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Estudio de la interacción proteína-ligando de la enzima Adenosina quinasa
mediante experimentos 2D-HSQC de Resonancia magnética nuclear
Bolsista
Romina Almasia Croce Estudiante de Ingeniería en Biotecnología
Molecular Universidad de Chile
Orientador Prof. Dr. Ana Carolina Zeri / LNBio
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Estudio de la interacción proteína-
ligando de la enzima Adenosina quinasa mediante experimentos 2D-HSQC de
Resonancia magnética nuclear
Bolsista Romina Almasia Croce
Estudiante de Ingeniería en Biotecnología Molecular
Universidad de Chile
Orientador Prof. Dr. Ana Carolina Zeri / LNBio
2011
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Estudio de la interacción proteína-ligando de la enzima Adenosina quinasa mediante experimentos 2D-HSQC de
Resonancia magnética nuclear
Proyecto desarrollado durante programa 20° bolsas de verano
LNBio- 2011
............................... .................................. Orientador Bolsista Ana Carolina Zeri Romina Almasia
Campinas, São Pablo Brasil
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer esta magnífica oportunidad de aprender y conocer sobre el trabajo que se realiza en este centro. Por la increíble experiencia de poder compartir con tanta gente que me enseño cosas muy bonitas tanto en el laboratorio como en lo cotidiano. También a mi familia por estar siempre apoyándome en todo momento, a mi Madre por apoyarme en todo lo que se me ocurre. A Guillermo por creer en mí siempre y apoyarme sin dudar. A Renata por enseñarme siempre con una gran sonrisa y muchísima paciencia. A Rafael “Lupito” por todo su apoyo, infinita paciencia y alegría diaria. A Ana Carolina por haber creído en mí al escogerme entre tantos candidatos, por la paciencia y por tiempo que dedico a enseñarme. A Mauricio y Siovana por sus conocimientos en RMN y por sus hermosos espectros. A los amigos “bolsistas” que me hicieron inmensamente feliz en mi estadía en Brasil. Por todos aquellos hermosos momentos como las comidas por la noche en la pousada donde nos contábamos el día y lo mucho que “trabajábamos”, por nuestros viajes, por los encuentros y desencuentros. Porque cada uno de ellos fue único e importante. Al CENPEM por el financiamiento del programa bolsas de Verão, que me entrego esta experiencia única. Y a todos los que contribuyeron con que este trabajo pudiera ser realizado.
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"…The clock is running. Make the most of today.
Time waits for no man. Yesterday is history.
Tomorrow is a mystery. Today is a gift.
That's why it is called…. the present..."
Alice Morse
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ÍNDICE
Página RESUMEN _______________________________________________________________________________ 9
1 INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________ 10
1.1 Adenosina quinasa (AK) ___________________________________________________ 10
1.2 Expresión y purificación ___________________________________________________ 12
1.3 Resonancia magnética nuclear ____________________________________________ 13
2 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ___________________________________________________ 16
2.1 Objetivo general ____________________________________________________________ 16
2.2 Objetivos específicos _______________________________________________________ 16
3 Metodología ______________________________________________________________________ 17
3.1 Clonación ____________________________________________________________________ 17
3.2 Expresión ____________________________________________________________________ 17
3.3 Purificación _________________________________________________________________ 18
3.4 Análisis RMN ________________________________________________________________ 19
4 RESULTADOS ____________________________________________________________________ 20
4.1 Expresión ____________________________________________________________________ 20
4.2 Purificación _________________________________________________________________ 20
5 DISCUCIÓN Y CONCLUSIÓN _____________________________________________________ 31
6 REFERENCIAS ____________________________________________________________________ 33
ANEXOS________________________________________________________________________________ 34
6.1 Análisis de movilidad relativa de las bandas _____________________________ 34
7
ÍNDICE DE TABLAS O CUADROS
Tabla I. Medio mínimo M9. ........................................................................................................ 18
Tabla II. Peso molecular aproximado según movilidad relativa de las bandas. ... 24
Tabla III. Titulación para la enzima adenosina quinasa y un sustrato específico mediante RMN TROSY/HSQC. .................................................................................................. 25
Tabla IV. Titulación para la enzima adenosina quinasa y su sustrato específico adenosina mediante RMN TROSY/HSQC. ........................................................................... 28
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ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Figura 1. Prueba de inducción. ................................................................................................ 20
Figura 2. Prueba de adhesión de la proteína fusionada a una cola de histidina con la resina de agarosa NI-NTA. .................................................................................................... 21
Figura 3. Espectro obtenido en cromatografía de afinidad en columna His trap 5ml para la enzima adenosina quinasa. ............................................................................... 21
Figura 4. SDS PAGE 12% de las fracciones eluidas con mayor absorbancia en cromatografía de afinidad. ........................................................................................................ 22
Figura 5. Espectro de cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 26/60 200 pg. ............................................................................................................. 22
Figura 6. SDS PAGE 12% de las fracciones eluidas por cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 16/60 200 pg. ............................................................... 23
Figura 7. Análisis SDS PAGE 12% para la digestión de la cola de histidina al incubar con proteasa sumo. ...................................................................................................... 23
Figura 8. Espectro obtenido por cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 26/60 200 pg. con flujo lento para separar la cola de histidina de la enzima adenosina quinasa tras digestión con proteasa sumo. ........................ 24
Figura 9. Espectro de RMN TROSY/HSQC de la enzima adenosina quinasa a una concentración de 0,17 mM. ....................................................................................................... 25
Figura 10. Espectro de RMN TROSY/HSQC de la enzima adenosina quinasa ....... 26
Figura 11. Acercamiento del espectro de la Figura 10 en puntos donde se observó desplazamiento del corriente químico................................................................ 27
Figura 12. Comparación del desplazamiento en el corrimiento químico de los espectros de RMN. ........................................................................................................................ 29
Figura 13. Espectro de interacción entre adenosina quinasa y sus sustratos específicos: adenosina y ATP.................................................................................................... 30
Gráfico 1. Relación logaritmo del peso molecular en función de la movilidad relativa de las bandas de la enzima unida a la cola de histidina................................. 34
Gráfico 2. Relación logaritmo del peso molecular en función de la movilidad relativa de las bandas de la enzima tras digestión con sumo proteasa. .................. 34
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RESUMEN
La enzima adenosina (AK) quinasa cataliza la fosforilación de adenosina usando
como fosfato dador al ATP. Su función fisiológica está asociada con la regulación
de los niveles de adenosina extracelular y la preservación intracelular. Se conoce
que la adenosina en el medio extracelular es capaz de activar receptores que
modulan respuestas fisiológicas que restauran las funciones normales en casos
de isquemia o trauma. Sin embargo, AK es la primera ruta del metabolismo de la
adenosina implicando que los inhibidores de AK serían los únicos capaces de
producir un aumento considerable de los niveles de adenosina. De acuerdo con
lo anterior, se podrían generar compuestos farmacológicos con efectos
terapéuticos. Es por ello que resulta interesante estudiar la proteína y conocer
como esta interactúa con sus ligando específicos. Dado estos antecedentes es que
en este proyecto se expresó la enzima en un medio de cultivo que solo posee una
fuente de nitrógeno marcada isotópicamente, el cual corresponde al medio
mínimo M9. Se indujo la expresión con IPTG y luego de 5 horas de incubación a
37ºC con agitación se procedió a lisar las células utilizando lisozima y sonicación.
Luego, se purificó mediante cromatografía de afinidad en columna de Níquel y en
una segunda purificación se utilizó cromatografía de exclusión. Utilizando
ambas cromatografías es posible obtener alto rendimiento. Se digirió la proteína
con proteasa SUMO obteniendo una eficiencia del 99%. Finalmente, se separó la
cola de histidina digerida de la enzima mediante una cromatografía de exclusión
a una tasa de flujo menor.
Una vez obtenida la enzima se realizaron experimentos bidimensionales HSQC
mediante Resonancia magnética nuclear para poder analizar la interacción de
esta enzima con algunos ligandos específicos como adenosina y ATP,
obteniéndose que esta enzima presenta interacción con ATP en sitios distintos
que con adenosina. Finalmente al analizar el espectro de AK con ATP y
adenosina, se observó cambios en el espectro para las concentraciones
escogidas.
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1 INTRODUCCIÓN
1.1 Adenosina quinasa (AK) La enzima Adenosina quinasa (Adenosina 5´-fosfotransfera) cataliza la
fosforilación de adenosina usando como fosfato dador al ATP o GTP (Mathews y
cols, 1998). En diversos estudios, se ha determinado que la adenosina presenta
propiedades neuromoduladoras que generan un amplio rango de respuestas
fisiológicas, en tejido de mamífero ésta limitan el daño y restaura las funciones
normales (Park, J. y Gupta,S., 2008) mediante la interacción con receptores de
adenosina. Bajo condiciones de O2 normal, la tasa de catabolismo y anabolismo
es igual, por lo que la concentración de ATP se mantiene en niveles superiores al
de ADP. Sin embargo, bajo condiciones de estrés o trauma, como isquemia o
hipoxia, los suministros de O2 no son los adecuados para la fosforilación
oxidativa de ADP para generar ATP. Por lo que aumenta la concentración de ADP
resultando en un aumento de AMP, el cual hidroliza y se convierte en adenosina.
Debido al aumento de la concentración de adenosina en el citosol, está es
liberada al espacio extracelular (Decking y col., 1997), donde se une a los
receptores de adenosina. Los efectos mediados por estos receptores incluyen
vasodilatación coronaria, reducción de la actividad neuronal, inhibición de la
agregación de plaquetas, actividad antiinflamatoria, angiogénesis y pre-
condicionamiento isquémico (Park y Gupta, 2008).
Estudios sobre la distribución de AK en los tejidos muestran que esta
quinasa es muy abundante en mamíferos y que presenta una elevada actividad
en hígado, riñón y pulmones, mientras que en cerebro, corazón y músculos
esqueléticos la actividad es intermedia en el caso de humanos y monos (Mathews
y col., 1998).
Su función fisiológica está asociada con la regulación de los niveles de
adenosina extracelular y la preservación intracelular, pero cuando existen
alteraciones de esta enzima como sobreexpresión en partes determinadas del
hipocampos epiléptico esta contribuye al desarrollo y avance de la actividad
convulsiva (Gouder y col., 2004). Basado en estudios bioquímicos se ha
determinado que AK posee bajo valor de Km -25nM-1µM (Park y Gupta, 2008)-,
11
por lo que se postula que AK es la primera ruta del metabolismo de la adenosina
implicando que los inhibidores de AK serían los únicos capaces de producir un
aumento considerable de los niveles de adenosina. De acuerdo con lo anterior, se
podrían generar compuestos farmacológicos con efectos terapéuticos (Mathews
y col., 1998).
Actualmente su estructura y función han sido ampliamente estudiadas.
Mediante cristalografía de rayos X se determinó que la estructura de la proteína
consistía en un gran dominio α/β con 9 cadenas β, 8 α hélices y un dominio
pequeño α/β con 5 cadenas β y 2 α hélices. Donde el sitio activo se encontraba
sobre el borde de la sabana β, en el dominio mayor, mientras que el dominio
menor actúa como una tapa que cubre la cara superior del sitio (Mathews y col.,
1998).
Existen pocos acuerdos respecto al orden en el que los sustratos se unen a la
enzima. Sin embargo se sabe que existen dos sitios de unión para adenosina, uno
con alta afinidad que corresponde al sitio catalítico y otro con menos afinidad.
Por análisis de competencia este último sitio no correspondería al sitio de unión
del trifosfato, pero podría cumplir una función reguladora de la actividad de AK
durante episodios de isquemia o alta producción de adenosina (Mathews y col.,
1998).
La estructura determinada presentó alta similitud con la estructura de
riboquinasa de Escherichia coli ambas pertenecientes a la familia de las
carbohidratos quinasas (Park y Gupta, 2008). Al comparar las estructuras se
observó que uno de los sitios de unión en los que se encontró adenosina,
coincidían con el sitio de unión de ribosa en la riboquinasa, por lo que
probablemente este sitio representaría el sitio de unión a sustrato. Mientras que
el segundo sitio en el que se observó unión a adenosina hubo un
sobrelapamiento con el sitio de unión a ADP en riboquinasa, por lo que
probablemente este sitio representaría el sitio de unión a ATP. El sitio de unión
al ion Mg2+ se observó entre los dos sitios de unión a adenosina. (Park y Gupta,
2008).
En cuanto al mecanismo catalítico para AK este tendría como primer paso la
unión a adenosina en su forma abierta. Esta unión iniciaría el plegamiento y
llevaría al envolvimiento del sustrato dentro de la enzima. Este cierre
12
aumentaría la afinidad por ATP, lo cual induciría a la formación de un espacio
aniónico en el sitio activo. Se sabe que una Asparagina desprotonaría el grupo 5´-
hidroxil de la adenosina, el cual luego atacaría el grupo fosfato del ATP. Mg 2+ se
une a ATP, mientras que funciona estabilizando la carga negativa de los
nucleótidos y potencia la salida de ADP. Luego, los sustratos abandonan la
enzima, primero ADP y luego AMP. Ésto se debe a que el sitio de unión a
adenosina se encuentra más profundo en la estructura (Park y Gupta, 2008).
1.2 Expresión y purificación La expresión y purificación de proteínas implica una serie de pasos que
aprovechan propiedades fisicoquímicas y biológicas del organismo modelo y de
las proteínas de interés, con el fin de obtener una proteína separada del resto de
las moléculas del organismo. Lo importante, dependiendo del experimento, es
conseguir diseñar un protocolo que permita purificar la proteína, obtenerla
pura, pero manteniendo la actividad específica intrínseca, y por lo tanto que el
plegamiento sea el adecuado. Si bien, no hay una sola secuencia de protocolos a
seguir, en general se recomienda comenzar por expresar la proteína en un
organismo modelo, para luego purificar con técnicas que tengan alta capacidad,
siguiendo con las de baja capacidad.
La purificación macromolecular de mayor resolución se obtiene mediante
cromatografía. En general muchos pasos de purificación disminuyen el
rendimiento. Para RMN en general los costos de purificación son ignorados con
tal de obtener una proteína estable y pura, en alto rendimiento. Entre estas
cromatografías encontramos la cromatografía de afinidad que provee buena
resolución, corto tiempo y elevada capacidad. En este caso se utilizan proteínas
ligadas a una molécula que presenta alta afinidad por el soporte sólido de la
columna, que luego mediante competencia con otra molécula, permite separarla
de la columna y obtener el eluido. Un problema de este método es que requiere
cortar la molécula ligada después de la purificación, que en algunos casos puede
complicar el proceso (Chary y Govil, 2008). Sin embargo, en este proyecto se
utilizó la tecnología SUMO que corresponde a un péptido pequeño que potencia
la expresión y permite remover eficientemente proteínas de fusión. Mediante
proteasas que reconocen la secuencia terciaria de la proteína SUMO, lo que
13
permite obtener la proteína fusionadas de interés sin clivajes internos o en los
entremos (SUMOpro™Technology), de forma rápida y eficiente.
Luego para continuar con la purificación, se utiliza la cromatografía de
exclusión molecular o filtración en gel, donde la proteína se aplica a una sílica
estacionaria y porosa, con lo que las moléculas son separadas por su tamaño,
donde las partículas de mayor tamaño se mueven más rápido porque no quedan
retenidas entre los poros, mientras que las de menor tamaño quedan retenidas y
requieren de mayor tiempo para eluir. Considerando las características propias
de cada protocolo se ha visto que cuando se utiliza la combinación de las técnicas
aquí mencionadas, junto con otras, se logra obtener proteínas de elevada pureza
y lista para ser utilizadas en ensayos de actividad, RMN, entre otros (Chary y
Govil, 2008).
1.3 Resonancia magnética nuclear Todas las funciones fisiológicas de los organismos requieren de proteínas,
formadas por miles de átomos organizados en conformaciones tridimensionales
muy diversas y complejas (Ochsenbien y Gilquin, 2007). Dada la importancia de
estas moléculas es que existe gran interés en determinar la estructura y función
de éstas. Para ello existen variadas técnicas bioquímicas y físicas.
Para la resolución de la estructura existen dos métodos diferenciados por
la resolución uno de ellos es la cristalografía de Rayos X y la otra es mediante
espectroscopia de resonancia magnética nuclear. La primera entrega mayor
resolución y permite trabajar con proteínas de mayor tamaño, el segundo
método permite estudiar la dinámica de las proteínas con sus ligando u otras
proteínas (Berg y cols, 2008), analiza las estructuras estables menores a 50 KDa
(Ochsenbien y Gilquin, 2007), y determinando el promedio de éstas dado que al
realizar los experimentos en solución, las moléculas se encuentran en constante
movimiento lento (del Río Portilla, 2003).
Desde sus inicios la resonancia magnética nuclear (RMN) se ha ido
consolidando como una poderosa herramienta para la determinación de la
estructura y dinámica de proteínas en solución (Chary y Govil, 2008). La RMN
constituye un fenómeno físico intrínseco de la mecánica cuántica y como tal, se
basa en las propiedades magnéticas de los núcleos. Esto se debe a que cada
14
núcleo atómico funciona como un pequeño magneto debido a que posee carga,
un spin y un momentum angular, lo que genera en consecuencia un momento
magnético (µ) (Chary y Govil, 2008). Cuando se introducen estos núcleos en un
campo magnético externo, estos se comportan como pequeños imanes y tienden
a orientarse preferentemente en la dirección del campo magnético aplicado. Sin
embargo, cuando se aplica una energía que obligue a los núcleos a invertir el
sentido de su orientación con respecto al campo magnético externo, se dice que
el sistema está en resonancia lo que genera que el núcleo precese en torno a eje
inicial con una frecuencia que es característica para cada tipo de átomo y la que
solo es alterada cuando existen campos magnéticos locales generados por la
densidad electrónica que rodea a cada núcleo (entorno químico), por lo que a la
posición donde se observa la excitación se la conoce como desplazamiento
químico, este se mide en partes por millón(del Río Portilla, 2003) y representa el
entorno en el que cada átomo detectado se encuentra.
Además del acoplamiento químico existen otros parámetros
espectroscópicos como el acoplamiento debido a la unión de enlaces químicos
conocido por la constante de acoplamiento J y el acoplamiento espacial que se
manifiesta por el efecto NOE. Ambos esenciales en la interpretación de los
espectros. Éstos entregan mucha información cuando son moléculas pequeñas,
pero cuando se analizan proteínas, las señales se ensanchan producto del
movimiento de la molécula en solución acuosa por lo que en una dimensión,
resulta imposible poder interpretarlos. Por lo que en el análisis de moléculas
más complejas como proteínas es requisito indispensable la obtención de
espectros multidimensionales (del Río Portilla, 2003). Existe una gran variedad
de experimentos en dos dimensiones y tres dimensiones en los cuales se
correlacionan átomos de la misma especie como 1H (mononucleares) y también
átomos de distinta especie como 15N -1H, 1H-13C, 1H-15N-13C entre otras
combinaciones (heteronucleares).
Con respecto a los experimentos heteronucleares, estos consisten en
correlaciones entre núcleos distintos, en general se usa 1H, 15N y 13C. Cuando las
correlaciones se hacen a un enlace de distancia los experimentos se llaman HSQC
y HMQC, si son de dos o más enlaces de distancia se denominan experimentos
HMBC (del Río Portilla, 2003).
15
Con la información que entrega un experimento de RMN es posible
obtener acercamientos sobre el funcionamiento de las macromoléculas y
conocer la especificad de interacción entre proteínas en sistemas biológicos,
permitiendo generar nuevos compuestos capaces de actuar en blancos
específicos para el diseño de nuevas drogas, o estudiar el funcionamiento general
de las moléculas que dan forma y control a la vida.
16
2 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
La propuesta de este trabajo es expresar la enzima adenosina quinasa en
un medio de cultivo que solo posee una fuente de nitrógeno marcada
isotópicamente, para luego purificarla mediante cromatografía de afinidad y
cromatografía de exclusión. Una vez obtenida la enzima se realizarán
experimentos bidimensionales HSQC mediante Resonancia magnética nuclear
para poder analizar la interacción de esta enzima con algunos ligandos
específicos como adenosina y ATP.
2.1 Objetivo general Expresar en condiciones mínimas de cultivo, purificar y determinar si
existe interacción entre la enzima Adenosina quinasa con adenosina y ATP
mediante resonancia magnética nuclear HSQC-2D.
2.2 Objetivos específicos - Expresar la enzima clonada en Escherichia coli en un medio mínimo M9, que
contiene cloruro de amonio marcado con 15N como única fuente de nitrógeno en
el medio de cultivo.
- Purificación por cromatografía de afinidad y exclusión molecular en soluciones
tampón fosfato.
- Analizar la interacción entre la enzima y los ligandos mediante RMN-2D-HSQC
17
3 Metodología
3.1 Clonación cDNA de la enzima AK de ratón (Mus musculus) flanqueado por las
enzimas de restricción BamHI y HindIII fue clonada en vector pet 28a sumo,
transformada en E.coli DH5α para amplificar el plasmidio. Luego, se extrajo el
plasmidio recombinante y transformo en células competentes E. coli BL21 (DE3).
Proceso completo de clonación fue llevado a cabo previamente por el grupo del
Profesor Kleber Franchini (Renata de Oliveira y colaboradores).
3.2 Expresión Los transformantes fueron crecidos en placas de medio LB sólido con
kanamicina (50 µL/ml) y aquellas colonias aisladas resistentes fueron pre-
inoculadas en 5 ml de medio LB líquido con kanamicina (50 µL/ml) e incubadas
durante la noche a 37°C en agitación a 200 rpm. Luego, este pre-inóculo fue
transferido a 500 ml de medio mínimo M9 (Tabla I), este nuevo inoculo se dejó
incubando a 37°C con agitación a 200 rpm durante 5 horas. Cuando se alcanzó un
valor de OD600 ~ 0.7 se indujo la expresión de la proteína usando 1 M de
isopropil-β-D-tiogalactosido (IPTG) y se incubó por 5 horas más colectando cada
1 hora alícuotas para análisis de expresión. Las células fueron colectadas
mediante centrifugación en rotor F-10 a 8000 rpm por 12 minutos y
resuspendidas en solución A (10 mM fosfato [fosfato dibásico y fosfato
monobásico], 300 mM NaCl y 2 mM β-mercaptoetanol), se agregó 100 µg/ml de
lisozima e incubó por 20 minutos a 20° C. Tras ello se lizo las células mediante
sonicación en hielo por 2 ciclos de 2.5 minutos (10 segundos off- 10 segundos
on) y los restos celulares fueron eliminados mediante centrifugación a 18000
rpm por 40 minutos a 4°C en rotor Sorvall SS-34. Se analizó la fracción soluble e
insoluble mediante SDS-PAGE 12%.
18
Tabla I. Medio mínimo M9. Na2HPO4 6 g/L
Autoclavar 15 minutos juntos KH2PO4 3 g/L
NaCl 0,5 g/L 15NH4Cl 1 g/L Autoclavar 15 minutos por
separado MgSO4 * 7H2O 0,492 g/L
CaCl2 * 2H2O 0,294 mg/L
Tiamina * HCL 0,01 g/L Filtrar en millipore 0,22 µm
por separado Glucosa 2 g/L
Agua MilliQ -
3.3 Purificación La fracción soluble fue concentrada en Falcon Amicon (Amicon Ultra–15
10,000 MW, Millipore) en centrifuga a 4000 rpm en intervalos de 5 minutos.
Antes de eluir la fracción soluble en cromatografía de afinidad se probó la
unión de la cola de histidina de la proteína a la resina de agarosa NI-NTA
(QIAGEN), lavando 50 µl de resina con agua y luego con tampón A. Se incubó la
resina con el sobrenadante por 10 minutos a temperatura ambiente, se lavó 3
veces con tampón A. Finalmente se lavó tres veces con
Luego, se incubó en una columna de resina Ni-NTA de 5 ml(GE
Healthcare) que se encontraba preequilibrada con la solución A, se lavó la
columna con 3 volúmenes de solución A y se eluyó la proteína de interés
mediante una concentración creciente de solución B (10 mM fosfato, 300 mM
NaCl, 500 mM Imidazol y 2 mM β-mercaptoetanol ). Se colecto las fracciones que
contenían la proteína eluida se preparó un Gel SDS PAGE 12%. Se eluyó solo
aquellas fracciones con alto contenido de proteína y poca contaminación en una
columna de exclusión molecular de 330 ml (HiLoad 26/60 Superdex 200
prepgrade, GE Healthcare) previamente equilibrada con solución C (10 mM
Fosfato, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 7,4, filtrado en membrana de
0,22 µM). Las fracciones de proteína eluida fueron colectadas y se preparó un gel
SDS PAGE. Se analizó la concentración de la enzima en espectrofotómetro. Se
digirió las colas de histidina utilizando 10 µL de proteasa Sumo (63,2 mg/mL) e
incubando a temperatura ambiente con agitación suave por una hora. Tras ello
19
se agregó la muestra en una columna de exclusión molecular de 330 ml (HiLoad
26/60 Superdex 200 prepgrade, GE Healthcare) preequilibrada con solución C y
eluyó lentamente a 0,7 ml/min. Se colecto las fracciones de mayor absorbancia y
corrió un gel SDSPAGE 12%. Las fracciones que contenían proteína fueron
concentradas (Amicon Ultra–15 10,000 MW, Millipore) a 4000 rpm en intervalos
de 5 minutos a 4°C. Para calcular la concentración utilizando la ley de Lambert
Beer, Se midió en espectrofotómetro la absorbancia a 280 nm y se obtuvo el
coeficiente de extinción molar del sitio ExPASy (www.expasy.org).
3.4 Análisis RMN La alícuota a medir fue mezclada con 10 % de agua deuterada y montada
en un tubo shigemi. Se midió los espectros de RMN en un espectrómetro Varian
Innova de 600 MHz a 20°C con el programa VnmrJ. El análisis de los espectros
fue realizado con el programa NMRview.
20
4 RESULTADOS
4.1 Expresión La expresión de la enzima recombinante en la bacteria E. coli fue
monitoreada antes y después de la inducción con IPTG durante un periodo de 24
horas (Figura 1).
De acuerdo con la figura 1, a las 5 horas de incubación en presencia del inductor
(carril 11) se observa mayor expresión de proteína que se mantiene soluble en el
sobrenadante, en comparación con los demás carriles. La incubación de la
proteína por un tiempo mayor a 24 horas con el inductor genera proteína
insoluble que se acumula en el pellet. Considerando estos datos es que los
procedimientos de inducción de la expresión desarrollados a continuación,
fueron incubados sólo por 5 horas a 37ºC con agitación constante de 200 rpm.
4.2 Purificación Además, se confirmó que la cola de histidina fusionada a la proteína se adhiere a
la resina de agarosa NI-NTA (QIAGEN) al analizar el gel SDS PAGE de la Figura 2
correspondiente a muestras colectadas durante la prueba de adhesión.
Figura 1. Prueba de inducción. Gel SDS PAGE 12% de las fracciones colectadas antes y después de inducir con IPTG la expresión de la enzima AK. Carril M, marcador LBM; Carril 1, No inducido soluble; Carril 2, No inducido pellet; Carril 3, inducido 1 hora soluble; Carril 4, inducido 1 hora pellet; Carril 5, 2 horas soluble; Carril 6, 2 horas pellet; Carril 7, 3 horas soluble; Carril 8, 3 horas pellet; Carril 9, 4 horas soluble; Carril 10, 4 horas pellet; Carril 11, 5 horas soluble; Carril 12, 5 horas pellet; Carril 13, 24 horas soluble, Carril 14, 24 horas pellet.
21
De la figura anterior es posible observar en el carril 1 una banda de
aproximadamente 57 KDa que correspondería a la proteína unida a la resina,
luego en el carril 2 aparece la misma banda luego de lavar con el tampón A, de
acuerdo con ello la proteína se mantendría unida a la resina. Pero al observar el
carril 3 y 4 que corresponden a la resina tras ser lavada con tampón B, se
observa una disminución de la intensidad de la banda, fenómeno que
corresponde a que producto con los lavados con el tampón B que posee alta
concentración de imidazol, la proteína se suelta de la resina. Con esto se
confirma que la proteína expresada en medio mínimo es adherida y eluida
correctamente con tampones fosfato A y B en columnas de afinidad NI-NTA.
En la cromatografía de afinidad se eluyó las fracciones solubles del lisado, en el
que la proteína tuvo un pico de elución en torno a un 30% de concentración del
tampón B (Figura 3). Las fracciones con mayor valor de absorbancia fueron
analizadas por SDS PAGE 12% (Figura 4).
Figura 3. Espectro obtenido en cromatografía de afinidad en columna His trap 5ml para la enzima adenosina quinasa. Línea azul, Valor de UV; Línea verde, valor de concentración de tampón B, Línea naranja, cantidad de flujo; Segmentos rojos, fracciones colectadas.
Figura 2. Prueba de adhesión de la proteína fusionada a una cola de histidina con la resina de agarosa NI-NTA. Carril M, Marcador LBM; Carril 1, Resina incubada con sobrenadante del lisado; Carril 2, Resina lavada 3 veces con tampón A; Carril 3, Resina lavada 1 vez con tampón B; Carril 4, Resina lavada 2 veces con tampón B.
22
Basándose en la información entregada por el gel de la Figura 4, se procedió a
concentrar aquellas fracciones que contenían mayor cantidad de proteína y poca
contaminación. Entonces, se concentró en falcon Amicon de la fracción 15 a la 21.
Obteniéndose aproximadamente 10 ml de muestra que se aplicaron en la
columna de cromatografía de exclusión molecular. Se eluyó las fracciones por
aproximadamente 3 horas con tampón C y se obtuvo el espectro que se muestra
en la Figura 5, el cual presenta un único pico de alta intensidad de 800 mAU en
torno a los 200 ml colectados entre las fracciones 30 a la 37.
Figura 5. Espectro de cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 26/60 200 pg. Línea azul, Valor de UV; Línea verde, valor de concentración de tampón B; Segmentos rojos, fracciones colectadas
Figura 4. SDS PAGE 12% de las fracciones eluidas con mayor absorbancia en cromatografía de afinidad. Carril M, marcador; Carril FT, descarte (flow through); Carril 7 al 21, corresponde a número de la fracción eluida.
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Figura 7. Análisis SDS PAGE 12% para la digestión de la cola de histidina al incubar con proteasa sumo. Carril M, Marcador LBM; Carril 1, Bandas generadas por digestión, correspondientes a enzima AK (superior) y a cola de histidina (inferior).
Las fracciones que contenían la proteína identificada fueron sometidas a análisis
de SDS PAGE 12% (Figura 6), en el que se puede observar un alto grado de
pureza en las mismas.
Se concentró de la fracción 31 a la 36 hasta aproximadamente 10 ml. Luego, para
eliminar la cola de histidina unida a la enzima se incubó esta muestra purificada
con proteasa sumo. Se evaluó la eficiencia de la digestión mediante un análisis de
SDS PAGE 12% (Figura 7).
De acuerdo con la Figura 7, se observa que la eficiencia de la proteasa es de un
99% debido a que no se observan rastros de la proteina ligada a la cola de
histidina (57,1 KDa).
Se determino por moviliddad relativa de las bandas de la Figura 6 y 7 el peso de
las proteinas analizadas (Tabla II – Graficos en el anexo).
Figura 6. SDS PAGE 12% de las fracciones eluidas por cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 16/60 200 pg.
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Tabla II. Peso molecular aproximado según movilidad relativa de las bandas. Enzima adenosina quinasa Peso molecular
Con cola de histidina 57,1 KDa
Sin cola de histidina 44,8 KDa
Luego, para separar el fragmento correspondiente a la cola de histidina de la
enzima AK se procedió a eluir la muestra en cromatografia de exclusion
molecular (Figura 8) a una tasa de 0,7 ml/min para conseguir una buena
separación.
Figura 8. Espectro obtenido por cromatografía de exclusión molecular en columna Superdex 26/60 200 pg. con flujo lento para separar la cola de histidina de la enzima adenosina quinasa tras digestión con proteasa sumo. Finalmente, se concentró hasta 1 ml las fracciones de mayor absorbancia, las
cuales corresponden a la enzima sin cola de histidina (eluidas a los 200 ml).
4.3.- RMN
En tubos shigemi se agregó 320 ul de enzima AK y 30 µl de agua deuterada. Esta
última permite calibrar los espectros para realizar las mediciones en el equipo.
Se aplicó para cada muestra de la Tabla III un experimento de TROSY/HSQC,
obteniéndose los espectros que se muestran a continuación.
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Tabla III. Titulación para la enzima adenosina quinasa y un sustrato específico mediante RMN TROSY/HSQC.
Figura 9. Espectro de RMN TROSY/HSQC de la enzima adenosina quinasa a una concentración de 0,17 mM. Cada señal en el espectro de la Figura 9 corresponde a un amino ácido visible por
esta técnica. Existen partes de la proteína que no son observables debido a su
tamaño y a segmentos que son altamente inestables. Dada la presencia de
señales definidas que representan aminoácidos con densidades electrónicas
diferentes entre sí, se deduce que la enzima esta plegada, de lo contrario todos
los aminoácidos estarían en contacto con el tampón y presentarían
Adenosina Quinasa (AK) Proporción ATP
0,17 mM 1 : 0 0 mM
0,17 Mm 1: 0,05 0,0085 mM
0,17 mM 1 : 0,5 0,085 mM
0,17 mM 1: 1 0,17 mM
26
homogeneidad del entorno, por lo que aparecerían señales en un valor estrecho
del espectro.
Cuando se agregó una concentración pequeña de ATP de 0.0085 mM, se observó
que no hay diferencias en el espectro de la enzima cuando se encuentra sola, esto
los espectros se sobreponen. Lo que indica que no hay interacción a esa
concentración (Figura 10-señal roja).
Pero cuando la cantidad de ATP aumento de una proporción de 0.0085 mM a
0,085 mM se observan cambios en el corrimiento químico en varios puntos del
espectro (Figura 10 – señal verde). Finalmente cuando se agregó ATP en una
proporción 1:1, el espectro presentó un patrón similar al anterior, solo en
determinados puntos hubo diferencias (Figura 10- señal azul).
Figura 10. Espectro de RMN TROSY/HSQC de la enzima adenosina quinasa Enzima sola (0,17 mM – señal negra) y espectros generados por la interacción de AK + ATP a diferentes concentraciones (0.0085 mM- señal roja, 0.085 mM- señal verde, 0,17 mM- señal azul).
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Se generaron acercamientos de la Figura 10, para visualizar con mayor detalle
los desplazamientos en el corrimiento químico (Figura 11, A-B-C-D).
Figura 11. Acercamiento del espectro de la Figura 10 en puntos donde se observó desplazamiento del corriente químico. En este acercamiento es posible determinar cómo las señales sufren
desplazamientos en el corrimiento químico producto de la interacción con el
sustrato. Para el patrón del espectro rojo se observa que se solapa sobre el
espectro negro, no hay cambios en el patrón. Pero muy distinto es cuando se
observa el patrón del espectro verde y el azul los cuales se encuentran
desplazados. Interesante resulta al analizar el espectro azul, el cual se mantiene
con el mismo patrón que el verde, esto último podría deberse a que la estructura
se estabiliza a esas concentraciones o concentraciones cercanas.
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Luego, se evaluó las variaciones en el espectro de la enzima adenosina quinasa
sola cuando se agrega adenosina en el medio. Para ello se preparó muestras con
las características que se muestran en la Tabla IV. Tabla IV. Titulación para la enzima adenosina quinasa y su sustrato específico adenosina mediante RMN TROSY/HSQC.
Finalmente se analizó puntos específicos en los que la señal cambiaba al agregar
ATP o adenosina. Se observó que algunos cambios en el espectro son solo
generados por ATP y otros solo por adenosina. Sin embargo, también estos
cambios no se producen en las mismas señales del espectro. Además para el caso
en el que se agregó ATP a la solución con enzima se observó que aparecen
nuevas señales (Figura 12).
Adenosina Quinasa (AK) Proporción Adenosina
0.17 mM 1 : 0 0 mM
0.17 Mm 1: 0.006 0.001 mM
0.17 mM 1 : 0.03 0.005 mM
0.17 mM 1: 0.05 0.008 mM
0.17 mM 1: 0.5 0.085 mM
0.17 mM 1:1 0,17 mM
0.17 mM 1:4 0,68 mM
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Figura 12. Comparación del desplazamiento en el corrimiento químico de los espectros de RMN. TORSY/HSQC de la enzima adenosina quinasa cuando se encuentra en presencia de ATP (Izquierda, espectro negro 0,17 mM AK, espectro rojo 0,17 mM AK + 0,0085 ATP, espectro azul 0,17 Mm + 0,085 mM ATP) o de adenosina (derecha, espectro negro AK 0,17 mM, espectro rojo AK 0,17 mM + 0,17 mM adenosina, espectro azul AK 0,17 mM + 0,68 mM adenosina).
En estos espectros es posible visualizar el efecto de desplazamiento en el
corrimiento químico con uno u otro sustrato, lo que permite proponer que la
interacción no se da con los mismos aminoácidos porque el corrimiento no es
igual en ambos espectros.
Por último se evaluó el cambio en el espectro de la enzima adenosina quinasa en
presencia de ambos sustratos. Se obtuvo como se muestra en la figura 13, que la
hay desplazamiento del espectro con sustratos de aquel que solo tiene la enzima.
Además si se compara con el espectro de la figura 10 se observa que muchas
señales presentan los mismos desplazamientos pero algunos puntos de señal
desaparecen.
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Figura 13. Espectro de interacción entre adenosina quinasa y sus sustratos específicos:
adenosina y ATP. Espectro negro, Adenosina quinasa (0,17mM); Espectro rojo, 0,17mM Adenosina quinasa + 0,68 mM adenosina + 0,0085 mM ATP.
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5 DISCUCIÓN Y CONCLUSIÓN
La enzima adenosina quinasa fue expresada en medio mínimo M9, el cual posee
como fuente única de nitrógeno que corresponde al cloruro de amonio marcado
isotópicamente. En las condiciones en que se expresó la proteína fue posible
obtener la enzima uniformemente marcada y plegada, en un alto rendimiento,
suficiente para realizar experimentos de RMN (8 -9 mg/ml). Con respecto a la
digestión de la cola de histidina se utilizó la tecnología de la proteasa Sumo, con
la que se obtuvo resultados con alta eficiencia (cercanos al 99%).
En cuanto a los pasos de purificación debió cambiarse el tampón TRIS que se
conoce permite mantener la proteína estable por más de 30 días a 4ºC. En este
caso se utilizó el tampón fosfato, que de acuerdo a lo que se observó permitió
purificar la proteína por cromatografía de afinidad y por cromatografía de
exclusión molecular. Sin embargo, esta proteína precipitó rápidamente cuando
se mantuvo a temperaturas superior a 4ºC o se sometió a concentraciones
crecientes de sustratos.
Con respecto a los espectros obtenidos por RMN en experimentos de
TROSY/HSQC pudo observarse que la proteína muestra señales definidas para
cada aminoácido visible, donde cada uno tiene diferentes valores de corrimiento
químico por lo que se propone que la proteína se encuentra plegada. Al analizar
el patrón de los espectros cuando se agregó algunos de los sustratos específicos,
se observó cambios en determinadas zonas del espectro de corrimiento químico.
Específicamente estos cambios mostraron que la enzima interactúa con ATP a
concentraciones menores de las necesarias para interactuar con adenosina.
Según la literatura (Fisher y Newsholme, 1984), la proporción debería ser inversa
para poder observar actividad.
Al analizar los espectros se observa que cuando se agrega ATP en una
proporción de 1: 0.05, el espectro se sobrepone al espectro de la enzima sin
sustrato, por lo que se deduce que no hay interacción en dicha proporción. Pero
cuando se agregó una concentración 10 veces mayor de ATP el espectro cambio
en determinadas señales. Este cambio se produce por que la enzima está
interactuando con el sustrato en determinados puntos, lo que provoca un cambio
en la densidad electrónica de los núcleos de los átomos involucrados en dicha
32
interacción. Producto de ello al dar el pulso transversal la frecuencia con que
resuena cada átomo es diferente al espectro inicial sin sustrato, lo que se traduce
en un desplazamiento en el corrimiento químico. Lo que resulta interesante
también es que cuando se agrega enzima y ATP en la misma proporción el
patrón es sobrepuesto con el patrón obtenido en la proporción 1:0.5, de ello es
posible deducir que la enzima interactúa con ATP hasta determinada
concentración y cuando esta aumenta no hay cambios en la estructura de la
enzima, es decir, la estructura se estabiliza. Cuando esto sucede pueden aparecer
señales que no se observaban en el espectro captado sin sustratos, esto se debe a
que cuando el sustrato interactúa con la estructura de la enzima, este estabiliza
cadenas que son altamente móviles que no son captadas por la técnica de RMN.
Interesantemente cuando se comparan los espectros generados por uno u otro
sustrato. Se observó cambios puntuales en señales del espectro que son sólo
generados por ATP y otros sólo por adenosina. Considerando lo anterior es que
podría proponerse que estos interactúan en sitios distinto en la molécula dado
que provocan cambios en el corrimiento químico de aminoácidos distintos.
Finalmente se analizó los cambios en el espectro cuando se agregaba los
sustratos en las concentraciones se había observado generaban cambios. Se
obtuvo que los desplazamientos del espectro no son muy distintos a los
observados con cada uno de los sustratos por separado, pero si mucha señales
desaparecen. Seria interesante evaluar los cambios en el espectro cuando ambos
sustratos están presentes pero variando la concentración de cada uno de ellos
hasta encontrar aquella donde se produce mayor interacción. Lo difícil de ello es
que esta enzima es poco estable y es inhibida a determinadas concentración de
sustrato.
Este proyecto corresponde solo a estudios preliminares, dado que se proyecta
realizar análisis más profundos de la enzima con adenosina sola, con adenosina y
ATP juntos. Una vez determinada la interacción con sustratos específicos, se
probará con fármacos. Se espera conseguir mayor resolución en campos
mayores (800 MHz) marcando la proteína con deuterio. Además, se buscará
identificar los aminoácidos involucrados en la interacción marcando la proteína
con 15N y 13C.
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6 REFERENCIAS
Chary y Govil. 2008. NMR in biological systems: from molecules to human. Springer Verlag. Decking, Schlieper, Kroll y Schrader. 1997. Hypoxia-induced inhibition of adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release. Circulation research. 81: 154 Decking, Schlieper, Kroll y Schrader. 1997. Hypoxia-induced inhibition of adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release. Circulation research. 81: 154. del Río Portilla. 2003. Determinación de la estructura de proteínas por resonancia magnética nuclear. Mensaje Bioquímico. 27: 65-83. Gouder, Scheurer, Fritschy y Boison. 2004. Overexpression of adenosine kinase in epileptic hippocampus contributes to epileptogenesis. Journal of Neuroscience. 24: 692. Berg,J.M; Stryer,L y Tymoczkc,J. (2008). Investigación en proteínas y proteomas en Bioquímica (6 Ed.) Pág. 93-103. Nueva York, EUA: Reverte. Mathews, Erion y Ealick. 1998. Structure of Human Adenosine Kinase at 1.5 A Resolution†,‡. Biochemistry. 37: 15607-15620. Ochsenbien y Gilquin. 2007. La RMN pour comprendre les protéines. Clefs CEA. 52-55. Park y Gupta. 2008. Adenosine kinase and ribokinase–the RK family of proteins. Cellular and molecular life sciences. 65: 2875-2896. SUMOPRO™TECHNOLOGY. Novel methods for rapid recombinant peptide expression and purification. Publicación on line visitada día 20 de febrero 2011. http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Tag_Protein_Purification/SUMO/LifeSensors_SUMO_Pept.pdf
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ANEXOS
6.1 Análisis de movilidad relativa de las bandas A) Movilidad relativa de las bandas en Figura 6 en la enzima adenosina quinasa unida a la
cola de histidina.
Gráfico 1. Relación logaritmo del peso molecular en función de la movilidad relativa de las bandas de la enzima unida a la cola de histidina.
B) Movilidad relativa de las bandas en Figura 7
Gráfico 2. Relación logaritmo del peso molecular en función de la movilidad relativa de las bandas de la enzima tras digestión con sumo proteasa.
