Genetica 3 - Profs Area Scienze ed Ingegneriaprofs.scienze.univr.it/delledonne/Insegnamenti/Genetica 3.pdf · Sistemi genetici batterici e virali •La genetica batterica, coniugazione,

Genetica 3

Sistemi genetici batterici e virali

• La genetica batterica, coniugazione, trasformazione

• La genetica virale, trasduzione

Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005



Il termine auxotrofia indica l’impossibilità per un organismo di sintetizzare un

particolare composto organico necessario per la propria crescita, che deve

quindi essere assunto necessariamente dall’ambiente in aggiunta ai nutrienti

energetici forniti dall’alimentazione. Molti esseri viventi, incluse piante

eterotrofe ed animali, sono auxotrofi per una o più sostanze, come ad esempio

vitamine ed amminoacidi essenziali. L’auxotrofia è l’opposto della prototrofia

Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Cromosoma e plasmide

A plasmid is a small DNA molecule within a cell that is physically separated from a chromosomal DNA and can replicate

independently. They are most commonly found in bacteria as small, circular, double-stranded DNA molecules. In nature, plasmids

often carry genes that may benefit the survival of the organism, for example antibiotic resistance. While the chromosomes are big and

contain all the essential information for living, plasmids usually are very small and contain only additional information.

Plasmids are considered replicons, a unit of DNA capable of replicating autonomously within a suitable host. However, plasmids, like

viruses, are not classified as life.





Evento di ricombinazione



La coniugazione batterica

Trasferimento genico attraverso il contatto fisico tra due batteri, di cui il donatore è

denominato F+ (fertilità positivo) e possiede un pilo di coniugazione, mentre il

ricevente è F-.






Hfr= high frequency of recombination




Tipo Caratteristiche fattore F

• F+ DNA circolare distinto

• F- assente

• Hfr integrato nel cromosoma batterico

• F’ DNA circolare distinto, porta geni batterici

Caratteristiche del fattore F

• F+ x F- due cellule F+

• Hfr x F- una cellula Hfr e una cellula F-

• F’ x F- due cellule F’


La trasformazione batterica

Passaggio di frammenti di DNA libero ad un batterio ricevente

http://image.slidesharecdn.com/3-selection-speciation-1227690523569348-9/95/3-selection-speciation-19-728.jpg?cb=1227661644


La genetica virale







• Fagi virulenti: solo ciclo litico

• Fagi temperati: ciclo litico e lisogenico (profagi)


Esperimento di Lederberg e Zinder

• Trasduzione generalizzata: qualunque gene

• Trasduzione specializzata: pochi, specifici, geni

Trasferimento del DNA mediato da un virus dei

batteri (virus dei batteri: batteriofago).

La trasduzione


E’ possibile trasferire geni da un batterio a un altro tramite

la trasduzione generalizzata (richiesta degradazionecromosoma batterico)

Frequenza di trasduzione: da 1/100.000 a 1/1000.000


Trasduzionespecializzata

(richiesto ciclo lisogenico)


I virus a RNA

I Virus a RNA sono virus che utilizzano l'RNA

come materiale genetico. Questo acido

nucleico di solito è presente come filamento

singolo, sebbene siano presenti gruppi di

virus che utilizzano un RNA a doppio

filamento.

I principali virus patogeni appartenenti ai

virus a RNA sono i virus

dell’immunodeficienza umana (HIV),

dell'Influenza e dell'Epatite virale C.

Il virus dell’influenza contiene l’enzima

necessario per la duplicazione del proprio

genoma a RNA. Il filamento di RNA virale

così sintetizzato serve poi sia da mRNA sia

da stampo per la sintesi, mediante

appaiamento complementare delle basi, di

nuove copie del genoma virale. I retrovirus

come HIV presentano invece un ciclo

riproduttivo più complesso


I RETROVIRUS

Famiglia di virus dotati di membrana

lipoproteica esterna contenenti un genoma

a RNA, che per replicarsi necessitano di un

intermedio a DNA.

Una volta entrato nella cellula ospite il

genoma a RNA del virus va incontro alla

trascrizione inversa nel citoplasma ed il

risultante DNA a doppio filamento (detto

provirus) viene traslocato nel nucleo e

integrato nella cromatina della cellula

ospite.


Cellula T infettata da HIVI retrovirus includono tre gruppi (oncoretrovirus, lentivirus e spumavirus), che comprendono virus in grado di infettare diverse specie animali, compreso l’uomo, determinando infezioni croniche, a volte associate a trasformazione neoplastica (oncoretrovirus) o a sindromi lente e progressive, caratterizzate da immunodeficienza e disordini neurologici. Appartengono a questa famiglia, oltre al ben noto virus dell’immunodeficienza umana (HIV – “human immunodeficiency virus”), altri virus oncogeni per l’uomo come HTLV-1 e 2 (“Human T-cell Leukemia Virus” 1 e 2), ed anche virus della leucemia felina, virus della leucemia murina (topi) di Moloney (MoLV) e del tumore mammario murino.

Questa famiglia di virus è stata la prima ad attirare l'attenzione dei biologi molecolari per lo sviluppo di vettori per la terapia genica (vettori retrovirali ).

I PRIONI sono gli agenti infettivi responsabili:

• della Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE) nei bovini

• delle scrapie nelle pecore

• della Malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) e la sua variante clinica (vCJD)

nell'uomo

• di altre encefalopatie trasmissibili

I Prioni sono proteine normalmente presenti nel cervello e altri tessuti (milza) dei

mammiferi, incluso l'uomo. La loro funzione è quella di favorire la trasmissione

dei messaggi tra le cellule nervose. Si trasformano in proteine nocive o per

mutazione spontanea o per l'arrivo di un prione patologico. Quando il prione nocivo

attacca le cellule cerebrali e trasforma i prioni normali questi, a loro volta, attaccano

e disgregano le altre cellule, dando luogo al tipico aspetto spongioso del cervello da

cui la definizione "encefalopatia spongiforme".

Tutte le malattie animali da prioni note influenzano la struttura del Sistema nervoso

centrale o di altri elementi neurali dei tessuti, e tutti sono attualmente incurabili e

sempre letali. La modalità di infezione del prione è data da una particolare

catena proteica alfa e beta ripiegata in maniera scorretta, che induce altre

proteine ad assumere la stessa conformazione anomala. Queste proteine sono

poi in grado a loro volta di infettare le proteine adiacenti

I prioni


I prioni

Il DNA

Caratteristiche del MATERIALE genetico

• Deve contenere informazioni complesse

• Deve replicarsi in modo fedele e deve essere stabile

• Deve definire un fenotipo


La scoperta di Griffith del principio trasformante impiegando Streptococcuspneumoniae


1944: Esperimento di Avery, MacLeod e McCarty sulla natura chimica della sostanza trasformante

S e R: colonie lisce o rugose


La diffrazione ai raggi X permette di ricavare informazioni circa la struttura delle molecole


Il contributo di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins

Ma i due litigavano, per cui non sono riusciti a trovare la spiegazione dei dati che

avevano ottenuto. Comunque nel 1962 il nobel è stato dato a Watson, Crick e

Wilkins (Franklin morta nel 1957)


1953


I nucleotidi sono formati da zucchero, fosfato e base azotata (purina o pirimidina)


Watson riconobbe che una adenina poteva legare una timina, e che una

guanina poteva legare una citosina



Struttura secondariadel DNA



Implicazioni della struttura del DNA a livello genetico:

• Contiene informazioni complesse

• Si replica in modo fedele ed è stabile


Il dogma centrale della biologia molecolare:

DNA -> RNA -> Proteina


Cenni sulla struttura dei cromosomi e

sugli elementi trasponibili


Cromosomi battericiGeneralmente circolari.. Assenza di proteine istoniche, ma presenza

di alcune proteine che comunque favoriscono il compattamento


Plasmidi


Cromosomi eucariotici

Lineari. Necessario elevatissimo compattamento, e possibilità di ridurre il

compattamento per replicazione/trascrizione

Cromatina: DNA + proteine (soprattutto istoni)

Due tipi di cromatina:

• Eucromatina: subisce i normali processi di condensazione / decondensazione

nel corso del ciclo cellulare

• Eterocromatina: permane estremamente condensata (centromeri, telomeri,

cromosoma X inattivo)

Le proteine piu’ abbondanti nella cromatina sono gli istoni: proteine cariche

positivamente (attraggono il DNA che è carico negativamente).

Circa la metà della massa proteica del cromosoma è formata da una serie

eterogenea di proteine non istoniche



Il centromero

Regione centromerica di Saccharomices cerevisiae

Il centromero è formato da particolari sequenze ripetute molte volte. Nel caso sotto, la

regione ripetuta più volte è di circa 110 basi.

Il centromero è lungo 4000-7000 basi. Nell’uomo il centromero è lungo centinaia di

migliaia di basi.


I telomeri stabilizzano i cromosomi e ne impediscono la degradazione.

Nella diapositiva è riportata la sequenza nucleotidica dei telomeri eucariotici, che

nell’uomo è ripetuta da 250 a 1500 volte. Questa lunghezza varia da un cromosoma

all’altro e da cellula a cellula

I telomeri


Dimensioni del genoma di vari organismi

Fago Lambda

Escherichia coli

Saccharomices cerevisiae

Arabidopsis thaliana

Vitis vinifera

Homo sapiens

Mais (Zea Mais)

Cipolla (Allium cepa)

Ameba

50.000

4.500.000

12.000.000

150.000.000

450.000.000

3.000.000.000

4.500.000.000

18.000.000.000

670.000.000.000


Variabilità nelle sequenze di DNA degli eucarioti

Il DNA viene tagliato in frammenti lunghi diverse centinaia di basi. Poi si denatura a 100 gradi e si

raffredda lentamente, monitorando l’OD (Optic Density - DNA doppio filamento ha assorbimento

minore a 260nm)

Curva C0tUna curva C0t rappresenta la frazione di DNA rimasta a singolo filamento nel corso di una reazione

di denaturazione.

Il livello di rinaturazione dipende da 2 fattori:

1) Concentrazione iniziale di DNA a singolo filamento (C0).

2) Durata della rinaturazione (t).

Concentrazioni piu’ elevate (o tempi piu’ lunghi) aumentano la probabilità delle collisioni.

Il valore a cui metà del DNA si è riappaiato, è definito C0t ½


Rinaturazione dipende da concentrazione: il primo scalino rappresenta DNA che si rinatura per

valori di C0T molto bassi, pertanto DNA presente in mote copie (ripetuto)

Tipi di sequenze di DNA

• Sequenze non ripetute (geni)

• Sequenze moderatamente ripetute sequenze di 150-

300 bp ripetute migliaia di volte :

• Geni per tRNA e rRNA

• SINE (short interspersed elements, senza funzione):

Alu: ripetizioni di 2-300 bp, 106 copie nel genoma umano, 11% del DNA totale).

An Alu sequence is a short stretch of DNA originally characterized by the action of the Alu

restriction endonuclease. Alu sequences of different kinds occur in large numbers in primate

genomes.

• LINE (long interspersed elements): lunghe migliaia

di basi. In maggioranza trasposoni

• Sequenze altamente ripetute (satellite) < 10 bp,

ripetute centinaia di migliaia di volte

Una sequenza Alu è un breve tratto di DNA originariamentecaratterizzato come sito di taglio riconosciuto dall'endonucleasiAlu, un enzima di restrizione. Sequenze Alu di diversi tipi sonopresenti in gran numero nei genomi dei primati.

Le sequenze Alu misurano in media circa 300 paia di basi e sonoquindi classificate come short interspersed element (SINE). Si stimache le sequenze Alu presenti nel genoma umano siano più di unmilione e che quindi rappresentino il 10.7% del genoma umanototale. Ciò nonostante meno del 0.5% risultano polimorfiche

Sequenze Alu

Lo studio di questi tratti di DNA è importante per la genetica dipopolazione dell'uomo e per l'evoluzione dei primati, in particolareper l'evoluzione umana. Infatti, le sequenze Alu formano neiprimati un registro fossile relativamente semplice da decifrare inquanto gli eventi di inserzione delle sequenze Alu sono fedelmentetrasmessi di generazione in generazione e sono facilmenteidentificabili. Lo studio di queste sequenze può rivelare quindirelazioni di discendenza in quanto due individui condivideranno unaparticolare inserzione se hanno un antenato comune. La maggiorparte delle sequenze Alu nel genoma umano possono essereriscontrate anche nelle corrispondenti posizioni dei genomi di altriprimati, tuttavia circa 7.000 inserzioni Alu sono tipiche degli esseriumaniL'inserzione di sequenze Alu è implicata in diverse malattieereditarie umane e in varie forme di cancro.

Sequenze Alu

I TRASPOSONI (DNA mobile)

Quando si verifica un evento di trasposizione, un elemento trasponibile, o trasposone, si sposta da

una regione di DNA a un’altra. Barbara Mc-Clintock fu la prima a scoprire i trasposoni negli anni ’40

durante i suoi studi sulla genetica del mais. Da allora, i trasposoni sono stati trovati in tutti i tipi di

organismi, dai batteri all’uomo

La parte principale di una sequenza di inserzione codifica almeno due proteine che catalizzano la

trasposizione. Queste proteine sono note come Trasposasi. Un’altra caratteristica di una

sequenza di inserzione, in comune con molti trasposoni più complessi, si trova appena fuori dal

trasposone stesso. I trasposoni portano infatti su entrambi i lati Ripetizioni fiancheggianti dirette

(3-12 basi) che non fanno parte del trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate

dal processo di trasposizione in corrispondenza del sito di inserzione.

Alle estremità di molti – ma non di tutti – trasposoni, sono presenti inoltre le ripetizioni terminali

invertite (9-40 basi) -> forcina

Molti trasposoni contengono geni a parte rispetto a quelli necessari per la trasposizione. Questi

sono, solitamente, i geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, Tn3 contiene un

gene che conferisce la resistenza all’ampicillina.

I TRASPOSONI (DNA mobile)

Pierce, GENETICA, e “Genetica, principi di analisi formale" Zanichelli

I trasposoni rappresentano fino al 50% del DNA dell’uomo

Alle estremità di molti – ma non di tutti – trasposoni, sono presenti le ripetizioni terminali invertite

(9-40 basi) -> forcina

Su entrambi i lati portano Ripetizioni fiancheggianti dirette (3-12 basi): non fanno parte del

trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate dal processo di trasposizione in

corrispondenza del sito di inserzione. Sequenze variabili ma lunghezza costante. Queste ripetizioni

indicano che il TE si inserisce dopo aver effettuato dei tagli a scalino


Tipi di trasposizione(movimento di un trasposone da una localizzazione all’altra)

Esistono diversi modelli per spiegare i meccanismi di trasposizione dei trasposoni.

• Trasposizione replicativa (duplicazione)

• Trasposizione non replicativa (spostamento)

Nel modello replicativo avviene la trasposizione da un cromosoma a un altro o tra

due siti lontani di uno stesso cromosoma. Secondo tale modello, la porzione di

cromosoma che contiene il trasposone si fonde per breve tempo con la porzione di

cromosoma accettrice. A questo punto, il trasposone si duplica, e una delle copie si

posiziona nel DNA del cromosoma accettore, mentre l'altra rimane nella porzione

donatrice. Questo tipo di trasposizione viene perciò anche chiamata trasposizione

replicativa.

Nel modello non replicativo (o anche conservativo), il trasposone, in genere

composito, si sposta da una posizione all'altra del cromosoma, senza che questo si

replichi. Ciò permette lo spostamento fisico del trasposone, dalla posizione iniziale a

quella finale. La trasposizione conservativa prevede un taglio netto delle estremità

del trasposone e un taglio netto nel DNA ricevente. Il trasposone viene così integrato

senza formare ripetizioni fiancheggianti dirette.

I trasposoni nei batteri

I trasposoni batterici contengono soprattutto gli elementi necessari per la

trasposizione.

La trasposizione avviene con un meccanismo di ricombinazione del DNA del

trasposone con quello del sito in cui esso traspone, che viene detto di

'ricombinazione sito-specifica'. Il trasposone si può inserire soltanto in regioni di

DNA in cui si trovano brevi sequenze nucleotidiche che fanno da bersaglio per

l'inserzione ('siti di inserzione'). La sequenza nucleotidica di tali siti sembra irrilevante e

non omologa (cioè non somigliante) ad alcuna specifica sequenza del trasposone.

Non occorre quindi affinità tra sequenze del trasposone e sito di inserzione,

come invece nella ricombinazione omologa, che avviene tra geni aventi le stesse

sequenze nucleotidiche.

I trasposoni batterici appartengono a due classi: trasposoni semplici (detti

anche di 'classe I') e trasposoni compositi (di 'classe II').


Trasposoni batterici semplici (classe I) (sequenze di inserzione)

TE (Transposable Element) semplice, costituito da trasposasi e da due

sequenze (10-40 bp) simili tra di loro disposte in senso inverso alle due

estremita’ (sequenze di inserzione; IS). Lungo generalmente da 800 a 2000 bp.

Ha una trasposizione replicativa.

Possiede in pratica solo ripetizioni fiancheggianti, le ripetizioni terminali invertite

e il gene per la trasposasi, ma può contenere anche geni importanti, ad es. di

resistenza alla penicillina


Trasposoni batterici compositi (classe II)

Segmento di DNA che puo’ portare info aggiuntive – es resistenza antibiotici - fiancheggiato da 2

copie di una sequenza di inserzione. Sono indicati con la sigla Tn seguita da un numero

Sono costituiti da due IS nella stessa direzione o in direzione opposta, che si trovano

vicine o traspongono come una sola unita’, trasportando con se’ la parte di DNA

compresa tra loro. Fra le due IS si trovano il gene per la trasposasi e frequentemente

almeno un gene per la resistenza a un antibiotico. Il Tn3, che è il più studiato fra i

trasposoni di classe II, codifica anche per una proteina regolatrice, la quale, mediante

repressione, controlla la sintesi della trasposasi, evitandone in tal modo una

produzione eccessiva, che non sarebbe utile per un evento quale la trasposizione che

avviene con bassa frequenza. Presentano trasposizione conservativa (taglia-incolla

senza replicazione)


Mu: un batteriofago trasponibile

Alcuni batteriofagi si riproducono per trasposizione. Sebbene non abbia ripetizioni terminali

invertite, quando si inserisce nel cromosoma Mu genera brevi ripetizioni fiancheggianti (5 bp).

Trasponendo, Mu provoca mutazioni nel sito di inserzione, proprietà caratteristica degli

elementi trasponibili

I trasposoni negli eucarioti

I trasposoni degli eucarioti sono molto simili, per struttura, a quelli procarioti. Possiedono geni

che codificano per le proteine necessarie per la trasposizione e che permettono loro di excidersi

e reintegrarsi in vari luoghi del genoma. Oltre ai geni coinvolti nei processi di trasposizione,

la maggior parte di essi possiede anche numerosi altri geni, la cui funzione, però, è in larga

parte ancora ignota. Come i trasposoni procariotici, possono essere la causa di mutazioni

genetiche, inserendosi all'interno di geni funzionali e alterandone, o impedendone, le normali

funzioni.

Sono stati scoperti trasposoni praticamente in tutti gli organismi eucarioti, ma i più studiati sono

quelli delle piante (particolarmente del mais), del moscerino della frutta e dell'uomo.

I trasposoni negli eucarioti appartengono a due classi:

• trasposoni compositi (di 'classe II')

• retrotrasposoni.

I Retrotrasposoni si spostano mediante un intermedio a RNA: il retrotrasposone, costituito

comunque da un filamento di DNA inserito in un cromosoma, si replica in un filamento di RNA

(mediante trascrizione) e, questo filamento, viene poi copiato a sua volta in uno a DNA, capace

di integrarsi in una nuova posizione del genoma.

Studi hanno dimostrato che, almeno alcune particolari famiglie di brevi e lunghe sequenze

ripetute del genoma umano, mostrano proprietà di trasposizione, in particolare la famiglia

denominata Alu


Il trasposone Ty del lievito


Il sistema Ac-Ds nelle piante

Ac: Activator

Ds: Dissociation


Retrotrasposoni

I trasposoni che traspongono per

mezzo di un intermedio a RNA

sono definiti retrotrasposoni


I trasposoni causano mutazioni



La trasposizione causa anche riarrangiamenticromosomici

La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) o malattia di von Recklinghausen fa parte di

un gruppo di malattie genetiche multisistemiche e progressive dette Facomatosi

o anche sindromi “neurocutanee”: tumori a carico della pelle e dei nervi.

La NF1 ha un'incidenza di 1 su 2500–3000 nati ed una prevalenza di circa 1 su

4000–5000 individui nella popolazione generale. Si trasmette con modalita’

autosomica dominante, il 50% dei casi sono sporadici.

Il gene NF1 è stato localizzato in sede pericentrometrica del braccio lungo del

cromosoma 17. E’ un gene oncosoppressore di oltre 335 kb di DNA genomico,

con almeno 60 esoni, che codifica per una proteina di 2818 aa chiamata

neurofibromina che si localizza nei microtubuli citoplasmatici e che svolge una

regolazione negativa della crescita cellulare con attività di controllo di attivazione

sul ras pathway. Da qui la funzione di soppressore di

tumore svolto dalla neurofibromina.

Nel 1991 è stato scoperto, in un uomo di 31 anni affetto da

neurofibromatosi, che il danno genetico era stato causato da una

trasposizione della sequenza Alu in uno degl introni di NF1: errore nello

splicing con errata rimozione di un esone.

I genitori erano entrambi privi della sequenza Alu in quell’introne

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