Vjezba 3-Geneticki Kod

Lukić Bilela L. i Kalamujić B. (2013) Vježba 3: Genetički kod, čitanje ORF-a i

translacija

14

Vježba 3: Genetički kod, čitanje ORF-a i translacija

Priprema za vježbu

1. Napravite vlastitu tablicu genetičkog koda i zalijepite na komadić kartona. Istu tu

tablicu možete zalijepiti u svesku, kako bi vam uvijek bila pri ruci.

2. Ponovite skraćenice za aminokiseline u one letter code i three letter code.

Ukupna genetička informacija, skup gena jednog organizma naziva se genom.

Cjelokupna genetička informacija sadržana je u molekuli DNK. Svaka funkcionalna

regija molekule DNK čini gen. Gen je tačno određeni slijed nukleotida na tačno

određenom mjestu (lokus) u molekuli DNK, koji daje funkcionalni produkt. Produkti

ekspresije gena mogu biti proteini, rRNK, tRNK, miRNK, snRNK i razne druge

molekule RNK. Dakle, produkti ekspresije gena, odnosno funkcionalni genski produkti

se tokom ekspresije mogu translatirati u protein (produkti ekspresije proteinskih gena) ili

se samo transkribiraju (geni za različite RNK se eksprimiraju samo traskripcijom).

Tablica 3.1: Tablica standardnog genetičkog koda (Kod 1)

Sekvenca gena koja se nalazi na DNK i RNK molekulama, sastoji se od tri

nukleotida i oni čine triplet baza koji nazivamo kodon. Svaki kodon kodira jednu

aminokiselinu.

Kako se kodon sastoji od po tri nukleotida, a postoje četiri različite baze, moguće

su 64 različite kombinacije 43 = 64. Na primjer, RNK slijed 5'- UUUGGGCCC -3', se

sastoji od kodona UUU, GGG i CCC, i svaki od tri kodona kodira po tri amino kiseline.

Tako da ova RNK sekvenca predstavlja sekvencu proteina, koji je dug tri aminokiseline.


translacija

15

Kod (franc. code – šifra, ključ, skup dogovorenih znakova tajne poruke). Pod

pojmom genetičkog koda podrazumjevamo niz pravila koja se odnose na način kodiranja

genetičke informacije i prijevoda (DNK ili RNK slijedu) u aminokiselinske sljedove.

Genetički kod pokazuje tri važne osobine: univerzalnost, degenerativnost i čitanje

bez preklapanja.

1. Univerzalnost podrazumijeva da je genetički kod isti za sve biološke vrste, odnosno da

pojedini kodoni kod svih bioloških vrsta odgovaraju istoj aminokiselini,

2. Degenerativnost genetičkog koda podrazumijeva da jednu aminokiselinu najčešće

određuje veći broj kodona. Kodoni koji određuju istu aminokiselinu često su vrlo slični i

najčešće se razlikuju samo na trećoj bazi kodona.

Tablica 3.2: Aminokiseline sa datim kodonima za odgovarajuću aminokiselinu.

Ala A GCU, GCC, GCA, GCG Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG

Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys K AAA, AAG

Asn N AAU, AAC Met M AUG

Asp D GAU, GAC Phe F UUU, UUC

Cys C UGU, UGC Pro P CCU, CCC, CCA, CCG

Gln Q CAA, CAG Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU,AGC

Glu E GAA, GAG Thr T ACU, ACC, ACA, ACG

Gly G GGU, GGC, GGA, GGG Trp W UGG

His H CAU, CAC Tyr Y UAU, UAC

Ile I AUU, AUC, AUA Val V GUU, GUC, GUA, GUG

Start AUG, GUG Stop UAG, UGA, UAA

Na primjer kodoni GAA i GAG kodiraju glutamin. Aminokiselinu leucin kodiraju

kodoni CUU, CUC, CUA, CUG, te UUA, UUG. Prva četiri kodona, koji se razlikuju

samo na trećoj bazi kodona – čine jednu kodonsku obitelj kodona za leucin. Kodoni UUA

i UUG, razlikuju se od prve obitelji kodona za leucin, po tome što do promjene dolazi na

prvoj bazi kodona, te ova dva kodona čine drugu kodonsku obitelj kodona za leucin.

Samo dvije aminokiseline (u standardnom genetičkom kodu) imaju isključivo jedan

kodon, a to su metionin (AUG) i triptofan (UGG). Zahvaljujući postojanju više kodona za

jednu aminokiselinu, zamjena nukleotida u kodonu najčešće ne mora uzrokovati i

zamjenu aminokiseline u proteinu. Prednost ovakvog načina kodiranja je u tome što

spriječava negativan efekat mutacija na organizam.

3. Čitanje bez preklapanja znači da nukleotidi jednog kodona nikada ne pripadaju

istovremeno i susjednim kodonima. Genetički kod se smatrao univerzalnim, jednakim za

cjelokupni živi svijet, sve do 1979. godine kada je otkriveno da se genetički kod u

mitohondrijskim genima sisavaca razlikuje od standardnog u upotrebi kodona AUA,

UGA, AGA i AGG (Barrell et al., 1979). Kasnije je postojanje nestandardnog genetičkog

koda potvrđeno u sva tri carstva: Archaea, Bacteria i Eucaryota. Osim u genomima


translacija

16

staničnih organela, nestandarni genetički kod nađen je i u velikim genomima jezgre,

uključujući kvasac i Protozoe.

Slika 3.1: Tablica genetičkog koda uz prikaz adaptorske uloge molekula tRNK prilikom

translacije (prevođenja genetičke informacije sa mRNK u protein

Različite upotrebe kodona, u odnosu na standardni genetički kod (slika 3.1.), u

mitohondrijskim genima posjeduju: kralješnjaci (2), kvasac (3), plijesni, Protozoa,

Coelenterata, Mycoplasma/Spiroplasma (4), beskralješnjaci (5); Echinodermata (9);

Ascidia (13), Platyhelminthes (14); Chlorophyceae (16); Trematoda (21) Scenedesmus

obliquus (22); Thraustochytrium aureum (Labyrinthulida) (23). Varijacije genetičkog

koda uočene su u mitohondrijima svih organizama, osim u biljkama (Lukić-Bilela L,

2005).

Pojam ORF – otvoreni okvir čitanja

U molekularnoj genetici, open reading frame (ORF) predstavlja porciju genoma

koja sadrži slijed nukleotida koji potencijalno kodira protein. ORF je regija između start i

stop kodona, no to ne znači da on uvijek kodira za funkcionalni protein. Kada je jednom

gen sekvenciran (određen slijed nukleotida) i provjerena funkcionalnost njegovog

produkta, tada tom genu dajemo ime i on prestaje biti putativni gen za neki protein.

Možemo reći da gen uvijek podrazumijeva ORF koji je lociran između

inicijacijskog (start) i terminacijskog (stop) kodona, no ORF nije uvijek i gen. Otvoreni

okvir čitanja ne mora kodirati funkcionalni protein, mada dug ORF uvijek indicira da se

ipak radi o prisustvu gena, što je dalje potrebno provjeriti. U slučaju eukariotske DNK,

ORF je isprekidan jer se unutar njega nalaze introni. Teoretski, sekvencu DNK

NCBI (National Center for Biotechnology

Information) danas citira 17 različitih

upotreba kodona, uključujući i standardni

genetički kod. Njih 11 koristi se u

mitohondrijskim genima tačno određenih

grupa organizama, a označeni su brojevima

po kojima se prepoznaje o kojoj se grupi

organizama radi.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=35131&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock


translacija

17

(dvolančlanu DNK) možemo čitati u 6 okvira čitanja, po 3 sa svake strane, u pravcu 5'-3'

i 3'-5'.

Naprimjer, u slijedu nukleotida 5'-UCUAAAAUGGGUGAC-3', vidimo 2 od 3

moguća ORF-a. Naime, ovaj slijed u pravcu 5'-3' možemo pokušati pročitati u 3 okvira

čitanja.

1. UCU AAA AUG GGU GAC

2. ..CUA AAA UGG GUG AC

3. ....UAA AAU GGG UGA C

No, treći (posljednji) okvir čitanja počinje sa stop kodonom, dakle nije ga moguće

čitati. Taj okvir ne možemo smatrati otvorenim za čitanje. U prvom okviru čitanja, pak

zapažamo start kodon AUG, pa je sasvim izvijesno da je to korektan okvir čitanja u

kojem čitamo ovaj slijed nukleotida, koji je mogući gen.

Slika 3.2: „Output“ pretraživanja mogućih ORF-ova u datoj sekvenci, u programskom

paketu StarORF

Danas postoje brojni i besplatno dostupni programski i software paketi u okviru

kojih je moguće pretraživati otvorene okvire čitanja u svih 6 okvira. Jedan od njih je

StarORF čiji je „output“ (rezultat pretraživanja) prikazan je slici 3.2. Slijed nukleotida

(sekvenca DNK) prikazana u gornjem dijelu prozora naziva se „input“. To je ono što

insertiramo u program i šaljemo na pretraživanje. Rezultat pretrage, bioinformatičkim

jezikom, nazivamo „output“.


translacija

18

TRANSLACIJA DNK

Uloga ribosoma u sintezi proteina

Ćelija E.coli sadrži oko 20 000 ribosoma, raspoređenih u citoplazmi. Prosječna

humana ćelija sadrži i mnogo više ribosoma; neki su slobodni u citoplazmi, a neki vezani

za spoljašnju površinu endoplazmatskog retikuluma. Prvobitno, na ribosome se gledalo

kao na pasivne učesnike u proteinskoj sintezi, strukturu na kojoj se dešava translacija.

Ovo stajalište se promjenilo tokom godina i danas se smatra da ribosomi igraju dvije

važne uloge u proteinskoj sintezi:

Ribosomi koordiniraju proteinsku sintezu pozicionirajući iRNK, aminoacil-tRNK

i odgovarajuće proteinske faktore u pravilne položaje u odnosu jedne na drugih.

Komponente ribosoma, uključujući rRNK, kataliziraju bar neke od hemijskih

reakcija koje se odvijaju tokom translacije.

Građa ribosoma

Svaki ribosom se sastoji od dvije podjedinice. Kod eukariota to su 60S i 40S, a kod

bakterija 50S i 30S. Veća podjedinica sadrži tri molekule rRNK kod eukariota (28S, 5.8S

i 5S), a samo dvije kod bakterija (23S i 5S). Mala podjedinica sadrži jednu molekulu

rRNK kod oba tipa organizama: 18S rRNK kod eukariota i 16S rRNK kod bakterija.

Translacija i sinteza proteina

Transportne RNK igraju centralnu ulogu u

translaciji. One predstavljaju akceptor molekule

i čine vezu između iRNK i polipeptida koji se

sintetiše.

Bakterije sadrže 30-45 različitih tRNK, dok

eukarioti imaju i do 50. Obzirom da je samo 20

aminokiselina određeno genetičkim kodom, to

znači da svi organizmi imaju bar nekoliko

izoformi tRNK, različitih tRNK specifičnih za

istu aminokiselinu.

Najmanje tRNK su samo 74 nukleotida duge,

dok su najveće rijetko duže od 90 nukleotida.

Obzirom da se radi o malim molekulama koje je

moguće pojedinačno purificirati, tRNK su bile

među prvim nukleinskim kiselinama koje su

sekvencirane. Analizom prve tRNK sekvence za

tRNKAla

za Saccharomyces cerevisiae, utvrđeno

je da molekula može zauzeti različite sekundarne

Akceptor

Antikodon krak

Antikodon

V petlja

TYC krak

D krak

Slika 3.3: Shema strukture molekule tRNK


translacija

19

strukture. Nakon što su sekvencirane još neke tRNK, postalo je jasno da sve tRNK

molekule mogu zauzeti jednu određenu strukturu – strukturu lista djeteline (Slika 3.3.),

koja ima slijedeće osobine:

Akceptor krak sastoji se od sedam parova baza između 5′ i 3′ kraja molekule.

Aminokiselina je vezana za krajnji 3' kraj tRNK, za adenozin invarijantne CCA

terminalne sekvence;

D krak, nazvan prema modifikovanom nukleozid dihidrouridinu, koji je uvijek

prisutan u ovoj strukturi.

Antikodon krak sadrži triplet nukleotida nazvanih antikodon koji se

komplementarno veže za iRNK tokom translacije.

V petlja sadrži 3–5 nukleotida kod tRNK klase I ili 13–21 nukleotida kod tRNK

klase II.

TYC krak, nazvan po sekvenci timidin-pseudouridin-citosina, koji je uvijek

prisutan.

INICIJACIJA TRANSLACIJE

Iako je struktura ribosoma slična kod bakterija i eukariota, postoje razlike u načinu na

koji se dešava translacija kod ovih organizama. Najvažnija od ovih razlika javlja se

tokom prve faze translacije, kada se ribosom veže za iRNK na poziciji prije inicijacijskog

kodona. Razlika u inicijalnoj fazi translacije sastoji se u tome da se kod bakterija

inicijacijski kompleks formira direktno na inicijacijskom kodonu, tački na kojoj počinje

sinteza proteina, dok eukarioti koriste indirektniji princip lociranja inicijalne tačke.

Naime, kod eukariota manja ribosomalna podjedinica se veže za 5' kraj iRNK i kliže niz

molekulu dok ne naiđe na inicijalni kodon.

ELONGACIJA KOD BAKTERIJA I EUKARIOTA

Vezivanje veće podjedinice rezultira formiranjem dvaju pozicija na koje se može

vezati aminoacil-tRNK. Prva, P ili peptidil pozicija, je već zauzeta inicijatorom

tRNKiMet

, koji nosi N-formilmetionin ili metionin, i vezan je za inicijalni kodon. Druga

pozicija, A ili aminoacil pozicija, pokriva drugi kodon u otvorenom okviru čitanja (open

reading frame – ORF).

A pozicija biva popunjena odgovarajućom aminoacil-tRNK, koju kod E.coli na

poziciju donosi elongacijski faktor EF-Tu. Ovaj faktor osigurava da samo tRNK koja

nosi odgovarajuću aminokiselinu može ući u ribosom. Specifične veze između tRNK,

iRNK i 16S rRNK sa A pozicijom osiguravaju da samo odgovarajuća tRNK bude

prihvaćena.

Kada aminoacil-tRNK stigne na A poziciju, formira se peptidna veza između dvije

aminokiseline. U ovu reakciju je uključen enzim peptidil transferaza, koji raskida vezu

između aminokiseline i inicijatora tRNKiMet

i potom formira peptidnu vezu između te

aminokiseline i one koja je vezana za drugu tRNK. Kod bakterija, aktivnost peptidil

transferaze počiva na 23S rRNK veće podjedinice i stoga predstavlja primjer ribozima.


translacija

20

Za ovu reakciju neophodna je energija, te zato zahtijeva hidrolizu GTP vezanog za EF-Tu

(Eef-1 kod eukariota). To dovodi do inaktivacije EF-Tu, koji biva izbačen iz ribosoma i

regeneriran djelovanjem EF-Ts. Ekvivalent EF-Ts kod eukariota još nije otkriven, i

moguće je da podjedinica eEF-1 ima sposobnost regeneracije.

U ovoj fazi translacije dipeptid koji korespondira sa prva dva kodona u otvorenom

okviru čitanja je vezan za tRNK na A poziciji. Idući korak je translokacija, tokom koje se

istovremeno dešavaju tri stvari:

Ribosom se kreće niz tri nukleotida, tako da idući kodon dolazi na A poziciju

Dipeptid-tRNK na A poziciji se pomjera na P poziciju

Deacilirana tRNK na P poziciji stiže na treću poziciju, E – izlaznu poziciju (exit

site), kod bakterija, ili, kod eukariota, jednostavno bude izbačena iz ribosoma.

Translokacija zahtijeva hidrolizu molekule GTP, sa EF-G kao medijatorom kod

bakterija i eEF-2 kod eukariota. Elektronskom mikroskopijom ribosoma u različitim

međufazama translokacije utvrđeno je da se dvije podjedinice unekoliko zarotiraju u

suprotnom smjeru, otvarajući prostor između njih i omogućujući ribosomu da klizi niz

iRNK (Frank and Agrawal, 2000). Translokacija za rezultat ima oslobađanje A pozicije,

što otvara mogućnost novoj aminoacil-tRNK da dođe na nju. Elongacijski ciklus se

potom ponavlja, i nastavlja dok se ne dosegne kraj otvorenog okvira čitanja.

TERMINACIJA TRANSLACIJE

Sinteza proteina se završava kada ribosom stigne do jednog od tri terminacijska

kodona. Na A poziciju tada dolazi protein otpuštajući faktor. Kod bakterija su prisutna tri

ovakva faktora: RF-1 koji prepoznaje terminacijske kodone 5'-UAA-3' i 5'-UAG-3'; RF-2

koji prepoznaje 5'-UAA-3' i 5'-UGA-3'; te RF-3 koji stimulira otpuštanje RF1 i RF2 sa

ribosoma nakon terminacije, u reakciji za koju je potrebna energija generirana hidrolizom

GTP. Eukarioti imaju samo dva otpuštajuća faktora: eRF-1, koji prepoznaje terminacijski

kodon, i eRF-3, koji moguće ima istu ulogu kao RF-3, iako to još nije dokazano (Kisselev

and Buckingham, 2000).

Protein otpuštajući faktori okončavaju translaciju, ali se čini da nisu odgovorni za

disocijaciju ribosomalnih podjedinica, barem ne kod bakterija. Tu ulogu ima protein –

ribosom reciklirajući faktor (RRF), koji kao i eRF-1 ima strukturu sličnu tRNK (Selmer

et al., 1999). Reakcija disocijacije zahtjeva energiju iz GTP, a također i uključivanje

inicijalnog faktora IF-3, kako bi se spriječilo da se ribosomske podjedinice ponovo

povežu. Ekvivalent RRF-a kod eukariota još nije otkriven, i to bi mogla biti jedna od

funkcija eRF-3. Odvojene ribosomske podjedinice ostaju u citoplazmi sve dok ne budu

ponovo upotrebljene u idućem ciklusu translacije.

Literatura:

Barrell, B.G., Bankier, A.T., & Drouin, J. (1979). A different genetic code in human

mitochondria. Nature, 282(5735), 189-94.

Brown, T.A. (2002). Genomes, 2nd

edition, BIOS Scientific Publishers Ltd.


translacija

21

Frank, J. & R.K. Agarwal. (2000). A ratchet-like inter-subunit reorganization of the

ribosome during translocation Nature 406, 318-322.

Kisselev, L.L. & R.H. Buckingham. (2000). Translational termination comes of age

Trends Biochem. Sci. 25, 561-566.

Lukić-Bilela, L. (2005). Primarna struktura i filogenetska analiza mitohondrijskih gena

morske spužve Suberites domuncula (Olivi, 1792). Doktorska disertacija. Institut

Ruđer Bošković, Zagreb.

Selmer, M., S. Al-Karadaghi, G. Hirokawa, A. Kaji & A. Liljas. (1999). Crystal structure

of Thermatoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic Science 286,

2349-2352.

Yokobori, S., Suzuku, T., & Watanabe, K. (2001). Genetic code variations in

mitochondria: tRNA as a major determinant of genetic code plasticity. Journal of

Molecular Evolution, 53(4-5), 314-326.

ZADACI:

1. Uočite postojanje različitih kodonskih obitelji za aminokiseline arginin, leucin, serin.

2. Pronađite na web stranici http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/utils/wprintgc.cgi

(the genetic code) različite načine upotrebe kodona i usporedite ih i uočite razlike.

3. Vježbajte čitanje genske sekvence u različitim genetičkim kodovima.

4. Riješite zadatak:

Ako promatrate navedeni slijed nukleotida 5'-UCUAAAGGUGAC-3' koliko vidite

mogućih otvorenih okvira čitanja u smjeru 5'-3' i navedite koji su to okviri.

5. Pročitajte navedeni slijed nukleotida u svih 6 okvira čitanja, koristeći tablicu

standardnog genetičkog koda (kod br. 1).

ATGGTAAGTGATATATTAGCAGGTTCAAAAATTCGTTGATGGGTTGGAATTC

6. Navedni slijed nukleotida sada pročitajte koristeći tablicu koda broj 4 (mold, protozoa,

coelenterata, mycoplasma/spiroplasma). Genetički kod broj 4 koji koriste grupe navedene

u zagradi, podrazumijeva jednu glavnu razliku u odnosu na standardni genetički kod: uga

nije stop kodon, nego se prevodi u aminokiselinu triptofan (w).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/utils/wprintgc.cgi

22

U vašim ćelijama troslovne DNK „riječi“ kodiraju za specifične aminokiseline koje izgrađuju proteine. U ovdje prikazanom kodu, svaka troslovna DNK „riječ“ kodira za jedno slovo abecede.

Koristeći dati kod dešifirajte pitanje ispod, te odgovorite na njega.

AAA = A AAC = B CCC = C CCA = Č CCG = Ć ACT = D GCG = DŽ GTG = Đ GTT = E GGC = F GGG = G ACG = H GAC = I GAT = J GTA = K GCC = L GAA = LJ CAC = M CAT = N CGG = O CTA = P CAG = R CCT = S TCC = Š TTT = T TGT = U TGC = V TAT = Z TTG = Ž

GTA CGG GAT AAA CGG CAG GGG AAA CAT GTT GCC AAA

CTA CAG GTT ACT CCT TTT AAA TGC GAA AAA

GTT CAT GTT CAG GGG GTT TTT CCT GTA GAC

CCC GTT CAT TTT AAA CAG CCT TTT AAA CAT GAC CCC GTT ?

Odgovor:

23

Preuzeto sa: http://www.revisionworld.co.uk/files/geneticcode2%20copy.jpg

Preuzeto sa: http://www.monde-solidaire.org/spip/IMG/jpg/UniversalGeneticCode.jpg

Documents

Vjezba 3-Geneticki Kod