GENETIĈKI INŢENJERING

PITANJA

• DA LI ZNATE ŠTA JE GENETIĈKI INŢENJERING?

• DA LI ZNATE ŠTA SU GENETIĈKI MODIFIKOVANI ORGANIZMI?

• JESTE ĈULI ZA POJAM ’’TRANSGEN’’?

GENETIĈKI INŢENJERING –GENETIĈKO INŢENJERSTVO

• Genetiĉko inţenjerstvo (ili rekombinantna DNK tehnologija) je VEŠTAĈKO FORMIRANJE NOVIH KOMBINACIJA NASLEDNOG MATERIJALA ugradnjom molekula DNK iz ćelije jedne vrste, posredstvom prenosioca (plazmida, virusa...) ili direktno u organizam domaćina (koji prirodno ne sadrţi takvu DNK, ali u kome je sposobna da se umnoţava).

Genetiĉko inţenjerstvo u zavisnosti od dela genetiĉkog materijala koji

se prenosi moţe biti:

•GENSKO

•HROMOZOMSKO

•GENOMSKO

U osnovi se radi o HORIZONTALNOM PRENOSU

GENA za razliku od uobiĉajenog vertikalnog, odnosno sa roditeljske generacije na generaciju potomaka.

METODA GENSKOG GENETIĈKOG INŢENJERSTVA KORISTI MOGUĆNOSTI:

• 1. IDENTIFIKACIJE POJEDINIH GENA KOJI DOVODE DO IZRAŢAVANJA POJEDINIH OSOBINA,

• 2. IZREZIVANJA TOG GENA IZ GENOMA DAVAOCA I

• 3. PRENOS U GENOM DOMAĆINA, ĈIME SE ŢELJENA OSOBINA DAVAOCA PRENOSI NA DOMAĆINA PRIMAOCA.

Prenos gena moţe da se vrši IZMEĐU JEDINKI ISTE VRSTE, kada se radi o ubrzavanju i usmeravanju prirodnih procesa UKRŠTANJA I SELEKCIJE i

IZMEĐU JEDINKI RAZLIĈITIH VRSTA

•CUT – PASTE princip!

• IZREZIVANJE GENA IZ GENOMA DAVAOCA OBAVLJA SE POMOĆU TZV. RESTRIKCIONIH ENZIMA, A PRENOS U GENOM DOMAĆINA POMOĆU VEKTORA.

•LIGAZE

Otkrića znaĉajna za razvoj genetiĉkog inţenjerstva:

• 1944. hemijska priroda naslednog materijala

• 1953. sekundarna struktura DNK

• 1958. replikacija DNK i uloga enzima nukleza i ligaza

• 1965. priroda genetiĉkog koda-univerzalnost genetiĉke šifre

• 1973. tehnika kloniranja DNK

• 1973. prvi himerni genom, tj. rekombinantna DNK, Cohen i Boyer u bakterijski genom ugradili gen za rRNK ţabe

Hronološki prikaz najvaţnijih uspeha genetiĉkog inţenjerstva:

• 1975. i 1977. u Cold Spring Harboru dobijen je transgeni miš u koji je ubaĉen gen majmuna

• 1982. transgeni miš sa genom za hormon rasta pacova

• 80-ih je ugraĊen ljudski gen za insulin u bakteriju Escherichia coli

• 1989. geni zeca ubaĉeni u majmunske hromozome i ljudski geni u mišji genom(ONKOMIŠEVI)

• 1996. proizvodnja duvana, soje, kukuruza, pamuka, pirinĉa, uljane repice, krompira, paradajza... sa genima stranog porekla

• 1997. kloniran je prvi sisar (taĉnije, te godine su objavljeni rezultati), ovca Doli

• Transgena krava Rouz sa humanim genom za proizvodnju humanog mleka

• Transgena ovca Poli stvara protein za leĉenje hemofilije

• Transgene koze za proizvodnju humanih krvnih proteina

Majmun sa genom meduze (zelene fluorescentne boje)

• Akvarijumske ribice sa ugraĊenim genom za proizvodnju fluorescentnog proteina

• Formirani su genetski izmenjeni komarcikoji ne mogu da prenesu izazivaĉe malarije

• Radi se na proizvodnji transgenih svinjaĉiji organi bi bili podesni za transplantaciju kod ljudi

• Iz ribe IVERAK izolovan je antifriz gen za dobro podnošenje niskih t (protein se dodaje sladoledu koji je već u upotrebi u SAD i paradajzu)

METODE

•MIKROINJEKCIJA DNK

•GENSKI TRANSFER POSREDOVAN EMBRIONALNIM STEM ĆELIJAMA

•GENSKI TRANSFER POSREDOVAN VIRUSIMA

METODE

• MIKROINJEKCIJA DNK

• Ugradnja genskog konstrukta u pronukleus jajne ćelije

• Vraćanje u jajovod ţenke

• Ukoliko se ugraĊen gen eksprimira i prenosi na potomstvo dobijene su tzv.

ţivotinje RODONAĈELNICI

METODE

GENSKI TRANSFER POSREDOVAN EMBRIONALNIM STEM ĆELIJAMA

Manipulacija sa naslednim materijalom (DNK) embrionalnih stem ćelija

IzvaĊenim iz BLASTOCISTE i

njihovo vraćanje u nju;

Dobijaju se HIMERE, vaţno je da germ ćelije sadrţe transgen!

METODE

GENSKI TRANSFER POSREDOVAN VIRUSIMA

•Korišćenje virusa kao prenosioca jer oni umnoţavaju sopstvenu

DNK ili RNK u ćeliji domaćinu pa tako mogu da obezbede siguran

unos transgena

GENETIČKI

MODIFIKOVANI

ORGANIZMI, GMO

GENETIĈKI MODIFIKOVANI ORGANIZAM – TRANSGENI

ORGANIZAM u genetiĉkom smislu, jeste novi, sintetski organizam koji ne

postoji u prirodi jer nastaje odreĊenom genetiĉkom

manipulacijom. Pod genetiĉkom manipulacijom podrazumevamo

prenos gena ili paketa gena jedne vrste u drugu vrstu posredstvom

vektora ili direktno mikronjekcijom.

Vektori mogu biti virusi ili plazmidi.

Mora imati:Širok spektar domaćina

Mesto za delovanje restrikcionih enzimaMora biti podloţan amplifikaciji

Zašto se to radi?

1. Genetiĉko inţenjerstvo je savremenabiotehnologija.

PROIZVODNJA MIKROBA ZNAĈAJNIH ZAPROIZVODNJU ŢIVOTNIH NAMIRNICA.

Biotehnologija je nauka XXI vekaPrva etapa – korišćeni su celi mikrobi

Druga etapa – korišćeni su njihovi enzimiTreća etapa – upotreba celih transgenih

mikroba

Zašto se to radi?

2. Oĉekivana dobit za ĉoveĉanstvo koje donosi tehnologija rekombinantne DNK i NJENA

PRIMENA U MEDICINI I FARMACIJI, npr. u leĉenju genetski uslovljenih bolesti ili u

proizvodnji lekova je nemerljiva.

3. PROIZVODNJA HRANE - ObezbeĊivanje dovoljne koliĉine hrane.

4. Genetiĉko inţenjerstvo biljaka naglo se

razvilo iz komercijalnih razloga.

• PROIZVODNJA BILJNIH KULTURA BOLJIH I NOVIH OSOBINA (POVEĆANJE PRINOSA, POVEĆANJE OTPORNOSTI NA HERBICIDE, INSEKTE, POVIŠENJE KVALITETA –sadrţaja amino-kiselina, Fe, vitamina A itd.)

• PROIZVODNJA BIOMATERIJALA

Transgene koze sa genom za proizvodnju pauĉine (iz pauka Nephila clavipes)

Biomaterijal za proizvodnju hiruškog konca, padobrana, vodootpornih materijala...)

• Teţnja da se proizvedu BIORAZGRADIVI MATERIJALI u cilju zaštite ţivotne okoline

Praktiĉni ciljevi formiranja GMO bili su razliĉiti (primena u industriji, poljoprivredi,

medicini, farmaciji...),ali im je suština zajedniĉka:

to je proizvodnja STRANIH PROTEINAna bazi funkcije genetiĉkih elemenata

stranog porekla.

Već dvadesetak godina genetiĉkim inţenjerstvom se proizvodi HUMANI REKOMBINANTNI INSULIN koji je dijabetiĉarima omogućio kvalitetan ţivot.

• Na isti naĉin se proizvodi VAKCINA PROTIV HEPATITISA B.

• Teţi se proizvodnji VOĆNE VAKCINE!

Primeri

• Za 1g interferona potrebno je 300t krvi ili

1500 slezina

• Za 1g somatotropina potrebno je 700 hipofiza

• INSULIN, dva polipeptida - dva gena

od 63 nukleotida i od 90 nukleotida

NE MOGU SE PROIVODITI POLNI HORMONI

JER NISU PROTEINSKE STRUKTURE!

• Svoju najveću praktiĉnu primenu rekombinantna DNK tehnologija je našla U POLJOPRIVREDI gde se koriste za stvaranje biljnih kultura novih i boljih osobina (boljih u smislu povećanja prinosa, povećanja otpornosti na bolesti i delovanje hemikalija, povišenje kvaliteta i dr.)

•Danas u Svetu postoji oko 50 vrsta GM biljaka koje su u komercijalnoj primeni (NAJVIŠE SOJA, KUKURUZ, PAMUK I DUVAN) na oko 90 miliona hapoljoprivrednih površina, a više od pola ukupne svetske proizvodnje soje ĉini GM soja.

• Jedna od najĉešće korišćenih povoljnih osobina, koja se metodom genetiĉkog inţenjeringa, postigla kod biljaka jeste TOLERANCIJA NA HERBICIDE GLIFOSFAT I GLUFOSINAT. Time se postiţe manje propadanje kulturnih biljaka herbicidnim tretmanom.

• TakoĊe, uspešno je preneta osobina OTPORNOST NA ŠTETOĈINE. Primer je kukuruz s genom zemljišne bakterije Bacillus thuringiensis, koja se već 40 godina koristi za uništavanje larvi komaraca i drugih insekata. Takav kukuruz sam stvara tzv. BT-toksin, kojim postaje otporan na štetoĉine (kukuruznog moljca, kukuruznu zlaticu...) bez dodatnih insekticidnih tretmana.

• Interesantan je i primer PARADAJZA SA BLOKIRANIM ENZIMOM KVARENJA (TRULJENJA) koji je normalno prisutan u njemu, ĉime paradajz postaje dugotrajan.

• Neka od drugih karakteristika koje se nastoje ugraditi ovom tehnologijom u biljke koje se uzgajaju za proizvodnju namirnica jesu POBOLJŠANA NUTRITIVNA VREDNOST, ODNOSNO POVEĆANI SADRŢAJ PROTEINA, VITAMINA (pirinaĉ sa provitaminom A – zlatni pirinaĉ i paradajz sa povećanim sadrţajem likopena) I MODIFIKOVAN SADRŢAJ MASNOĆA.

50%-60% biljnih semena koji se u SADprodaju su GMO

U Engleskoj se ostvaruje 70.000tproteina za stoĉnu hranu pomoću GMO;za povećanje mišićne mase znaĉajni su

proteini koji sadrţe više LIZINAI TRIPTOFANA, a aditivi su upravo

takve strukture

DA LI SE GMO MOŢE UPOTREBITIZA DALJU REPRODUKCIJU?

Da i ne, zavisi od vrste transgenogorganizma.

Ukoliko je transgena bakterija, nju sameljui iz nje ekstrahuju npr. insulin, znaĉi NE.

U sluĉaju transgene animalne vrste – moţe.U sluĉaju sojine saĉme koja ostaje pošto iz

nje ekstrahujemo proteine, ulje nemoguće je reprodukovati biljku u prirodnim

uslovima.Ako je raspolaţemo semenskom robom –moţe.

DA LI SE TREBA BAVITI GENETIĈKIMINŢENJERSTVOM?

DA JER...Ova istraţivaĉka oblast je moćno sredstvo

za prouĉavanje funkcije i organizacije gena;

Naĉin za veću proizvodnju lekova;

Mogućnost da se pronaĊe lek za kancer...

ALI...

NEOPHODNA JE DRUŠTVENA KONTROLAOVAKVIH ISTRAŢIVANJA,

KONTROLA UPOTREBE NAUĈNIH DOSTIGNUĆA,

POTREBNO JE USAGLAŠAVANJE NAŠIHZAKONA SA ZAKONIMA EVROPSKE UNIJE

STRATEGIJA PROCENE RIZIKA ZA GMO UKLJUĈUJE:

• INFORMACIJE O KARAKTERISTIKAMA MODIFIKACIJE UKLJUĈUJUĆI FUNKCIJU I OSOBINE NOVOG GENA,

• ISPITIVANJE NEŠKODLJIVOSTI I PREHRAMBENE VREDNOSTI SUPSTANCI-PRODUKATA FUNKCIJE STRANIH GENA,

• IDENTIFIKACIJA I EVALUACIJA SVIH PROMENA U SASTAVU MODIFIKOVANIH PROIZVODA,

• UTICAJ MODIFIKACIJE NA TOKSIKOLOŠKA SVOJSTVA...

• Za konvencionalne namirnice smo, korišćenjem vekovima, postigli ravnoteţu i poznati su nam njihov SASTAV, NAMENA I MOGUĆNOSTI ŠTETNOG DELOVANJA, dok za GM namirnice to ne moţemo reći, jer se sve desilo poslednjih desetina godina.

• Zato je SVETSKA ZDRAVSTVENA ORGANIZACIJA RAZVILA PROCENE NEŠKODLJIVOSTI GENETSKI MODIFIKOVANIH NAMIRNICA

• ŠTO PODRAZUMEVA TOKSIKOLOŠKA, ALERGOLOŠKA, PREHRAMBENA I DRUGA ISPITIVANJA. Princip ekvivalentnosti, koji se primenjuje (ocenjuje se da li namirnica ima iste okvire varijacija kljuĉnih nutritijenata i toksikanata kao konvencionalni pandan ili ne).

RIZICI!!!Ni jednu vrstu, pa ni transgenu, ne smemo

posmatrati nezavisno od drugihjer se svaka ukljuĉuje u odreĊeni ekosistemi u odreĊenu interakciju sa drugim vrstama.

Ukljuĉivanje ovakvih biljaka u prirodu nosirizik od moguće pojave rezistentnih

korovskih biljaka i njihovonekontrolisano širenje.

Drugi rizik jeste produkcija proteina koji

indukuju ALERGIJSKE REAKCIJE.

Primer ekspresije gena brazilskog oraha unetog u grašak (i soju),

koji se transformisao u jak imunogen,

izazivajući fatalne posledice u plućima miša, ukazuje na ozbiljnost rizika korišćenja GM

hrane.

OBAVEZAN JE INFORMISANI IZBOR –obeleţavanje GM hrane

ETIĈKI PROBLEMI TERMINATOR TEHNOLOGIJA!!!

Ova tehnologija spreĉava mogućnostkorišćenja komercijalnog GM semena

za drugu setvu.Terminator tehnologija ukljuĉuje

modifikaciju koja spreĉava klijanjesledeće generacije semena, a pri tome ne

utiĉe na kvalitet hrane koja nastajeod tog semena.

• Terminator tehnologija je osmišljena da ubaci farmere u krug kupovine semena ili hemikalija za prskanje svake sezone

Statistiĉki podaci

• Od 1996. do 2005. ukupna površina zasejana komercijalno genetiĉki modifikovanim usevima u svetu povećala se na 90 mil. ha.

• Broj drţava u kojima se gaje GMO povećao se sa 17 na 21 (za 1 godinu)

ETIĈKO-MORALNA PITANJA VEZANA ZA

1. GENSKU TERAPIJU

GENSKA TERAPIJA JE KOREKCIJA OŠTEĆENIH GENA ODGOVORNIH ZA

NASTANAK BOLESTI

POD POJMOM GENSKA TERAPIJA PODRAZUMEVA SE SVAKA MANIPULACIJA

NASLEDNIM MATERIJALOM U TERAPEUTSKE SVRHE

Postoje 3 vida genske terapije:

1. Korekcija oštećenog gena (zamena mutiranog gena normalnim, tj.

ubacivanje funkcionalnog gena u bolesnu ćeliju)

2. Antisens terapija (blokada primarnog produkta gena, tj. iRNK)

3. Ukljuĉivanje mikro RNK molekula u terapeutske svrhe

Razliĉiti pristupi ugraĊivanja normalnog gena:

1. VEKTORSKI2. NEVEKTORSKI (NEVIRUSNI)

- Direktno ugraĊivanje terapeutske DNK u ciljnu ćeliju

- Korišćenje lipozoma kao prenosioca- Hemijskim vezivanjem za molekule koji

prepoznaju receptore3. UVOĐENJEM 47.og HROMOZOMA

Ostale mogućnosti:1. Zamena mutiranog gena normalnim genom

kroz HOMOLOGU TRANSLOKACIJU2. Reparacija oštećenog gena REVERZNOM

MUTACIJOM3. DIRIGOVANA MUTAGENEZA reaktiviranih

protoonkogena

Virusni vektori u genskoj terapiji:

RETROVIRUSIADENOVIRUSI

ADENO-ASOCIRANI VIRUSIHERPES-SIMPLEKS VIRUSI

TIPOVI GENSKIH TERAPIJASOMATSKA genska terapija

GERMINATIVNA genska terapija

Nedostaci praktiĉne primene genske terapije:

1. NESTABILNOST TERAPEUTSKE DNK2. IMUNI ODGOVOR3. VIRUSNI VEKTORI

4. MULTIFAKTORIJALNE BOLESTI5. RIZIK ZA INDUKOVANJE TUMORA

INSERCIONOM MUTAGENEZOM6. ETIĈKI PROBLEMI

DOSTIGNUĆA IZ DOMENA GENSKE TERAPIJE

2008. Uspešna genska terapija jedne vrste slepila –London

2006. Uspešan tretman kancera (melanoma) –Meriland

2006. leĉenje mijeloidne leukemijeUspešno se leĉi imunodeficijencijaAGAMAGLOBULINEMIJA izazvana

nedostatkom enzima adenozin-deaminaze.

Talasemija, cistiĉna fibroza, Parkinsonova bolest –reparacijom mutacija na iRNK

PROBLEMI

1999. ĉetiri dana od poĉetka tretmana preminuo 18-godišnji deĉak zbog oštrog imunog odgovora na

vektor koji je bio adenovirus

Od 20-oro pacijenata leĉenih od imunodeficijencije (retrovirusi), troje je dobilo leukemiju

PITANJA• Šta je genetiĉki inţenjering?• Objasnite zašto je rekombinantna DNK

tehnologija horizontalan prenos gena.• Koja su tri kljuĉna koraka u genetiĉkom

inţenjeringu? • Šta se koristi kao vektor u genetiĉkom

inţenjerstvu?• Rekombinantna DNK tehnologija kao

biotehnologija XXI veka.• Koji se virusni vektori koriste u genskoj terapiji?• Tipovi genskih terapija?• Koji su nedostaci primene genske terapije?• Dostignuća u oblasti genske terapije?

• Šta su transgeni ili GMO? • Koji su praktiĉni ciljevi formiranja GMO?• Da li se GMO mogu upotrebiti za dalju

reprodukciju?• Navedite razloge zbog kojih treba formirati GMO.• Navedite rizike formiranja GMO.• Navedite primere korišćenja GMO u medicini.• Navedite primere korišćenja GMO u

poljoprivredi.• Šta podrazumeva ’’terminator tehnologija’’?• Koje GM biljne vrste se gaje u komercijalne

svrhe?• Da li je proizvodnja GMO u porastu? Statistiĉki

podaci.

• Genetiĉki inţenjering podrazumeva _____________ novih kombinacija _____________________.

• Šta omogućuje formiranje rekombinovanih molekula koji se sastoje iz DNK koje vode poreklo iz razliĉitih organizama?

a) Univerzalnost polimeraze bakterije omogućava ugraĊivanje gena

b) Supresija restrikcionih enzima u bakteriji

c) Univerzalnost genetiĉkog koda

• Šta prepoznaju restrikcione endonukleaze?a) Ĉeoni niz u DNKb) Ukosnicu-umnoţak GC parovac) Specifiĉne nukleotide u dvolanĉanoj DNK

nazvane palindromske sekvence • Koji od ponuĊenih odgovora se odnosi na

plazmid kao vektor za kloniranje?a) Vektor za kloniranje je izolovani deo

bakterijske hromozomske DNKb) To je kruţni molekul DNK koji postoji u nekim

baketrijama i ima sposobnost da se replikuje nezavisno od bakterijske DNK

c) Sadrţi neke neophodne gene za metabolizam laktoze bakterije

d) Svi odgovori su taĉni

• Genetiĉki inţenjering je:a) Manipulacija genetiĉkim materijalomb) Prenošenje genetiĉkog materijala iz jednog

organizma u drugic) Dobijanje organizama sa drugaĉijom

kombinacijom genad) Svi odgovori su taĉni• Genetiĉki inţenjering ima primenu u:a) Medicinib) Veterinic) Poljoprivredid) Ratarstvue) Industrijif) Svi odgovori su taĉni

• Da bi se u ćeliji bakterije sintetisao protein ĉoveka, koji od ponuĊenih molekula mora biti prenet u bakteriju?

a) Gen za taj proteinb) RNK ĉovekac) tRNKd) Svi navedeni molekuli• Obeleţi taĉnu tvrdnju:a) postoji gensko i genomsko inţenjerstvob) Od biotehnologije se oĉekuje da poveća

proizvodnju hranec) Primena inţenjerstva moţe da bude u zaštiti

ĉovekove okolined) Svi odgovori su taĉni

• Da li se genetiĉkim inţenjeringom moţe da dobije estrogen?

a) da

b) ne

• Biološki bioreaktori su?

a) E. coli

b) Pseudomonas

c) Obe vrste

• U bakterijskim kulturama moţe da se dobije niz ____________ neophodnih u medicini.

• Genetiĉko inţenjerstvo omogućava da se:

a) U ćeliji bakterije sintetiše insulin, koji ne izaziva imunološku reakciju posle dugotrajne upotrebe

b) U bakteriji sintetiše hormon rasta

c) Oba navoda su taĉna

• Koji od sledećih odgovora je taĉan?a) Prenošenje genetiĉkog materijala iz jednog

ţivog sistema u drugi naziva se genetiĉko inţenjerstvo

b) PresaĊivanje jedra iz jedne ćelije u drugu je genomsko inţenjerstvo

c) Geni se najĉešće prenose pomoću plazmidad) Svi odgovori su taĉni • Tehnikom genetskog inţenjerstva se mogu

dobiti:a) Biljke rezistentne na delovanje herbicida i

insekticidab) Biljke sa većim prinosom plodac) Biljke krupnih cvasti i lepših bojad) Sve navedene

• Koji od navedenih hormona ne moţe da se dobije genetiĉim inţenjeringom?

a) Humani insulin

b) Testosteron

c) Hormon rasta

d) Svi navedeni molekuli

• U sluĉaju ovce Doli:

a) Doli je nastala kao klon iz somatskih ćelija

b) Doli je nastala iz jajne ćelije jedne vrste ovce koja je nakon oploĊenja ubaĉena u drugu ovcu

c) Doli je dokaz da su u somatskim ćelijama svi geni prisutni