Funktionelle und molekulare Aspekte der antiinflammatorischen Wirkung niedrig dosierter Radiotherapie

Strahlentherapieund Onkologie Originalarbeit

Funktionelle und molekulare Aspekte der antiinflammatorischen Wirkung niedrig dosierter Radiotherapie Franz Rödel1, Friedrich Kamprad2, Rolf Sauer1, Guido Hildebrandt2

Hintergrund: Niedrig dosierte Radiotherapie (LD-RT) mit Dosen zwischen 0,1 und 1,0 Gy hat eine empirisch gut belegte anti-inflammatorische Wirksamkeit. Obwohl verschiedene Hypothesen über die Mechanismen für die klinische Wirkung vorgeschlagenwurden, liegen bislang nur wenige experimentelle Untersuchungen vor. Aktuelle Daten über funktionelle und molekulare Aspekteder LD-RT im Hinblick auf ihre adhäsionsbiologischen und antiinflammatorischen Effekte werden vorgestellt.Methoden und Ergebnisse: In experimentellen Modellen der Osteoarthritis und rheumatoiden Arthritis konnten klinisch nach-weisbare antiinflammatorische Effekte der LD-RT objektiviert werden. Im Modell der Adjuvansarthritis führten sowohl 5 � 1,0 alsauch 5 � 0,5 Gy, wenn zum Zeitpunkt des akuten Entzündungsmaximums appliziert, klinisch und histologisch zu einer Präven-tion der weiteren Arthritisprogression, ohne bereits vorhandene Zeichen zu vermindern. In einem In-vitro-Assay wurde der Ein-fluss von LD-RT auf die Adhäsion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) an Endothelzellen (EC) untersucht. Da-bei zeigte die Adhäsion bereits 4 Stunden nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 0,3–0,7 Gy ein relatives Minimum im Vergleichzur Kontrolle. Als mögliche Mechanismen der verminderten Adhäsion wurden auf Seite der PBMC ein diskontinuierlicher Anstiegder Apoptoserate mit einem lokalen Maximum bei 0,3–0,5 Gy, die proteoloytische Abspaltung des L-Selektins von der Oberflächeund eine gesteigerte Expression des antiinflammatorischen Zytokins Interleukin 10 bzw. die Herunterregulation von TNFα be-stimmt. Auf Seiten der Endothelzellen konnte neben einer Reduktion von E-Selektin die Induktion des antiinflammatorisch wirk-samen Zytokins Transforming Growth Factor beta (TGF�1) mit einem Maximum bei 0,5 Gy festgestellt werden. In den Entzün-dungsherd migrierende Makrophagen exprimieren induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS), welche über die Bildung von Stickoxid(NO) sowohl zytotoxische als auch immunmodulatorische Effekte vermittelt. LD-RT aktivierter Makrophagen mit 0,6–1,25 Gy re-duzierte die NO-Produktion und iNOS-Protein-Expression ohne nachweisbaren Effekt auf die iNOS-mRNA-Expression in vitro.Schlussfolgerung: Es wird deutlich, dass LD-RT wahrscheinlich mit unterschiedlichen zellulären Komponenten und Mechanismendes Entzündungsprozesses interferiert. Die Untersuchungen bestätigen antiinflammatorische Effekte der LD-RT in vitro und invivo. Dabei steht derzeit die funktionelle Regulation der adhäsiven Interaktion von PBMC und Endothelzellen sowie von aktivier-ten Makrophagen im Mittelpunkt. Weiterführende experimentelle Ansätze könnten zur weiteren Klärung der molekularen Mecha-nismen führen.

Schlüsselwörter: Niedrig dosierte Strahlentherapie · Antiinflammatorische Effekte · Adhäsion · Arthritismodelle · Makro-phagen

Strahlenther Onkol 2002;178:1–9 DOI 10.1007/s00066-002-0901-3

Low-Dose Radiotherapy: Molecular and Functional Aspects

Purpose: Low-dose radiotherapy (LD-RT) with single fractions between 0.1 and 1.0 Gy is known to exert an antiinflammatory ef-fect. Although different mechanisms for the clinical efficiency were proposed, only few experimental data are still available. Thispaper focuses on functional and molecular aspects of LD-RT.Methods and Results: The antiinflammatory efficiency of LD-RT in clinical studies could be confirmed in experimental models ofosteoarthritis and rheumatoid arthritis. In a model of adjuvans arthritis, 5 � 1.0 Gy as well as 5 � 0.5 Gy, given at the maximumof the acute inflammation, could prevent clinically and histologically progression of the disease without affecting existing signsof inflammation. The effect of LD-RT on the adhesion of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and endothelial cells (EC) wasanalyzed in in-vitro assays. In the dose range between 0.3 and 0.7 Gy almost 4 hours after irradiation adherent cells reached arelative minimum of adhesion compared to unirradiated controls. In PBMC an discontinuous increase of apoptosis with a maxi-mum between 0.3 and 0.5 Gy, the proteolytic shedding of L-selectin and an increased expression of the antiinflammatory cytokineinterleukin 10 as well as downregulation of TNFα could be identified as potential mechanisms for the observed reduced adhesion.

Eingang: 27. Juni 2001; Annahme: 10. August 2001

1 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie, Universität Erlangen-Nürnberg,2 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Universität Leipzig.

1Strahlenther Onkol 2002 · No. 1 © Urban & Vogel

Einleitung Seit mehr als 100 Jahren gibt es die klinisch empirische Beob-achtung, dass eine Radiotherapie mit niedrigen Dosen (LD-RT) entzündungshemmend und schmerzlindernd wirkt [22,56]. Die LD-RT benigner Erkrankungen ist deshalb eine seitJahrzehnten etablierte Behandlungsform. Allein in Deutsch-land werden gegenwärtig jährlich mehr als 20 000 Patientenlokal bestrahlt, davon etwa 12600 mit schmerzhaft entzünd-lich degenerativen Gelenkerkrankungen und Insertionstendi-nopathien [33, 53]. Die für die Behandlung verwendetenStrahlendosen sind empirisch und gehen insbesondere auf kli-nische Untersuchungen durch von Pannewitz (1933) [46]zurück. Sie betragen in der Regel 5- bis 6-mal 0,5–1,0 Gy, 2- bis3-mal wöchentlich, eventuell in zwei Serien mit einem Inter-vall von 6–8 Wochen.

Seit den 60er und 70er Jahren wurde die LD-RT jedoch ineinigen Ländern nach Publikation einer Malignominduktion[9] verlassen und durch medikamentöse Therapie mit nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) oder Corticosteroidenersetzt. Dennoch spricht auch noch heute eine erhebliche An-zahl von Patienten auf die medikamentöse Therapie nichtoder unzureichend an, und die Rate an relevanten Nebenwir-kungen ist bei chronischer Einnahme beträchtlich. So werdenbei bis zu 30% der Patienten gastritische Beschwerden bis hinzu blutenden Ulzera, seltener Osteoporose oder Infektanfäl-ligkeit beobachtet. Auch modernere Medikamente wie bei-spielsweise selektive COX-2-Inhibitoren sind nicht ohne rele-vante Nebenwirkungen und zudem sehr kostenintensiv.

Neuere klinische Studien belegen klinisch eine gute Wirk-samkeit der LD-RT bei Periarthritis humeroscapularis [54],Hidradenitis axillaris [18], Epicondylitis humeri [32] und Mor-bus Dupytren [55]. Auch akut entzündliche Prozesse wie dieMastitis oder eine postoperative Parotitis lassen sich erfolg-reich behandeln [65]. Es kann deshalb angenommen werden,dass der therapeutische Effekt der LD-RT unabhängig vonder Art des zugrunde liegenden Entzündungsursprungs undEntzündungstyps ist und auf einer Modulation basaler Me-chanismen der Entzündungsreaktion beruht.

Experimentelle Untersuchungen zur Überprüfung derklinisch empirischen Beobachtungen hinsichtlich der Objekti-vierung antiinflammatorischer Effekte, der Bestimmung derniedrigsten effektiven Dosis, der wirksamsten Fraktionierungund möglicher biologischer Wirkmechanismen sind selten [63,64]. Die vorliegende Arbeit möchte deshalb aktuellere experi-mentelle Aspekte der Regulation einer Entzündungsreaktiondurch LD-RT zusammenfassen.

Grundmechanismen des Entzündungsprozesses Eine Entzündung ist die relativ uniforme Reaktion des Im-munsystems auf Noxen jeglicher Art, seien sie infektiö-ser, chemischer oder physikalischer Natur. Sie ist der basaleimmunologische Effektorprozess. Die klassische Entzün-dungsreaktion ist dabei durch eine lokale Ansammlung vonFlüssigkeit, Plasmaeiweißen und Leukozyten gekennzeich-net. Klinische Charakteristika sind infolgedessen Schwellung,Rötung, Schmerz, Funktionsverlust und erhöhte Temperatur.Aufgrund der Vielzahl beteiligter Komponenten und Mecha-nismen ist das Entzündungsgeschehen ein mehrstufiger undauf verschiedenen Ebenen komplex regulierter Prozess.

Gewebsständige Zellen des Immunsystems wie etwa Ma-krophagen oder dendritische Zellen erkennen entzündlicheNoxen und sezernieren eine Reihe entzündungsfördernderBotenstoffe. Damit beginnt eine komplexe Regulation der lo-kalen Blutgefäße, insbesondere der Endothelzellen (EC) [58].Ein initiales Ereignis ist dabei die Gewebsinfiltration von mo-nonukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) an denOrt der Entzündung. In einem mehrphasigen Prozess werdendie PBMC [12, 57] erst reversibel [37], dann irreversibel an dasEndothel angeheftet („Adhäsion“), um dann durch die Ge-fäßwand hindurch in das Gewebe einwandern zu können [64].Die erste Bindung wird durch die sog. „Selektine“ [62] auf denEndothelzellen (E-Selektin, P-Selektin) und PBMC (L-Selek-tin) und ihre aus Kohlenhydratstrukturen bestehenden Ligan-den vermittelt [38]. Anschließend treten die Bindungspartnerüber eine weitere Gruppe von Adhäsionsmolekülen („Inter-cellular Adhesion Molecule“, ICAM-1, ICAM-2 und „Vas-

Rödel F, et al. Antiinflammatorische Wirkung niedrig dosierter Radiotherapie

2 Strahlenther Onkol 2002 · No. 1 © Urban & Vogel

Conversely, reduced expression of E-selectin and an increased induction of transforming growth factor beta (TGF�1) with a max-imum at 0.5 Gy could be observed in endothelial cells. Macrophages immigrating the site of inflammation are known to expressinducible nitric-oxide synthase (iNOS), which in turn mediates cytotoxic and immunmodulatory effects by producing nitric oxide(NO). LD-RT of stimulated macrophages within the dose range between 0.6 and 1.25 Gy reduced NO production and iNOS-proteinexpression without affecting iNOS-mRNA expression.Conclusion: Our experimental data have confirmed the antiinflammatory efficiency of LD-RT in vitro and in vivo, indicating ef-fects on different cellular components and mechanisms of inflammation. The regulation of the adhesion between PBMC andendothelial cells and the effects on activated macrophages may mediate the antiinflammatory properties of LD-RT. Ongoing ex-periments will help to clarify the molecular mechanism.

Key Words: Low-dose radiotherapy · Antiinflammatory effects · Adhesion · Arthritis models · Macrophages


cular Cell Adhesion Molecule“ , VCAM-1) in eine ortsfesteBindung [7]. Als Liganden auf den PBMC dient dabei dieFamilie der „Integrine“ [24].

Die anschließende Effektorphase der Entzündung kenn-zeichnet vor allem die Akkumulation von Monozyten undderen nachfolgende Differenzierung zu „inflammatorischenMakrophagen“, die im Mittelpunkt der lokalen gewebestän-digen Entzündungsreaktion stehen. Neben Effektorfunktio-nen, wie Phagozytose, zytotoxischer Aktivität, Prozessierungund Präsentation von Antigenen und akzessorischer Hilfe beider Lymphozytenaktivierung, kennzeichnet den Makropha-gen die Fähigkeit zur Synthese und Sekretion von Zytokinenund Stickoxid (NO) [3].

Zytokine Unabdingbare Voraussetzung und somit zentraler molekula-rer Mechanismus in der Regulation des Entzündungsprozes-ses ist die Aktivierung der beteiligten zellulären Komponen-ten durch lösliche niedermolekulare Signalproteine, die in ih-rer Gesamtheit als Zytokine zusammengefasst werden. Unterder Vielzahl der an der Entzündungsreaktion beteiligten Zy-tokine haben vor allem Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFα),Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 6 (IL-6) und chemotaktischwirksame Chemokine wie Interleukin 8 (IL-8) und Macro-phage Inflammatory Protein (MIP) als entzündungsförderndeFaktoren Bedeutung [5, 13]. TNFα beispielsweise kennzeich-net ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten, die von derStimulation von Makrophagen und Lymphozyten, der Akti-vierung von Endothelzellen mit Induktion von Adhäsions-molekülen bis zu systemischen Effekten wie Fieberinduktionreichen [43]. Auf der anderen Seite dient eine Gruppe vonantiinflammatorisch wirksamen Zytokinen wie TransformingGrowth Factor beta (TGF�1) und Interleukin-10 der Regula-tion und Begrenzung der Entzündungsreaktion. TGF�1 wirdvon aktivierten Endothelzellen produziert [2] und vermag dieendotheliale Zellproliferation, Migration und die Adhäsionvon Lymphozyten zu hemmen [19], während IL-10 vorwie-gend von T-Lymphozyten und Monozyten produziert wirdund die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wieTNFα und IL-1 zu inhibieren vermag [41].

Stickoxid (NO) Eine wesentliche Funktion aktivierter Makrophagen ist dieExpression der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS), diedurch die Synthese von Stickoxid eine bedeutende Rolle imEntzündungsprozess spielt [42]. NO trägt zur Ödembildungbei akuten Entzündungen bei [45], erhöht die vaskuläre Per-meabilität in Verbindung mit Entzündungen vom Immun-komplextyp und ist in die Genese des Entzündungsschmerzesinvolviert [29]. Bei der rheumatoiden Arthritis und Osteoar-thritis ist NO von pathogenetischer Bedeutung [1, 16, 23, 59].

Im Rahmen entzündlicher Gelenkerkrankungen kanndie Fähigkeit aktivierter Makrophagen zur erhöhten Produk-tion spezifischer Zytokine und des Botenstoffs NO eine Ursa-

che für die Aktivierung von Zellen der Synovialmembran undSynovialflüssigkeit, insbesondere von Synovialfibroblasten,sein, die dann ihrerseits über die Aktivierung von Matrix-metalloproteinasen (MMP) in der Lage sind, Synovialmem-brankomponenten zu zerstören. Tierexperimentell konntenmehrere Arbeitsgruppen nachweisen, dass eine pharmakolo-gische spezifische iNOS-Inhibition die Entzündungsreaktionbei rheumatoider Arthritis [30, 59] und Osteoarthritis [47]klinisch und histomorphologisch vermindert und des Weite-ren zu einer ausgeprägten Reduktion wichtiger kataboler Fak-toren wie Kollagenase 1 (MMP-1), Stromelysin 1 (MMP-3),IL-1�, Peroxinitrit und einer Verminderung der COX-2-Ex-pression führt [48].

Effekte der LD-RT im Tiermodell (Arthritis, Air Pouch) Die Verwendung von Arthritismodellen zur Überprüfung derWirksamkeit neuer antirheumatischer oder antiphlogistischerPharmaka ist in der Arzneimittelforschung weit verbreitet.Einige dieser Modelle wurden auch verwendet, um die Effek-te der LD-RT auf Arthritiden zu untersuchen [6, 60, 64].

Erste Untersuchungen evaluierten zunächst Strahlenef-fekte auf eine akute fremdkörperinduzierte Arthritis bei Ka-ninchen, einem Osteoarthritismodell [17]. In Anlehnung andie klinische Praxis wurden die arthritischen Kniegelenke derVersuchstiere mit 5 � 1,0 Gy täglich fraktioniert bestrahlt.Dies führte zu einer signifikant schnelleren Rückbildung derentzündlichen Gelenkschwellung über den gesamten Be-obachtungszeitraum und zu einem signifikant geringeren Sy-novialflüssigkeitsvolumen unmittelbar nach Abschluss derRadiotherapie. Die histomorphologische Analyse ergab so-wohl am ersten Tag als auch 24 Tage nach Abschluss der Be-handlung eine Abnahme der Synovialzellreihen, eine deutli-che Reduktion der Dicke der Synovialmembran sowie eineverminderte Distanz zwischen Kapillaren und Synovialmem-branoberfläche [17].

In anschließenden Untersuchungen wurde die antiinflam-matorische Wirksamkeit der LD-RT auf die Adjuvansarthritisder Ratte, einem Modell für die rheumatoide Arthritis, verglei-chend überprüft [26]. Beide Hinterpfoten der arthritischenTiere wurden zum Zeitpunkt des Entzündungsmaximums(Tag 15–19) täglich fraktioniert bestrahlt. Während in schein-bestrahlten Ratten die Arthritissymptomatik weiter progre-dient verlief, führte die lokale Radiotherapie mit 5 � 1,0 Gyoder 5 � 0,5 Gy zu einer signifikanten Reduktion des Arthri-tis-Scores (AS) sowie des Hinterpfotenvolumens (HPV) amEnde der Beobachtungszeit (Tag 30). Histologisch lag in denbestrahlten Gelenken eine signifikante Reduktion von Knor-pel- und Knochendestruktion bei nur gering verringerter An-zahl der Entzündungszellen vor. Dabei waren in der entzün-deten Synovialmembran und anderen immunkompetentenArealen massiv aktivierte Makrophagen nachweisbar, die alsEffektorzellen der Gewebedestruktion und als immunregula-torische Zellen eine Schlüsselrolle im Entzündungsprozessspielen [8]. Der histologische Befund einer signifikanten Ver-


minderung der Knorpel- und Knochen-destruktion bei nur gering veränderterAnzahl an Entzündungszellen erscheintin diesem Zusammenhang bemerkens-wert [26].

Weiterführende Experimente unter-suchen derzeit den optimalen Behand-lungszeitpunkt, die niedrigste effekti-ven Gesamtdosis und den günstigstenFraktionierungsrhythmus im Modell derAdjuvansarthritis. Vorläufige Ergebnis-se hinsichtlich der klinischen Parame-ter Hinterpfotenvolumen und Arthritis-Score ergeben folgendes Bild: Als kli-nisch effektiv erwiesen sich 5 � 1,0 Gyan Tag 10–14 oder Tag 15–19 bzw. 5 �

0,5 Gy an Tag 15–19, während 5 � 0,5 Gyan Tag 10–14 oder protrahiert 5 � 1,0 Gyvon Tag 10–18 keinen Effekt zeigten.

Im Modell einer chronisch granulo-matösen Entzündung, dem Air-Pouch-Modell der Maus, konnte gezeigt wer-den, dass antiproliferative Effekte nichtin die Wirksamkeit der LD-RT invol-viert sind [27]. Histologie und Zytokinexpressionsmuster in-nerhalb des normalen zeitlichen Entzündungsablaufs wurdenin diesem Modell extensiv beschrieben [4, 66]. In granulo-matösem Gewebe ist die NO-Synthese in Endothelzellen undMakrophagen ein bedeutender Mediator von Gewebsde-struktion, Ödembildung und anderen Entzündungszeichen.Einzeitbestrahlung mit 2 Gy am Tag 2 oder Tag 6 nach Induk-tion bzw. 5 � 0,5 Gy täglich fraktioniert (Tag 2–6) führte in al-len Gruppen im Durchschnitt zu einer verminderten iNOS-Proteinkonzentration im Gewebe. Der suppressive Effektwar in der akuten Entzündungsphase (Tag 2) am deutlichs-ten ausgeprägt. Im Gegensatz dazu war die Hämoxigenase-1-(HO-1-)Expression in allen bestrahlten Gruppen erhöht.

Effekte der LD-RT auf die adhäsive Interaktion von Endothelzellen und PBMC in vitro

Die Adhäsion von mononukleären Zellen stellt einen initialenSchritt der Entzündungsreaktion dar. Es wurde deshalb derEinfluss von LD-RT auf diesen Prozess untersucht. Dazu wur-den Endothelzellen bis zu 95% Konfluenz zum geschlossenenMonolayer kultiviert und 4 Stunden vor Durchführung einesAdhäsionsassays durch Zugabe von IL-1� stimuliert. An-schließend wurden frisch isolierte humane PBMC zugesetztund die Ansätze auf einem horizontalen Rüttler für 25 Minu-ten unter Scherkraftbedingungen inkubiert [35]. Die Objekt-träger wurden gewaschen, fixiert und die Adhäsionsereignissebei 400facher Vergrößerung ausgezählt, wobei der Mittel-wert adhärenter PBMC in den nicht bestrahlten Kontrollenals 100% definiert und die Adhäsionsereignisse in den behan-delten Ansätzen als Relativwert angegeben wurden. Sowohl

PBMC als auch Endothelzellen wurden einer LD-RT ausge-setzt, um das suszeptible Zellkompartiment zu identifizieren.Dabei zeigte sich, unabhängig vom bestrahlten Komparti-ment, eine deutliche Reduktion der Adhäsion von bis zu 70%im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle nach Dosen zwi-schen 0,3 und 0,7 Gy, also dem Dosisbereich, der klinisch füreine antiinflammatorische Radiotherapie genutzt wird. DerEffekt der Adhäsionsreduktion war dabei bereits nach 4 Stun-den nachweisbar und für alle untersuchten Subpopulationender PBMC vergleichbar [35]. Abbildung 1 zeigt exemplarischdas Adhäsionsverhalten unbestrahlter PBMC an bestrahlteund stimulierte Endothelzellen mit einem Adhäsionsmini-mum bei 0,7 Gy.

Effekte der LD-RT auf Endothelzellen Eine der zellulären Hauptkomponenten des Adhäsionspro-zesses ist die Endothelzelle, die durch eine Vielzahl löslicherFaktoren aktiviert und in ihrer Funktion reguliert wird. Alsein interessantes Zytokin erwies sich im Zusammenhang mitder LD-RT der TGF�, der von Endothelzellen nach Bestrah-lung produziert wird und nach Zugabe zum Kulturmediumoder in autokriner Weise die endotheliale Proliferation undAdhäsion von Lymphozyten und polymorphkernigen PBMCzu inhibieren vermag. Der exakte Mechanismus dieser Inhibi-tion ist bisher noch nicht vollständig geklärt, jedoch wird eineerniedrigte Expression von E-Selektin beschrieben [11].

Analysen des Zytokinprofils nach LD-RT und Stimulie-rung der Endothelzellen zeigten eine gesteigerte Expressionvon TGF�1 mit einem Maximum bei 0,5 Gy sowohl auf Ebeneder mRNA wie auch im Kulturüberstand auf Proteinebene



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+ IL 1� + IL 1�

0,0 1,0 2,0 3,0 10,0 0,0 1,0 2,0 3,0 10,0

Dosis (Gy) Dosis (Gy)

Abbildung 1. Adhäsion unbestrahlter PBMC an bestrahltes, aktiviertes Endothel. Dargestellt istdie relative Zahl der Adhäsionsereignisse, bezogen auf eine unbestrahlte Kontrolle (0 Gy)4 und 24 Stunden nach Bestrahlung mit den angegebenen Einzeldosen. Die Daten repräsen-tieren die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten und das 95%-Vertrauens-intervall. Aktivierung der Endothelzellen mit IL-1� (10 U/ml) 4 Stunden vor Durchführung desAdhäsionsassays. Figure 1. Adhesion of non-irradiated PBMC to irradiated and activated endothelium. Relativevalues of adhesion compared to sham-irradiated control (0 Gy) 4 and 24 hours after singledose irradiation. Data are presented as mean value with 95% confidence interval of three in-dependent experiments. Endothelial cells were activated with IL-1� (10 U/ml) 4 hours beforeperforming the adhesion assay.


[49]. Eine funktionelle Bedeutung die-ses Zytokins für den adhäsionsmindern-den Effekt der LD-RT konnte zudem indem zuvor beschriebenen Adhäsionsas-say nach Blockierung von TGF� mitneutralisierenden Antikörpern nachge-wiesen werden. Dabei wurde das Ad-häsionsminimum dosisabhängig bis zu80% aufgehoben. Zusätzlich zeigtendurchflusszytometrische Untersuchun-gen eine deutliche Reduktion der Ober-flächenexpression von E-Selektin imDosisbereich zwischen 0,3 und 0,7 Gy.Diese Beobachtung steht in einem ge-wissen Widerspruch mit den Ergebnis-sen anderer Gruppen, die Schwellen-dosen von über 2,0 Gy bzw. 5 Gy fürVeränderungen in der Expression vonAdhäsionsmolekülen wie ICAM-1 aufNabelschnurendothelzellen beschriebenhatten [21]. Ob für E-Selektin ebenfallseine solche Schwellendosis existiert,wird kontrovers diskutiert, die vorlie-genden Ergebnisse sprechen jedochdafür, dass bereits niedrige Strahlendosen die Selektinexpres-sion auf Endothelzellen beeinflussen können.

Effekte der LD-RT auf PBMC Apoptose ist ein physiologisches endogenes Programm derZelle, das durch einen planmäßigen Zerfall der Zellfunktio-nen und der Zellmorphologie charakterisiert ist. Dabei kanndie Apoptose unter unterschiedlichen physiologischen Be-dingungen, aber auch durch externe Stimuli wie ionisieren-de Strahlung induziert werden [52]. Im Gegensatz zur Ne-krose löst dieser Zelltod keine inflammatorische Reaktiondes Immunsystems aus, weshalb er auch als „stiller“ Zelltododer, wegen seines regelhaften Ablaufs, als „programmierterSelbstmord“ bezeichnet wird.

Bisher galt die Annahme einer kontinuierlichen Zunah-me der Apoptoserate von Lymphozyten nach Bestrahlung,die sich auf Beobachtungen nach Einzeldosen von 0,05, 0,1,0,5, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 Gy stützte [10]. Detailliertere Analy-sen mit kleineren Dosisabstufungen und drei unterschiedli-chen Nachweisverfahren auf Zellkernebene (PI/Triton-Fär-bung), auf Zellebene (histographische Morphologiekriterienin der Zytofluorometrie) und durch AnnexinV/PI-Färbungzeigten jedoch für den Dosisbereich zwischen 0,3 und 1,0 Gyeinen diskontinuierlichen Verlauf der Apoptoserate mit einemrelativen Maximum oder Plateau nach unterschiedlichenInkubationszeiten zwischen 12 und 48 Stunden [36]. WerdenMonozyten des peripheren Blutes in Gegenwart apopto-tischer Zellen aktiviert, reagieren sie in paradoxer Weise miteiner durch den Thrombospondin-(CD36-)Rezeptor vermit-telten Herunteregulation proinflammatorischer Zytokine wie

TNFα und sezernieren stattdessen das antiinflammatorischwirksame IL-10 [67]. Somit sind apoptotische Zellen auch inder Lage ein immunsuppressives Regulationssignal zu geben.Das nach LD-RT in den PBMC gefundene Zytokinprofil mitReduktion von TNFα und Induktion von IL-10 im Dosisbe-reich von 0,3–0,5 Gy [50] deutet auf einen vergleichbaren Vor-gang auch nach niedrig dosierter Bestrahlung hin. Für dieseAnnahme spricht auch das lokale Maximum der Apoptosera-te in diesem Dosisbereich (Abbildung 2).

Die Koinzidenz von reduzierter Adhäsion einerseits undInduktion von Apoptose andererseits warf die Frage auf, obdurch den Vorgang der Apoptose auch adhäsionsrelevanteVeränderungen an Adhäsionsmolekülen hervorgerufen wer-den. Tatsächlich konnte bei apoptotischen Zellen eine pro-teolytische Abspaltung von L-Selektin von der Oberflächenachgewiesen und mit dem Verlust der Adhäsivität korreliertwerden, da die Zugabe von löslichem L-Selektin konzentra-tionsabhängig die Adhäsion inhibieren konnte [34].

Radiogene Effekte der LD-RT auf inflammatorische Makrophagen

Makrophagen stellen eine essenzielle Komponente der loka-len Entzündungsreaktion im Gewebe dar. Es wurden deshalbEffekte der LD-RT auf Makrophagenzelllinien sowie resi-dente peritoneale Makrophagen untersucht [28]. Unstimu-lierte sowie LPS/IFNγ-stimulierte Makrophagen wurden dazu6 Stunden vor oder nach Zellaktivierung mit Einzeitdosenvon 0, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 und 10 Gy bestrahlt:

Dabei wurden die metabolische Aktivität, Zellprolife-ration und reproduktive Integrität aktivierter Makrophagen


Apo

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1,000,0 1,0 2,0 3,0 0,0 1,0 2,0 3,0 0,0 1,0 2,0 3,0

AxV/PI-Färbung FSC/SSC-Analyse PI/Triton-Färbung

Dosis (Gy)

Abbildung 2. Diskontinuierliche Induktion von Apoptose in PBMC nach LD-RT. Dargestellt istder Nachweis der relativen Apoptoserate, bezogen auf die unbestrahlte Kontrolle, in denPBMC eines Spenders 36 Stunden nach Bestrahlung. Links: AnnexinV/Propidiumiodid-(PI-)Doppelfärbung; Mitte: Analyse des Vorwärts-(FSC-) und Seitwärts-(SSC-)Streuverhaltens;rechts: Kernfärbung mit Triton/PI. Ein erstes Maximum der Apoptoserate zeigt sich zwischen0,5 und 0,7 Gy.Figure 2. Discontinuous induction of apoptosis in PBMC after LD-RT. Relative apoptosis inPBMC compared to sham-irradiated control 36 hours after LD-RT. Left panel: AnnexinV/Pro-pidiumiodid (PI) staining; central panel: forwardscatter–sidescatter log analysis; right panel:nuclear staining with Triton/Pi. A first relative maximum of apoptosis was observed between0.5 and 0.7 Gy.

durch Dosen ≤ 10 Gy nicht beeinflusst, sodass ein zytotoxi-scher Strahleneffekt als Mechanismus der antiinflammato-rischen Strahlenwirkung ausgeschlossen werden konnte.Nach Bestrahlung stimulierter Makrophagen mit Dosen von0,6–1,25 Gy war jedoch zu allen Bestrahlungszeitpunkten einesignifikant verminderte NO-Produktion nachweisbar. DasAusmaß der Suppression nahm zu, je enger der zeitliche Zu-sammenhang zwischen Zellaktivierung und Bestrahlung war[39] (Abbildung 3). Dosen ≥ 5 Gy resultierten hingegen ineiner Steigerung der NO-Produktion. Die iNOS-mRNA-Ex-pression blieb nach Dosen ≤ 1,25 Gy 6, 12 und 18 Stundennach Stimulation im Gegensatz zur iNOS-Protein-Expressionweitgehend unbeeinflusst. In Abbildung 4 sind exemplarischdie iNOS-mRNA-Expression/iNOS-Protein-Expression undkumulative NO2�-Freisetzung 6, 18 und 30 Stunden nachStimulation und unmittelbar anschließender Bestrahlung dar-gestellt.

Da die iNOS-Aktivität in Makrophagen auch durch Zy-tokine wie TNFα induziert werden kann [15] und Makropha-

gen selbst in parakriner oder autokrinerWeise in der Lage sind, TNFα zu produ-zieren, wurde der Einfluss der LD-RTauf die TNFα-Produktion analysiert.Dabei konnte jedoch kein von der unbe-strahlten Kontrolle deutlich abweichen-des TNFα-Produktionsprofil bezüglichder Absolutmenge und der Zeitkinetikbeobachtet werden [28]. Es erscheint da-her unwahrscheinlich, dass der beobach-tete Effekt auf das iNOS-System TNFα-vermittelt ist. Aufgrund der mRNA-Analysen sowie der Unabhängigkeit derNO-Suppression vom Bestrahlungszeit-punkt innerhalb eines Zeitfensters von6 Stunden vor bis 6 Stunden nach Stimu-lation [39] ist es ebenso unwahrschein-lich, dass der beobachtete Effekt aufTranskriptionsebene reguliert ist. Nor-malerweise setzt nämlich innerhalb von2–4 Stunden nach LPS und/oder IFNγ-Stimulation eine ausgeprägte Steigerungder iNOS-Aktivität ein [12]. Die Sup-pression der iNOS-Protein-Expressionsowie die verminderte NO-Produktionin Zeitkursen über 30 Stunden legensomit den Schluss nahe, dass die post-transkriptionelle oder posttranslationel-le Kontrolle der iNOS-Aktivität beein-flusst wird [28]. Die zuvor beschriebeneSteigerung der Expression des Stress-proteins HO-1 nach LD-RT in chronischgranuloma- tösem Gewebe stützt dieseHypothese, da HO-1 die Reaktion vonHäm zu Biliverdin katalysiert und somit

den für die iNOS-Aktivität essenziellen oxidativen CofaktorHäm vermindert.

Molekulare Mechanismen Bei der LD-RT werden Bestrahlungsdosen verwendet, dienur etwa 5–10% der Dosis für tumorkurative Bestrahlungs-indikationen darstellen. Es ist deshalb anzunehmen, dass anbeiden Enden des Dosisspektrums unterschiedliche radiobio-logische Mechanismen wirksam sind. Während detaillierteVorstellungen über die Mechanismen der Schadenserken-nung, DNA-Reparatur und zellulären Reaktion bei höherenStrahlendosen existieren [51], kann derzeit über die moleku-laren Mechanismen nach Bestrahlung mit LD-RT nur speku-liert werden. Dennoch gibt es Hinweise aus Untersuchungendes Phänomens der Hyperradiosensibilität nach geringen Do-sen (< 0,5 Gy) und der induzierten Radioresistenz nach Strah-lendosen zwischen 0,5 und 1 Gy [31, 40]. So wurde beschrie-ben, dass in Zellkulturexperimenten geringe Einzeldosen inihrer biologischen Wirkung und in der Induktion von Apopto-



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%

RT 0 h RT +2 h RT +4 h RT +6 h

Abbildung 3. Dosisabhängige kumulative Nitritproduktion nach Bestrahlung aktivierter RAW-264.7-Makrophagen. Dargestellt ist die relative kumulative Nitritproduktion bezogen aufdie unbestrahlte Kontrolle (0 Gy) zum Zeitpunkt 30 Stunden nach Stimulation mit LPS(0,1 ng/ml)/IFN� (100 U/ml). Die Bestrahlung erfolgte zu definierten Zeitpunkten vor bzw.nach Zellstimulation, die Messung der kumulativen NO2�-Freisetzung in 3-Stunden-Interval-len in Zeitkursen über 30 Stunden. Die Daten repräsentieren den relativen Mittelwert ± SEMbezogen auf die unbestrahlte Kontrolle (zwei unabhängige Experimente, n = 12).Figure 3. Dose dependent cumulative nitrite production after irradiation of activated RAW264.7 macrophages. Cumulative nitrite production compared to sham-irradiated control(0 Gy) 30 hours after stimulation with LPS (0.1 ng/ml)/IFN� (100 U/ml). Cells were irradiated atdefined time points before or after stimulation and nitrite production was measured in 3-hourintervals up to 30 hours. Data are presented as mean ± SEM (two independent experiments,n = 12).


se effektiver sind, als es die Extrapolation nach dem linear-quadratischen Modell bei höheren Dosen vermuten lässt [25,31]. Für dieses Phänomen werden zwei hypothetische Er-klärungsmöglichkeiten diskutiert. Die Antwort der Zelle aufniedrige Strahlendosen stellt erstens einen konservierten Me-chanismus der Stressreaktion dar, wobei niedrige Dosen untereiner möglichen Schadenserkennungsschwelle zum Triggerneiner schnellen und effizienten DNA-Reparatur liegen. Zwei-

tens treten bei niedrigen Strahlendosen noch keine Änderun-gen in der DNA-Struktur oder Organisation auf, die eineerleichterte Reparatur ermöglichen [51]. Interessant ist in die-sem Zusammenhang auch eine Arbeit, die in Lungenepithel-zellen bei Bestrahlung mit 0,5 Gy Änderungen der Proteinex-pression nachweisen konnten [20]. In den Untersuchungenkonnten sieben Proteine identifiziert werden, die um einenFaktor 2–5 herunterreguliert wurden, während zwei Proteineum einen Faktor 2 hochreguliert wurden. Zu diesen Faktorenzählten neben einem Inhibitor der Proteinkinase C Transla-tionsinitiationsfaktoren und das Zytokin IL-1, die in der zel-lulären Stressantwort und damit evtl. auch bei der Reaktionder Zelle auf LD-RT eine Rolle spielen könnten.

Einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren für die Gen-expression von Zytokinen ist der Nuclear Factor kappa B(NF�B) [61], dessen zytoplasmatische Aktivierung von derAbspaltung des Inhibitors I�B durch das 26s-Proteasom ab-hängig ist. Pajonk & McBride [44] untersuchten daher, ob dieproteolytische Aktivität des 26s-Proteasoms auch durch nied-rige Strahlendosen moduliert werden kann. Sie konnten nach-weisen, dass LD-RT (≤ 2 Gy) in konstitutiv NF�B exprimie-renden Zellen die proteolytische Aktivität des 26s-Protea-soms unabhängig von der Transkriptionsaktivität auf bis zu60% des Ausgangswertes senkt und Dosen < 0,5 Gy zu einemAnstieg der I�B-Proteinkonzentration führen [44]. Da das26s-Proteasom für den Abbau aller kurzlebigen und 70–90%aller langlebigen zellulären Proteine verantwortlich ist, stelltdiese Beobachtung einen weiteren wichtigen Ansatzpunkt fürzukünftige Forschungsaktivitäten dar.

Zusammenfassende Schlussfolgerung Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse können zu einerspekulativen Synopsis der Entzündungsmodulation durch nied-


Abbildung 4. Dosisabhängige iNOS-mRNA-Expression (A), iNOS-Pro-tein-Expression (B) und kumulative NO2�-Freisetzung (C) nach Be-strahlung aktivierter RAW-264.7-Makrophagen. Die Bestrahlung er-folgte unmittelbar nach LPS (0,1 ng/ml)/IFN� (100 U/ml)-Stimulation,der Northern-Blot 6 Stunden, der Western-Blot 18 Stunden, der Griess-Assay 30 Stunden nach Stimulation. Die Werte entsprechen dem rela-tiven Mittelwert ± SEM bezogen auf die unbestrahlte Kontrolle (dreiunabhängige Experimente). Figure 4. Dose dependent expression of iNOS-mRNA (A), iNOS-protein(B), and cumulative nitrite production (C) after irradiation of activatedRAW 264.7 macrophages. Cells were irradiated immediately after stim-ulation with LPS (0.1 ng/ml)/IFN� (100 U/ml). Northern-Blot analysiswas performed 6 hours later, Western-Blotanalysis 18 hours and Griessassay 30 hours after stimulation. Data are presented as mean ± SEMcomparedtosham-irradiatedcontrol(threeindependentexperiments).

Abbildung 5. Modellvorstellung zur antiinflammatorischen Wirkungder LD-RT. Detaillierte Beschreibung des Modells im Text.Figure 5. Hypothesis on the antiinflammatory action of LD-RT. The hy-pothesis is described in details in the text.

rige Strahlendosen herangezogen werden, die in Abbildung 5zusammengefasst sind. Aus der Komplexität der Materie er-gibt sich dabei zwanglos, dass neben den hier vorgestelltenMechanismen viele andere, heute noch unbekannte beteiligtsein müssen.

Die vorliegenden tierexperimentellen Untersuchungenbelegen, dass LD-RT die klinischen und/oder histomorpholo-gischen Symptome in verschiedenen Arthritismodellen posi-tiv beeinflusst. Im Modell der Adjuvansarthritis sind dabei be-reits täglich fraktioniert 5 � 0,5 Gy klinisch wirksam, sofernsie zum Zeitpunkt des akuten Entzündungsmaximums appli-ziert werden.

LD-RT induziert in vitro ein relatives Apoptosemaxi-mum in PBMC und führt innerhalb weniger Stunden bei denapoptotischen Zellen zum Verlust des Adhäsionsmoleküls L-Selektin. Gleichzeitig wird durch die Anwesenheit apoptoti-scher PBMC die Produktion von IL-10 mit antinflammatori-scher Wirkung induziert und des proinflammatorischen Zyto-kins TNFα reduziert. In den lokalen Endothelzellen wird dieSynthese des adhäsionsmindernden Zytokins TGF�1 hoch-und die Expression von E-Selektin herunterreguliert, was zurVerminderung der Adhäsionsbereitschaft beitragen und eineweitere Rekrutierung entzündungsunterhaltender PBMC ausdem zirkulierenden Blut unterbrechen könnte. Die LD-RThat im Vergleich zu höheren Strahlendosen offensichtlich ge-gensätzliche Effekte auf die funktionellen Eigenschaften akti-vierter Makrophagen. Dosen von 0,6–1,25 Gy zeigen diehöchste Effektivität in der Suppression der iNOS-Protein-Ex-pression und der kumulativen NO-Freisetzung. Da NO zurRegulation der Entzündung beiträgt, könnte die NO-Suppres-sion durch niedrige Strahlendosen antiinflammatorische Ef-fekte wie Reduktion der Gelenkschwellung sowie Schmerzlin-derung vermitteln. Durch die reduzierte Menge an NO kanndieser zelluläre Botenstoff beispielsweise nicht mehr modulie-rend auf Synovialfibroblasten einwirken, die dann ihrerseitsnicht mehr in der Lage sind, über die Aktivierung von Matrix-metalloproteinasen eine Destruktion der Synovialis einzulei-ten.

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Korrespondenzanschrift Dr. rer. nat. Franz Rödel Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie Universitätsstraße 27 91054 Erlangen Deutschland Telefon (+49/9131) 853-32311, Fax -9335E-Mail: [email protected]


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Funktionelle und molekulare Aspekte der antiinflammatorischen Wirkung niedrig dosierter Radiotherapie