In the current work, we scaled up the production of pectinase by A. niger CH4 from 12 g of dry wheat bran in a column bioreactor to 30 kg of dry substrate (of which 27 kg was wheat bran) in a pilot-scale packed-bed bioreactor. This is the largest scale at which pectinase production by SSF has been studied to date (Table 2). Other pilot-scale studies have used smaller substrate loadings.

Dalam pekerjaan saat ini, kami ditingkatkan produksi pektinase oleh A. niger CH4 dari 12 g dedak gandum kering dalam bioreaktor kolom 30 kg substrat kering (yang 27 kg itu dedak gandum) dalam packed-bed skala pilot bioreaktor. Ini adalah skala terbesar di mana produksi pektinase oleh SSF telah dipelajari untuk saat ini (Tabel 2). Studi skala pilot lain telah menggunakan beban substrat kecil.

Unfortunately, it is not possible to compare the pectinase activities that we obtained with other results in the literature, since different authors use quite different reaction conditions and assay times [14]. We chose a relatively long assay time, in order to minimize the effect of the early deceleration that occurs in the hydrolysis profile [14], and a low temperature, in order to avoid denaturation; this combination means that our measured activities are much lower than those obtained by authors who have used shorter reaction times and higher temperatures [14]. Even though it is not meaningful to compare production levels, it is notable that we achieved maximum pectinase activities in quite short fermentation times, of 10 to 24 h. Fermentation times reported for pilot-scale production of pectinases in the literature are much longer, ranging from 68 to 96 h (Table 2).

Sayangnya, tidak mungkin untuk membandingkan aktivitas pektinase yang kita diperoleh dengan hasil lain dalam literatur, karena penulis yang berbeda menggunakan kondisi reaksi yang sangat berbeda dan uji kali [14]. Kami memilih waktu uji relatif lama, untuk meminimalkan efek dari perlambatan awal yang terjadi pada profil hidrolisis [14], dan suhu rendah, untuk menghindari denaturasi; Kombinasi ini berarti bahwa kegiatan kami diukur jauh lebih rendah dari yang diperoleh oleh penulis yang telah menggunakan waktu reaksi yang lebih pendek dan suhu yang lebih tinggi [14]. Meskipun tidak bermakna untuk membandingkan tingkat produksi, perlu dicatat bahwa kita mencapai kegiatan pektinase maksimal dalam waktu fermentasi cukup singkat, dari 10 sampai 24 jam. waktu fermentasi untuk produksi skala pilot pectinases dalam literatur yang lebih lama, mulai 68-96 jam (Tabel 2).

Our work represents the only study of the pilot-scale production of pectinases in which samples have been removed from several different locations within the bed in order to evaluate the spatial uniformity of activity levels. Activity levels varied significantly when compaction occurred (from 11 to 28×103 U kg-1 in the third pilot fermentation and from 15 to 26 in the fourth pilot fermentation). In the second pilot fermentation, for which compaction of the bed did not occur, activity levels were more uniform throughout the bed (17 to 20×103 U kg-1). Interestingly, the moisture contents measured in the bed for this fermentation confirmed the prediction of the two-phase model of packed-bed operation developed by von Meien and Mitchell [19] that the inner regions of the bed would dry more quickly than the upper regions and the regions very near to the base.

Pekerjaan kami merupakan satu-satunya studi tentang produksi skala pilot pectinases di mana sampel telah dihapus dari beberapa lokasi yang berbeda dalam tbed untuk mengevaluasi keseragaman spasial tingkat aktivitas. Tingkat aktivitas bervariasi secara signifikan ketika pemadatan terjadi (11-28 × 103 U

kg-1 di fermentasi percontohan ketiga dan 15-26 dalam fermentasi percontohan keempat). Dalam pilot fermentasi kedua, yang pemadatan bed tidak terjadi, tingkat aktivitas yang lebih seragam di seluruh bed (17-20 × 103 U kg-1). Menariknya, isi kelembaban diukur dalam bed untuk fermentasi ini menegaskan prediksi dari model dua-tahap operasi packed bed yang dikembangkan oleh von Meien dan Mitchell [19] bahwa daerah bagian dari bed akan kering lebih cepat dari pada daerah atas dan daerah sangat dekat dengan pangkalan.

On the basis of our results, we propose a strategy for scaling up of pectinase production by SSF to commercial scale, using a mixture of 90% wheat bran and 10% sugarcane bagasse: a bed height of 40 cm should be maintained, with the scale of production being increased by increasing the diameter of the bioreactor and maintaining the superficial air velocity at 0.1 m s-1. As with our fourth pilot-scale fermentation, the temperature of the inlet air should be controlled, with cooler air being supplied when the bed temperature rises above 35°C. The process would be similar to koji production in the soy sauce industry, where the bioreactors have diameters of up to 12 m and bed heights of around 20 cm [20]. With this strategy, if the fermentation is harvested at 10 h, then the results of the fourth pilot-scale fermentation suggest that it is possible to avoid the problems with bed compaction that occur later in the fermentation and that a pectinase productivity of 1840 U kg-1 h-1 can be obtained.

Atas dasar hasil kami, kami mengusulkan strategi untuk scaling up produksi pektinase oleh SSF untuk skala komersial, menggunakan campuran 90% dedak gandum dan 10% ampas tebu: ketinggian bed 40 cm harus dipertahankan, dengan skala produksi yang meningkat dengan meningkatkan diameter bioreaktor dan mempertahankan kecepatan udara superfisial pada 0,1 m s-1. Seperti fermentasi skala pilot keempat kami, suhu udara masuk harus dikontrol, dengan udara dingin yang disediakan ketika suhu naik di atas bed 35 ° C. Proses ini akan sama dengan produksi koji dalam industri kecap, di mana bioreaktor memiliki diameter hingga 12 m dan ketinggian bed sekitar 20 cm [20]. Dengan strategi ini, jika fermentasi dipanen pada 10 h, maka hasil fermentasi skala pilot keempat menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk menghindari masalah dengan pemadatan bed yang terjadi kemudian di fermentasi dan produktivitas pektinase dari 1840 U kg -1 h-1 dapat diperoleh.

Previous pilot-scale studies of the production of pectinases by SSF have not provided the basis for clear scale-up strategies (Table 2). For example, although Huerta et al. [11] claimed that the use of sugarcane bagasse avoided the problems of heat transfer that are usually encountered in packed-bed bioreactors, they did not provide any experimental temperature measurements to support this claim. Additionally, they did not specify the bed height that was used. In the case of the work of He and Chen et al. [12], the question of scale up was not addressed. However, since their bioreactor is a tray-type system, albeit with pressure pulsations inside the tray chamber, the implicit scale-up rule would be to build a larger reactor with more trays. However, their bioreactor has a low volumetric loading capacity, with 15 kg of dry solids per 800 L of bioreactor volume. In our case, at 40 cm bed height, our bioreactor uses 27 kg of dry wheat bran (and 3 kg of dry sugarcane bagasse) for a total volume of 400 L, namely a 200 L working volume plus 200 L headspace.

Studi skala pilot sebelumnya produksi pectinases oleh SSF belum memberikan dasar bagi strategi skala-up yang jelas (Tabel 2). Sebagai contoh, meskipun Huerta dkk. [11] menyatakan bahwa penggunaan ampas tebu menghindari masalah perpindahan panas yang biasanya dihadapi dalam packed-bed bioreaktor, mereka tidak memberikan pengukuran suhu eksperimental untuk mendukung klaim ini. Selain itu, mereka tidak menentukan tinggi yang digunakan. Dalam kasus pekerjaan Dia dan Chen et al.

[12], pertanyaan skala up tidak dibahas. Namun, karena bioreaktor mereka adalah sistemjenis tray, meskipun dengan tekanan denyutan di dalam ruang nampan, aturan skala-up implisit akan membangun reaktor yang lebih besar dengan lebih nampan. Namun, bioreaktor mereka memiliki kapasitas memuat volumetrik rendah, dengan 15 kg padatan kering per 800 L volume bioreaktor. Dalam kasus kami, pada 40 cm tinggi bed, bioreaktor kami menggunakan 27 kg dedak gandum kering (dan 3 kg ampas tebu kering) untuk total volume 400 L, yaitu 200 L volume kerja ditambah 200 L headspace.

Only Rodríguez-Fernández et al. [21] have suggested a strategy for the scale up of pectinase production by SSF. On the basis of experiments undertaken with 0.8 kg of dry substrate at four different aeration rates in a horizontal cylinder, they suggested that it would be sufficient to maintain the air flow (L min-1) per kg of solid constant during scale up. It should be noted that no mention was made of the bed being agitated during the fermentation, so presumably the bed was static, and therefore it is questionable as to whether their scale-up strategy would work. Due to the circular cross section of the bioreactor, the bed height, and therefore the resistance to air flow, varies across the bed. Consequently, the air would tend to flow preferentially through the regions of lesser height. This would lead to serious overheating problems in the thicker regions of the bed if such a bioreactor were operated with several tonnes of substrate.

Hanya Rodríguez-Fernández dkk. [21] telah menyarankan strategi untuk skala up produksi pektinase oleh SSF. Atas dasar percobaan dilakukan dengan 0,8 kg substrat kering pada empat tingkat aerasi yang berbeda dalam silinder horisontal, mereka menyarankan bahwa itu akan cukup untuk mempertahankan aliran udara (L min-1) per kg konstan padat selama skala up. Perlu dicatat bahwa tidak disebutkan terbuat dari bed yang rawan (agitated) selama fermentasi, sehingga bed adalah statis, dan oleh karena itu dipertanyakan apakah strategi skala-up mereka akan bekerja. Karena penampang melingkar dari bioreaktor, bed tinggi, dan karena itu resistensi terhadap aliran udara, bervariasi di bed. Akibatnya, udara akan cenderung mengalir melalui daerah ketinggian yang lebih rendah. Hal ini akan menyebabkan masalah overheating yang serius di daerah tebal dari bed jika bioreaktor seperti yang dioperasikan dengan beberapa ton substrat.

Although workable scale-up strategies have not been proposed previously for the production of pectinases, various modeling and optimization studies have been done with the intention of guiding the scale up of SSF processes in packed-bed bioreactors [19,22,23]. However, although these models give insights into the performance of packed-bed bioreactors, they are of limited usefulness for guiding the scale up of processes involving specific microorganism/substrate combinations. This is due to a lack of knowledge with respect to heat and mass transfer in packed-bed bioreactors and growth kinetics of microorganisms in SSF, as discussed in the following paragraphs.

Meskipun strategi skala-up yang bisa diterapkan belum diusulkan sebelumnya untuk produksi pectinases, berbagai model dan optimasi penelitian telah dilakukan dengan maksud membimbing skala up proses SSF di packed-bed bioreaktor [19,22,23]. Namun, meskipun model ini memberikan wawasan ke dalam kinerja packed=bed bioreaktor, kegunaan terbatas untuk membimbing skala up dari proses

yang melibatkan kombinasi mikroorganisme / substrat tertentu. Hal ini disebabkan kurangnya pengetahuan terhadap perpindahan panas dan perpindahan massa di packed-bed bioreaktor dan kinetika pertumbuhan mikroorganisme di SSF, seperti yang dibahas dalam paragraf berikut.

Firstly, with respect to heat and mass transfer in packed beds, although the general principles are well established, in SSF processes the properties of the bed of solids in the bioreactor change significantly during growth of the microorganism. For example, the growth of aerial hyphae of fungi into the interparticle spaces and the reduction of particle size affect the bed porosity in a complex manner, while the presence of biomass in the solid affects the isotherm of the solids [24,25]. Some efforts have been made to characterize these phenomena, but they are quite specific for organism and substrate. For example, the void fraction did not change significantly during the growth of Myceliophthora thermophila on a 3:7 mixture of wheat bran and sugarcane bagasse, but it increased from 0.52 to 0.76 during the growth of A. niger on wheat bran [26,27].

Pertama, sehubungan dengan panas dan perpindahan massa di bed penuh, meskipun prinsip-prinsip umum yang terpancang, di SSF memproses properti dari bed padatan dalam perubahan bioreaktor secara signifikan selama pertumbuhan mikroorganisme. Misalnya, pertumbuhan hifa aerial jamur ke dalam ruang interparticle dan pengurangan ukuran partikel mempengaruh porositas bed secara kompleks, sementara kehadiran biomassa dalam padat mempengaruhi isoterm dari padatan [24,25]. Beberapa upaya telah dilakukan untuk mengkarakterisasi fenomena ini, tetapi mereka cukup spesifik untuk organisme dan substrat. Misalnya, fraksi kekosongan tidak berubah secara signifikan selama pertumbuhan Myceliophthora thermophila pada 3: 7 campuran dedak gandum dan ampas tebu, tetapi meningkat 0,52-0,76 selama pertumbuhan A. niger pada dedak gandum [26,27 ].

Secondly, with respect to the growth kinetics of microorganisms in SSF, the key variables that affect growth change in a complex manner during the process. There can be significant variations in the temperature and the water activity of the solid [28]. Additionally, there are complex patterns of induction of enzymes for hydrolyzing the range of polymeric substrates present within the solid particle and the concentrations of soluble hydrolysis products and O2 vary significantly [29,30]. It would be too complicated to try to describe all these phenomena mechanistically within bioreactor models and, as a result, these models use simple empirical equations to describe the growth kinetics [31]. These empirical equations can be fitted to specific results, but often fail to make accurate predictions for new situations.

Kedua, sehubungan dengan kinetika pertumbuhan mikroorganisme di SSF, variabel kunci yang mempengaruhi perubahan pertumbuhan secara kompleks selama proses tersebut. Ada variasi yang signifikan dalam suhu dan aktivitas air padat [28]. Selain itu, ada pola yang kompleks induksi enzim untuk hidrolisis berbagai substrat polimer hadir dalam partikel padat dan konsentrasi produk hidrolisis larut dan O2 bervariasi secara signifikan [29,30]. Ini akan menjadi terlalu rumit untuk mencoba menjelaskan semua fenomena ini secara mekanis dalam model bioreaktor dan, sebagai hasilnya, model ini menggunakan persamaan empiris sederhana untuk menggambarkan kinetika pertumbuhan [31]. Persamaan-persamaan empiris dapat dipasang untuk hasil yang spesifik, tetapi sering gagal untuk membuat prediksi yang akurat untuk situasi baru.

Given these limitations of bioreactor models, it is necessary to use simpler scale-up strategies. In fact, in the current work, we have followed a strategy that we proposed almost a decade ago, namely that the pilot-scale bioreactor should use bed heights that would be used in commercial scale bioreactors, thereby enabling study of phenomena that depend on bed height [32]. By maintaining the superficial velocity of the air constant, the axial temperature profile and the pressure drop through the bed at commercial scale should be similar to those we obtained in the current pilot-scale experiments.

Mengingat keterbatasan model bioreaktor ini, perlu untuk menggunakan strategi skala-up sederhana. Bahkan, dalam pekerjaan saat ini, kami telah mengikuti strategi yang kami usulkan hampir satu dekade yang lalu, yaitu bahwa bioreaktor skala pilot harus menggunakan ketinggian bed yang akan digunakan dalam bioreaktor skala komersial, sehingga memungkinkan studi tentang fenomena yang bergantung pada bed tinggi [32]. Dengan mempertahankan kecepatan superfisial konstan udara, profil temperatur aksial dan penurunan tekanan melalui bed pada skala komersial harus sama dengan yang kami diperoleh dalam percobaan skala pilot saat ini.