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Facoltà di Medicina Veterinaria
Dottorato di Ricerca in Medicina Veterinaria
Sviluppo e differenziamento di casta in Apis mellifera:
un approccio proteomico
Candidata Relatore
Barbara Baldacci Antonio Felicioli
a Eleonora e Giampiero
Sommario
Riassunto ......................................................................................................................................... 1
Abstract ........................................................................................................................................... 3
INTRODUZIONE ................................................................................................................................... 5
Il polifenismo ................................................................................................................................... 6
Polifenismo stagionale ................................................................................................................ 6
Polifenismo cannibalesco ............................................................................................................ 7
Polifenismo determinato dal predatore ..................................................................................... 8
Polifenismo di casta .................................................................................................................... 9
Termiti ..................................................................................................................................... 9
Vespe ..................................................................................................................................... 11
Formiche ............................................................................................................................... 13
Polifenismo di casta negli Apoidea ........................................................................................... 14
Polifenismo in Apis mellifera L. ............................................................................................. 16
Genoma e polifenismo in Apis mellifera ....................................................................................... 23
Le proteasi ..................................................................................................................................... 27
Possibili ruoli delle proteasi negli insetti .................................................................................. 29
La scelta della proteomica ............................................................................................................ 32
MATERIALI E METODI ....................................................................................................................... 34
Il campione sperimentale .............................................................................................................. 35
Estrazione delle proteine .............................................................................................................. 35
Quantificazione proteica ............................................................................................................... 36
SDS‐PAGE ...................................................................................................................................... 36
Zimografia monodimensionale ..................................................................................................... 37
Elettroforesi bidimensionale ......................................................................................................... 38
Zimografia bidimensionale ............................................................................................................ 39
Colorazione dei gel ........................................................................................................................ 40
Western blotting ........................................................................................................................... 40
Immunorivelazione ....................................................................................................................... 41
Analisi d’immagine ........................................................................................................................ 42
RISULTATI E DISCUSSIONE ................................................................................................................ 44
Zimografia dell’estratto grezzo di larve differenziate di regina e operaia .................................... 45
Studio dell’attività proteolitica durante lo sviluppo delle larve di operaia .................................. 47
Localizzazione dell’attività proteolitica nella larva di operaia ...................................................... 50
Attività proteolitica in gelatina reale, polline e larva di operaia ................................................... 52
Attività proteolitica della larva di operaia su diversi substrati proteici ........................................ 53
Polline e induzione dell’attività proteolitica ................................................................................. 55
Gelatina reale e inibizione dell’attività proteolitica ...................................................................... 57
Studio dell’attività proteolitica delle larve di operaia in funzione del pH .................................... 59
Studio della termostabilità dell’attività proteolitica nelle larve di operaia del quinto stadio larvale ............................................................................................................................................ 60
Effetto degli inibitori di proteasi su PS4 ........................................................................................ 63
Zimografia bidimensionale dell’estratto proteico di larva di operaia del quinto stadio larvale ... 65
Zimografia bidimensionale del tratto gastrointestinale di larva di operaia del quinto stadio ..... 67
Comparazione tra la zimografia bidimensionale e la 2D‐PAGE di operaia del quinto stadio larvale ............................................................................................................................................ 68
Struttura e funzioni della nucleoplasmina .................................................................................... 70
Nucleoplasmina e PS4 nel differenziamento in Apis mellifera ..................................................... 79
Comparazione delle 2D‐PAGE di larve di operaia e regina del quinto stadio larvale ................... 80
Western blotting della 2D‐PAGE di larve di operaia del quinto stadio larvale ............................. 82
Western blotting della 2D‐PAGE di larve di regina del quinto stadio larvale ............................... 83
CONCLUSIONI ................................................................................................................................... 85
LETTERATURA CITATA ...................................................................................................................... 88
RINGRAZIAMENTI ........................................................................................................................... 103
1
Riassunto
Il polifenismo è la capacità di svilupparsi, a partire dallo stesso genoma, in individui
morfologicamente e fisiologicamente molto diversi. Questo fenomeno è ben evidente e
molto studiato nell’ape (Apis mellifera).
In Apis mellifera, infatti, durante lo sviluppo larvale, il tipo di nutrimento che viene
somministrato alle larve gioca un ruolo cruciale nella determinazione di casta; le larve
destinate a diventare regine ricevono gelatina reale durante tutto il periodo larvale
(cinque giorni dalla schiusa), mentre le larve con destino di operaia ricevono gelatina
reale soltanto per i primi tre giorni e un alimento a base di polline nei restanti due.
Sebbene regine ed operaie posseggano lo stesso genoma, il cambio di dieta durante lo
sviluppo genera profonde differenze sia nella morfologia che nel comportamento del
futuro adulto. I meccanismi molecolari implicati in questo processo sono ancora oggi non
del tutto compresi.
Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato quello di investigare per mezzo di un
approccio proteomico le differenze nel pattern di espressione proteica tra le larve di
regina ed operaia. In particolare, la prima parte del lavoro si è focalizzata sullo studio del
pattern proteolitico; le proteasi sono infatti proteine implicate nella digestione del cibo e
nel rimodellamento intracellulare. La seconda parte è stata dedicata al confronto del
pattern di espressione proteica negli stadi larvali delle due caste. Il pattern proteolitico è
stato analizzato per mezzo di zimografie mono‐ e bi‐dimensionali, quello proteico
utilizzando elettroforesi bi‐dimenasionali (2D‐PAGE), western blotting e spettrometria di
massa MALDI‐TOF.
2
Questo lavoro ha portato alla identificazione come nucleoplasmina dell’ape di una
proteina differenzialmente espressa e alla parziale caratterizzazione di due proteasi (PS4a
e PS4b).
La nucleoplasmina è uno chaperon nucleare implicato nella riprogrammazione
genica. Per mezzo di tecniche proteomiche siamo stati in grado di mostrare come la
nucleoplasmina sia presente in entrambe le caste di Apis mellifera in forme polimeriche
differenti. Questi dati suggeriscono che la nucleoplasmina possa esplicare funzioni diverse
nelle due caste. Dal momento che la nucleoplasmina è coinvolta nei processi di
assemblaggio del nucleosoma e nella regolazione dell’attività trascrizionale del DNA, una
variazione della sua attività potrebbe essere implicata nella regolazione dell’espressione
genica alla base del polifenismo in Apis mellifera.
3
Abstract
Honeybees (Apis mellifera) show polyphenism, that is the ability to develop into
alternative morphologies. During larval development, feeding plays a central role in caste
determination; in fact, larvae destined to become queens receive royal jelly for the whole
larval development period (five days from the hatching), while workers‐destined larvae
receive royal jelly for the first three days and pollen for the two remaining days. Although
queens and workers have the same genome, the change of diet during larval
development leads to dramatic differences in morphology and behaviour. The molecular
mechanisms that regulate caste determination are still not clear.
The aim of this doctoral work was to investigate the differences in worker and
queen destined‐larvae proteic patterns with a proteomic approach. In particular, in the
first part of the work we focused on proteinases, which take part to the digestion of food
and to intracellular remodeling, while in the second one we compared the whole proteic
pattern of queen‐ and worker‐destined larvae. The proteolitic pattern has been studied
by means of zimography and 2D‐zimography, while the proteic pattern with the aid of
2D‐electrophoresis, western blotting and MS spectroscopy.
This doctoral study led to the identification as nucleoplasmin from honeybee of a
differentially expressed protein and to the partial characterization of two proteinases
(PS4a and PS4b).
Nucleoplasmin is a nuclear chaperone involved in genes reprogramming. By means
of proteomic techniques we have been able to show that nucleoplasmin is present in the
two castes of Apis mellifera in different polymeric forms. These data suggest that
nucleoplasmin could operate with different functions in the two castes. Since
4
nucleoplasmin is involved in the assembly process of the nucleosome and also in
determining whether DNA is transcriptionally active or inactive, a variation of its activity
could be involved in the differentiation of the gene expression underlying polyphenism in
Apis mellifera.
Introduzione
6
Il polifenismo
Il polifenismo è la presenza, in una stessa popolazione, di diversi fenotipi che non
sono dovuti ad una diversità genetica. Come conseguenza, a parità di genotipo si
manifestano, nel corso dello sviluppo, diversità morfologiche e funzionali che sono il
riflesso di un differenziamento a livello dell’espressione genica. In tutto il regno animale
esistono diversi tipi di polifenismo, ognuno dei quali è determinato anche da componenti
ambientali specifiche: un polifenismo stagionale, un polifenismo cannibalesco, un
polifenismo determinato dal predatore ed infine il polifenismo di casta (Nijhout, 2003).
Polifenismo stagionale
Un esempio di polifenismo stagionale lo fornisce una farfalla tropicale, la Precis
almana (Brakefield et al., 2007) (fig.1).
Figura 1. Precis Almana. Lepidottero in cui è osservabile il polifenismo stagionale; (a) individuo che si èschiuso nella stagione secca; (b) individuo che si è schiuso nella stagione umida
7
Gli individui di questa specie che si schiudono durante la stagione secca hanno ali
marroni e spigolose, che assomigliano alle foglie morte, quelli che si schiudono durante la
stagione umida, presentano ali con i margini tondeggianti e colori sgargianti. Il fattore
ambientale scatenante è l’umidità
Polifenismo cannibalesco
Questo fenomeno è stato ampiamente studiato nell’ anfibio Scaphiopus (Wakano,
2004), un rospo (fig. 2) che mediante tale polifenismo massimizza la sua capacità
riproduttiva in pozze d’acqua temporanee in ambienti desertici.
Quando l’acqua è a livello di sicurezza il girino presenta una dieta basata su altri
abitanti dello stagno. Quando il livello dell’acqua si abbassa e l’essiccazione dello specchio
d’acqua è imminente i girini sviluppano una morfologia (ampia bocca, mascelle più forti)
Figura 2. Anfibio del genere Scaphiopus; (a) anfibio adulto; (b) girino mentre si nutre di un conspecifico.
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Polifenismo di casta
Un altro tipo di polifenismo ampiamente studiato è il polifenismo di casta negli
insetti eusociali. I meccanismi che portano allo sviluppo di caste riproduttive e non
riproduttive negli insetti eusociali è una delle più antiche e stimolanti questioni nella
storia della biologia evoluzionistica (Darwin, 1859). Un insetto si definisce eusociale
quando vive in una colonia in cui i singoli membri allevano in comune la prole ed in cui è
presente una divisione del lavoro basata sulla presenza di individui sterili che lavorano a
vantaggio della comunità e che aiutano gli individui fertili nel loro compito riproduttivo
(Anderson e McShea, 2001). Si suppone che la presenza di caste sterili sia dovuta ad un
processo evolutivo detto “selezione parentale” (kin selection), introdotto da Hamilton nel
1964 (Hamilton, 1964). Una caratteristica tipica degli insetti eusociali è la sovrapposizione
di generazioni, in cui si assiste alla co‐presenza nel nido di figli e genitori (Queller e
Strassmann, 2003). In una colonia di insetti eusociali le diverse caste presentano
morfologie caratteristiche, come le mandibole allargate dei soldati a scopo di difesa, o le
ali nelle forme alate atte alla dispersione. In molti casi le caste si differenziano durante lo
sviluppo post‐embrionale, in risposta a stimoli esterni riscontrabili nell’ambiente fisico o
nelle interazioni tra i membri della colonia (Noirot, 1991; Miura, 2001, 2004). Gli Insetti
eusociali appartengono a due ordini, uno è quello degli Isotteri (termiti), l’altro è quello
degli Imenotteri (vespe, formiche e api).
Termiti
Le termiti appartengono all’ordine degli Isotteri, vivono organizzate in colonie i cui
membri sono divisi in caste diverse (fig. 4). In questo ordine, come negli altri ordini di
10
insetti eusociali vi è la presenza di individui sterili che operano a vantaggio di altri fertili e
collaborano nelle cure parentali in modo che le generazioni più giovani aiutino quelle più
vecchie per un certo periodo della loro esistenza (Weil et al., 2007). Gli Isotteri sono i
primi insetti sociali che comparvero sulla Terra. Risalgono infatti al periodo Triassico
dell’era Mesozoica (220 milioni di anni fa), mentre i primi Imenotteri eusociali appaiono
nel tardo Cretaceo (circa 70 milioni di anni fa) in concomitanza con la comparsa delle
prime Angiosperme. Le termiti sono caratterizzate da una perfetta regolazione delle
dimensioni e della composizione in caste delle loro società. Al momento della schiusa,
dalle uova emergono larve indifferenziate totipotenti, geneticamente in grado di
svilupparsi in qualsiasi casta, con maschi e femmine in proporzione uguale.
Figura 4. Polimorfismo funzionale di casta nelle termiti: A) re primario, B) regina primaria, C) regina secondaria, D) regina terziaria, E) soldati, F) operaia
11
Il destino dell’individuo dipende quindi da un complesso insieme di fattori
ambientali ed individuali ma anche dal controllo sociale, che si esplica attraverso i ripetuti
contatti intercastali sottoforma di scambi di cibo (trofallassi), di attività di reciproca
pulizia e caratteristici movimenti vibratori del corpo. Nella differenziazione è coinvolto
anche un fattore ormonale. Le colonie delle termiti sono costituite da due caste principali:
la casta riproduttiva e la casta sterile, a cui appartengono operaie e soldati (Roux e
Korb, 2004).
Vespe
Le vespe sociali vivono in colonie, nelle quali le responsabilità sono divise tra due
caste (fig. 5): la regina (femmine fecondate) e le operaie (femmine normalmente sterili).
Una o più femmine dominanti e alcune operaie fondano il nido in primavera. Le operaie,
pur non essendo completamente sterili, non si riproducono per l’ effetto di dominanza
operata dalla femmina α (femmina che domina su tutte le altre).
Figura 5. Individui delle diverse caste nella famiglia Vespidae
12
Verso la fine dell’estate nascono un certo numero di maschi e di femmine che prima
dell’inverno si accoppieranno, i maschi moriranno in poco tempo, mentre le femmine
sverneranno in un luogo riparato per poi fondare un nuovo nido la primavera successiva.
Il ciclo stagionale di questa specie inizia a primavera. Durante la fondazione del nido
se ci sono parecchie femmine associate, tra queste si instaura subito una gerarchia di
dominanza regolata da precisi comportamenti ritualizzati e determinata da fattori quali
l’aggressività, l’esito delle lotte, le dimensioni relative. Dopo qualche tempo (10 giorni
circa) solo la femmina dominante resta in grado di deporre mentre le femmine
subordinate si specializzano in lavori da operaie: escono per rifornirsi di cibo, acqua e
materiale per la costruzione del nido, difendono il nido con accanimento da predatori
subendo, nel contempo, una riduzione delle dimensioni degli ovari. Verso la fine della
primavera iniziano a nascere le prime operaie e le fondatrici subordinate spariscono dalla
colonia, a meno che non abbiano sostituito la femmina conduttrice. Le operaie svolgono
adesso il loro compito e la colonia cresce in dimensioni ed in numero di individui. Verso la
fine di luglio la colonia ha raggiunto il suo apice, ed è a questo punto che iniziano a
sfarfallare i primi maschi e le femmine che, destinate ad accoppiarsi e a fondare un nido
la primavera successiva, prendono il nome di fondatrici figlie o future fondatrici. Solo
queste femmine sopravvivranno ai primi freddi e passeranno l’inverno in posti riparati per
rientrare in attività con la buona stagione. A differenza di altri insetti eusociali, le vespe
vivono in società temporanee che si dissolvono in autunno, alla morte di tutti i
componenti della famiglia (i maschi, le operaie e la stessa madre fondatrice del nido).
Soltanto le femmine fecondate in autunno e qualche rara operaia sopravvivono,
trascorrendo la cattiva stagione in un luogo riparato per poi fondare un nuovo nido
all’arrivo della primavera (Hoffman e Goodisman, 2007)
13
Formiche
Anche le formiche presentano un’organizzazione sociale basata sulle caste (fig. 6).
Ritroviamo femmine capaci di riprodursi, dette semplicemente femmine o regine, alle
quali spetta il compito di provvedere alla riproduzione ed alla deposizione delle uova e
femmine non feconde, le operaie che si distinguono in operaie vere ed in soldati; alle
prime spetta il compito di rifornire di cibo la comunità e di edificare il formicaio, alle
seconde quello di difendere il formicaio. I soldati sono più grossi e dalle mandibole più
sviluppate proprio in virtù del loro compito di difesa. Tuttavia, è bene precisare che anche
le operaie partecipano alla difesa del nido e spesso sono più aggressive dei soldati
(Abouheif e Wray, 2002).
La formica regina, che è l’unica femmina feconda, ha caratteristiche morfologiche
diverse dalle operaie poiché diverso è il suo ruolo nel formicaio, è infatti più grande delle
Figura 6: Caste in Atta texana, con maschio fecondatore, regina alata; formiche operaie e formichesoldato. La società delle formiche è matriarcale: i maschi muoiono per cause naturali, dopo averprovveduto alla fecondazione della sola regina.
14
operaie, ha il torace molto largo e l’addome voluminoso. Prima dell’accoppiamento è
provvista di due paia di ali che cadono subito dopo il volo nuziale, al contrario del maschio
che non le perde mai.
Il polifenismo di casta negli Apoidea
La superfamiglia Apoidea (ordine Hymenoptera, subordine Apocrita) comprende
Imenotteri solitari e sociali, generalmente di piccole o medie dimensioni. Mentre le specie
solitarie nidificano nel sottosuolo o negli anfratti naturali, le specie sociali costruiscono i
nidi in maniera più complessa, fabbricando celle con un misto di cera e polline (Bombi) o
con cera, terra e resina (Melipone) o infine con cera pura (Api). Le specie sociali
presentano un polimorfismo di casta con femmine fertili alate, femmine sterili (operaie)
alate e maschi alati.
Sono insetti che allevano la prole con polline (alimento sostanzialmente proteico) e
nettare. Sette famiglie costituiscono la superfamiglia Apoidea (Pinzauti e Frediani, 1993):
• Colletidae
• Andrenidae
• Halictidae
• Melittida
• Megachilidae
• Apidae
• Antophoridae
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divenire operaie, altrimenti le larve svilupperanno in nuove regine, a patto che la loro
alimentazione sia più ricca di quella fornita alle larve di operaie, a partire dal quarto
stadio larvale (Röseler, 1991; Cnaani e Hefetz, 2001; Cnaani et al., 1997; Hartfelder et al,
2000; Bortolotti et al, 2001; Bourke e Ratnieks, 2001; Pereboom et al., 2003).
Polifenismo in Apis mellifera L.
Tra gli imenotteri, uno degli insetti maggiormente studiato per il polifenismo di
casta è l’ape mellifera (Apis mellifera L.). Il genere Apis ricade nella famiglia Apidae, che
comprende quattro specie, Apis florea F., Apis dorsata F., Apis cerana F., Apis mellifera L.
Di questa in Italia sono presenti quattro razze di Apis mellifera L. (Pinzauti e Frediani,
1998):
• Apis mellifera mellifera L.
• Apis mellifera ligustica Spin.
• Apis mellifera carnica Poll.
• Apis mellifera sicula Grassi
La società delle api è matriarcale, monoginica, pluriennale ed è stata definita da
molti autori come suddivisa in tre caste: la regina, i fuchi e le operaie (Ruttner, 1968; Free,
1977; Contessi, 1990). Secondo un più recente punto di vista (Evans e Wheeler, 1999;
Evans e Wheeler, 2000; Evans e Wheeler, 2001) la specie è normalmente suddivisa in due
sessi, dei quali solo gli individui appartenenti al sesso femminile sono suddivisi in due
caste, regine e operaie.
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Le operaie sono, come già detto, individui sterili, non mostrando alcun segno di
oogenesi fintanto che la regina è presente nell’alveare. Se per qualche ragione però la
regina viene a mancare alcune operaie possono attivare i loro ovari e produrre uova
aploidi che daranno luogo a individui maschi (Kropàcova e Haslbachovà, 1971; Page e
Erickson, 1988; Moritz et al., 1996).
Il processo di differenziamento di casta in Apis mellifera fu definitivamente
accertato da Perez nel 1889, il quale sottolineò il fatto che la trasformazione da operaia a
regina è dovuta al tipo di dieta somministrata alle larve, in particolare alla quantità e alla
qualità del nutrimento ricevuto durante i cinque stadi larvali. In tal senso si pose la
questione di quale insetto fosse quello “normale”: la femmina di ape, dal punto di vista
della sua costituzione citoplasmatica, è un’operaia che può acquisire i caratteri della
regina o è una regina che a seguito a un processo di castrazione nutriciale può
trasformarsi in operaia? Flanders sosteneva che le larve femminili divengono
normalmente operaie e, solo nel caso in cui vengano nutrite in modo particolare, possono
dar luogo a regine; Lukoshus invece asseriva che l’ape femmina è geneticamente
conformata per avere l’apparato genitale della regina e che l’operaia rappresenta una
deviazione determinata da castrazione nutriciale. La seconda teoria sembra essere quella
corretta: la regina, per quanto più voluminosa, si sviluppa più rapidamente, mentre nelle
operaie si ha un prolungato periodo di sviluppo dovuto ad un arresto di crescenza; inoltre,
in una larva di operaia di 5‐6 giorni si rinvengono 130 ovarioli, mentre nell’adulto se ne
trovano solo da un minimo di 5 a un massimo di 20; la larva di operaia quindi, in partenza,
sembra predisposta per diventare regina, la quale, in età adulta, possiede 160 ovarioli.
Durante i primi tre giorni di vita tutte le larve femminili ricevono una nutrizione a
base di gelatina reale, una sostanza secreta dalle ghiandole prefaringeali e mandibolari
22
delle operaie; successivamente l’alimentazione si differenzia, infatti le regine
continueranno ad essere nutrite con gelatina reale durante tutta la loro vita larvale,
mentre le operaie saranno nutrite con un miscuglio di miele e polline (worker jelly)
(Haydak, 1970). Questa diversità ha fatto pensare all’ipotesi che nelle operaie intervenga
il suddetto fenomeno della castrazione nutriciale, con conseguente atrofia degli organi
sessuali. Tuttavia, il fattore trofico non risulta sufficiente per spiegare il fenomeno di
differenziamento delle due caste, essendovi più di una semplice differenza di sviluppo
somatico ed ovarico. La regina presenta infatti caratteri involuti rispetto a taluni
corrispondenti caratteri delle operaie, come ligula più corta, assenza di ghiandole della
cera e degli organi di raccolta. È quindi difficilmente spiegabile come un’alimentazione
particolarmente ricca faccia, di per sé, sviluppare gli ovari e, nel contempo, regredire altri
apparati (Pinzauti e Frediani, 1998).
A tal proposito, si è visto che il tipo di alimentazione durante lo sviluppo larvale
influisce sul sistema endocrino delle larve, in cui si generano quantità casta‐specifiche di
ormone giovanile (JH) e di ecdisteroide (Hartfelder e Engels, 1998; Rachinsky et al., 1990).
A partire dal quarto stadio larvale, infatti, il corpora allata delle larve destinate a divenire
regine diventa molto più grande rispetto alle corrispondenti larve di operaia, e le prime
mostrano una produzione relativamente alta di ormone giovanile.
23
Genoma e polifenismo in Apis mellifera
L’ape mellifera è un insetto di fondamentale importanza in agricoltura, non solo per
la produzione di miele, pappa reale, propoli ecc., ma soprattutto per il ruolo che riveste
come impollinatore. E’ inoltre un organismo modello per comprendere il comportamento
sociale negli insetti e le suddivisioni in caste (Chan et al., 2006), e si presta ottimamente
per studi genetici, molecolari, neurali, ecologici, ecc.. Queste caratteristiche hanno fatto sì
che l’ape venisse selezionata per il sequenziamento del genoma dal National Human
Genome Research Institute (NHGRI) e dal National Institutes for Health (NIH), con l’aiuto
dello United States Department of Agricolture (USDA) (Honeybee Genome Sequencing
Consortium, 2006). L’ape è il quinto insetto e il primo imenottero il cui genoma sia stato
sequenziato (Robinson et al., 2006). Il genoma dell’ape (fig. 13 e 14) ha mostrato
caratteristiche diverse rispetto a quelli di altri insetti, aprendo nuove prospettive di
ricerca in campo genomico e proteomico (Chan et al., 2006).
Figura 13. Mappa del cromosoma LG3 di Apis mellifera (da NCBI Map Viewer).
24
Per tentare di indagare quali possano essere i meccanismi molecolari e le vie di
trasduzione del segnale che stanno alla base dello sviluppo e del differenziamento di
casta nell’ape, a partire dagli anni ‘90 sono stati portati avanti diversi studi basati su
tecniche di biologia molecolare, incentrati in particolar modo sull’utilizzo di librerie di
cDNA e sull’analisi di macroarrays (Cristino et al., 2006).
Evans e Weeler, nel 1999 hanno affrontato la questione dello sviluppo nell’ape
mediante l’utilizzo della tecnica SSH (suppressive subtractive hybridization), mostrando
che in regina e operaia numerosi geni vengono differenzialmente espressi nelle varie fasi
di crescita delle larve. Inoltre, sembra che l’attivazione genica, contrariamente a quanto si
pensasse, sia presente sia in regina che in operaia. I geni presi in considerazione
sembrano appartenere a cinque gruppi funzionalmente ed evolutivamente diversi.
Da numerosi studi sull’espressione dei geni a diversi stadi larvali è emerso che le api
operaie rimangono più fedeli, rispetto alle regine, al profilo di espressione genica delle
larve bipotenziali più giovani. Al contrario, sembra che le regine simultaneamente vadano
in contro ad una down‐regulation di molti geni espressi dalle larve bipotenziali ed attivino
una serie distinta di geni legati alla casta. Questa differenza nell’espressione dei geni
porta alle ben conosciute difformità morfo‐funzionali (Evans, 2000). Quindi, alla base
delle profonde dissomiglianze esistenti tra le caste troviamo un complesso meccanismo
genico che segna il destino della larva mediante la up‐ o la down‐regulation di precisi
Figura 14. I cromosomi di Apis mellifera come schematizzati su NCBI Genome Project
25
geni. L’espressione di un polifenismo inizia quando uno o più segnali ambientali e
ormonali sono tradotti in risposte fisiologiche o cellulari che si risolvono in un
cambiamento dello sviluppo post‐embrionale.
Mediante la tecnica dei microarray è stato possibile quantificare l’espressione
genica differenziale alla base dei cambiamenti nelle larve differenziate (Cristino et al.,
2006), infatti sono stati individuati, per ora, 240 geni diversamente espressi fra regina ed
operaia nel quarto e quinto stadio larvale (Barchuk et al., 2007). La regolazione
dell’attività trascrizionale di questi geni permette il manifestarsi di due fenotipi
profondamente diversi. Per fare qualche esempio prendiamo una delle caratteristiche che
contraddistingue le due caste, la capacità di riprodursi. Come già detto, la regina è
estremamente prolifica, il suo corpo presenta un addome più voluminoso rispetto alla
operaie ed è dotato di una grande spermateca in cui accoglie gli spermi, in
contrapposizione a quella rudimentale delle operaie; alla base di questo dimorfismo
troviamo l’attività di geni per lo sviluppo differenziale delle ovaie. Durante l’ontogenesi
dell’ape, come degli altri metazoi, si verifica un programma di morte cellulare che, in
collaborazione con la proliferazione cellulare, modula lo sviluppo di determinati organi, in
questo caso delle ovaie dell’operaia durante la metamorfosi. Gli ultimi studi hanno messo
in evidenza come molti dei geni che sono preferenzialmente espressi nella larva di
operaia siano associati alla morte cellulare programmata, come per esempio il gene traf‐1
(TNF‐receptor‐associated‐factor 1), i cui prodotti, studiati in Drosophila, partecipano ai
processi di morte cellulare (Soller et al., 1999); o come il gene atx2 (Ataxin‐2) la cui
sovraespressione (sempre in Drosophila) provoca la sterilità delle femmine (Satterfield et
al., 2002). Una up‐regulation di questi geni in particolari fasi critiche degli stadi larvali di
operaia provocherebbero un minore sviluppo dell’apparato riproduttivo dell’ape. Al
26
contrario il gene tor, che va in contro ad una up‐regulation, in larve di regina è un
regolatore negativo della morte cellulare autofagica e la sua sovraespressione inibirebbe
la distruzione di tessuti, quali le ovaie, permettendone lo sviluppo (Patel et al., 2007). Una
concertata e differenziata regolazione di questi tre geni insieme ad altri, è la base
molecolare della capacità delle regine di procreare e dell’impossibilità delle operaie di
farlo.
Andando ad esaminare alcune differenze nella morfologia delle due caste, si osserva
che la bottinatrice è fornita di particolari apparati di raccolta del polline nella zampa
posteriore (o metatoracica), infatti la larga tibia presenta esternamente una lieve
concavità marginata da forti e lunghi peli incurvati, che formano la cestella in cui l’ape
accumula il polline per trasportarlo nell’alveare (Patel et al., 2007); queste strutture non
si ritrovano nella regina, ed anche in questo caso, se andiamo ad indagare a livello
dell’espressione genica troviamo 3 geni (gug, dac, crc) che agiscono come regolatori dello
sviluppo delle zampe ed uno (atx2) che regola la morfologia delle setole, più attivi
nell’operaia che nella regina a parità di stadio larvale. La loro temporanea espressione
durante lo sviluppo dei dischi imaginali delle zampe nel periodo critico di differenziazione
delle caste suggerisce che siano coinvolti, insieme ad altri, nella formazione delle
strutture della gamba tipiche della casta (Barchuk et al., 2007) In generale si può dire che
durante il periodo larvale l’operaia presenta una maggiore espressione di geni legati allo
sviluppo di strutture specifiche (strutture per la raccolta di polline, ghiandole per la cera
ecc.) ed alla assenza o quasi di altre (ovaie); si ha anche attivazione di geni che codificano
per membri della famiglia del citocromo P450 e di particolari proteine
d’immagazzinamento, le esamerine; la regina mostra una up‐regulation di geni che
codificano per enzimi metabolici e di geni coinvolti nella crescita generale del corpo e
27
delle ovaie (Evans e Wheeler, 2000). Un discreto numero di geni che sono espressi
differentemente nelle larve di regina ed operaia sono regolati dal livello di ormone
giovanile nell’emolinfa. Ancora molto c’è da capire sui meccanismi del polifenismo legati
all’ormone giovanile.
Le proteasi
Il termine proteasi è apparso per la prima volta nella letteratura chimica tedesca in
riferimento agli enzimi proteolitici, ed è stato usato come termine generale per indicare
tutte le idrolasi che agiscono sulle proteine o che degradano parti di esse.
Successivamente, la necessità di distinguere fra diversi tipi di attività proteolitica portò
Grassmann e Dyckerhoff in Germania e Bergmann e Ross negli Stati Uniti a proporre due
terminologie indipendenti. I primi chiamarono proteinasi gli enzimi che agiscono sulle
proteine e peptidasi quelli che agiscono sugli oligopeptidi. Bergmann e Ross indicarono
con peptidasi qualunque idrolasi che agisce sul legame peptidico, quindi senza le
distinzioni proposte da Grassmann, ed estesero il termine per costituirne due nuovi:
endopeptidasi ed esopeptidasi.
L’uso dello stesso termine per indicare diversi meccanismi di azione ha generato
confusione, portando di conseguenza lo IUBMB (International Union of Biochemistry and
Molecular Biology) a consigliare l’uso della terminologia coniata da Bergmann e Ross.
Per indicare invece una idrolasi che agisce preferenzialmente o esclusivamente su
oligopeptidi, i termini consigliati sono esopeptidasi se l’enzima agisce soltanto sulle
28
estremità libere del peptide, ed oligopeptidasi nel caso in cui la specificità di azione
dipende dalla grandezza del substrato (Barrett, 2001).
Hartley classificò poi gli enzimi proteolitici in base alla natura chimica del sito
catalitico dell’enzima, riconoscendo quattro classi di proteasi:
• Serino‐proteasi
• Cisteino‐proteasi
• Aspartico‐proteasi
• Metallo‐proteasi
Più recentemente è stata scoperta una nuova classe di proteasi:
• Treonino‐peptidasi
Già negli anni ‘70 (Neurath e Walsh, 1976) emerse l’evidenza che molte proteine
sono sintetizzate come precursori inattivi o zimogeni e che questi, solo successivamente,
vengono convertiti in forme fisiologicamente attive per mezzo di tagli enzimatici selettivi
di specifici legami peptidici. Questo processo è noto come “attivazione dello zimogeno”
ed è riscontrabile in una enorme varietà di processi biologici, come la coagulazione del
sangue, la reazione del complemento, la fibrinolisi, la produzione di ormoni, la digestione,
lo sviluppo e il differenziamento. In tutti i casi menzionati la conversione dello zimogeno
nella forma attiva dell’enzima coinvolge una proteolisi limitata del substrato, con la
rimozione di un “segmento di attivazione” di dimensioni estremamente variabili, da due
peptidi fino a domini comprendenti più di cento residui (Khan e James, 1998).
Le proteasi possono quindi essere alla base della generazione di specifiche funzioni,
ma allo stesso modo possono essere causa della loro interruzione; in questo senso è utile
pensare alla proteolisi limitata come ad un elemento di controllo in grado di attivare o
disattivare processi fisiologici generando o distruggendo i relativi catalizzatori.
29
Possibili ruoli delle proteasi negli insetti
Per far fronte alle gravose perdite in agricoltura dovute agli insetti fitofagi, si è
iniziato da qualche tempo a far uso di inibitori di proteasi. Gli inibitori di proteasi possono
infatti essere efficacemente impiegati per alterare i processi digestivi delle larve di insetti
che danneggiano le colture di interesse economico (Hilder et al., 1987; Johnson et al.,
1989; Ryan, 1990).
Questo è uno dei motivi per cui negli ultimi anni è cresciuto enormemente
l’interesse verso la caratterizzazione e l’identificazione di proteasi specifiche, in una
ampia varietà di insetti: in lepidotteri come Agrotis (Purcell et al., 1992), Cydia (Christeller
et al., 1992), Spodoptera (Lee e Anstee, 1995), Lymantria (Valaitis, 1995), Heliothis
(Johnston et al., 1995), Ostrinia (Bernardi et al., 1996), Bombyx (Nobuyasu e Yamashita,
1997), Sesamia (Novillo et al., 1999), e Pieris (Broadway, 1995); nei coleotteri Adalia
(Murdock et al., 1987; Walker et al., 1998), Tenebrio (Dadd, 1956; Jang et al., 1998) e
Tribolium (Blanco‐Labra et al., 1996); nei ditteri Aedes (Fisk, 1950) e Aenopheles (Berner
et al., 1983; Vizioli et al., 2001); nell’ Hemiptera Dysdercus (Khan e Ford, 1962) ed in
ortotteri quali Locusta (Khan, 1964).
D’altro canto, per gli insetti impollinatori, come l’ape mellifera o i bombi, la
somministrazione di insetticidi a base di inibitori di proteasi può essere dannosa, se non
mortale. A questo scopo in Bombus terrestris sono stati effettuati esperimenti per
studiare il ruolo di alcune proteasi (tripsina, chimotripsina, leucina‐amminopeptidasi,
elastasi) in risposta all’utilizzo di inibitori di proteasi, come insetticidi, sulle operaie
(Malone et al., 2000).
30
Come già detto, i meccanismi molecolari che stanno alla base dello sviluppo e del
differenziamento negli insetti non sono ancora ben compresi (Evans e Wheeler, 1999), ma
negli ultimi anni diversi studi hanno mostrato un ruolo preponderante degli enzimi
proteolitici in questi complessi processi, e più specificamente delle serino‐proteasi.
Le serino‐proteasi (famiglia S1, di cui fanno parte la tripsina e la chimotripsina) sono
enzimi coinvolti in molteplici processi fisiologici, sia endo‐ che esocellulari, come la
digestione gastrica, lo sviluppo e le risposte di difesa (Rawlings e Barrett, 1993; Krem e Di
Cera, 2002). Tra gli enzimi proteolitici, e, forse, nell’intera enzimologia, sono la classe
maggiormente studiata. Il meccanismo d’azione delle serino‐proteasi è ormai ben noto
(fig. 15) e il trasferimento della porzione acilica del substrato a formare un legame
covalente con uno specifico gruppo funzionale dell’enzima è una caratteristica comune ad
altre transferasi (Dunn, 2001).
Figura 15. Rappresentazione schematica del meccanismo di azione delle serino‐proteasi. Da “Proteolytic Enzymes”, Second edition, Edited by Robert Beynon and Judith S. Bond.
31
Nel 2006, Zou et al. hanno identificato 44 geni che codificano per serino‐proteasi
(SP) e 13 per omologhi di serino‐proteasi (SPH) nel genoma di Apis mellifera. La maggior
parte di questi geni codifica per proteine putative secrete esternamente alla cellula,
mentre 4 SP e 3 SPH sembrano poter associarsi alla membrana plasmatica per mezzo di
regioni transmembrana. Un’analisi comparativa di queste sequenze geniche con quelle di
Drosophila ha portato ad ipotizzare un possibile ruolo delle SP nella determinazione
dell’asse dorso‐ventrale nell’embrione di ape.
Felicioli et al. nel 2004 hanno studiato il pattern proteolitico dell’imenottero
solitario Megachile rotundata durante le fasi di larva, pupa e imago del ciclo
ontogenetico. Dal loro lavoro sono emerse differenze nell’espressione di proteasi solubili
durante le varie fasi dello sviluppo. Delle 22 proteasi osservate alcune sono risultate
capaci di digerire una mistura di polline prelevato dal nido dell’ape solitaria; la proteasi
che ha mostrato la più intensa attività proteolitica su gelatina è stata identificata come
una serino‐proteasi.
Durante lo sviluppo ontogenetico in Ceratitis capitata, la mosca della frutta, gli
organi di riserva immaturi vengono progressivamente disintegrati per far posto ai lisosomi
tipici dello stadio adulto. E’ stato dimostrato che esiste una correlazione tra l’attivazione
dei lisosomi e l’attività proteolitica di una aspartico‐proteasi tipica degli insetti (Rabossi et
al., 2004).
Quindi, sulla base delle conoscenze pregresse circa i ruoli assunti dalle proteasi nei
processi di sviluppo e differenziamento, la prima parte di questo lavoro di dottorato si è
incentrata sullo studio del pattern proteolitico delle larve differenziate di operaia e
regina, con l’intento di mettere in evidenza eventuali differenze di rilievo tra le due caste.
32
La scelta della proteomica
Le proteine determinano il fenotipo biologico di un organismo (Barrett et al., 2000).
Il termine “proteoma” indica l’insieme delle proteine espresse in una frazione
subcellulare, una cellula, un tessuto, un qualsiasi organismo o secreto sotto un particolare
stadio di sviluppo o sotto un particolare insieme di condizioni fisiologiche (Wilkins et al.,
1996; Barrett et al., 2000). Il termine proteoma è stato usato per la prima volta nel 1994
al congresso di Siena sull’elettroforesi bidimensionale ed è ancora largamente accettato
(Williams e Hochstrasser, 1997). La proteomica offre enormi potenzialità nell’analisi
dell’espressione del genoma (Anderson e Anderson, 1998; Thomas e Vanbogelen, 2000)
ed è menzionata in più di 4600 articoli. Diverse riviste scientifiche sono nate negli ultimi 5
anni sull’ argomento: Proteomics, Functional & Integrative Genomics, Molecular &
Cellular Proteomics, Journal of Proteome Research, Applied Genomics and Proteomics,
Comparative and Functional Genomics, etc.
Il proteoma, a differenza del genoma, non è una caratteristica stabile di un
organismo; esso cambia con lo stadio di sviluppo, con il tessuto o anche con le condizioni
ambientali nelle quali un organismo si trova. Ci sono quindi molte più proteine in un
proteoma che geni in un genoma, specialmente per gli eucarioti, a causa delle
modificazioni post‐trascrizionali e post‐traduzionali dell’informazione genetica.
La proteomica è basata su un insieme di tecnologie che hanno lo scopo di separare
la complessa miscela di proteine di un campione e permettono di identificare quelle più
interessanti per avere informazioni complete sul fenotipo proteico di un organismo, di
una cellula, di una frazione cellulare, di un secreto in un dato tempo o stato.
33
Fasi essenziali della proteomica sono la preparazione del campione, la separazione
delle proteine mediante elettroforesi bidimensionale (Gorg, 2000), l’acquisizione e
l’analisi delle immagini dei gel, l’identificazione delle proteine mediante spettrometria di
massa associata alla ricerca delle sequenze nelle banche dati (Hoogland et al., 1997;
Bakhtiar e Nelson, 2000).
All’inizio di questo lavoro di dottorato, diversi articoli sul polifenismo dell’ape
tentavano di analizzare l’argomento dal punto di vista ecologico, etologico o mediante
l’uso di tecniche della biologia molecolare (vedi riferimenti nel testo). A tutt’oggi in
letteratura esiste soltanto un esiguo numero di articoli che affrontino da un punto di vista
proteomico lo studio dell’ape nei suoi vari apetti. Tra questi: uno studio
sull’identificazione di alcune proteine della gelatina reale (Scarselli et al., 2005) e
un’analisi comparativa delle proteine dell’emolinfa nel differenziamento di casta (Chan
et al., 2006).
Le due caste regina e operaia in Apis mellifera si differenziano, come più volte
ripetuto, a partire da larve identiche, in funzione della dieta somministrata alle larve e di
altri fattori esterni. Il fenotipo mostrato da regina e operaia è dunque la manifestazione di
una diversa espressione genica dello stesso genoma. Per questo motivo abbiamo ritenuto
l’utilizzo delle tecniche della proteomica particolarmente adatto allo studio del
differenziamento in questo insetto.
Materiali e Metodi
35
Il campione sperimentale
I campioni costituiti da larve di ape operaia ed ape regina sono stati forniti
dall’apiario sperimentale di Lamone, gestito dal settore di Apidologia del Dipartimento di
Coltivazione e Difesa delle Specie Legnose "G. Scaramuzzi" della facoltà di Agraria
dell’Ateneo di Pisa.
Sono state utilizzate larve di operaia e regina dei cinque stadi larvali, in particolare
del quinto stadio, periodo che corrisponde al quinto giorno dopo la schiusa (L5).
Per individuare la fase di prelevamento del campione ci siamo basati sulla massa
delle larve come suggerito da H. Rembold e J.P. Kremer (Apidologie, 1980.), tenendo
presente che la regina, a parità di età con l’operaia, ha una massa maggiore.
I campioni biologici sono serviti per realizzare l’analisi del pattern proteolitico in
larve di regina e operaia mediante zimografia monodimensionale e bidimensionale; sono
inoltre stati utilizzati per studiare il pattern proteico delle larve del quinto stadio larvale
mediante elettroforesi bidimensionale, spettrometria di massa MALDI‐TOF, western
blotting ed immunorivelazione.
Estrazione delle proteine
Per ciascuna prova si sono prelevate quattro larve di operaia o due larve di regina
dello stadio larvale desiderato. Le larve sono state pesate e successivamente introdotte in
un potter a cui sono stati aggiunti 3 ml di tampone di estrazione Tris‐HCl (Fluka) 50 mM
36
pH8. Per la comparazione tra la 2D‐PAGE di larve del quinto stadio di regina e operaia
sono stati aggiunti 80μl di cocktail di inibitori di proteasi (Sigma). Successivamente le larve
sono state omogeneizzate usando un pestello di teflon e il campione centrifugato a 19000
rcf per 60 minuti a 4°C, prelevando poi il sopranatante.
I campioni destinanti alla 2D‐PAGE sonno stati lasciati per una notte in PEG
(polyethylene glycol 20; Fluka) per ottenere un’appropriata concentrazione proteica.
Quantificazione proteica
La concentrazione proteica di ciascun campione è stata determinata utilizzando il
reagente di Bradford (Bradford, 1976) e ovoalbumina per la creazione della curva
standard.
SDSPAGE
L’estratto grezzo di operaia è stato suddiviso in due aliquote successivamente
conservate a 4°C e ‐20°C rispettivamente. Di ogni aliquota è stata fatta una corsa
elettroforetica in condizioni semi‐denaturanti (senza 2‐β‐mercaptoetanolo) secondo la
tecnica di Laemmli (1970) su gel di separazione di poliacrilammide al 15%. Il campione è
stato opportunamente diluito con l’SDS (sodio dodecil solfato, Acros Organics) Reducing
Buffer (0,5 M Tris‐HCl, pH 6,8, 10% Glicerolo, 10% SDS).
37
In ogni corsia di un gel avente lo spessore di 1mm sono state caricate differenti
quantità di campione (20 e 30 μg). L’elettroforesi è stata effettuata utilizzando un
apparecchiatura Mini‐PROTEAN II (Bio‐Rad, Hercules, CA, U.S.A.) collegata
all’alimentatore EPS 3500 XL (Pharmacia), applicando una corrente costante di 20mA /gel.
Come riferimento sono stati utilizzati standard Low Range 14,4‐97 kDa (Amersham
Biosciences, San Francisco, CA, USA).
Zimografia monodimensionale
La zimografia è stata eseguita con il kit Miniprotean II (Bio‐Rad). L’attività
proteolitica delle proteine contenute nel campione è stata evidenziata mediante
elettroforesi in gel di poliacrilammide al 12% o al 15% contenente gelatina (Gelatin from
porcine skin, Sigma) allo 0.1% (Heussen e Dowdle, 1980). L’elettroforesi è stata effettuata
in condizioni semidenaturanti: i campioni sono stati diluiti 1:2 con un tampone
contenente SDS al 2% senza l’aggiunta di β‐mercaptoetanolo e in seguito non è stata
effettuata alcuna bollitura.
Dopo l’elettroforesi i gel sono stati sottoposti a lavaggio per 30 minuti in 100ml di
una soluzione al 2% di TritonX‐100 (Merck) per rimuovere l’SDS e ripristinare la piena
attività enzimatica. I gel, immersi in una soluzione 100mM di tampone Tris‐HCl pH8, sono
stati successivamente incubati a 37°C per 2 ore e quindi colorati con Coomassie Blue
(0,1% Coomassie Brilliant Blue R250, 40% metanolo, 10% acido acetico). Infine la
decolorazione è stata eseguita con una soluzione di metanolo al 40% e acido acetico al
10% in acqua.
38
Elettroforesi bidimensionale (2DPAGE)
La 2D‐PAGE (elettroforesi bidimensionale, figura 16) è stata effettuata secondo
Gorg e coautori (Gorg et al., 1988).
Un’aliquota del campione, corrispondente a 2500 μg di proteine, è stata risospesa
in 250μl di Rehidration Buffer (Urea 8M, CHAPS 2%, DTT (ditiotreitolo, Sigma) 0,2%, IPG
buffer pH3‐10 (Amersham Bioscience) 0,8%, Pharmalyte (Amersham Bioscience) pH 3‐10
Figura 16. Descrizione dei due tipi di separazione, per carica e per massa, che si susseguono nella2D‐PAGE.
39
0,8% e tracce di Blu di Bromofenolo). Il campione così preparato è stato caricato su strip
pH 3‐10 da 11cm (Immobiline DryStrip, Amersham Bioscience).
L’IEF (Iso‐Electro‐Focusing) è stata effettuata per mezzo di un apparecchio
Multiphor II (Amersham Biosciences) utilizzando l’alimentatore EPS 3500 XL (Pharmacia)
con il seguente programma di gradiente di tesione: 500V, 1mA, 5W, 1Vh; 500V, 1mA, 5W,
2500Vh; 3500V, 1mA, 5W, 10000Vh; 3500V, 1mA, 5W, 33250Vh. La temperatura è stata
mantenuta costante a 15°C durante tutta l’IEF per mezzo di un termostato Hetofrig.
Al termine dell’IEF, le strip sono state equilibrate per 4 minuti in una soluzione di
Tris‐HCl 50 mM, pH8,8 contenente Glicerolo 30%, Urea 6M, SDS 4% e per 6 minuti in una
soluzione di Tris‐HCl 50 mM, pH 6,8, Glicerolo 30% , Urea 6M, SDS 4% e tracce di Blu di
Bromofenolo.
La seconda dimensione è stata effettuata in gel al 12% o 15% dello spessore di
1mm, secondo il protocollo di Laemmli (Laemmli, 1970).
Zimografia bidimensionale
La zimografia bidimensionale viene eseguita in maniera identica alla 2D‐PAGE fino al
termine della corsa elettroforetica, con la sola variante dell’utilizzo di un gel contenente
gelatina allo 0,1%. Al termine della corsa, il gel viene trattato come nel caso della
zimografia monodimensionale.
40
Colorazione dei gel
I gel sono stati colorati utilizzando il protocollo Silver Stain MALDI‐TOF compatibile
(Yan et al., 2000) oppure il Coomassie Blu (0,1% Coomassie Brilliant Blue R250,
40% metanolo, 10% acido acetico).
Western blotting
Le proteine separate mediante 2D‐PAGE sono state elettricamente trasferite su una
membrana di polivinil‐dien‐fluoruro (PVDF) (Hybond‐P PVDF, Amersham Biosciences),
attivata in metanolo per 10 secondi, mediante l’utilizzo del Multiphor II (Amersham
Biosciences) applicando una corrente costante di 0,8 mA/cm2 di gel per la durata totale di
un’ora.
I fogli di carta da filtro posti sul catodo sono stati equilibrati in Tris 13mM, Glicina
100mM e Metanolo al 5% (Cathodic Transfer Buffer), quelli posti sull’anodo sono stati
equilibrati in Tris 13mM, Glicina 100 mM e Metanolo al 20% (Anodic Transfer Buffer). Il
gel e la membrana sono stati equilibrati in Tris 13 mM, Glicina 100 mM e Metanolo al 10%
(Gel‐PVDF Transfer Buffer). Per l’esecuzione di questa tecnica è stato utilizzato il
protocollo Amersham Biosciences.
41
Immunorivelazione
L’ anticorpo specifico per la nucleoplasmina è stato acquistato presso la ditta Gene
Script Corporation. Esso è stato costruito sfruttando la conoscenza del genoma di Apis
mellifera, utilizzando una sequenza di 16 amminoacidi (ssevwdpehknddadgc) con
l’aggiunta di una cisteina con lo scopo di ancorare l’oligopeptide ad un opportuno carrier
per la produzione dell’anticorpo.
La membrana è stata saturata per un’ora in PBS (tampone fosfato 5mM, NaCl
137mM, KCl 2,7mM), pH7,5, latte in polvere scremato al 3%. In seguito la membrana di
PVDF è stata incubata tutta la notte a 4°C con l’anticorpo primario. L’anticorpo è stato
diluito 1000 volte in PBS pH7,5. Alla fine dell’incubazione sono stati effettuati 3 lavaggi
con PBS pH7,5 e Tween‐20 allo 0,05%, ciascuno della durata di 5 minuti, ed ulteriori 3
lavaggi di 5 minuti con solo PBS pH7,5. Successivamente la membrana di PVDF è stata
incubata per un’ora con anticorpo secondario Goat Anti‐Rabbit IgG‐HRP (Sigma) diluito
10000 volte in PBS pH7,5. In seguito sono stati effettuati tre lavaggi della membrana,
della durata di 5 minuti ciascuno, con PBS pH7,5.
La reazione anticorpale è stata evidenziata trattando la membrana con una
soluzione cromogeno costituita da PBS pH7,5, 4‐cloro‐1‐naftolo 5M, metanolo al 6% e
perossido di idrogeno allo 3%.
42
Analisi d’immagine
Le immagini dei gel e delle membrane di blotting sono state acquisite attraverso
l’uso di uno scanner piatto (Epson Expression 1680 Pro). I dati acquisiti sono stati
elaborati con l’ausilio di opportuni software. I gel delle elettroforesi monodimensionali
sono stati elaborati mediante il programma QuantityOne 4.2.3 (Bio‐Rad, Hercules, CA,
U.S.A.) che permette di avere una stima quantitativa dell’intensità di ciascuna banda.
Infatti la banda come appare sullo schermo del computer è costituita da un insieme di
pixel. Ciascun pixel ha una coordinata X, una Y e un valore Z. Le coordinate X e Y indicano
la posizione in orizzontale e in verticale del pixel nell’immagine, mentre il valore Z è
l’intensità di segnale del pixel abbreviata come p.i. (Pixel Intensity). L’intensità totale di
una banda è data dalla somma delle intensità di tutti i pixel che compongono la banda
stessa. L’intensità media della banda è l’intensità totale diviso il numero di pixel. Con una
sorgente di luce bianca l’unità dell’intensità del segnale corrisponde alla Densità Ottica
(O.D.). Nel linguaggio del software tale densità ottica è definita come “intensità di
volume”. Il volume è dato dalla somma delle intensità dei singoli pixel moltiplicato per
l’area del pixel stesso e viene indicato, negli istogrammi riportati, come Volume
Percentuale.
Figura 17. Illustrazione del volume considerato per il calcolo dell’intensità.
43
I gel delle elettroforesi bidimensionali sono stati elaborati mediante il programma
PD‐Quest 6.2.1 (Bio‐Rad Hercules, CA, USA). Il software di analisi di immagine di PD‐Quest
confronta le immagini dei gel ottenuti mediante 2D‐PAGE per determinarne il diverso
pattern proteico. Le immagini dei gel vengono filtrate e manipolate dal software per
uniformare le dimensioni delle diverse mappe e, per quanto possibile, ridurre il rumore di
fondo. Le aree ad elevata densità ottica, basandosi su parametri precedentemente
impostati, vengono quindi identificate come zone proteiche. Durante la determinazione
degli spot vengono create due immagini non reali: una detta immagine filtrata e una
detta immagine gaussiana. La prima è l’immagine reale del gel ripulita dalle impurità di
fondo, mentre la seconda è costituita dalle funzioni gaussiane associate ad ogni spot. In
questo modo ciascuno spot assume una struttura tridimensionale (X,Y,Z: dove X e Y
identificano la posizione sul gel dello spot e Z l’intensità del segnale in unità di densità
ottica) sulla quale vengono poi condotte tutte le analisi successive.
Risultati e Discussione
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46
La banda di attività proteolitica indica la presenza di una o più proteasi comprese
tra 66 e 45 KDa (prime due bande del marker Low Range, SIGMA). Lo zimogramma è stato
analizzato con il software Quantity One (BioRad) per determinare la massa molecolare
delle proteasi presenti e l’intensità della banda. La massa molecolare della banda in
questione è risultata essere circa 57 KDa e la sua intensità corrisponde a più di 10 volte
quella delle prime due bande del marker (fig. 19).
Come facilmente si può intuire, il picco del grafico corrispondente all’attività
proteolitica ha orientazione opposta a quelli corrispondenti alle bande proteiche del
marker.
Una intensa attività proteolitica è dunque presente soltanto nelle larve che sono
andate incontro ad una marcata trasformazione, passando da un iniziale destino di regina,
Figura 19. Analisi mediante software “Quantity One” BioRad dello zimogramma di fig.18. Int: intensità;Rf: relative front.
47
che accomuna tutte le larve indifferenziate, a quello di operaia. Come precedentemente
spiegato, il cambio di alimentazione avviene nelle sole larve di operaia, che dovranno
mettere in atto una serie di meccanismi molecolari di rimodellamento, in cui sappiamo
intervenire numerose proteasi, tra cui principalmente le serino‐proteasi. Nella fattispecie,
nel rimodellamento da potenziale regina ad operaia sembra essere coinvolta l’attività
proteolitica evidenziata nello zimogramma. Questa banda di attività è stata imputata ad
una proteasi che è stata denominata PS4.
La PS4 potrebbe essere sintetizzata ex novo sotto lo stimolo esterno della nuova
dieta, oppure potrebbe essere già presente nella larva sotto forma inattiva ed essere
attivata successivamente.
Per caratterizzare ed indagare la classe di appartenenza della proteasi da noi
individuata e per cercare di capire come e quando questa si manifesti nel corso del
differenziamento nei diversi stadi larvali, sono state effettuate numerose prove, di
seguito riportate.
Studio dell’attività proteolitica durante lo sviluppo
delle larve di operaia
In questa prova sperimentale è stato indagato l’andamento dell’attività proteolitica
della PS4 nel corso dei cinque stadi larvali delle larve di operaia e delle prime fasi di
opercolatura.
I campioni larvali presi in esame sono stati prelevati in stadi diversi e pesati. Per
ogni campione sono state utilizzate 10 larve della stessa pezzatura, a partire dalle larve
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Intensità relativa (U
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Banda di attività
Intensità relativa bande di attività
terzo o l’inizio del quarto stadio larvale, periodo in cui approssimativamente inizia il
cambio di dieta delle larve. Come si può osservare dal grafico prodotto mediante analisi
dei gel con il software Quantity One (fig. 21), l’intensità della banda di attività non è
crescente, ma varia nei diversi stadi fino a raggiungere un massimo verso il quarto stadio
larvale (0,09g), per poi diminuire e nuovamente aumentare nei successivi stadi larvali e di
opercolatura delle larve.
Il cambio di dieta delle larve di operaia a partire dal quarto stadio larvale e la
concomitante comparsa, in questa fase, della banda di attività proteolitica corrispondente
alla PS4 lasciano pensare ad una correlazione tra i due eventi.
La PS4 potrebbe essere sia una proteasi digestiva che una proteasi di tipo
regolativo, la cui espressione o la cui attivazione a livello post‐traduzionale sia indotta dal
cambio di dieta. Nel caso si tratti di una proteasi di tipo digestivo, questa potrebbe essere
Figura 21. Grafico dell’intensità relativa delle bande di attività dei gel di figura 3. Dati ottenuti permezzo del software Quantity One (BioRad).
50
impiegata per digerire il polline o le altre sostanze presenti in quantità minore nella
worker jelly. Questa sostanza è prodotta dalle operaie adulte e fornita, a partire dal
quarto stadio larvale, come alimento alle larve con destino di operaia. Nel caso si tratti
invece di una proteasi di tipo regolativo, la PS4 potrebbe intervenire sia per digerire
molecole specifiche che per attivarne altre (zimogeni), che a loro volta prendono parte ai
meccanismi molecolari di differenziamento dell’ape operaia in un processo a cascata di
reazioni.
Localizzazione dell’attività proteolitica nella larva di
operaia
Come ulteriore informazione per indagare la natura della PS4 è stata effettuata una
prova sperimentale in cui si è cercato di capire quale potesse essere la localizzazione
dell’attività proteolitica all’interno della larva. Per questo scopo ci siamo serviti di un
criostato, con cui alcune larve congelate di operaia del quinto stadio larvale sono state
tagliate longitudinalmente in fettine di 3µm di spessore. Il criostato si è rivelato
indispensabile per il mantenimento della compattezza dei tessuti delle larve, che una
volta scongelate assumono una consistenza simile ad un liquido viscoso e di conseguenza
risultano poco gestibili. Le fettine sono state adagiate su gel con gelatina allo 0,1% e
lasciate incubare a 37°C per 2 ore in un tampone Tris‐HCl 0,1M a pH8 per mantenere
umido il gel e permettere alle proteasi di agire.
Nello zimogramma di figura 22 si intravedono in blu scuro i contorni della sezione
longitudinale della larva di operaia, mentre la zona di gel in cui la gelatina è stata digerita
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cui sono state collezionate anche le larve) ed esaminati.
Gli estratti grezzi di gelatina reale, polline e larva di operaia sono stati caricati su gel
con gelatina allo 0,1% come mostrato in figura 23.
Dal gel emerge come l’attività proteolitica sia presente soltanto nell’estratto di
operaia e non nel polline e nella gelatina reale fornite alle larve. Quindi la PS4 sembra
essere una proteasi peculiare della larva di operaia, coerentemente con quanto mostrato
nell’esperimento precedente.
Attività proteolitica della larva di operaia su diversi
substrati proteici
Le zimografie dell’estratto grezzo di operaia sono state effettuate, inoltre, su gel
contenenti tre diversi substrati proteici in percentuali dello 0,1% per indagare
ulteriormente il ruolo della PS4 come enzima regolativo o digestivo. I tre substrati
utilizzati sono: gelatina animale (porcine gelatine, SIGMA), gelatina reale e polline. Se la
PS4 fosse un enzima digestivo ci aspetteremmo di trovare la banda corrispondente a
57KDa anche nei gel con gelatina reale o polline. Di fatto questo non si è verificato, infatti
analizzando i gel di figura 24 si osserva che la PS4, ben evidente nel gel con gelatina
animale (fig. 24a) è assente negli altri due gel contenenti gelatina reale (fig. 24b) e polline
(fig. 24c).
Figura 24. Ztre diversi s(M, 5µl), esRange (MH,0,1%, nel ge
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M
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M
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Inoltre nei gel b) e c) compaiono diverse altre proteasi nell’intervallo compreso tra i
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della digestione di gelatina reale e polline. Nel gel a) si notano invece tre bande di attività
proteolitica a bassa massa molecolare che non compaiono nella zimografia di figura 18.
Queste bande non sono sempre presenti nelle zimografie dell’estratto grezzo di larva di
operaia, e potrebbero imputarsi a diversi fattori, sia esogeni (periodo in cui sono state
prelevate le larve, età delle larve, temperatura esterna, tipo di polline assunto, ecc.) che
endogeni. Non ricorrendo costantemente, però, non sono stati al momento presi in
considerazione.
Come nelle altre zimografie i gel sono stati incubati in tampone Tris‐HCl 0,1M, pH8.
La stessa prova è stata però ripetuta incubando i gel in tamponi a pH diversi (Tris‐Acetato
pH6 e pH7, Tris‐HCl pH8 e pH9, Borato pH 10 e 11) per tentare di simulare le condizioni di
pH del gastro delle larve. Gli esiti sono stati gli stessi della prima prova (immagini non
riportate).
Il dato che emerge da questo esperimento sembra essere ancora a favore
dell’ipotesi di un ruolo regolativo della PS4 nel differenziamento.
Polline e induzione dell’attività proteolitica
Il cambio di dieta da gelatina reale a polline fa sì che una larva indifferenziata muti il
proprio destino per divenire un’operaia. Ci possiamo allora chiedere se sia il polline ad
inibire il destino di regina o, più presumibilmente, a favorire quello di operaia, o se al
co
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al contrario
5°C per diversdalle cellette35°C. I periodgenato di larvpolline (0h, 2h
56
regina o ad
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mostrato in
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si periodi die ed è statodi di tempova di reginah, 12h, 24h;
6
d
a
e
e
n
o
a
é
e
57
essere l’interruzione della somministrazione della gelatina reale a determinare la
comparsa della PS4 nelle larve che cambiano il proprio destino verso quello di operaia.
Gelatina reale e inibizione dell’attività proteolitica
Sulla base delle considerazioni precedenti si è cercato di verificare se in vitro la
gelatina reale potesse inibire la PS4 presente nelle larve differenziate di operaia. A tal
proposito gli omogenati di operaia sono stati incubati con e senza (controllo) gelatina
reale a 35°C per tempi diversi, e caricati su gel contenenti gelatina animale allo 0,1%,
come riportato in figura 26.
Nello zimogramma di fig. 26a, in assenza di gelatina reale, la PS4 compare a 57KDa
in tutti i pozzetti in cui sono stati caricati i campioni, ed indicate dalla freccia rossa si
vedono delle bande proteiche che al passare del tempo di incubazione tendono a
scomparire, presumibilmente digerite dalla PS4. Nel gel di fig. 26b invece, in cui
l’omogenato è stato incubato con gelatina reale, la PS4 sembra essere assente, e sembra
comparire una banda di attività proteolitica di massa molecolare inferiore. Inoltre le
bande proteiche evidenziate dalla freccia rossa permangono inalterate al passare del
tempo di incubazione, segno della mancata digestione da parte di una proteasi attiva.
La banda di attività proteolitica di massa molecolare inferiore a quella della PS4
sembra dunque essere inattiva sulle proteine presenti nel campione. Questa banda
potrebbe essere il risultato di una parziale degradazione della PS4 indotta dalla presenza
di gelatina reale, che determina una riduzione di massa molecolare della PS4, ma lascia
inalterata la capacità di digerire la gelatina animale. Dall’altra parte, invece, si potrebbe
ip
de
Fpctlso
potizzare la
ella gelatina
a)
b)
Figura 26. Zimperiodi di temcellette e sudtempo sono rlarva di operaservito come operaia del qu
M
M
sintesi ex n
a reale nel c
mografia dell’ompo. L’omogediviso in aliquriportati in figaia del quintocontrollo; fig.uinto stadio c
M 0min 30m
0min 30m
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campione.
omogenato denato di larvauote, ognuna ura. Fig. 26a, stadio senza . 26b, da sinison gelatina re
min 60min
min 60min
vazione di u
di larva di opea di operaia èdelle quali è sda sinistra a gelatina realestra a destra: eale (0min, 30
120min
120min
una nuova p
eraia incubatoè stato incubastata incubatadestra: Markee (0min, 30mMarker Low r0min, 60min, 1
proteasi in r
o con gelatinaato con gelatia per tempi der Low range in, 60min, 12range (M, 5µl120min; 30 µg
relazione al
a reale a 35°C na reale preliversi a 35°C. (M, 5µl), om
20min; 30 µg d), omogenatog di estratto).
58
la presenza
per diversi evata dalle i periodi di
mogenato di di estratto) o di larva di
8
a
59
pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 pH11
Sembra dunque che in vitro la gelatina reale influisca sull’attività della PS4 nelle
larve differenziate di operaia, facendo supporre che la somministrazione di gelatina reale
per tutti e cinque gli stadi larvali (come avviene nelle future regine) possa inibire la sintesi
o l’attivazione della PS4.
Studio dell’attività proteolitica delle larve di operaia in
funzione del pH
L’attività della PS4 comincia a manifestarsi su gelatina animale a pH7 e aumenta
passando da pH8 fino a toccare un massimo a pH9, per poi diminuire a pH 10 e 11. La PS4
è dunque una proteasi a carattere basico. Questa sua peculiarità è stata evidenziata
mediante zimografia, incubando in tamponi a diverso pH fettine di gel con gelatina allo
0,1% su cui è stato caricato l’estratto grezzo di operaia del quinto stadio larvale.
Figura 27. Attività proteolitica della PS4 in funzione del pH. In ogni pozzetto del gel sono stati caricati 30 µg di proteine dell’estratto grezzo di larva di operaia del quinto stadio larvale. Dopo la corsa il gel è stato tagliato in strisce corrispondenti ciascuna ad un pozzetto ed ogni striscia è stata incubata a 37°C per 2 ore in tamponi a diversi pH specificati in figura.
60
La figura 27 mostra gli zimogrammi risultanti dall’incubazione dei gel con tamponi a
pH da 5 a 11 (Tris‐Acetato pH6 e pH7, Tris‐HCl pH8 e pH9, Borato pH 10 e 11). Si è poi
proceduto all’analisi mediante software Quantity One per una esatta determinazione
dell’intensità delle bande corrispondenti alla PS4 (figura 28).
Studio della termostabilità dell’attività proteolitica
nelle larve di operaia del quinto stadio larvale
La temperatura è uno dei fattori che maggiormente influiscono sulla struttura, e di
conseguenza, sull’attività delle proteine, con particolare riferimento agli enzimi; è stato
dunque studiato il comportamento della PS4 nell’intervallo di temperatura compreso tra
‐20°C e 65°C.
Nella prova inerente alla resistenza alle alte temperature l’estratto grezzo di operaia
del quinto stadio larvale è stato suddiviso in aliquote da 100µl che sono state incubate
per 10 minuti a diverse temperature e successivamente caricate su gel con gelatina allo
Figura 28. Analisi mediante software Quantity One (BioRad) degli zimogrammi mostrati in figura 27.
61
0,1% per effettuare una zimografia come riportato in “Materiali e metodi”. La figura 29
mostra chiaramente come la PS4 sia una proteasi resistente a temperature relativamente
alte; la sua attività permane inalterata fino ai 40°C, diminuisce parzialmente fino ai 60°C,
per subire un crollo netto intorno ai 65°C. Si deve notare come nell’estratto grezzo
conservato a 4°C (controllo) l’attività della PS4 sia inferiore a quella dei campioni trattati
con temperature superiori a quella ambientale.
Sembra dunque che l’enzima abbia il suo ottimo di attività intorno ai 30‐35°C. In
concomitanza con la diminuzione dell’attività proteolitica della PS4, nell’intorno dei 65°C,
si nota la comparsa di una nuova banda di attività a più bassa massa molecolare. Questa
banda potrebbe essere il risultato, una volta che si superino i 60°C, di una parziale
degradazione o digestione della stessa PS4, che porta ad una diminuzione della sua massa
Figura 29. Zimogramma dell’attività proteolitica della larva di operaia del quinto stadio in funzionedella temperatura. L’estratto grezzo di larva di operaia è stato diviso in aliquote, ognuna delle quali è stata incubata per 10 minuti a diverse temperature specificate in figura sopra ogni pozzetto del gel. In ogni pozzetto sono stati caricati 30µg di proteine.
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62
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2
l
a
ì
i
63
Le basse temperature sembrano invece azzerare l’attività della PS4. Già nella
conservazione a 4°C è stato messo in evidenza un calo dell’attività proteolitica rispetto a
campioni trattati con temperature superiori ai 25°C; la zimografia di figura 30a mostra
chiaramente come i campioni di estratto grezzo conservati a ‐20°C per 24 ore perdano
completamente l’attività proteolitica imputata alla PS4.
Gli stessi campioni trattati con basse temperature, utilizzati per la zimografia di
figura 30a, sono stati caricati su un gel di poliacrilammide al 12% per effettuare una
SDS‐PAGE (fig. 302b). In questo caso sono state messe in evidenza le bande proteiche
presenti negli estratti grezzi. Laddove la PS4 manifesta ancora la sua attività proteolitica,
vale a dire nei campioni mantenuti a 4°C, si nota un numero di bande proteiche assai
inferiore a quello presente nel campione conservato a ‐20°C, in cui l’attività della PS4 è
venuta meno. Questo è sicuramente imputabile anche al fatto che a ‐20°C la maggior
parte degli enzimi è inattiva.
Effetto degli inibitori di proteasi su PS4
L’utilizzo di inibitori di proteasi, assieme agli altri risultati raccolti finora, ha
consentito la determinazione della natura della PS4. Ogni classe di proteasi è infatti
inibita, secondo il proprio meccanismo molecolare di azione, da specifiche sostanze:
l’EDTA è un inibitore delle metallo‐proteasi, l’E64 e la leupeptina delle cisteino‐proteasi,
la bestatina delle amino‐proteasi, la aprotinina, il PMSF e la leupeptina delle serino‐
proteasi, mentre il cocktail di inibitori è una miscela di tutti gli inibitori menzionati.
64
L’estratto grezzo di operaia del quinto stadio larvale è stato suddiviso in aliquote, ad
ognuna delle quali è stato aggiunto uno specifico inibitore di proteasi (40µl 10X ogni
1,5ml), come riportato in figura 31. La zimografia ha consentito di mettere in evidenza
quali inibitori riducano in modo consistente l’attività della PS4. Come è possibile
osservare, i tre inibitori delle serino proteasi (leupeptina, PMSF e aprotinina) e il cocktail
di inibitori, riducono considerevolmente l’attività della PS4, portando a concludere che la
proteasi in questione sia una serino‐proteasi.
Questo risultato sarebbe in accordo sia con un possibile ruolo digestivo della PS4,
dal momento che molti enzimi digestivi (tripsina, chimotripsina, ecc.) sono delle serino‐
M C EDTA E64 Bestatina Leupeptina Aprotinina PMSF Cocktail
Figura 31. Zimografia dell’estratto grezzo di operaia del quinto stadio larvale con aggiunta di inibitori di proteasi. Da sinistra a destra: M: Marker Low Range; W: estratto grezzo di larva di operaia del quinto stadio larvale (controllo); EDTA: inibitore di metallo‐proteasi; E64: inibitore di cisteino‐proteasi; Bestatina: inibitore di amino‐proteasi; Leupeptina: inibitore di cisteino‐proteasi e serino‐proteasi; Aprotinina: inibitore di serino‐proteasi; PMSF: inibitore di serino‐proteasi; Cocktail di inibitori.
65
proteasi, sia con un ruolo regolativo nel processo di differenziamento delle larve di
operaia, in cui, come noto, le serino‐proteasi rivestono una funzione centrale.
Zimografia bidimensionale dell’estratto proteico di
larva di operaia del quinto stadio larvale
La zimografia bidimensionale, così come la 2D‐PAGE, consente di separare le
proteine sia secondo il loro punto isoelettrico che secondo la loro massa molecolare,
mettendo inoltre in evidenza le proteine che hanno attività proteolitica. Ogni “spot
bianco” di uno zimogramma bidimensionale corrisponde, quindi, ad un tipo proteico che
possiede attività proteolitica sul substrato utilizzato.
Abbiamo visto che nella zimografia dell’estratto grezzo di larva di operaia è
presente una banda di attività che risulta completamente assente nelle larve di regina, e
che è stata imputata ad una proteasi, la PS4. La zimografia bidimensionale dello stesso
estratto ha messo in evidenza due spot corrispondenti all’incirca alla massa molecolare
della PS4 (fig. 32). Questo risultato può essere spiegato tenendo conto di molteplici
fattori, tra cui il diverso potere risolutivo delle zimografie mono‐ e bidimensionali e i
differenti trattamenti utilizzati nelle delle due tecniche. Per quanto concerne il primo
punto, posto di avere due gel con stessa percentuale di acrilamide e gelatina animale,
l’elettroforesi bidimensionale mostra un maggior potere risolutivo rispetto alla
monodimensionale, dovuto principalmente alle maggiori dimensioni del resolving gel e al
conseguente maggior tempo di corsa. Dal punto di vista del trattamento del campione
invece, le due tecniche presentano notevoli differenze: mentre l’elettroforesi
66
monodimensionale è effettuata in blande condizioni denaturanti, con la presenza del solo
SDS come detergente e senza l’ausilio di alcun riducente, la bidimensionale prevede
l’utilizzo del detergente zwitterionico CHAPS con l’aggiunta dell’urea come agente
denaturante e del DTT come riducente. Si devono inoltre considerare i tempi di
esecuzione dei due metodi, tenendo presente che, a partire dalla preparazione del
campione, in monodimensionale l’esperimento si esaurisce in poche ore, mentre nel caso
della bidimensionale occorrono circa due giorni, nel corso dei quali il campione può
andare incontro a modificazioni. Per esempio, durante l’isoelettrofocalizzazione, tutte le
molecole della PS4 vengono a concentrarsi in una ristretta porzione della strip, dove
potrebbero andare incontro a reazioni di parziale autolisi.
pH3 pH10
Figura 32. Zimogramma bidimensionale dell’estratto grezzo di larva dioperaia del quinto stadio larvale. Strip di 11 cm, pH 3‐10. T: 15%.
57,6KDa
49,6KDa
67
I due spot di attività proteolitica, secondo l’analisi con software PDQuest (BioRad),
risultano avere punto isoelettrico di 4,7 e massa molecolare rispettivamente di 57,6 e
49,6 KDa.
La banda di attività che abbiamo denominato PS4 avrebbe dunque carattere acido e
potrebbe essere costituita da due distinte proteasi corrispondenti ai due spot individuati
con la zimografia bidimensionale. Per comodità chiameremo queste due proteasi PS4a (a
più alta massa molecolare) e PS4b.
Zimografia bidimensionale del tratto gastrointestinale
di larva di operaia del quinto stadio
La zimografia bidimensionale ha consentito di confermare e approfondire i risultati
ottenuti con l’esperimento di figura 22.
pH3 pH10 pH3 pH10
Figura 33. Zimogrammi bidimensionali delle larve di operaia del quinto stadio private del trattogastrointestinale (sinistra) e del medesimo tratto gastrointestinale (destra). Strip 11 cm, pH 3‐10. T: 15%.
68
Dalle larve di operaia del quinto stadio larvale sono stati separati i tratti
gastrointestinali mediante l’uso del criostato, così da poter confrontare lo zimogramma
dell’estratto grezzo dei soli tratti digerenti con quello delle larve private di tali apparati.
Come si può osservare in figura 33, l’intera attività proteolitica si trova nello zimogramma
relativo ai soli tratti gastrointestinali (fig.33, destra), così come ipotizzato
precedentemente. Il pattern proteolitico è inoltre del tutto simile a quello mostrato in
figura 32. Si confermerebbe quindi l’ipotesi di un coinvolgimento delle PS4a e PS4b in un
eventuale rimodellamento molecolare a livello del gastro.
L’attività proteolitica corrispondente alla PS4 è stata dunque classificata di tipo
serino‐proteasico (fig. 31), con punto isoelettrico acido. Non possiamo specificare,
tuttavia, se sia la PS4a che la PS4b appartengano al gruppo delle serino‐proteasi. Nel gel
di figura 31, infatti, non tutta l’attività proteolitica viene annullata dagli inibitori, per cui
una delle due attività potrebbe essere di altro tipo.
Per tentare di ottenere l’identificazione delle PS4a e b è stata effettuata una
comparazione tra lo zimogramma bidimensionale e la 2D‐PAGE dell’estratto grezzo di
operaia.
Comparazione tra la zimografia bidimensionale e la
2DPAGE di operaia del quinto stadio larvale
L’identificazione tramite MALDI‐TOF di una proteasi proveniente da uno
zimogramma bidimensionale non è attuabile a causa dei residui di gelatina animale che
permangono nella porzione di gel in cui la proteasi in esame ha digerito il substrato.
69
Attraverso la comparazione di uno zimogramma bidimensionale e di una 2D‐PAGE
dello stesso campione, però, può essere possibile identificare nella 2D‐PAGE lo spot
proteico corrispondente alla proteasi di interesse dello zimogramma.
La figura 34 mostra il risultato della prova in parallelo effettuata sottoponendo
l’estratto grezzo di operaia alle due tecniche menzionate.
a) b)
La freccia nel gel a) indica la PS4a; all’interno dell’alone bianco lasciato dalla
digestione del substrato da parte della PS4a si può osservare la presenza di uno spot
corrispondente ad un tipo proteico. Nel gel b) è evidenziato lo stesso spot, visibile in
misura maggiore grazie alla colorazione “silver staining”. La concomitanza dell’alone
bianco nella zimografia e dello spot nella 2D‐PAGE ha fatto supporre che i due
corrispondessero entrambe alla proteasi PS4a, mentre non si osservano spot
Figura 34. Confronto tra la zimografia bidimensionale (a) e la 2D‐PAGE (b) dell’estratto grezzo dioperaia del quinto stadio larvale. Strip pH 3‐10, 11cm. Gel al 15%. Colorazione del gel a con Coomassieblue, del gel b con silver staining MALDI compatibile.
54,3KDa
70
corrispondenti alla PS4b. Lo spot corrispondente alla PS4a, prelevato dal gel della
2D‐PAGE, è stato fatto analizzare mediante spettrometria di massa MALDI‐TOF.
La ricerca in banca dati per lo spot in questione ha individuato la sequenza della
nucleoplasmina di Apis mellifera. Di seguito è riportata la sequenza amminoacidica della
nucleoplasmina di ape (da NCBI):
maeeylygit leglnssevw dpehknddad gtnqhfgadq kliikmallg peakpgelnv lqveamglkg piktpialle mgktaqiild lsfpdppvtf tlvkgsgpvh ivghnllgth meefddmdde meeenidddd ddkepedeed dedepkkkna klttaakykn qanknkkk
Questa sequenza è stata predetta tramite analisi computazionale della sequenza
genomica annotata NW_001253215 (NCBI) utilizzando il metodo GNOMON. La sequenza
consta di 178 amminoacidi, per una massa molecolare di 19.658Da.
Struttura e funzioni della nucleoplasmina
Per la prima volta la nucleoplasmina è stata isolata nel 1978 dalle uova ed oociti di
Xenopus laevi ed è stata descritta come una proteina acida (con punto isoelettrico pari
a 5), termostabile, appartenente alla famiglia delle chaperonine nucleari (Ellis, 2006).
I membri della famiglia delle chaperonine nucleari sono stati osservati in tutto il regno
animale. Gli elementi della famiglia delle nucleoplasmine mostrano una somiglianza non
solo nella loro sequenza aminoacidica primaria, ma anche nell’ organizzazione dei loro
71
domini e nella struttura terziaria. Le nucleoplasmine possono essere suddivise in 4 gruppi
sulla base della loro sequenza proteica (Eirin‐Lopez et al., 2006) (fig. 35).
Per quanto riguarda la struttura, la nucleoplasmina in Xenopus è decamerica con
monomeri di 200 aminoacidi (Dingwall et al., 1987). Il decamero è lungo 80Å e ha un
diametro di 60Å, i due pentameri che lo costituiscono sono a forma di anello posti faccia a
faccia con una sfasatura di 15° (fig.36).
Gruppo Localizzazione Proprietà e funzioni
NPM1 prevalentemente nucleolare
ampia distribuzione nei tessuti di mammiferi ed anfibi
biogenesi ribosomiale trasporto nucleocitoplasmatico sviluppo embrionale e stabilità
genomica duplicazione del DNA
regolazione trascrizionale legame e ripiegamento delle
proteine denaturate legame con acido nucleico
NPM2 nucleare osservata solo nelle uova ed
oociti di anfibi
legame con gli istoni assemblaggio nucleosomiale
decondensazione della cromatina paterna
NPM3 principalmente nucleolare
ampia distribuzione nei tessuti di anfibi
biogenesi RNA ribosomiale probabile ruolo nella
decondensazione della cromatina paterna nei mammiferi
dNLP oocita e uova di Drosophila
legame con gli istoni assemblaggio nucleosomiale (ATP‐
dipendente) decondensazione cromatina
spermatica
Figura 35. Schema riassuntivo dei 4 gruppi di nucleo plasmine conosciute.
72
Figura 36. (a) struttura della nucleoplasmina di Xenopus, vista frontale del decamero. I due pentameri(in rosso ed in blu) sono sfasati l’uno rispetti all’altro di 15°. (b) Rappresentazione del decamero visto dilato. Si può notare i β‐hairpin che sporgono verso l’esterno. In rosso ed in blu sono rappresentaterispettivamente la distribuzione delle cariche negative e delle cariche positive (R.J. Ellis, 2006).
I monomeri della subunità pentamerica sono costituiti da 8 β‐foglietti con una
struttura a “jellyroll” e sono allineati pressappoco parallelamente. Un β‐hairpin che si
trova in ogni monomero gioca un ruolo importante nella determinazione della formazione
del pentamero. Infatti due opposti β‐hairpin permettono la formazione della superficie
laterale concava determinando la conformazione idonea all’interazione del decamero con
il dimero istonico H2A‐H2B (fig.37).
I monomeri della nucleoplasmina presentano un dominio C‐terminale flessibile
costituito da 80 aminoacidi, che include i due tratti acidi A2 (un ampio tratto
poliglutammico costituito da 20 aminoacidi) e A3 (un tratto acido più piccolo costituito da
5 aminoacidi) (Bañuelos et al., 2003) (fig.38A). È inoltre presente una sequenza basica
bipartita di localizzazione nucleare (NLS). Studi su questo elemento della proteina
(Dingwall et al., 1982) hanno dimostrato che la NLS è una lunga sequenza con due domini
73
indipendenti di aminoacidi basici responsabili del trasporto della nucleoplasmina dal
citoplasma, dove viene sintetizzata, al nucleo (Dingwall et al., 1987). Il trasporto avviene
grazie al legame della sequenza di localizzazione nucleare al dimero α‐β delle importine
(Fontes et al., 2000; Luger, 2006).
Nel monomero, il dominio N‐terminale è altamente conservato, è compreso nei
primi 20 aminoacidi e contiene un piccolo tratto acido A1 (fig. 38A).
Figura 37. In questa figura è mostrata la superficie di interazione tra l’ottamero istonico ed il decamerodella nucleoplasmina. La superficie laterale concava del decamero è creata da due opposti β‐hairpin. Leipotetiche posizioni dei tratti A1 e A2 sono indicate dalle linee punteggiate. Il complesso decamero‐ottamero è visto di lat. (S. Dutta et al., 2001)
74
Le funzioni della nucleoplasmina sono quelle di rimodellamento della cromatina
spermatica mediante rimozione di proteine spermatiche basiche (SPs);
immagazzinamento delle proteine istoniche nell’oocita; assistenza nell’assemblaggio del
nucleosoma durante i primi stadi dello sviluppo embrionale fino alla MBT (medium‐
blastula‐transition) (Ellis, 2006).
Per quanto riguarda l’immagazzinamento degli istoni, nel nucleo dell’oocita è
presente una gran quantità di istoni accumulati e pronti per essere utilizzati al momento
della replicazione del DNA nelle uova appena fecondate. La nucleoplasmina in questo
Figura 38. (A) rappresentazione schematica di nucleoplasmina di Xenopus (NP) e nucleoplasmin‐likeprotein di Drosophila (dNLP); sono mostrate le posizioni dei tratti acidi (A1,A2,A3 ) ed il segnale dilocalizzazione nucleare (NLS). Il tratto N‐terminale (core) è evidenziato dalla barra nera in basso. (B)forma pentamerica della dNLP (in verde) e di NP (in blu). Sono anche indicatele posizioni dei β‐hairpin dientrambe e quella del tratto A1 per la dNLP. (C) il confronto tra i monomeri di dNLP (in verde) e di NP (inblu) ne mostra le differenze: in dNLP il tratto A1 ed il β‐hairpin si proiettano verso il basso dellasubunità; in NP il β‐hairpin mostra un orientamento verso l’esterno rispetto alla superficie laterale dellasubunità (L.J. Frehlick et al., 2007)
75
caso esercita una funzione di stoccaggio degli istoni, soprattutto H2A‐HB, anche se in vitro
è stato osservata un’affinità per gli istoni H3‐H4 (Kleinschmidt et al., 1990).
Il rimodellamento della cromatina spermatica avviene mediante la rimozione delle
SPs dal DNA spermatico in concomitanza con la deposizione degli istoni (H2A‐H2B)
provenienti dall’oocita (Bañuelos et al., 2003). In uno stadio iniziale, immediatamente
dopo la fecondazione, la cromatina spermatica contiene due tipi di protammine SP2 ed
SP6 (Mann et al., 1982) e due tetrameri istonici (H3‐H4), mentre la nucleoplasmina
iperfosforilata porta legati alla sua superficie laterale i dimeri istonici H2A‐H2B. Quando
entrano in contatto le proteine spermatiche e la nucleoplasmina, le SPs si dissociano dalla
cromatina e si legano alla superficie distale del pentamero mediante interazioni
elettrostatiche favorite dall’iperfosforilazione della nucleoplasmina (Cotten et al.,1986). Il
legame delle protammine con la nucleoplasmina si risolve in una alterazione strutturale
della proteina e questo conduce all’annullamento delle interazioni stereospecifiche fra la
chaperonina e il dimero H2A‐H2B, che si dissocia dalla superficie laterale. Poichè queste
reazioni hanno luogo in prossimità della cromatina spermatica priva di SPs, il dimero può
ora legarsi al DNA disponibile, che già contiene il tetramero (H3‐H4) paterno, formando la
struttura nucleosomiale di tipo somatico (Philpott e Leno, 1992).
Dopo la sostituzione delle SPs con il nucleo istonico, prima che si formi la struttura
definitiva della cromatina sono richieste altre modifiche della cromatina stessa, come per
esempio la deacetilazione degli istoni, la fosforilazione e l’incorporazione di altre proteine
istoniche, tipo l’H1 istone di collegamento (Nightingale et al., 1996; Ura et al., 1996). In
questo processo di rimodellamento della cromatina spermatica è coinvolto il tratto acido
A2 (tratto poliglutammico) che è responsabile del legame delle SPs (Prieto et al., 2002).
76
La nucleoplasmina, oltre a rimodellare la cromatina spermatica, presiede
all’assemblaggio del nucleosoma. Già da tempo è stato dimostrato che il pentamero di
nucleoplasmina è in grado di legare un ottamero istonico (Earnshaw et al., 1980). Un
ulteriore conferma è giunta da studi più recenti (Arnan et al., 2003) che si sono avvalsi di
tecniche analitiche di ultracentrifugazione. Un modello proposto (Ellis, 2006) in seguito
alla raccolta dei dati disponibili, prevede che cinque dimeri H2A‐H2B si leghino in modo
simmetrico alla superficie concava laterale mediante interazioni fra il tratto A1 del
monomero di nucleoplasmina e le estremità N‐terminali positive degli istoni (Namboodiri
et al., 2003). Quindi cinque tetrameri H3‐H4 si possono legare ai dimeri per produrre
cinque ottameri istonici. Il meccanismo è schematizzato in fig.39.
In questo modello è chiara l’essenziale funzione di chaperonina della
nucleoplasmina che previene un erroneo assemblaggio del nucleo istonico agendo come
perno per un lato dell’ottamero (Ellis, 2006). Ancora non è chiaro come l’ottamero venga
trasferito al DNA. Questo meccanismo è stato osservato nelle prime fasi dello sviluppo
embrionale. In questo stadio intervengono altre chaperonine nucleari, col compito di
aiutare la deposizione degli istoni a livello del DNA. In particolare, in Xenopus ed in
Drosophila è stata studiata la N1/N2 che può fornire gli istoni H3 e H4 per la formazione
degli ottameri (Akey et al., 2003); questa funzione può non essere richiesta nelle prime
fasi della fecondazione in Xenopus poichè, come precedentemente accennato, gli istoni
H3‐H4 sono già presenti nella cromatina spermatica. Al contrario del processo di
rimodellamento della cromatina spermatica che, abbiamo visto essere modulato dal
grado di fosforilazione, l’assemblaggio del complesso istonico, quindi il legame con gli
istoni, è indipendente dal livello di fosforilazione (Prado et al., 2004).
77
La nucleoplasmina è coinvolta nelle prime fasi di decondensazione della cromatina
spermatica. Essa lega e rimuove le proteine spermatiche e le sostituisce con gli istoni. Tale
attività dipende da una iperfosforilazione della chaperonina che avviene durante la
Figura 39. Modello di assemblaggio ottamero istonico. (a) vista frontale. (b) vista laterale. Il pentamerodi nucleoplasmina (blu e giallo) dimerizza per dare un decamero. La formazione del decamero determinaun cambio conformazionale nel pentamero questo fa si che i β‐hairpin si estendano verso l’esterno. Idimeri H2A‐H2B (in rosso) si leghino ai β‐hairpin ed ai tratti acidi A1 del decamero. Un tetramero H3‐H4(in verde) in seguito si lega ad ogni dimero a formare un ottamero. Questo legame si ripete cinque voltea livello della superficie laterale del decamero, il risultato è un complesso decamero‐ottamero (Ellis,2006).
78
maturazione dell’oocita in uovo. Estratti di uova con nucleoplasmina iperfosforilata hanno
dimostrato di decondensare la cromatina spermatica e rimuovere le protammine molto
più velocemente rispetto agli estratti di oocita. Invece la defosforilazione della
nucleoplasmina di uovo rallenta questi processi (Leno et al., 1996). L’ iperfosforilazione
determina un aumento della carica negativa netta sul decamero per l’aggiunta di circa
200 fosfati su tutto il pentamero (15‐20 per monomero). L’incremento di gruppi fosfato
inizia quando l’oocita entra in meiosi e trova la massima espressione nell’uovo maturo
(Sealy et al., 1986). La nucleoplasmina perde il suo stato di iperfosforilazione dopo la
MBT, uno stadio in cui è attivata per la prima volta la trascrizione ed il ciclo cellulare
aumenta la sua durata (Newport et al., 1982). Un’ipotesi è che la nucleoplasmina possa
avere il massimo grado di fosforilazione prima della transizione a medio‐blastula per
mantenere una conformazione della cromatina aperta, la quale permetterebbe un rapido
ciclo di replicazione del DNA e le divisioni cellulari caratteristiche dei primi stadi di
sviluppo embrionale (Prado et al., 2004).
In letteratura sono difficilmente reperibili informazioni sull’attività della
nucleoplasmina nelle cellule somatiche dopo la MBT. Perciò l’attività e le eventuali
modifiche a carico di questa proteina, nel periodo d’interesse per questo lavoro di
dottorato (avanzato stadio larvale), sono ancora sconosciute. Inoltre, dai dati presenti in
letteratura non emerge in nessun caso un possibile ruolo della nucleoplasmina come
proteasi; questo è uno dei principali motivi che ci ha spinti ad ulteriori indagini sulle
funzioni della nucleoplasmina e su una sua possibile corrispondenza con la PS4a.
79
Nucleoplasmina e PS4 nel differenziamento in Apis
mellifera
Per aumentare il potere risolutivo della 2D‐PAGE, è stata effettuata una
comparazione analoga alla precedente, in cui la percentuale di acrilamide nei due gel è
stata portata dal 15 al 12% e la corsa elettroforetica è stata protratta per ulteriori due ore
rispetto alla prova precedente.
Si osserva come in questo caso (fig.40) la nucleoplasmina dell’ape e le PS4 risultino
nettamente distinte, pur mostrando masse molecolari e punti isoelettrici simili. Inoltre,
agli spot delle PS4a e b nello zimogramma bidimensionale non si associa alcuno spot
proteico nel gel della 2D‐PAGE.
Figura 40. Confronto tra la zimografia bidimensionale (sinistra) e la 2D‐PAGE (destra) dell’estratto grezzo di operaia del quinto stadio larvale. Strip pH 3‐10, 11cm. Gel al 12%. Colorazione: a) Coomassie Blue, b) Silver Staining MALDI compatibile.
80
Questo risultato ci ha fatto escludere definitivamente una funzione proteolitica
della nucleoplasmina. Inoltre, dalla massa molecolare della sequenza della
nucleoplasmina dell’ape e dai dati riportati in letteratura, si ipotizza una struttura
multimerica della nucleoplasmina, che nel gel elettroforetico è presente con massa
molecolare di circa 46KDa.
Per quanto concerne la mancata corrispondenza tra gli spot di attività proteolitica e
gli spot proteici delle PS4, l’evidenza sperimentale porta a credere che le proteasi siano
presenti in quantità non rilevabile con l’elettroforesi bidimensionale, ma che la loro
attività proteolitica sia elevatissima. Si rende allora infattibile, nel nostro caso, una
possibile identificazione delle proteasi con le tecniche finora utilizzate.
Comparazione delle 2DPAGE di larve di operaia e
regina del quinto stadio larvale
L’analisi comparativa delle larve di regina e operaia del quinto stadio larvale è stata
effettuata mediante 2D‐PAGE (fig. 41). In questo caso agli estratti grezzi delle larve sono
stati aggiunti gli inibitori di proteasi per avere un quadro completo del pattern proteico
dei due tipi larvali. Il software PDQuest (BioRad) ha individuato 76 spot identici nei due
gel (immagine non riportata), mentre le differenze più marcate si osservano alle alte
masse molecolari, in cui nel gel dell’estratto grezzo di operaia è presente una serie di
proteine non riscontrabile in quello delle regine.
81
Sulla base dei dati raccolti in letteratura abbiamo ipotizzato che le proteine in
questione potessero essere varie forme di polimerizzazione e/o polifosforilazione della
nucleoplasmina; questo spiegherebbe il cambiamento di massa molecolare e, allo stesso
tempo, del punto isoelettrico delle potenziali isoforme trovate. Inoltre, in regina e
operaia, la differenza di massa molecolare e di punto isoelettrico degli spot che a nostro
avviso corrisponderebbero alla nucleoplasmina fanno pensare ad un diverso ruolo della
proteina nelle due caste durante il differenziamento.
La conferma della nostra ipotesi è stata ottenuta mediante western blotting e
immunorivelazione.
Per poter effettuare il western blotting delle 2D‐PAGE di operaia e regina è stato
utilizzato un anticorpo policlonale ottenuto mediante la costruzione di un oligomero della
sequenza della nucleoplasmina dell’ape:
Figura 41. Confronto tra le 2D‐PAGE di larve di operaia (sinistra) e regina (destra). Nei gel sono staticaricati 2500µg di estratto grezzo. Gel al 12%, strip pH3‐10, 11cm. Colorazione silver staining MALDIcompatibile.
69,1KD64,8KD 55,2KD
50,3KD 43,0KD41,3KD 37,4KD
34,3KD
>70KDa
82
maeeylygit leglnssevw dpehknddad gtnqhfgadq kliikmallg peakpgelnv lqveamglkg
piktpialle mgktaqiild lsfpdppvtf tlvkgsgpvh ivghnllgth meefddmdde meeenidddd
ddkepedeed dedepkkkna klttaakykn qanknkkk
La parte evidenziata in rosso, con l’aggiunta di una cisteina che permette di
veicolare l’oligomero ad un carrier (ssevwdpehknddadgc), è stata utilizzata per la
produzione dell’anticorpo.
Western blotting della 2DPAGE di larve di operaia del
quinto stadio larvale
Per effettuare il blotting è stata eseguita una 2D‐PAGE dell’estratto grezzo di
operaia del quinto stadio larvale. La membrana PVDF (fig. 42, destra) mostra come diversi
spot del gel della 2D‐PAGE (fig. 42, sinistra), sia ad alta che a bassa massa molecolare, si
siano legati all’anticorpo anti‐nucleoplasmina. Il western blotting e l’immunorivelazione
hanno dunque confermato l’ipotesi secondo cui gli spot compresi tra i 70 e i 34KDa,
evidenziati dal cerchio rosso, potessero essere diverse conformazioni polimeriche della
nucleoplasmina. Alcune differenze negli spot relativi alla nucleoplasmina dei gel
bidimensionali sono imputabili a piccole differenze di età delle larve utilizzate per gli
esperimenti.
Nella parte bassa della membrana si notano inoltre numerosi spot, risultato che
potrebbe dipendere da una non elevata specificità dell’anticorpo primario, essendo
questo policlonale.
83
Analoga prova sperimentale è stata effettuata per le larve di regina del quinto
stadio larvale.
Western blotting della 2DPAGE di larve di regina del
quinto stadio larvale
In questa prova, nella membrana PVDF (figura 43, destra) sono stati immunorilevati
gli spot ad alta massa molecolare evidenziati nel gel (figura 43, sinistra), oltre ad ulteriori
spot di media e bassa massa molecolare. Di nuovo si conferma l’ipotesi che gli spot ad
alta massa molecolare possano corrispondere a diverse forme polimeriche della
nucleoplasmina.
Figura 42. 2D‐PAGE dell’estratto grezzo di operaia del quinto stadio larvale (sinistra) e membrana PVDF conimmunorivelazione delle varie forme di nucleoplasmina (destra). Gel al 12%, caricati 2500µg. Strip pH3‐10,11cm. Colorazione in silver staining MALDI compatibile.
84
La nucleoplasmina sembra dunque essere espressa in entrambe le larve, ma con
diversa conformazione. Tali evidenze suggeriscono che la diversa distribuzione dei
polimeri di nucleoplasmina possa essere la conseguenza di modifiche post‐traduzionali a
cui la chaperonina va incontro durante lo sviluppo larvale.
Figura 43. 2D‐PAGE dell’estratto grezzo di regina del quinto stadio larvale, (sinistra), e membranaPVDF con immunorivelazione delle varie forme di nucleoplasmina (destra). Gel al 12%,caricati 2500µg.Strip pH3‐10, 11cm. Colorazione in silver staining MALDI compatibile.
88,9KD85,1KD75,7KD
50,4KD
71,4KD
68,4KD
60,8KD
Conclusioni
86
Da quanto emerso nella sperimentazione di questi tre anni di dottorato, è possibile
trarre diverse conclusioni.
La 2D‐PAGE e la zimografia bidimensionale si sono rivelate strumenti immediati in
grado di fornire un’analisi qualitativa del pattern proteico e proteolitico nelle due diverse
caste di Apis mellifera, la regina e l’operaia. La capacità risolutiva della 2D‐PAGE ha
esaltato le differenze a livello del pattern proteico larvale, portando, mediante la tecnica
MALDI‐TOF, all’individuazione della nucleoplasmina. La zimografia bidimensionale ha
inoltre consentito di evidenziare le differenze nel pattern proteolitico delle larve di regina
e operaia, mostrando in particolare la presenza costante, nelle larve differenziate di
operaia, delle due proteasi PS4a e PS4b. Queste proteasi potrebbero corrispondere a due
serino‐proteasi. Gli esperimenti finora effettuati lasciano ancora irrisolta la questione del
ruolo di queste proteasi come digestive o regolative.
Mediante il western blotting e l’immunorivelazione abbiamo confermato la
presenza della nucleoplasmina nelle sue diverse forme nel complesso quadro proteico
larvale. In base ai nostri risultati abbiamo potuto osservare la presenza in operaia di
numerose forme polimeriche diverse di nucleoplasmina, che differiscono per punto
isoelettrico e massa molecolare. Queste diverse forme potrebbero essere dovute a
modifiche post‐traduzionali della chaperonina. La nucleoplasmina presenta inoltre forme
polimeriche diverse in regina e operaia.
I risultati ottenuti rappresentano la prima descrizione oggi disponibile della
presenza delle nucleoplasmina in Apis mellifera.
La PS4 e la nucleoplasmina sono concomitanti nell’operaia: l’attività proteolitica è
presente soltanto nell’operaia, con punto isoelettrico e massa molecolare simili a quelle
della nucleoplasmina; nella regina, dove l’attività proteolitica è assente, la
87
nucleoplasmina si mostra con una o poche forme polimeriche. I dati raccolti potrebbero
suggerire che l’attività proteolitica, evidenziata mediante le zimografie precedentemente
mostrate, possa essere alla base delle variazioni strutturali della chaperonina nucleare.
Alla luce di quanto osservato possiamo ipotizzare un possibile coinvolgimento della
nucleoplasmina e delle PS4a e PS4b nel differenziamento di casta in Apis mellifera. Poiché
uno dei ruoli della nucleoplasmina è quello di regolare l’assemblaggio dei nucleosomi, e di
conseguenza determinare quali zone del DNA siano di volta in volta trascrizionalmente
attive o inattive, la nostra ipotesi è che le diverse forme polimeriche della nucleoplasmina
da noi osservate nell’operaia si possano ripercuotere sull’attività della proteina come
chaperonina nucleare.
Le diverse caratteristiche strutturali della nucleoplasmina nelle due caste, messe in
evidenza in questo lavoro di dottorato, potrebbero dunque rispecchiare una diversa
funzionalità della proteina nel differenziamento; questo potrebbe risolversi in una
diversificata espressione genica nelle larve di regina e operaia, ed in ultima analisi,
portare alla manifestazione del polifenismo di casta.
Letteratura citata
89
Abouheif E, Wray GA. (2002). Evolution of the gene network underlying wing
polyphenism in ants. Science, Vol. 297, Issue 5579, pp. 249‐252.
Akey C.W., Luger K. (2003). Histone chaperones and nucleosome assembly. Current
opinion in structural biology, Vol. 13, Issue 1, pp. 6‐14
Anderson C., McShea D.W. (2001). Individual versus social complexity, with particular
reference to ant colonies. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society,
Vol. 76, Issue 2, pp. 211‐237.
Anderson N.L., Anderson N.G. (1998). Proteome and proteomics: new technologies, new
concepts, and new words. Electrophoresis, Vol. 19, Issue 11, pp. 1853‐1861.
Arnan C., Saperas N., Prieto C., Chiva M., Ausió J. (2003). Interaction of nucleoplasmin
with core histones. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, Issue 33,
pp. 31319‐31324.
Bakhtiar R., Nelson R.W. (2000). Electrospray ionization and matrix‐assisted laser
desorption ionization mass spectrometry. Emerging technologies in biomedical sciences.
Biochemical Pharmacology, Vol. 59, Issue 8, pp. 891‐905.
Bañuelos S., Hierro A., Arizmendi J.M., Montoya G., Prado A., Muga A. (2003). Activation
mechanism of the nuclear chaperone nucleoplasmin: role of the core domain. Journal of
Molecular Biology, Vol. 334, Issue 3, pp. 585‐593.
Barchuk A.R., Cristino A.S., Kucharski R., Costa L.F., Simões Z.L., Maleszka R. (2007).
Molecular determinants of caste differentiation in the highly eusocial honeybee Apis
mellifera. BMC Developmental Biology, Vol. 7, No. 70.
Barrett A.J. (2001). Proteolytic enzymes: nomenclature and classification. In: Beynon R.,
Bond J.S. (eds.) “Proteolytic Enzymes: A Practical Approach”, Oxford University Press,
pp. 1‐22.
90
Barrett J., Jefferies J.R., Brophy P.M. (2000). Parasite proteomics. Parasitology Today,
Vol. 16, Issue 9, pp. 400‐403.
Bernardi R., Tedeschi G., Ronchi S., Palmieri S. (1996). Isolation and some molecular
properties of a trypsin‐like enzyme from larvae of European corn borer Ostrinia nubilalis
Hübner (Lepidoptera: pyralidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 26,
Issues 8‐9, pp. 883‐889.
Berner R., Rudin W., Hecker H. (1983) Peritrophic membranes and protease activity in
the midgut of the malaria mosquito, Anopheles stephensi (Liston) (Insecta: Diptera) under
normal and experimental conditions, Journal of Ultrastructure Research, Vol. 83, Issue 2,
pp. 195‐204.
Blanco‐Labra A., Martínez‐Gallardo N.A., Sandoval‐Cardoso L., Delano‐Frier J. (1996).
Purification and characterization of a digestive cathepsin D proteinase isolated from
Tribolium castaneum larvae (Herbst). Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 26,
Issue 1, pp. 95‐100.
Bloch G. (1999). Regulation of queen‐worker conflict in bumble‐bee (Bombus terrestris)
colonies. Proceedings: Biological Sciences, Vol. 266, Issue 1437, pp. 2465‐2469.
Bloch G., Hefetz A. (1999). Regulation of reproduction by dominant workers in bumble
bee (Bombus terrestris) Queenright Colonies. Behavioral Ecology and Sociobiology,
Vol. 45, Issue 2, pp. 125‐135.
Bortolotti L., Duchateau M.J., Sbrenna G. (2001). Effect of juvenile hormone on caste
determination and colony processes in the bumblebee Bombus terrestris. Entomologia
Experimentalis et Applicata, Vol. 101, Issue 2, pp. 143‐158.
91
Bourke A.F., Ratnieks F.L. (2001). Kin‐selected conflict in the bumble‐bee Bombus
terrestris (Hymenoptera: Apidae). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences,
Vol. 268, Issue 1465, pp. 347‐355.
Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein‐dye binding. Analytical
Biochemistry, Vol. 72, pp. 248‐254.
Brakefield P.M., Pijpe J., Zwaan B.J. (2007). Developmental plasticity and acclimation
both contribute to adaptive responses to alternating seasons of plenty and of stress in
Bicyclus butterflies. Journal of Biosciences, Vol. 32, Issue 3, pp. 465‐75.
Broadway R.M. (1995). Are Insects Resistant to Plant Proteinase Inhibitors? Journal of
Insect Physiology, Vol. 41, Issue 2, pp. 107‐116.
Chan Q.W., Howes C.G., Foster L.J. (2006). Quantitative comparison of caste differences
in honeybee hemolymph. Molecular & Cellular Proteomics, Vol. 5, Issue 12, pp. 2252‐
2262.
Christeller J.T., Laing W.A., Markwick N.P., Burgess E.P.J. (1992). Midgut protease
activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae: Dietary and protease inhibitor
interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 22, Issue 7, pp. 735‐746.
Cnaani J., Borst D.W., Huang Z.Y., Robinson G.E., Hefetz A. (1997). Caste determination
in Bombus terrestris: differences in development and rates of JH biosynthesis between
queen and worker larvae. Journal of Insect Physiology, Vol. 43, Issue 4, pp. 373‐381.
Cnaani J., Hefetz A. (2001). Are queen Bombus terrestris giant workers or are workers
dwarf queens? Solving the ‘chicken and egg’ problem in a bumblebee species.
Naturwissenschaften, Vol. 88, Issue 2, pp. 85‐87.
Contessi A. (1990). Le api. Biologia, allevamento, prodotti. Edagricole.
92
Cotten M., Sealy L., Chalkley R. (1986). Massive phosphorylation distinguishes Xenopus
laevis nucleoplasmin isolated from oocytes or unfertilized eggs. Biochemistry, Vol. 25,
Issue 18, pp. 5063‐5069.
Cristino A.S., Nunes F.M., Lobo C.H., Bitondi M.M., Simões Z.L., da Fontoura Costa L.,
Lattorff H.M., Moritz R.F., Evans J.D., Hartfelder K. (2006). Caste development and
reproduction: a genome‐wide analysis of hallmarks of insect eusociality. Insect Molecular
Biology, Vol. 15, Issue 5, pp. 703‐714.
Dadd R. (1956). Proteolytic activity of the midgut in relation to feeding in the beatle
Tenebrio molitor L. and Dytiscus marginalis L.. Journal of Experimental Biology, Vol. 33,
Issue 2, pp. 311‐324.
Darwin C. (1859). The origin of species by means of natural selection. John Murray,
London.
Dingwall C., Dilworth S.M., Black S.J., Kearsey S.E., Cox L.S., Laskey R.A. (1987).
Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of
sequences homologous to putative nuclear localization signals. EMBO Journal, Vol. 6,
Issue 1, pp. 69‐74.
Dingwall C., Sharnick S.V., Laskey R.A. (1982). A polypeptide domain that specifies
migration of nucleoplasmin into the nucleus. Cell, Vol. 30, Issue 2, pp. 449‐458.
Duchateau M.J., Velthuis H.H.W. (1988). Development and Reproductive Strategies in
Bombus Terrestris Colonies. Behaviour, Vol. 107, Numbers 3‐4, pp. 186‐207.
Dunn, B.M. (2001). Determination of protease mechanism. In: Beynon R., Bond J.S. (eds.)
“Proteolytic Enzymes: A Practical Approach”, Oxford University Press, pp. 77‐104.
93
Earnshaw W., Honda B.M., Thomas J.O., Laskey R. (1980). Assembly of nucleosomes: the
reaction involving X. laevis nucleoplasmin. Cell, Vol. 21, Issue 2, pp. 373‐383.
Eirín‐López J.M., Frehlick L.J., Ausió J. (2006). Long‐Term Evolution and Functional
Diversification in the Members of the Nucleophosmin/Nucleoplasmin Family of Nuclear
Chaperones. Genetics, Vol. 173, Issue 4, pp. 1835‐1850.
Ellis R.J. (2006). Molecular chaperones: assisting assembly in addition to folding. Trends in
Biochemical Sciences, Vol. 31, Issue 7, pp. 395‐401.
Evans J.D., Wheeler D.E. (1999) Differential gene expression between developing queens
and workers in the honey bee, Apis mellifera. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the U.S.A., Vol. 96, Issue 10, pp. 5575‐5580.
Evans J.D., Wheeler D.E. (2000). Expression profiles during honeybee caste
determination. Genome Biology, Vol. 2, Issue 1, pp. 1‐6.
Evans J.D., Wheeler D.E. (2001). Gene expression and the evolution of insect
polyphenisms. BioEssays, Vol. 23, Issue 1, pp. 62‐68.
Felicioli A., Donadio E., Balestreri E., Montagnoli G., Felicioli R., Podestà A. (2004).
Expression profile of water‐soluble proteinases during ontogenesis of Megachile
rotundata: an electrophoretic investigation. Apidologie, Vol. 35, pp. 595‐604.
Fisk F.W. (1950). Studies on proteolytic digestion in adult Aedes aegypti mosquitoes.
Annals of the Entomological Society of America, Vol. 43, pp. 555‐572.
Fontes M.R., Teh T., Kobe B. (2000). Structural basis of recognition of monopartite and
bipartite nuclear localization sequences by mammalian importin‐alpha. Journal of
Molecular Biology, Vol. 297, Issue 5, pp. 1183‐1194.
Free J.B. (1977). The social organization of honey bees. Edward Arnold, London.
94
Görg A. (2000). Advances in 2D gel techniques. Trends in Biotechnology, Vol. 18,
Supplement 1, pp. 3‐6.
Görg A., Postel W., Günther S. (1988). Two‐dimensional electrophoresis. The current
state of two‐dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis,
Vol. 9, Issue 9, pp. 531‐546.
Hamilton W.D. (1964). The genetical evolution of social behaviour. Journal of Theoretical
Biology, Vol. 7, Issue 1, pp. 1‐16.
Hartfelder K, Engels W. (1998). Social insect polymorphism: hormonal regulation of
plasticity in development and reproduction in the honeybee. Current topics in
developmental biology, Vol. 40, pp. 45‐77.
Hartfelder K., Cnaani J., Hefetz A. (2000). Caste‐specific differences in ecdysteroid titers
in early larval stages of the bumblebee Bombus terrestris. Journal of Insect Physiology,
Vol. 46, Issue 11, pp. 1433‐1439.
Haydak M.H. (1970). Honey bee nutrition. Annual Review of Entomology, Vol. 15,
pp. 143‐156.
Heussen C., Dowdle E.B. (1980). Electrophoretic analysis of plasminogen activators in
polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.
Analytical Biochemistry, Vol. 102, Issue 1, pp. 196‐202.
Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Sheerman S.E., Barker R.F., Boulter D. (1987). A novel
mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature, Vol. 330, Issue 6144,
pp. 160‐163.
Hoffman EA, Goodisman MA. (2007). Gene expression and the evolution of phenotypic
diversity in social wasps. BMC Biology, Vol. 5, No. 23.
95
Honeybee Genome Sequencing Consortium (2006). Insights into social insects from the
genome of the honeybee Apis mellifera. Nature, Vol. 443, Issue 7114, pp. 931‐949.
Hoogland C., Baujard V., Sanchez J.C., Hochstrasser D.F., Appel R.D. (1997). Make2ddb: a
simple package to set up a two‐dimensional electrophoresis database for the World Wide
Web. Electrophoresis, Vol. 18, Issue 15, pp. 2755‐2758.
Jang K.S., Cho M.Y., Choi H.W., Lee K.M., Kim M.H., Lee Y.U., Kurata S., Natori S.,
Lee B.L. (1998). Purification and characterization of a 25 kDa cathepsin L‐like protease
from the hemocyte of coleopteran insect, Tenebrio molitor larvae. Journal of
Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 31, Issue 4, pp. 364‐369.
Johnson R., Narvaez J., An G., Ryan C. (1989). Expression of proteinase inhibitors I and II
in transgenic tobacco plant: effects on natural defense against Manduca sexta larvae.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Vol. 86, Issue 24,
pp. 9871‐9875.
Johnston K.A., Lee M.J., Brough G., Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Gatehouse J.A.
(1995). Protease activities in the larval midgut of Heliothis virescens ‐ Evidence for trypsin
and chymotrypsin‐like enzymes, Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 25,
Issue 3, pp. 375‐383.
Khan A.R., James M.N. (1998). Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to
active proteolytic enzymes. Protein Science, Vol. 7, Issue 4, pp. 815‐836.
Khan M.A. (1964). Studies on the secretion of digestive enzymes in Locusta migratoria L..
Entomologia Experimentalis et Applicata, Vol. 7, Issue 2, pp. 125‐130.
Khan M.R., Ford J.B. (1962). Studies on digestive enzyme production and its relationship
to the cytology of the midgut epithelium in Dysdercus fasciatus sign. (Hemiptera,
Pyrrhocoridae). Journal of Insect Physiology, Vol. 8, Issue 6, pp. 597‐608.
96
Kleinschmidt J.A., Seiter A., Zeintgraf H. (1990). Nucleosome assembly in vitro: separate
histone transfer and synergistic interaction of native histones complexes purified from
nuclei of Xenopus laevis oocytes. EMBO Journal, Vol. 9, Issue 4, pp. 1309‐1318.
Krem M.M., Di Cera E. (2002). Evolution of enzyme cascades from embryonic
development to blood coagulation. Trends in Biochemical Sciences, Vol. 27, Issue 2,
pp. 67‐74.
Kropacova S., Haslbachova H. (1971). The influence of queenlessness and of unsealed
brood on the development of ovaries in worker honeybees. Journal of apicultural
research, Vol. 10, pp. 57‐61.
Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, Vol. 227, Issue 5259, pp. 680‐685.
Laforsch C., Tollrian R. (2004). Embryological aspects of inducible morphological defenses
in Daphnia. Journal of Morphology, Vol. 262, Issue 3, pp. 701‐707.
Lee M.J., Anstee J.H. (1995). Endoproteases from the midgut of larval Spodoptera
littoralis include a chymotrypsin‐like enzyme with an extended binding site. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 25, Issue 1, pp. 49‐61.
Leno G.H., Mills A.D., Philpott A., Laskey R.A. (1996). Hyperphosphorylation of
nucleoplasmin facilitates Xenopus sperm decondensation at fertilization. The Journal of
Biological Chemistry, Vol. 271, Issue 13, pp. 7253‐7256.
Luger K. (2006). Dynamic nucleosomes. Chromosome Research, Vol. 14, Issue 1, pp. 5‐16.
Malone L.A., Burgess E.P.J., Stefanovic D., Gatehouse H.S. (2000). Effects of four
protease inhibitors on the survival of worker bumblebees, Bombus terrestris L..
Apidologie, Vol. 31, pp. 25‐38.
97
Mann M., Risley M.S., Eckhardt R.A., Kasinsky H.E. (1982). Characterization of
spermatid/sperm basic chromosomal proteins in the genus Xenopus (Anura, Pipidae). The
Journal of Experimental Zoology, Vol. 222, Issue 2, pp. 173‐186.
Michener C.D. (1974). The Social Behavior of the Bees. Harvard University Press.
Miura T. (2001). Morphogenesis and gene expression in the soldier‐caste differentiation
of termites. Insectes Sociaux, Vol. 48, pp. 216‐223.
Miura T. (2004). Proximate mechanisms and evolution of caste polyphenism in social
insects: From sociality to genes. Ecological Research, Vol. 19, Issue 2, pp. 141‐148.
Moritz R.F.A., Kryger P., Allsopp M.H. (1996). Competition for royalty in bees. Nature,
Vol. 384, Issue 6604, pp. 31.
Murdock L.L., Brookhart G., Dunn P.E., Foard D.E., Kelley S., Kitch L., Shade R.E.,
Shukle R.H., Wolfson J.L. (1987). Cysteine digestive proteinases in Coleoptera.
Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology,
Vol. 87, Issue 4, pp. 783‐787.
Namboodiri V.M., Dutta S., Akey I.V., Head J.F., Akey C.W. (2003). The crystal structure
of Drosophila NLP‐core provides insight into pentamer formation and histone binding.
Structure, Vol. 11, Issue 2, pp. 175‐186.
Neurath H, Walsh K.A (1976). Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a
review). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Vol. 73, Issue 11,
pp. 3825‐3832.
Newport J., Kirschner M. (1982). A major developmental transition in early Xenopus
embryos. Cell, Vol. 30, Issue 3, pp. 675‐696.
98
Nightingale K., Dimitrov S., Reeves R., Wolffe A.P. (1996). Evidence for a shared
structural role for HMG1 and linker histones B4 and H1 in organizing chromatin. EMBO
Journal, Vol. 15, Issue 3, pp. 548‐561.
Nijhout H.F. (2003). Development and evolution of adaptive polyphenisms. Evolution and
Development, Vol. 5, Issue 1, pp. 9‐18.
Nobuyasu M., Yamashita O. (1997). Purification and characterization of a protease
degrading 30 kDa yolk proteins of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and
Molecular Biology, Vol. 27, Issues 8‐9, pp. 721‐728.
Noirot C. (1991). Caste differentiation in Isoptera: basic features, role of pheromones.
Ethology, Ecology and Evolution, Vol.1, pp.3‐7.
Novillo C., Castañera P., Ortego F. (1999). Isolation and characterization of two digestive
trypsin‐like proteinases from larvae of the stalk corn borer, Sesamia nonagrioides. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 29, Issue 2, pp. 177‐184.
Page R.E. Jr., Erickson E.H. (1988). Reproduction by worker honey bees (Apis mellifera L.),
Behavioral Ecology and Sociobiology, Vol. 23, Issue 2, pp. 117‐126.
Patel A., Fondrk M.K., Kaftanoglu O., Emore C., Hunt G., Frederick K., Amdam G.V.
(2007). The making of a queen: TOR pathway is a key player in diphenic caste
development. PLoS ONE, Vol. 2, Issue 6, pp. e509.
Pereboom J. J. M., Velthuis H. H. W., Duchateau M. J. (2003). The organisation of larval
feeding in bumblebees (Hymenoptera, Apidae) and its significance to caste
differentiation. Insectes Sociaux, Vol. 50, Issue 2, pp. 127‐133.
Perez, J. (1889). Les abeilles. Traitié de Biologie de l’ Abeille, Vol. 1, ed. R. Chauvin (1968),
Paris, France.
99
Philpott A., Leno G.H. (1992). Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg
extracts. Cell, Vol. 69, Issue 5, pp. 759‐767.
Pinzauti M., Frediani D. (1998). Appunti di Apicoltura. S.E.U., Pisa.
Prado A., Ramos I., Frehlick L.J., Muga A., Ausió J. (2004). Nucleoplasmin: a nuclear
chaperone. Biochemistry and Cell Biology, Vol. 82, Issue 4, pp. 437‐445.
Prieto C., Saperas N., Arnan C., Hills M.H., Wang X., Chiya M., Aligué R., Subirana J.A.,
Ausiò J. (2002). Nucleoplasmin interaction with Protamines. Involvement of the
Polyglutamic tract. Biochemistry. Biochemistry, Vol. 41, Issue 24, pp. 7802‐7810.
Purcell J.P., Greenplate J.T., Sammons R.D. (1992). Examination of midgut luminal
proteinase activities in six economically important insects. Insect Biochemistry and
Molecular Biology, Vol. 22, Issue 1, pp. 41‐47.
Queller D.C, Strassmann J.E. (2003). Eusociality. Current Biology, Vol. 13, Issue 22,
pp. R861 ‐ R863.
Rabossi A., Stoka V., Puizdar V., Turk V., Quesada‐Allué L.A. (2004). Novel aspartyl
proteinase associated to fat body histolysis during Ceratitis capitata early
metamorphosis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, Vol. 57, Issue 2,
pp. 51‐67.
Rachinsky A., Strambi C., Strambi A., Hartfelder K. (1990). Caste and metamorphosis:
Hemolymph titers of juvenile hormone and ecdysteroids in last instar honey bee larvae.
General and Comparative Endocrinology, Vol. 79, Issue 1, pp. 31‐38.
Rawlings N.D., Barrett A.J. (1993). Evolutionary families of peptidases. The Biochemical
Journal, Vol. 290, Part 1, pp. 205‐218.
100
Rembold H., Kremer J.P., Ulrich G.M. (1980). Characterization of postembryonic
developmental stages of the female castes of the honey bee. Apidologie, Vol. 11,
pp. 29 38.
Robinson G. E., Evans J. D., Maleszka R., Robertson H. M., Weaver D. B., Worley K.,
Gibbs R. A., Weinstock G. M. (2006). Sweetness and light: illuminating the honey bee
genome. Insect Molecular Biology, Vol.15, Issue 5, pp. 535‐539.
Röseler P.F (1991) Reproductive competition during colony establishment. In: Ross KG,
Matthews R.G. (eds.) “The social biology of wasps”. Comstock, Ithaca, pp 309‐335.
Roux E.A., Korb J. (2004). Evolution of eusociality and the soldier caste in termites: a
validation of the intrinsic benefit hypothesis. Journal of Evolutionary Biology, Vol. 17,
Issue 4, pp. 869‐875.
Ruttner, F. (1968). Methods of breeding honey bees: intra‐racial selection or inter‐racial
hybrids? Bee World, Vol. 49, pp. 66‐72.
Ryan C.A. (1990). Protease Inhibitors in Plants: Genes for Improving Defenses Against
Insects and Pathogens. Annual Review of Phytopathology, Vol. 28, pp. 425‐449.
Satterfield T.F., Jackson S.M., Pallanck L.J. (2002). A Drosophila homolog of the
polyglutamine disease gene SCA2 is a dosage‐sensitive regulator of actin filament
formation. Genetics, Vol. 162, Issue 4, pp. 1687‐1702.
Sealy L., Cotten M., Chalkley R. (1986). Xenopus nucleoplasmin: egg vs. oocyte.
Biochemistry, Vol. 25, Issue 10, pp. 3064‐3072.
Scarselli R. Donadio E., Giuffrida M.G., Fortunato D., Conti A., Balestreri E., Felicioli R.,
Pinzauti M., Sabatini A.G., Felicioli A. (2005). Towards royal gelly proteome. Proteomics,
Vol. 5, Issue 3, pp. 769‐776.
101
Soller M., Bownes M., Kubli E. (1999). Control of oocyte maturation in sexually mature
Drosophila females. Developmental Biology, Vol. 208, Issue 2, pp. 337‐351.
Thomas J.D., Vanbogelen R.A. (2000). Experimentalism in proteomics. Trends in
Biotechnology, Vol. 18, Supplement 1, pp. 7‐11.
Ura K., Nightingale K., Wolffe A.P. (1996). Differential association of HMG1 and linker
histones B4 and H1 with dinucleosomal DNA: structural transitions and transcriptional
repression. EMBO Journal, Vol. 15, Issue 18, pp. 4959‐4969.
Valaitis A.P. (1995). Gypsy moth midgut proteinases: Purification and characterization of
luminal trypsin, elastase and the brush border membrane leucine aminopeptidase. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 25, Issue 1, pp. 139‐149.
Vizioli J., Richman A.M., Uttenweiler‐Joseph S., Blass C., Bulet P. (2001). The defensin
peptide of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae: antimicrobial activities and
expression in adult mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 31,
Issue 3, pp. 241‐248.
Wakano J.Y. (2004). Drastic growth effect may explain sympatric cannibalistic
polymorphism. Journal of Theoretical Biology, Vol. 226, Issue 1, pp. 69‐77.
Walker A.J., Ford L., Majerus M.E.N., Geoghegan I.E., Birch N., Gatehouse J.A.,
Gatehouse A.M.R. (1998). Characterisation of the mid‐gut digestive proteinase activity of
the two‐spot ladybird (Adalia bipunctata L.) and its sensitivity to proteinase inhibitors.
Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 28, Issue 3, pp. 173‐180.
Weil T., Rehli M., Korb J. (2007). Molecular basis for the reproductive division of labour in
a lower termite. BMC Genomics, Vol. 8, No.198.
Wilkins M.R., Sanchez J.C., Gooley A.A., Appel R.D., Humphery‐Smith I., Hochstrasser
D.F., Williams K.L. (1996). Progress with proteome projects: why all proteins expressed by
102
a genome should be identified and how to do it. Biotechnology & genetic engineering
reviews, Vol. 13, pp. 19‐50.
Williams K.L., Hochstrasser D.F. (1997). Introduction to the Proteome. In: Wilkins M.R.,
Williams K.L., Appel R.D., Hochstrasser D.F. (eds.), “Proteome Research: New Frontiers in
Functional Genomics”, Springer, pp. 1‐12.
Yan J.X., Wait R., Berkelman T., Harry R.A., Westbrook J.A., Wheeler C.H., Dunn M.J.
(2000). A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with
matrix‐assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization‐mass
spectrometry. Electrophoresis, Vol.21, Issue 17, pp. 3666‐3672.
Zou Z., Lopez D.L., Kanost M.R., Evans J.D., Jiang H. (2006). Comparative analysis of
serine protease‐related genes in the honey bee genome: possible involvement in
embryonic development and innate immunity. Insect Molecular Biology, Vol. 15, Issue 5,
pp. 603‐614.
Ringraziamenti
104
È doveroso ringraziare Gabriella Giuffrida e collaboratori dell’Istituto ISPA di Ivrea
per aver effettuato le analisi di spettrometria di massa.
Per l’utilizzo del criostato ringrazio Vincenzo Miragliotta del dipartimento di
Anatomia, Biochimica e Fisiologia di Medicina Veterinaria.
Poi grazie a Gianluca e al prof. Pinzauti per essere sempre stati disponibili quando
ho avuto bisogno, a partire dagli anni della tesi di laurea fino ad ora.
Ed ora veniamo al Dipartimento di Biofisica del CNR di Pisa, dove ho effettuato la
quasi totalità degli esperimenti, ma soprattutto dove ho conosciuto un vai e vieni di
persone e personaggi che mi hanno arruffato la vita più dei capelli che porto sulla testa.
Comincio con Ettore Balestreri, che è stato sempre presente durante questi tre (e
più anni) di dottorato, seguendomi, consigliandomi, arrabbiandosi, sopportando tutti i
miei sfoghi e gli ippopippi e facendomi il verso del coccodrillo come fa (dopo che ha
mangiato un’anatra, dice lui).
Il prof. Felicioli, per avermi insegnato i rudimenti della biochimica e per il prezioso
aiuto in buona parte degli esperimenti.
Alessandro e Francesco per avermi accolta come una di famiglia nei momenti iniziali
di questa esperienza, per avermi fatto tanto ridere, per avermi insegnato a difendermi
dalle battutacce, per la pazienza con cui mi hanno iniziato alle pratiche del laboratorio
biochimico in un mio momento di fragilità e per tutto il resto.
Danika, per essere diventata un bravissimo topo di laboratorio e avermi aiutata
tanto nei momenti di caos. E poi per le buffe e sincere chiacchiere nel bagno dell’Istituto.
Alessandro Puntoni, per l’aiuto con Gnagno e il precedente computer, ma
soprattutto per la costruzione della pila al limone!
105
Gabriele Chiti, senza il quale il laboratorio sarebbe stato inutilizzabile 360 giorni
all’anno!
Margherita e lo Strambini per la splendida centrifuga!
Poi i “capi”! Il prof. Lenci, con cui mi ricordo di aver scambiato le prime chiacchiere
da ubriaca alla cena di Natale. Giuliano, straordinario medico durante la peggior
congiuntivite che mi ricordi. Francesco Ghetti, prezioso consigliere di film; Antonellina,
per le divertenti chiacchierate e le storie di bambine, di gatti e di colliri. Giovanni, babbo
severo durante le partite a calcetto e Sabina, introspettiva e premurosa.
E poi vorrei ringraziare il prof. Cercignani per le risposte alle innumerevoli e
fastidiose domande con cui l’ho tartassato in tutti i corridoi dell’Istituto.
Serena, per avermi sempre tenuta aggiornata sulle novità del dottorato.
Stefano, per i consigli, per aver ascoltato i fiumi di parole che gli ho versato
addosso, per le dritte sul polline e sulle api. Devo ancora restituirgli i libri.
Babbo e mamma, ovviamente, per tutto tutto tutto tutto tutto.
Il mio amòr Lorenzo, per tutto tutto tutto tutto tutto. E per i piegamenti sulle
braccia (una volta ogni due domeniche).
E poi, (notate che vi metto in fondo) gli amichi bellissimi che ho conosciuto in questi
tre anni: Bella Pagnotta, Francesco (di nuovo) e Lucia e il pipino che aspettano, Nicola,
Lucia, Veronica, Simona, Giorgio, Alessandro, Nicoletta e Pallina di Pelo e Andrea (la vera
identità di Pallina), tutti gli amichi del calcetto e chiunque abbia scordato!
