Received March 3, 1976 andrologia 9 (3) : 279-288 (1977)

Universitk Catholique de Louvain, Unit6 des Sciences Vbtkrinaires, Laboratoire d’Anatomie et d’Embryologie Animales,

B-1348 Louvain La Neuve, Belgique

Essai de Dosage Diffbrentiel par Ultramicrospectrophotom4trie de I‘ADN et de YARN dans le Spermatozoide (Suite)

L. HENRIET, P. BERTHET et J.C. LEHOUCQ

Introduction

L‘un d’entre nous (Henriet - 1974) a publii, antirieurement, les risultats d’essais prkliminaires de dosage de I’ARN et de I’ADN I l’aide de l’ultramicrospectrophoto- mktrie de Zeiss.

La prisente note fait suite A ces essais priliminaires dans lesquels l’attention a i t6 centrie moins sur les quantitks que sur les localisations des acides nucliiques et sur les possibilitks offertes pa l’appareil.

V. mais la disposition spatiale des iliments cellulaires des spermatozoides a permis de faire supputer leurs sites de localisations respectifs.

Toutefois ces risultats itaient trop impricis pour une connaissance approfondie de la structure et ce second essai a it6 effectuk aprks ilimination ilective de l’un et l’autre des acides nucliiques par leurs enzymes cataboliques spicifiques (ARNase et ADNase).

Le principe de cette recherche est donc trks simple mais les auteurs se sont heurtis a des difficultis dues, d’une part A des impricisions dans les modes d’action des enzymes et d’autre part, au manque d’homoginiiti du milieu et d des distorsions dues B une non application de la loi de Lambert-Bert.

Les acides nucliiques sont indiscernables l’un de I’autre en absorption de lumibre U-

Materiel et Methode

1. L ’appareillage: L’ultramicrospectrophotombtre de Zeiss a it6 dicrit dans les publica- tions priddentes (Henriet 1975, Henriet - 1976).

Rappelons tout simplement que son principe a i t6 itabli par Caspersson (1936)- (1941) et Caspersson, Lommaka et Jacobson (1951) et qu’il se compose d’un microscope a optique en quartz muni d’une platine A balayage, d’un spectrophotombtre et d’une machine analogique Wang qui ricolte e t restitue les risultats du dosage.

Le diplacement de la platine a i t6 limit6 B 0,5 microns. Chaque spot de mesure re- prksentait 0,625 microns.

Le principe de 1’6valuation est d’effectuer 4 mesures chevauchantes pour un champ de 0,5 microns. Mais dans le cas qui nous occupe, ce systkme ne change rien aux donnies, puisque si nous avons recueilli les valeurs globales fournies par l’ordinateur, nous nous sommes cependant limitis i des comparaisons entre les mesures ponctuelles de chaque kchantillon examink. Les risultats ont en effet i t i , chaque fois consignis sur papier par l’ordinateur Wang selon la ripartition de chacune de ces mesures. C’est 18 l’avantage de cet appareil: toute la surface de la cellule examinie est mesurie point par point et chacun de ces points est restitui sur papier e t donc connu. On obtient ainsi un dosage trks localisi de la substance itudiie.

4 2 2 -~

7182121232214 13212425232219 _ ~ _ . ~ ~ ~~~~. 1723242~241814 21'222624272316

AL3Z52 4? t 2 5 t ? 20202425212119 22252426242417 iii3i6i~z313ii 21222525222713 _ _ 24262524252313 202227242422 5

U36423510 _.. 3272134

6 7 617 1013

- 21 7 24 24 221

- 911 18 4 22 22

- . __

- _

4 7 217

Fig. 1: Rkpartition des mesures ponctuelles d'un spermatozoide normal. Les valeurs d'absorption sont donnks par des nombres de deux chiffres.

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Ultramicrospectrophotometrie 281

Les mesures ont CtC effectukes a 2600 A; choix qui a BtC fait en fonction du travail antirieur. Des mesures complementaires A 2800 et 3 150 A auraient mieux dkfini la valeur des chiffres recueillis. Toutefois, A la lumiere de l’expkrience prCcCdente, nous savions, en les nkgligeant, que la prdcision atteinte serait suffsante pour une premiere investigation.

2. Les spermutozoides: Le sperme a BtC diluC pour faciliter le centrage du balayage sur un seul spermatozoide.

Les Cchantillons ont CtC CtalBs sur lame de quartz, sCchCs, fix& par l’alcool acktique et l’alcool absolu.

Le dilueur utilisC est une solution de citrate inactive sur l’absorption des rayons U-V; Choix des limites d’absorption: de 5%8 95%. 3. I,e traitement par les enzymes: L’ARNase a CtC utilisCe aux concentrations de 0,l mgr et 0,2 mgr par centilitre de tampon Tris pH=7,4 pendant respectivement 1 heure, 2 heures et 5 heures. L’ADNase a CtC utiliske aux concentrations de 1 mgr et 2 mgr par centilitre du mdme tampon pendant 5 heures.

couverte vers le bas en sorte que les frottis baignent dans la solution a 37”. La compa- raison a CtC faite avec des tkmoins.

Les spermatozoides ont CtC soumis a leur action en suspendant les porte-objets, face

Resultats

Les images jointes a ce texte illustrent les possibilitks offertes par la methode. On voit en figure 1 la silhouette du spermatozoide tCmoin. Cette silhouette est dessine par chaque mesure sitCe ti son emplacement dans le champ, lors du passage du rayon lumi- neux. Elle se dCtache des valeurs parasites du fond de la preparation. Rien, toutefois, dans cette image ne permet de discerner la localisation des deux sortes d’acides nuclei- ques. De plus, on constate une absorption dans tout le flagelle du spermatozoide. Ceci ne semble pas concorder entierement avec l’image classique de la localisation des acides nucliiques.

La figure 2 montre une silhouette similaire risultant du balayage par I’appareil d’un spermatozoide soumis A l’action de I’ARNase et la figure 3, le resultat aprks l’action de 1’ADNase.

Des images semblables ont BtC obtenues pour chacun des 15 spermatozoides exami- nes.

Ripresentation graphique des rksultats

Les mesures fournies par l’appareillage dicrit ci-avant peuvent &re assimilkes a des matrices de donnCes (Z) (80 des niveaux d’absorption. Les indices lignes et colonnes re- prCsentent la coordonnCes dans le plan x,y. Pour des donnees de ce genre, l’utilisation conjointe de l’ordinateur et du traceur de courbe peut faciliter grandement l‘interpri- tation des risultats. Dans le cas prdsent, nous avons mis en oeuvre 1’6quipement du centre de calcul de 1’UniversitC comprenent un ordinateur IBM 379 travaillant sous VM/CMS connect6 a un terminal a Ccran Tektronics 2004 et une Table tragante Xyne- tics.* Trois voies d’approches ont C t C exploitCes.

* Nous tenons i rcmercier Monsieur J.P. Raucq du Centre de Calcul de 1’U.C.L. pour I’aide et les conseils qu’il nous a apportk.

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CMS 2e-1x8 -- UCL - L0UVAIN-L~ FILE: S P E R M DATL- B --- --- __

__- 2 2 1 2 2 1 2 2 2 1- 2141718ia222_~~_5 s 2 1 2 1 2

1113 5 3 3 4 - 71619 5 1

- 1 5 9 1 2 2 ._ 2 1 8 2 2 2 3 2

__ 2 2

_ _ - 2 217 3 4 5 4 2 31714 2 2 610 2 5 2 620

2 10 21

_ - - -

3 1 2 2 2 - 2 7 1 1 4 2 2 2 2 -2 9 6 4

2 4 2 4 1 1 4 4 2 2 3

1 2 2 2 2 3 2 5 1 2 1 1 2 --2-1-2s_ 2 2 4 2 1 2 ‘ 1 2 _ _ _ 2 2 1 4 4 2 2

5 1 2 2 2 1 1 2 2 2 1 0 2 3 - -2-7 3 2 2- 1 2 11

1 1 17 2 4 2 ~- L 2 3 ~ _ _ -

.: __ n 3 _ _

14 2 2 9 7-2 2 1 - 1 9 2 2 2 2 1 1

1 - -

5 2 - -2 2 2 2 - 1-2__L-z_-- 16

- ___ -

10 2 8 _ _

6 4

2 3 1 3 3 2 2 - 5

2 1 2 2 1

2 2 2

ONNES E l

L L A L A a 1 1 1 2 3 2 2 2

3 2 3 2 1 2 2 2 2 6 2 2--2 2 1 2 1 1 2 2 3 4 2 2 1 2 2 2 2 2 1 3 2 --1-2 2 1 2

2 5 2 2 3 1 5 s - 2 - 2 2 2 2 1 2

3 5 2 2-1 2:--27 2 1 1 2 2 2 4 2 2 2 1 2

-- -

_____-

52 LIGhES

Fig. 2: Rhartition des mewres ponctuelles d‘un spermatozoide trait6 par I’ARNase.

En premier lieu, nous pouvons reprisenter les niveaux d’absorption dans le sperma- tozoide par la mdthode des Bquipotentielles ou courbes de niveau. Le programme utilisk est dO a Sindic (1 975) et utilise l’algorithme rapide de Schreiber (1 968).

L’application de cette m6thode est illustrie i la fig. 6 qui permet clairement de loca- liser dans la partie proximo-caudale de la tete du spermatozoide la zone d’absorption opt rque maximale.

Il’autre Part, lorsque la surface a reprksenter est relativement simple, il peut dtre possible de l’assimiler a une fonction continue comme par exemple une Bquation poly- noniiale du type:

z = a. t a ,x + a2y + a3xz = a4xy + a5yZ + a6x3 t a7x2y t ....

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Ultramicrospectrophotometrie 283

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Fig. 3: Rhartition des mesures ponctuelles d'un spermatozolde trait6 par I'ADNase.

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Fig. 4 et 5: Vues en perspective sous un angle de 0" et 144" d'une t&e de spermatozoide normale, approxim&s par une fonction polynomiale du S h e degr6. (Les vues sous 72", 216" et 288" ne sont pas reproduites ici)

Fig. 6: Vue en perspective des donnCs de la fig. 2.

Dans le cas d'une tdte de spermatozoide, il s'est aver6 nkcessaire d'utiliser une Bqua- tion polynomiale d'ordre 5 pour obtenir une approximation quelque peu satisfaisante. Disposant de cette fonction, nous pouvons faire appel B des sous-routines de vues en perspective (Raucq 1972) et obtenir diffdrentes vues de la mime surface. Les fig. 4 et 5

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Ultrarnicrospectrophotomttrie 285

illustrent cette methode oh une tQte de spermatozoide normal est examinees sous une colatitude de 130’ et sous un angle variant rigulierement de 72 en 72 degrks.

La mCthode par regression polynomiale est cependant laborieuse et exigente en temps calcul et inapplicable a une surface aussi complexe qu’un sperrnatozoide entier. Nous avons utilid alors un programme de reprksentation par perspective cavalitre d’une matrice (Sindic 1975). Afin d’obtenir un rCseau suffisamment dense, nous procCdons d’abord a une interpolation en deux dimensions par la mdthode des splines et nous doublons ou triplons ainsi la maille de matrice; puis nous procbdons Cventuellement i un lissage de la surface par la mCthode de Reinsch (1967).

bibliotheque de Stanford University. C‘es Ctapes sont rCalisCes en faisant appel aux sous-routines ICSIDE et ICSSMU de la

On obtient aussi des reprCsentations comme celle reprise ii la fig. 6.

Discussion

On wit que la majoritt de I’ADN est IocalisCe dans la tQte et il est logique que 1’ADNase Climine I’absorption en ultra-violet a ce niveau. D’autre part, il existe sans doute de I’ARN dans la tbte, mais ces quantitis sont faibles et nous avons d6ji signal6 que Premkumar (1972) en trouve 0,02 % pour I’ensemble du sperrnatozoide, alors que Devuyst, Henriet et J. Vanderhaute (1970) en trouvent de 1 1 5 %. Cela fait une Cnorme diffirence en valeur absolue, mais en regard de la grande quantitC d’ADN, cette diver- gence est bien faible.

selective et, partant, tres precise de l’un et de I’autre acide nuclCique, mais nous nous sommes heurtis a des obstacles que nous n’avons pas encore surmontis.

Si on compare les figures 1 et 2, on constate que les nombres caracttrisant le flagelle sonst infkrieurs apres I’action de 1’ARNase. Mais I’action de 1’ADNase se manifeste aussi au niveau de ce flagelle. On sait effectivement qu’il existe de I’ADN mitochondrial et la chute est forte au niveau de la piece intermediaire et faible ou nkgligeable, ou non inter- pritable dans le reste du flagelle.

Tout ce que l’on peut a f fmer , c’est que ces bases n’ont pas diffusd dans leporte-objet , puisqu’on ne trouve pas de diffirence d’absorption entre les fonds de prCparation avant et aprts action des deux enzymes.

Mais on doit dks lors, considirer ce que deviennent ces bases apds leur liberation par l’enzyme. En effet, elles peuvent rester sur place et dans ce cas, elles augmentent I’inten- sitC d’absorption de la lumiere ultra-violette; ou bien elles sont Climinies par le lavage, et dans ce cas, cette absorption s’affaiblit. Effectivement, nous trouvons des silhouettes repondant a ces deux CventualitCs. Cette alternative complique le probltme.

1. Nous n’avons pas pu dbfinir une pCriodc optimale d’action des deux enzymes (Con-

2. I’exploration des flagelles ne correspond pas a une utilisation optimale de I’appareil

Nous espirions, par la mCthode que nous prCsentons, parvenir a une localisation tres

A cet inconvknient, viennent s’ajouter les trois causes d’Cchec suivantes:

centration et durke)

et ce difaut reltve, lui aussi de deux causes: a) Dabord, pour que les comparaisons soient significatives, il faut que la lumikre tra-

verse des Cpaisseurs Bgales de matitre. Les objets vivants r6pondent bien a cette condition. Dans le cas particulier du spermatozoide, les valeurs marginales sont moindre et d’interprbtation plus difficile. Toutefois, nous en avons precis6 les limites acceptables dans une prCcCdente publication (Henriet 1974).

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Pour le flagelle, chaque section nicessite au moins deux mesures. Mais, comme il est cylindrique, l’endroit de passage de la lumiere influe beaucoup sur l’absorp- tion. Comme il est Ctroit par rapport au diametre du plan lumineux, les mesures de chevauchement avec Ie champ interferent plus que lors de l’exploration de la tCte.

h) D’autre part, ce balayage, privu par le constructeur, se poursuit toujours dans un rectangle dont le rapport des cBtCs peut varier. Toute cellule peut donc s’inscrire dans un de ces rectangles, mais il faut veiller A ce que les ptrimktres enserrent les contolirs cellulaires de tres pres. Cette condition est aisee a rialiser pour la tCte, elle l’est beaucoup moins pour le flagelle surtout s’il n’est pas strictement Ctendu comme dans la figure 3. Cette extension du flagelle est tres aisee sur un frottis simple, mais lors des bains dans les enzymes et dans l’eau de lavage, la fixation se reliche et les flagelles se replient.

au tres grand nombre de mesures ntcessitkes par l’exploration du flagelle.

suivant: la cellule observke a des grossissements de plus de 500 diamktres ne re- prisente plus un materiel optique aussi homogene qu’il apparait a de moindres grossissements et nous nous demandons si la loi de Lambert-Beer est toujours applicable.

D’apres les spicialistes des usines Zeiss, nous aurions eu une interference due

La reflexion sur ces inconvenients nous a ament a un autre ccniveau)) qui est le

Conclusion

[,a mesure analytique par ultramicrospectrophotomCtrie permet d’espirer une loca- lisation exacte de chaque aide nucltique et le dosage precis de chacun des sites rep6rCs. L’appareil laisse entrevoir une trts large possibilitk d’informations nouvelles. Toutefois, une longue mise au point est encore nicessaire.

MalgrC les obstacles rencontris, nous croyons pouvoir difinir une mithode de dosage des acides nucleiques, comme suit: 1. Le sperme doit Ctre fortement diluC (I partie pour 100) pour reperer facilement les

2. Faire un dosage ponctuel en lumiere ultra-violette. 3. Soumettre les frottis I’action de l’enzyme choisie. 4. ArrCter I’action de l’enzyme et ensuite suivre l’un des deux modes operatoires:

spermatozoides a Ctudier et rendre l’influence du milieu pratiquement nulle.

a) Eliminer les produits de scission par lavage abondant. b) Ne pas Climiner les produits de scission de maniere a les garder sur le lieu de leur

libtration. 5 . ProcCder A un nouveau dosage ponctuel sur le mCme spermatozoide convenablement

rzplaci dans sa situation primitive sur le microscope. La comparaison des histogrammes recueillis permet de localiser les acides nucli-

iques et de mesurer par diffkrence les quantitis prisentes. Les deux modes opiratoires peuvent i tre utilisks comme compliment l’un de

l’autre et accroitre ainsi la pre’cision des rksultats. Cette precision dtpendra, entre autres, de deux facteurs non ntgligeables: la con-

naissance d’une d u d e d’action precise des diastases et l’exactitude du replacement des permatozoides dans sa position initiale.

Toutefois, des travaux complkmentaires sont indispensables avant de pouvoir dis- cuter d’une localisation precise et d’une reprksentation fidele des structures du sper- matozoide.

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Ultramicrospectrophotometrie 287

Resume

Les auteurs decrivent un complement ?i la methode ultramicrospectrophotometrique de dosage des acides nucleiques, qu’ils ont publike anterieurement. Les spermatozoides sont balayes par un flux ponctuel de lumikre ultra-violette. On obtient ainsi la mesure d’absorption lumineuse d’un tr4s grand nombre de sites trks restreints, qui sont definis avec une grande precision de localisation sur un histogramme. Les spermatozoides sont ensuite soumis ii l’action de 1’ARNase et de I’ADNase, et soumis une seconde fois au balayage. La comparaison des deux histogrammes permet d’evaluer les quantitis pri- sentes. La methode demande encore une longue mise au point.

Ultraspektrophotometrische Dosierungsmethode zur Bestimmung der Nukleinsiiuren in Spermatozoen

Zusammenfassung

Die Autoren beschreiben eine Erganzung der ultraspektrophotometrischen Dosie- rungsmethode der Nukleinsiuren, welche sie schon vorher veroffentlicht haben. Die Spermatozoen werden von einem punktuellen Lichtstrahl gefegt. So erhalt man die Ab- sorptionsmasse einer sehr groDen Anzahl ganz kleiner Flachen. Diese konnen mit groaer Genauigkeit in der Ortsbestimmung mittels eines Histogramms definiert werden. Die Spermatozoen sind anschlieBend dem EinfluB der RNSase und DNSase ausgesetzt und ein zweites Ma1 dem punktuellen ultravioletten Lichtstrahl unterlegt worden. Der Ver- gleich der Histogramme erlaubt es, die vorhandenen Quantitaten zu ermitteln. Die Me- thode bedarf noch einer weiteren Ausarbeitung.

Ultraspectrophotometric method for the dosage of nucleic acids in spermatozoa

Summary

The authors describe a complement of the previously published ultramicrospectro- photometric method for the dosage of nucleic acids. The spermatozoa are scanned by a bundle of U-V. light. It is so possible to obtain the measurement of the U-V. light ab- sorption on a very big number of very small areas. The data are printed very accurately on one histogram. Thereafter spermatozoa are submitted to the action of RNase and DNase and rescanned with U-V. light. The comparison of the histograms allows to esti- mate the amount of nucleic acids. Further investigations are requested.

Bibliographie

Caspersson, T. 1936. Uber den chemischen Aufbau der Strukturen der Zellkerne, Scand. Arch. Phy-

Caspersson, T. 1941. Studien iiber den EiweiDumsatz der Zelle, Naturwissenschaften, 29.33. Caspersson, T., S. Lommaka and F. Jacobson. 195 1 . An automatic scanning device for ultraspectro-

Devuyst, A., L. Henriet et I. Vandenhaute. 1970. Le rapport entre les acides nucl6iques du sperme de

Henriet, L. 1975. Essai de localisation et de dosage de I’ARN dans le flagelle et dans la gouttelette

Henriet, L. 1976. M6thode de localisation et d’6valuation des quantit6s d’ADN contenues dans le

siol. 73, Suppi. 8.

graphy, Exp. Cell Research 2, 301.

taureau et son pouvoir fkcondant, Zootechnica e veterinaria N 1/2, 33 ,45 .

cytoplasmique du spermatozoide de taureau, andrologia 7, 39-48.

spermatozoide de taureau. andrologia 8, 326-339.

andrologia 9 (1977)

288 L . HENRIET, P. BERTHET et J . C. LEHOUCQ

Henriet, L. 1965. Recherche d’une correlation entre le pouvoir fecondant du sperme de taureau et ses quantites d’acides ribonucl6iques et desoxyribonucleiques. Rapport annuel du Centre Expe- rimental d’Indmination Artificielle de Lovenjoul, Universite de Louvain (1 965).

Raucq, J.P. 1972. Representation plan de figures spatiales. Rapport no 8 du Centre de Calcul U.C.L.

Reinsch, C.H. 1967. Smoothing by spline functions. Numer Math. 10, 177-183. 0. Sindic, L. 1975. Representation graphique de fonctions de deux variables discrites, Memoire de

Schreiber, D.E. 1968. A generalized equipotential platting routine for a scolar function of two vari-

47 PP.

licence U.C.L. non publie. 49 pp.

ables. RJ-499. Computer applications May 74.

Nous tenons i exprimer ici nos remerciements au confrere R. Jaumotte, directeur du centre d‘in- semination artificielle du Brabant et i la firme Carl Zeiss pour I’aide consid6rable que I’un et l’autre nous ont fournie dans la realisation de ce travail.

Address: Dr. L. Henriet, Universiti Catholique de Louvain, Unit6 des Sciences V6t6rinaires, Labora- toire d’Anatomie et d’Embryologie Animales, B-1348 Louvain La Neuve, Belgique.

Book Review

Praktische Endokrinologie und Hormontherapie nichtendokriner Erkrankungen. A. JORES und H. NOWAKOWSKI. Unter Mitarbeit W. Bartsch, H. Frahm, E. Klein, Z. Skrabalo, H-J. Staernrnler, J. Tamm, K.-D. Voigt, R. Ziegler. 4., iiberarbeitete und erweiterte Auflage, 1976. XII, 463 Seiten, 132 Abbildungen, 37 Tabellen. (Georg Thierne Verlag, Stuttgart.). 17 x 24 cm. Geb. DM 148,- ISBN 3 13 3559 04 4

Dieses Buch erscheint nun schon in der 4., erweiterten Auflage, allerdings nicht rnehr unter der Mitwirkung von A. Jores. Es hat irnmer einen guten Ruf gehabt und fur den an endokrinen Fragen interessierten Allgemeinarzt und Facharzt stets einen besonderen Anreiz geboten. Das ist wohl auch in der Zukunft so, wenn man bedenkt, da8 durch die Hereinnahrne 8 weiterer Mitarbeiter ein zusatzlicher Inforrnationsge- winn fiir den Leser entstehen mu& Die Aussagen zu den Kriterien normaler und patho- logischer Hodenfunktion, zur andrologischen Nomenklatur und zur Infertilitat des Mannes entsprechen allerdings nicht dem internationalen Standard.

Die Ausstattung des Buches ist hervorragend. C. Schirren, Hamburg

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