist zu diesem Zeitpunkt in groBen Mengen in der animalen Hiilfte des Eies in Form yon mehr oder weniger grol3en Granula abgelagert (WARTENBERG, unverSffentl.).

    3. Das be/ruchtete Ei

    Nach A~CEL und VINTEMBERGER (1948) ist 15 min nach der Besamung die ,,Aktivierung" des Eies durchgeffihrt und die sog. Rindenreaktion eingeleitet. Eintritt des Spe...

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