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Genetica del cancro . Lezione 12. Il tumore come network. Carcinoma del colon. Cancro invasivo Le cellule divengono invasive e metastatizzano. Le cellule mutate iniziano a duplicarsi in modo incontrollato. Displasia. Le cellule perdono morfologia. Processo di vascolarizzazione. - PowerPoint PPT Presentation
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By NA 1
Genetica del cancro
Lezione 12
By NA 2
Il tumore come network
Carcinoma del colon
Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno
Iperplasia Le cellule conservano morfologia
Cancro in situ Le cellule perdono il contatto con il tessuto
Le cellule mutate iniziano a duplicarsi in modo incontrollato
Displasia. Le cellule perdono morfologia
Cancro invasivo Le cellule divengono invasive e metastatizzano
Processo di vascolarizzazione
By NA 3
Un punto di vista diversoLa selezione agisce attraverso la fitness di un gruppo di individui: chi si riproduce di piu’ per effetto di mutazioni favorevoli in quel momento e in quel luogo prendera’ il sopravvento
trasferiamo questo concetto ad un gruppo di cellule : una cellula muta, acquisisce un vantaggio proliferativo sfuggendo anche parzialmente al sistema di controllo, si riprodurra’ piu’ rapidamente
la cellula nell’organismo e’ sottoposta ad un controllo a molti livelli e difficilmente potra’ in breve tempo prendere il sopravvento…… almeno finche’ i sistemi di controllo sono efficienti
By NA 4
Due forze contrastantiUna spinge la cellula mutata a prendere il sopravvento e l’altra protegge l’organismo nel suo insieme (apoptosi, meccanismi di riparo)
questo fa si che almeno fino al momento in cui un organismo si riproduce il numero di mutazioni somatiche che si accumulano nella cellula non raggiungano il livello di guardia: si pensa 6-7 (con le dovute eccezioni), e soprattutto con la nuova generazione si rincomincia.con il tempo i meccanismi di controllo si attenuano e vengono meno………
By NA 5
e allora come mai il cancro?se la possibilita’ di accumulare in una cellula o in un suo clone e’ bassa come mai ci sono i tumori cosidetti maligni?
sostanzialmente ci sono due meccanismi che permettono la progessione: mutazioni che aumentano la capacita’ proliferativa incrementando il numero di “individui” in cui potrebee manifestarsi una seconda, terza …… mutazione
mutazioni che intaccano la stabilita’ del genoma aumentando il livello di mutazioni nel loro insieme
By NA 6
riarrangiamenti multipli
By NA 7
riarrangiamenti multipli
By NA 8
percorsi che portano alla cancerogenesipossiamo ridurre a due i percorsi che sviando, portano al
tumore: percorsi che controllano la nascita di nuove cellule (geni del ciclo cellulare) e percorsi che portano alla morte (geni che controllano l’apoptosi)
al primo percorso appartengono quei geni (protoncogeni) che nella forma wt promuovono la proliferazione. Quando l’effetto della mutazione provoca un ”gain of function” il risultato e’ un prodotto inappropriato nella sua attivita’ o nello spazio o nel tempo.Vista la loro funzione wt basta la mutazione di un allele
vi ricordo che non e’ la mutazione in se’, ma l’effetto che la mutazione ha sulla funzione. il cancro e’ un fenotipo come gli altri, viene meno una funzione dell’individuo cellula.
By NA 9
percorsi che portano alla cancerogenesial secondo appartengono quei geni che nella versione wt
impediscono la progressione del ciclo cellulare (definiti TS tumor suppressor), stimolano l’apoptosi , controllano la stabilita’ del genoma, garantiscono l’accuratezza della replicazione, del riparo e della segregazione. Il fenotipo mutante compare quando tutti e due gli alleli sono mutati nella stessa cellula.Il nostro organismo e’ come un auto in cui i protooncogeni sono l’accelleratore e i TS i freni.
By NA 10
OncogeniEra noto che alcuni tumori animali originassero da infezioni virali, questa informazione derivava da esperimenti in vivo ed in vitro. Nell’uomo sono pochi quelli dimostrati ad eziologia esogena
By NA 11
OncogeniQuello che ci interessa e’ che geni portati da virus possono trasformre le cellule ospite. lo studio di questi geni ha permesso di capire cosa sono gli oncogeni. Test in vitro come il NIH-3T3 hanno permesso di chiarire che in tumori di origine non virale sono presenti oncogeni endogeni attivati
By NA 12
OncogeniIl primo oncogene virale identificato (1983) e’ stato v-sis che corrisponde al gene PDGFB fattore di crescita delle piastrine. La sua espressione incontrollata e’ concordante con l’idea che l’eccesso di un grow factor porti ad un’iperproliferazione.L’analisi di altri oncogeni ha confermato che la loro funzione e’ indispensabile per la cellula e che la loro alterata espressione e’ all’origine dei tumori.Grossolanamente possiamo suddividere gli oncogeni in 5 classi: fattori di crescita secreti recettori di membrana componenti dei sistemi di trasduzione del segnale intracellulare proteine DNA-binding compresi i fattori di trascrizione componenti del network delle cicline, delle chinasi-ciclino dipendenti e degli inibitori delle kinasi. Tutti componenti che controllano il normale svolgimento del ciclo cellulare
By NA 13
Oncogeni
By NA 14
Attivazione protoncogeniUn protoncogene diventa oncogene quando la mutazione provoca un aumento di funzione che puo’ essere : quantitativo di un prodotto normale qualitativo: prodotto leggermente mutato che non puo’ rispondere al suo controllore, prodotto chimerico originato da un riarrangiamento genomicoLe mutazioni sono sempre somatiche, ci sono alcune eccezioni, ma la predisposizione alla comparsa di tumori e’ un aspetto di sindromi polimalformative a trasmissione auosomica dominante (RAS)
Anche il protoncogene RET e’ particolare: le sue mutazioni con attivazione provocano la MEN2A neoplasia delle ghiandole endocrine che si puo’ presentare come familiare. Si ritiene che questo comportamento derivi dalla ristrettezza dell’espressione del prodotto mutato di RET nello spazio e nel tempo. Da notare che mutazioni con perdita di funzione di questo gene provocano una sindrome neonatale:Morbo di Hirschprung.Anche il protoncogene KIT mutato con perdita di funzione provoca una sindrome familiare con depigmentazione il piebaldismo.
By NA 15
Attivazione protoncogeni Amplificazione genica
conseguenza di errori casuali nella replicazione del DNAEsempio: cromosomi double minutes e homogeneously staining regions (HSR)
double minutes
By NA 16
Attivazione protoncogeni Mutazione puntiforme
Esempio: nel carcinoma della vescica, il gene ras presenta una mutazione nella sostituzione di una
singola base che, a sua volta, provoca la sostituzione di un amminoacido. Tali cambiamenti
avvengono in punti caratteristici del gene che conducono a trasformazione cellulare
By NA 17
Attivazione protoncogeni Riarrangiamento cromosomico:linfoma di Burkitt t(8;14)
c-myc gene catena pesante Ig
c-myc si viene a trovare sotto il controllo del promotore del Igche e’ un promotore forte e nella serie bianca funziona ad un ritmo elevato: il proto-oncogene perde la propria regolazione e assume quella del Ig. La cellula perde il controllo
QUESTO AVVIENE SOLO SE LA TRASLOCAZIONE SI VERIFICA NEI LINFOCITI!
traslocazione
By NA 18
Attivazione protoncogeni
cromosoma non normale
chr Philadelphia (1961)
Nel 95% dei casi di CML
Indagini FISH E MOLECOLARI
SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE:- ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta)- BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare)
ABL
BCR
ABL/BCR
BCR/ABL
CML, Leucemia Mieloide Cronica
Traslocazione reciproca braccio lungo chr.9 e il braccio lungo chr.22: t(9;22)(q34;q11).
By NA 19
Attivazione protoncogeni
By NA 20
Attivazione protoncogeni
By NA 21
Modalita’ di espressioneGli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?
Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)
Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non nepregiudica la funzione.
Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della cellula non dell’individuo!
Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismoci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allelewild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore
By NA 22
Questi oncosoppressori vengono definiti “gatekeepers”: (guardiani) perche’ regolano funzioni cellulari fondamentali come l’innesco della proliferazione, del differenziamento e dell’apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA.
Oncosoppressori gatekeepers
APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata funzionalita’ di un allele non provoca la comparsa del fenotipo, ma mette la cellula in condizioni di “debolezza”. La cellula e’ eterozigote e il gene puo’ ancora svolgere la funzione, ma e’ una funzione non completamente efficace
By NA 23
La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita’ di ras.
La perdita di p53 genera la sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo le cellule al processo di apoptosi
APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo, che porta all’espressione di c-MYC
Oncosoppressori gatekeepers esempi
By NA 24
Altri oncosoppressori
By NA 25
famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D
Perdita di eterozigosita’ LOH
Cellule tumorali
omozigote eterozigote eterozigote LOH
By NA 26
Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione
+ + Rb --
+ Rb
Rb Rb
Rb+
Rb+Rb Rb x Rb
C.O mitotico Non disgiunzione
e duplicazione
Conversione genica
delezione
mutazionepuntiforme
Rb+Rb
By NA 27
Perdita di eterozigosi per identifiare un TS
By NA 28
Perdita di eterozigosi / instabilita’
By NA 29
come funzionano i TS
By NA 30
controllo dell’integrita’ del genoma
By NA 31
19 anni, lieve ritardo mentale, difficolta’ di apprendimento, iperpigmentazione, mixomi al seno e all’ipofisi
Diagnosi clinica:
Carney Complex (CNC) de novo
By NA 32
Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro
Mixoma: tumore benigno connettivale quando localizzato nel cuore puo’ provocare alterazioni cardiache
By NA 33
Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro
PRKAR1A(17q24): gene codificante l’unita’ regolatoria della proteinchinasi A.L’80% degli affetti ha mutazioni in questa sequenza
La paziente non ha mutazioni nel gene
By NA 34A 10 anni era stato eseguito il cariotipo per il ritardo mentale: presenza di un piccolo marcatore de novo non identificato nel 70% delle metafasi
Cariotipo
By NA 35
2009: array-CGH
chr1:83061240-846630251.6 Mb Log2ratio 1.08 (triplicatione)
last norm 82999282first trip 83061240last trip 84663025
first norm 84713307
alla comparsa del fenotipo del Carney Complex e’ stata eseguita un array-CGH perchiarire se ci fosse relazione con il piccolo marcatore
By NA 36
FISH with probe(s) of the unbalanced region confirmed that the triplicated material is located on the marker chromosome
FISH
La FISH con i BAC della regione triplicata conferma l’origine del piccolo marcatore sovrannumerario e lo sbilanciamento genomico
By NA 37
DomandaIl materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale
e Carney Complex disease della proposita?
By NA 38
Domanda
From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the geneAccording to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease
Is the genetic material contained within the de novo marker chromosome responsible for the phenotype of the proband(mental retardation, Carney complex disease)??
Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e Carney Complex disease della proposita?
By NA 39
Tubulin tyrosin ligase-like highly expressed in the nervous system
Sterile alpha motif domain???
cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit
The genes in the triplication portion not known as disease-gene
From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the geneAccording to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease
urate oxidase urate oxidase
By NA 40
Triplication of the
PRKACB cAMP-dependent protein
kinase catalytic subunit
Same effect of PRKAR1A mutation?
By NA 41
… The net effect of all these changes in CNC cells is an increase in DNA transcription and/or activation of other pathways leading to abnormal growth and proliferation.
By NA 42
Normalized to actin
Normalized to gapdh
PKA Activity Real Time PCR on lymphocytes
and fibroblastsfrom the patient and two controls
We know now that the Carney phenotype of our patient is linked
to the triplication of the catalytic subunit of the protein kinase A gene
By NA 43
Array analysis must be done having in mind the phenotype
and not in a blind wayGenome-wide array analysis requires noteworthy abilityin using public genomic databases
a similar case in a prenatal diagnostic setting could have been interpreted as without any clinical consequences since none of the triplicated genes was known to be pathogenic when amplified