Embed Size (px)
Citation preview
ĠSTANBUL TEKNĠK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
DOKTORA TEZĠ
GIDA RENKLENDĠRĠCĠLERĠNĠN TAYĠNĠ ĠÇĠN YENĠ
YÖNTEMLER GELĠġTĠRĠLMESĠ
FatoĢ Ayça ÖZDEMĠR OLGUN
Kimya Anabilim Dalı
Kimya Programı
ARALIK 2014
ARALIK 2014
ĠSTANBUL TEKNĠK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
GIDA RENKLENDĠRĠCĠLERĠNĠN TAYĠNĠ ĠÇĠN YENĠ
YÖNTEMLER GELĠġTĠRĠLMESĠ
DOKTORA TEZĠ
FatoĢ Ayça ÖZDEMĠR OLGUN
(509072214)
Kimya Anabilim Dalı
Kimya Programı
Tez DanıĢmanı: Prof. Dr. Birsen DEMĠRATA ÖZTÜRK
iii
Tez DanıĢmanı : Prof. Dr. Birsen DEMĠRATA ÖZTÜRK
İstanbul Teknik Üniversitesi
Jüri Üyeleri : Prof. Dr. Süleyman AKMAN
İstanbul Teknik Üniversitesi
Prof. Dr. ReĢat APAK
İstanbul Üniversitesi
Prof. Dr. Ġkbal KOYUNCU
Yıldız Teknik Üniversitesi
Doç. Dr. Gülçin YILMAZ
İstanbul Teknik Üniversitesi
İTÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü‟nün 509072214 numaralı Doktora Öğrencisi FatoĢ Ayça
ÖZDEMĠR OLGUN, ilgili yönetmeliklerin belirlediği gerekli tüm şartları yerine
getirdikten sonra hazırladığı “GIDA RENKLENDĠRĠCĠLERĠNĠN TAYĠNĠ ĠÇĠN
YENĠ YÖNTEMLER GELĠġTĠRĠLMESĠ” başlıklı tezini aşağıda imzaları olan jüri
önünde başarı ile sunmuştur.
Teslim Tarihi : 14 Kasım 2014
Savunma Tarihi : 24 Aralık 2014
iv
v
Kızıma,
vi
vii
ÖNSÖZ
Bilimsel, akademik ve insani kimliğiyle örnek aldığım doktora tez danışmanım Sayın
Prof. Dr. Birsen Demirata ÖZTÜRK‟e tez çalışmalarım boyunca gösterdiği her türlü
destek ve yardımlarından dolayı en derin şükranlarımı ve teşekkürlerimi sunarım.
Tez izleme komitemde yer alan çok kıymetli hocalarım Sayın Prof. Dr. Reşat
APAK‟a ve Sayın Prof. Dr. Süleyman AKMAN‟a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Bu çalışma boyunca büyük bir özveri ile bana yardımcı olan değerli arkadaşlarım
Uzman Dr. Dilek ÖZYURT‟a ve Arş. Gör. Dr. Işıl BERKER ÇETİN‟e ve analitik
kimya bölümündeki arkadaşlarıma teşekkür ederim. Hat-üstü HPLC-CUPRAC
çalışmalarında gösterdikleri yardım ve destekten ötürü başta Yrd. Doç. Dr. Esin
Çelik olmak üzere İstanbul Üniversitesi Kimya Bölümü, Analitik Kimya
Anabilimdalı çalışanlarına teşekkür ederim.
Hayatımın her döneminde beni cesaretlendiren, maddi ve manevi desteklerini hiçbir
zaman esirgemeyen değerli annem Vildan ÖZDEMİR, babam Fevzi ÖZDEMİR ve
eşim Asım Aykut OLGUN‟a canı gönülden teşekkür ederim.
Son olarak tezimle aynı adı taşıyan doktora tez projesine destek sağlayan İstanbul
Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Birimine ve Fen Bilimleri Enstitüsü
çalışanlarına teşekkür ederim
Kasım 2014
Fatoş Ayça ÖZDEMİR OLGUN
(KimyaYüksek Mühendisi)
viii
ix
ĠÇĠNDEKĠLER
Sayfa
ÖNSÖZ ...................................................................................................................... vii
ĠÇĠNDEKĠLER ......................................................................................................... ix
KISALTMALAR ...................................................................................................... xi
ÇĠZELGE LĠSTESĠ ................................................................................................ xiii
ġEKĠL LĠSTESĠ ....................................................................................................... xv
GIDA RENKLENDĠRĠCĠLERĠNĠN TAYĠNĠ ĠÇĠN YENĠ YÖNTEMLER
GELĠġTĠRĠLMESĠ ................................................................................................ xvii
ÖZET ....................................................................................................................... xvii
SUMMARY ............................................................................................................. xix
1. GĠRĠġ .................................................................................................................. 1
1.1 Tezin Amacı .......................................................................................................... 3
2. GENEL BĠLGĠ ................................................................................................... 5
2.1 Gıda Renklendiricileri Hakkında Genel Bilgi ....................................................... 5
2.2 Literatür Araştırması ............................................................................................. 8
2.2.1 Kromatografik yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri ................................................................................................................... 8
2.2.2 Spektrofotometrik yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri ................................................................................................................. 12
2.2.3 Antioksidan tayin yöntemleri kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri ................................................................................................................. 15
2.2.4 Diğer yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi analizleri ......... 15
2.2.5 Tez kapsamında kullanılan yöntemler hakkında genel bilgi ...................... 16
2.2.5.1 Kullanılan antioksidan kapasite tayin yöntemleri .............................. 16
2.2.5.2 Kromatografi ...................................................................................... 18
2.2.5.2.1 Kolon sonrası türevlendirme tekniği .............................................. 20
3. MALZEME VE YÖNTEM ............................................................................. 27
3.1 Kullanılan Cihazlar ............................................................................................. 27
3.2 Kimyasal Maddeler ............................................................................................. 27
3.3 Çözeltilerin Hazırlanması ................................................................................... 30
3.3.1 Antioksidan kapasite tayin yöntemleri için çözelti hazırlanması ............... 30
3.3.1.1 CERAC yöntemi için çözelti hazırlanması ........................................ 30
3.3.1.2 CUPRAC yöntemi için çözelti hazırlanması...................................... 30
3.3.2 HPLC yöntemi için çözelti hazırlanması ................................................... 30
3.4 Renklendirici ve Gerçek Örnek Çözeltilerinin Analiz için Hazırlanması ........... 31
3.5 Sentetik Renklendiricilerin Spektrofotometrik Yöntemlerle Tayini ................... 31
3.5.1 CERAC yöntemi ........................................................................................ 31
x
3.5.2 CUPRAC yöntemi .................................................................................. 32
3.6 Kromatografik Yöntemler ........................................................................... 32
3.6.1 HPLC analizi ........................................................................................... 32
3.6.2 Hat üstü HPLC yöntemleri ...................................................................... 33
3.6.2.1 Hat üstü HPLC-CUPRAC yöntemi .................................................... 34
3.6.2.2 Hat Üstü HPLC CERAC yöntemi ..................................................... 35
3.7 İstatistiksel Analiz ................................................................................................ 35
4. DENEYSEL BULGULAR ............................................................................... 37
4.1 Spektrofotometrik Yöntemler ............................................................................. 37
4.1.1 Sentetik renklendiricilerin sulu çözeltilerinin absorpsiyon spektrumları ... 37
4.1.2 CERAC yöntemi ile sentetik gıda renklendiricilerin tayini .......................... 38
4.1.2.1 CERAC yöntemine göre renklendiricilerin kalibrasyon grafiklerinin
oluşturulması ...................................................................................................... 38
4.1.2.2 İçecek tozlarına standart katkı yönteminin uygulanması ....................... 42
4.1.2.2.1 Portakal içecek tozuna tartrazin katkısı ........................................... 42
4.1.2.3 CERAC yönteminin geri kazanımının belirlenmesi ............................... 43
4.1.3 CUPRAC yöntemi ile sentetik gıda renklendiricilerin tayini ........................ 44
4.1.3.1 CUPRAC yöntemine göre renklendiricilerin kalibrasyon grafiklerinin
oluşturulması ...................................................................................................... 44
4.1.3.2 İçecek tozlarına standart katkı yönteminin uygulanması ....................... 48
4.1.3.2.1 Portakal içecek tozuna tartrazin katkısı ........................................... 48
4.1.3.3 CUPRAC yönteminin geri kazanımının belirlenmesi ............................ 49
4.2 Sentetik Renklendiricilerin Tayini İçin Geliştirilen Kromatografik Yöntemler . 50
4.2.1 HPLC-PDA yöntemi .................................................................................. 50
4.2.1.1 HPLC-PDA yönteminin toz içecek örneklerine uygulanması ........... 56
4.2.2 Kolon sonrası türevlendirme yöntemleri .................................................... 58
4.2.2.1 Hat-üstü HPLC- CUPRAC yöntemi .................................................. 58
4.2.2.1.1 Hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminin toz içecek örneklerine
uygulanması ................................................................................................... 60
4.2.2.2 Hat-üstü HPLC- CERAC yöntemi ..................................................... 63
4.2.2.2.1 Akış hızının optimizasyonu ............................................................ 63
4.2.2.2.2 CERAC reaktifinin derişiminin optimizasyonu ............................. 63
4.2.2.2.3 Hat-üstü HPLC-CERAC yönteminin Ponsö 4R‟e uygulanması .... 64
4.3 Tez kapsamında geliştirilen yöntemlerle toz içecek örneklerinin analizi ............ 65
5. SONUÇLAR ..................................................................................................... 69
5.1 Spektrofotometrik Toplam Antioksidan Kapasite Tayin Yöntemlerinin
Renklendirici Tayinine Uygulanması ................................................................. 69
5.2 Kromatografik Yöntemler .................................................................................... 72
5.3 Gerçek Örnek Uygulamaları ................................................................................ 74
KAYNAKLAR .......................................................................................................... 75
ÖZGEÇMĠġ .............................................................................................................. 81
xi
KISALTMALAR
AA : Askorbik asit
AO : Antioksidan
ABTS : 2,2‟- azinobis(3-etilbenzotiyazolin-6-sulfonat)
ABTS.+
: ABTS radikal katyonu
CI : Color Index (Renk indeksi)
CERAC : Seryum (IV) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite
CUPRAC : Bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasite
DPPH : 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
ET : Elektron transferi
EC : European comission (Avrupa komisyonu)
FDA : Food and drug administration (Gıda ve ilaç yönetimi)
FRAP : Demir(III) iyonu indirgetici antioksidan gücü
HPLC : Yüksek performans sıvı kromatografisi
LC : Sıvı kromatografisi
LOD : Limit of detection (Gözlenebilme sınırı)
LOQ : Limit of quantitation (Tayin sınırı)
MS : Kütle spektrometri
Nc : Neokuproin
PDA : Photo diode array (fotodiyot)
PERĠ : Ponsö 4R eşdeğer renklendirici içeriği
RSD : Bağıl Standart Sapma
TBHQ : Tersiyer bütilhidrokinon
TEAC : Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi
TRAP : Toplam peroksil radikal tutma antoksidan parametresi
TRĠ : Toplam renklendirici içeriği
UV : Mor ötesi
xii
xiii
ÇĠZELGE LĠSTESĠ
Sayfa
Çizelge 3.1: Analizleri yapılan sentetik renklendiricilerine ait renk indeks
numaraları, Avrupa Birliği numaraları ve kimyasal yapıları. ................... 29
Çizelge 3.2: HPLC-PDA sistemi ile renklendiricilerin ayrılması için optimize
edilen dereceli elüsyon programı [0,13 M amonyum asetat çözeltisi
(A), ve metanol (B)]. ................................................................................. 33 Çizelge 4.1: Sentetik renklendiricilerin CERAC yöntemi ile elde edilen lineer
kalibrasyon denklemleri, lineer çalışma aralıkları, gözlenebilme(LOD),
tayin sınırı (LOQ) değerleri ve ponsö eşdeğer renklendirici içeriği için
hesaplanan katsayı değerleri (PERİ). ........................................................ 41
Çizelge 4.2: CERAC yönteminin geri kazanımı ....................................................... 43 Çizelge 4.3: Sentetik renklendiricilerin CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar
absorpsiyon katsayıları, lineer çalışma aralıkları, lineer kalibrasyon
denklemleri, gözlenebilme(LOD), tayin sınırı (LOQ) değerleri ve ponsö
eşdeğer renklendirici içeriği için hesaplanan katsayı değerleri (PERİ). ... 47 Çizelge 4.4: CUPRAC yönteminin gerikazanımı ...................................................... 50
Çizelge 4.5: Minioti ve arkadaşları tarafından geliştirilen dereceli elüsyon
programı .................................................................................................... 51 Çizelge 4.6: Mobil fazlar değiştirilerek oluşturulan dereceli elüsyon programı ....... 52
Çizelge 4.7: Süre optimizasyonu için oluşturulan dereceli elüsyon programı .......... 53 Çizelge 4.8: Süre optimizasyonu ve piklerin belirginliğini arttırmak için
oluşturulan dereceli elüsyon programı ...................................................... 54
Çizelge 4.9: Sentetik renklendiricilerin HPLC yöntemi ile elde edilen alıkonma
süreleri, lineer kalibrasyon denklemleri, lineer çalışma aralıkları,
gözlenebilme(LOD) ve tayin sınırı (LOQ) değerleri(Akış hızı: 1mL/
dakika, λ = 485 nm, N=5). ........................................................................ 55
Çizelge 4.10: Kuşburnu ve portakal aromalı toz içeceklerin sentetik renklendirici
miktarlarının geliştirien HPLC yöntemiyle analiz sonuçları (N=5). ......... 57
Çizelge 4.11: HPLC-PDA yönteminin geri kazanımı ............................................... 57 Çizelge 4.12: Sentetik renklendiricilere ait hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile
elde edilen alıkonma süreleri, kalibrasyon denklemleri, linner aralık,
regresyon katsayıları, gözlenebilme sınırı (LOD) ve tayin sınırı (LOQ)
değerleri. (Akış hızı: 1mL/ dakika, λ = 450 nm, N=5). ............................ 59 Çizelge 4.13: Kuşburnu ve portakal aromalı toz içeceklerin sentetik renklendirici
miktarlarının geliştirien hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemiyle analiz
sonuçları (N=5). ........................................................................................ 62 Çizelge 4.14: Hat-üstü HPLC-CUPRAC tekrarlanabilirliği ve geri kazanımı .......... 62 Çizelge 4.15: Farklı CERAC reaktifi derişim oranlarında elde edilen Ce(IV)
pikinin sinyal/gürültü oranları. .................................................................. 64 Çizelge 4.16: Sentetik renklendiricilerin CERAC ve CUPRAC yöntemlerine göre
hesaplanan ponsö 4R eşdeğer renklendirici içerikleri (PERİ). ................. 66 Çizelge 4.17: HPLC ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemlerine göre toz içecek
örneklerinin renklendirici içerikleri (N=5) ............................................... 66
xiv
Çizelge 4.18: Spektrofotometrik CERAC, spektrofotometrik CUPRAC, HPLC
(CERAC hesaplamalı), HPLC (CUPRAC hesaplamalı), hat-üstü
HPLC-CUPRAC yöntemlerine göre toz içecek örneklerinin ponsö 4R
eşdeğer toplam renklendirici içerikleri (TRİ). ........................................... 67
Çizelge 5.1: HPLC-PDA ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemleri ile elde edilen
alıkonma süreleri (dakika) ve gözlenebilme sınırları (LOD) .................... 73
xv
ġEKĠL LĠSTESĠ
Sayfa
ġekil 2.1: Sıvı faz post-kolon sistemini gösteren blok şema (A: Mobil faz
rezervuarı, B: HPLC pompa, C: Enjeksiyon valfi, D: Kolon, E:
Karıştırma birimi, F: Reaktör, G: Dedektör, H: Post-kolon pompası, I:
Post kolon reaktif rezervuarı. .................................................................... 22
ġekil 4.1: Sentetik renklendirici çözeltilerinin moleküler absorpsiyon spektrumları
(Ctartrazin: 2,24 × 10-4
M; Cindigo: 5,45 × 10-4
M ; Cponsö 4R: 2,33 × 10-4
M
; Csunsetyellow : 2,85 × 10-4
M;Ceritrosin : 1,70 × 10-4
M). ............................... 37
ġekil 4.2: Ponsö 4R çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (4,00 - 24,00 10-6
M ponsö 4R). ................................................. 38
ġekil 4.3: Tartrazin çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (2,43 - 19,44 10-6
M tartrazin). ................................................... 39
ġekil 4.4: Eritrosin çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,42 - 8,52 10-6
M eritrosin). ..................................................... 39
ġekil 4.5: Sunset yellow çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen
kalibrasyon grafiği (2,43 - 29,16 10-6
M sunset yellow). ....................... 40
ġekil 4.6: Indigo çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (4,68 - 56,2 10-6
M indigo) ......................................................... 40
ġekil 4.7: Portakal aromalı içecek tozu ile tartrazin etkileşimi (♦: 2,0 × 10-4
M
Ce(IV) + tartrazin; ■: 2,0 × 10-4
M Ce(IV)+ tartrazin+ portakal içecek
tozu çözeltisi). ........................................................................................... 42
ġekil 4.8: Kuşburnu aromalı içecek tozu ile ponsö 4R etkileşimi (: 2,0 10-4
M
Ce(IV) + ponsö 4R; : 2,0 10-4
M Ce(IV)+ ponsö 4R + kuşburnu
içecek tozu çözeltisi). ................................................................................ 43
ġekil 4.9: Ponsö 4R çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (4,88 – 39,04 10-6
M ponsö 4R). ................................................ 44
ġekil 4.10: Tartrazin çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (5,80 – 46,4 10-6
M tartrazin). .................................................... 45
ġekil 4.11: Eritrosin çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,00 - 3,81 10-5
M eritrosin). ..................................................... 45
ġekil 4.12: Sunset yellow çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen
kalibrasyon grafiği (5,59 - 47,40 10-6
M sunset yellow). ....................... 46
ġekil 4.13: Indigo çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,11 - 9,10 10-5
M indigo). ........................................................ 46
ġekil 4.14: Portakal aromalı içecek tozu ile tartrazin etkileşimi (:1 mL 10-2
M
CuCl2 + 1 mL 7,5 10-3
M Nc +1 mL 1 M NH4Ac+ tartrazin; : 1 mL
10-2
M CuCl2 + 1 mL 7,5 10-3
M Nc + 1 mL 1M NH4Ac + tartrazin +
portakal içecek tozu çözeltisi). .................................................................. 48
ġekil 4.15: Kuşburnu aromalı içecek tozu ile ponsö 4R etkileşimi (:1mL 10-2
M
CuCl2 + 1mL 7,5 10-3
M Nc +1mL 1 M NH4Ac+ ponsö 4R; : 1mL
10-2
M CuCl2 + 1mL 7,5 10-3
M Nc +1mL 1 M NH4Ac+ ponsö 4R +
kuşburnu içecek tozu çözeltisi). ................................................................ 49
xvi
ġekil 4.16: Minioti ve çalışma arkadaşlarının geliştiridiği dereceli elüsyon
programına göre elde edilen kromatogram ( 1: tartrazin; 2: indigo; 3:
sunset yellow; 4: ponsö 4R; 5: eritrosin) ................................................... 51
ġekil 4.17: Çizelge 4.6‟da verilen dereceli elüsyon programı kullanılarak elde
edilen kromatogram( 1: tartrazin; 2: indigo; 3: sunset yellow; 4: ponsö
4R; 5: eritrosin). ........................................................................................ 52
ġekil 4.18: Çizelge 4.7‟de verilen dereceli elüsyon programı kullanılarak elde
edilen kromatogram( 1: tartrazin; 2: indigo; 3: sunset yellow; 4: ponsö
4R; 5: eritrosin). ........................................................................................ 53
ġekil 4.19: Çeşitli sentetik renklendirici standartlarını içeren sentetik karışıma ait
kromatogram. (1: tartrazin, 2: indigo, 3: sunset yellow, 4: ponsö 4R, 5:
eritrosin). ................................................................................................... 54
ġekil 4.20: Kuşburnu içecek tozuna ait gözlemlenen kromatogram (1: sunset
yelow, 2: ponsö 4R; λ = 485 nm) .............................................................. 56
ġekil 4.21: Portakal içecek tozuna ait gözlemlenen kromatogram. (1: tartrazin, 2:
ponsö 4R; λ = 485 nm) .............................................................................. 56
ġekil 4.22: Hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile analiz edilen sentetik
renklendirici karışımına ait 485 nm ve 450 nm de elde edilen
kromatogram (1: tartrazin, 2: indigo, 3: sunset yellow, 4: ponsö 4R, 5:
eritrosin). ................................................................................................... 60
ġekil 4.23: Kuşburnu içecek tozu örneğine ait 485 nm ve 450 nmde gözlemlenen
kromatogram (1: sunset yellow, 2: Ponsö 4R). ......................................... 61
ġekil 4.24: Portakal içecek tozu örneğine ait 485 nm ve 450 nmde gözlemlenen
kromatogram (1: tartrazin, 2: Ponsö 4R). .................................................. 61
ġekil 4.25: Farklı akış hızlarında CERAC reaktifine karşı Ponsö 4R çözeltisinin
sinyal/gürültü (S/N) oranları. .................................................................... 63
ġekil 4.26: Hat-üstü HPLC-CERAC yöntemi ile elde edilen ponsö 4R standart
çözeltisine ait kromatogram ...................................................................... 64
ġekil 5.1: Sentetik renklendiriciler için hesaplanan molar absorpsiyon katsayıları
kullanılarak çizilen, CERAC ve CUPRAC yöntemleri arasındaki
korelasyonu gösteren şekil (r= 0,9557) ..................................................... 71
xvii
GIDA RENKLENDĠRĠCĠLERĠNĠN TAYĠNĠ ĠÇĠN YENĠ YÖNTEMLER
GELĠġTĠRĠLMESĠ
ÖZET
Yüzyıllardır gıdalar birçok farklı amaçlarla renklendirilmektedir. Milattan önceki
yıllarda, şarabın renklendirilmesiyle başlayan bu süreç 1800‟lü yıllarda sentetik
renklendiricilerin kullanılmasıyla devam eder. Günümüzde ise renklendiricilerin
kullanılması sonucu ortaya çıkan sağlık problemleri ve gelişen teknoloji
doğrultusunda doğal renklendiricilerin kullanımı tercih edilmektedir.
Gıda pazarlamasında rengin ürüne kattığı cazibe nedeniyle gıdaların
renklendirilmesine ihtiyaç duyulmuştur. Renklendiriciler sentetik ve doğal kaynaklı
olmak üzere iki temel grupta toplanır. Bazı sentetik renklendiricilerin toksik ve
karsinojenik etkilerinden dolayı kullanımları gıda mevzuatları tarafından
sınırlandırılmıştır. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı tarafından yürütülen ve Avrupa
Birliği uyum çerçevesinde hazırlanan “Gıdalarda kullanılan renklendiriciler”
tebliğinde 2002/55 Ek 1 olarak verilen tabloda bulunan renklendiriciler gıda
maddelerine katkı olarak eklenebilirler. Son 25 yıldır tüketiciler sağlık endişeleri
nedeniyle gıdalarda doğal katkı maddelerinin kullanımını tercih etmektedirler. Gıda
renklendiricileri tebliğinde kullanımına izin verilen renklendiricilerden bazıları
karoten, klorofil ve antosiyanin gruplardır. Bu pigmentler gıdalara renklendirme
özelliğinin yanısıra antiokisdan özellikler de kazandırırlar. Epidemolojik çalışmalar,
antioksidanların kanser ve kardiyovasküler hastalıkları önlediğini göstermektedir.
Antioksidanlar, insan vücudunda bulunan serbest radikalleri temizleyerek hücre
hasarının önüne geçerler. Serbest radikaller, aerobik solunum sonucu süperoksit,
hidroksil, hidroperoksil, peroksil ve alkoksil gibi radikallere dönüşürler. Doğal
antioksidan enzimler bu serbest radikalleri uzaklaştırdığından oksidatif stresi
azaltmak için antioksidan açısından zengin gıdalar tüketmek faydalıdır. Bu bağlamda
gıdaların antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi zorunludur.
Gıda pazarlama endüstrisinde oldukça önemli yere sahip olan doğal veya sentetik
renklendiriciler için tayin ve ayırma yöntemlerinin geliştirilmesi oldukça önemlidir.
Sentetik renklendiriciler gıda proseslerinde kararlı yapıları ve ucuz maliyetleri
nedeniyle tercih edilseler de hatalı kullanımları sonucu insan sağlılğını bozucu
etkilere neden olabilirler. Bunun yanında, gıdalarda kullanılan renklendiricilerin
seçimi tebliğ rehberliğinde olmalıdır. Doğal renklendiriciler ise gıdalara renk
yanında antioksidan özellik katmalarından dolayı anioksidan kapasitelerinin
belirlenmesi ve tüketicinin bilinçlendirilmesi sağlanmalıdır.
Bu çalışmanın kapsamında gıdaların renklendirilmesinde kullanılan sentetik
renklendiricilerin hızlı, kolay ve uygulanabilir tayin yöntemleri ile analiz edilmeleri
hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda, literatürde antioksidan tayin yöntemleri
olarak kullanılan CERAC (Seryum(IV) indirgeyici antioksidan kapasite) ve
CUPRAC (Bakır (II) indirgeyici antioksidan kapasite) yöntemleri sentetik
renklendiricilere uygulanmış, toz içecek örneklerinin toplam sentetik renklendirici
içeriği bulunmuştur.
xviii
Renklendirici tayininde oldukça tercih edilen kromatografik yöntemde ise 5 farklı
sentetik renklendirici standartının ayırımı için dereceli elüsyon programı geliştirilmiş
ve literatürde çok kullanılan asetonitrilin bu teknikte kullanılmamasıyla çözücü
maliyetinin düşürülmesi sağlanmıştır.
Çalışmanın üçüncü bölümünde in-vitro antioksidan kapasite tayin yöntemleri ile
HPLC tekniği birleştirilerek hat-üstü HPLC sistemi oluşturulmuştur. Hat-üstü HPLC
yöntemi sayesinde, karmaşık matriks yapısında olan örneklerin parmak izi yapısı
oluşturulmuştur. Tez kapsamında hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ilk defa sentetik
renklendirici standartlarına uygulanmıştır. Hat-üstü HPLC-CERAC yöntemi ise tez
çalışması kapsamında geliştirilmiştir. Akış hızı ve hat-üstü CERAC reaktif derişimi
optimize edilmiştir.
Sonuç olarak sentetik renklendiricilerin tayini için yeni yöntemler geliştirmek
amacıyla yapılan tez çalışmasında, literatürde in-vitro antioksidan kapasite tayin
yöntemleri doğrudan sentetik renklendiricilere uygulanabilir olduğu saptanmıştır.
Ayrıca kullanılan iki yöntem arasındaki sonuçların birbiriyle uyumlu olduğu
gözlemlenmiştir. Bunun yanında beş farklı sentetik renklendiricinin HPLC yöntemi
ile ayırımı için dereceli elüsyon programı oluşturulmuştur. Bu ayırım programından
faydalınılarak, hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminin uygulanabilirliği
gözlemlenmiştir. Hat-üstü HPLC-CERAC yönteminin ise optimizasyonu
sağlanmıştır.
xix
DEVELOPMENT OF NOVEL METHODS FOR THE DETERMINATION OF
FOOD COLORANTS
SUMMARY
Color has been added to our foods for centuries. Coloring food was first started as
coloring wine before Christ and continued by the usage of synthetic colorants in
1800s. Today, the health concerns about the food colorants lead the food industry to
focus on natural colorants. The appetitive and attractive appearance of colored food
affecting the choice of the consumers direct the food marketing. Colorants are
basically divided into two main groups as synthetic and natural food colorants. As a
result of the toxic and carcinogenic effects of some synthetic food colorants, their
utilisation is limited by the regulations defined by the governments. The food
colorants allowed for usage are found in appendix 1 2002/55 given by regulations
carried out by the Ministry of Agriculture, may be used as food additives. Synthetic
colorants are preferred for their stability and low-cost in food processes. But their
misusage may cause damage in human health. When choosing the right colorant, the
regulations should guide.
For the last 25 years, the consumers prefer the usage of natural colorants as a
consequence of health concerns. Colorants belonging to carotenoid, chorophyll or
anthocyanin groups are found in the regulations as the allowed natural colorants.
These pigments contribute antioxidant properties to the food beside the color
benefits. The recent epidermological studies prove that antioxidants prevent cancer
and cardiovasciular diseases. Antioxidants scaverging free radicals inhibit the cell
damages. The free radicals found in human body are transformed into superoxides,
hydroxyles, hydroperoxyles, peroxyles and alcoxyles as a result of aerobic
respiration. Foods with rich antioxidant content should be consumed due to their
benefit over removing free radicals and decreasing oxidative stress. Therefore, the
determination and identification of these substances reveal a great importance. Apart
from this, the antioxidant capacities of natural colorants must be evaluated for their
antioxidant affects as well as their color properties. In this way, the consumers are
informed about the subject.
The aim of this study is to determine the synthetic colorants used as the food
additives by a fast, accurate and appliable methods by developing and investigating
novel methods for the determination of synthetic food colorants, analyzing synthetic
colorant content of food products, providing food control by informing consumers
about the limitations of these substances. Aiming the issues above, in-vitro
antioxidant assays (CERAC and CUPRAC) were adapted for the determination of
synthetic food colorants, proposed method results were correlated with HPLC
findings and combination of in-vitro antioxidant assays with HPLC technique
(application of online HPLC-CUPRAC technique and development of online HPLC-
CERAC technique) were performed.
xx
CERAC method is ceric reducing antioxidant capacity (CERAC) reagent, successful
in finding the antioxidant capacity of flavanoids, phenolics, vitamins C and E. The
formal potential of the Ce(IV)/(III) redox couple in the presence of dilute sulfuric
acid containing Na2SO4 is decreased from the standard potential of +1.61 V down to
a value less than that of citric acid. Colorants with a redox potential less than this
value can easily react with the CERAC reagent and be determined at the maximum
absorption wavelength of Ce(IV). The CUPRAC method is a simple and versatile
antioxidant capacity assay useful for a wide variety of polyphenols, including
phenolic acids, hydroxycinnamic acids, flavonoids, carotenoids,anthocyanins, as well
as for thiols, synthetic antioxidants, and vitamins C and E. The chromogenic
oxidizing reagent bis(neocuproine)copper(II) cation (Cu(II)-Nc) is used as an outer-
sphere electrontransfer agent and by reduction of this reagent with antioxidants,
bis(neocuproine) copper(I) cation (Cu(I)-Nc) is formed. The main idea of these two
in-vitro antioxidant capacity assays were used for the determination of synthetic food
colorants. The term “Ponceu 4R equivalent colorant content” (PERI) coefficient
which was found by the ratio of the molar absorption coefficient of a given synthetic
food colorant with respect to CERAC and CUPRAC assays was introduced in order
to calculate the total colorant content of yynthetic powder beverages.
Most preferred methods for the determination of synthetic food colorants are still
chromatographic techniques coupled with ultraviolet (UV) or diode array detectors
(Serdar and Knezevic, 2009; Culzoni et al., 2009; Kirschbaum et al., 2006). There
are two main problems with the use of single-wavelength UV detectors; various UV–
visible (UV–Vis) spectra with different maximum absorbance wavelengths and long
seperation time. Also in some cases, possible overlap of colorant peaks or the
presence of other organic compounds such as flavors in the sample may occur. Both
problems can be solved in the case of DADs. All dyes can be detected near to their
maximum wavelength with the aid of multisignal detection capability, and peak
identity can be easily confirmed. In the content of this study, a new gradient elution
program was optimized for the analysis of synthetic food colorants. As an advantage,
solution costs were minimized, not using the conventional solvent acetonitrile.
Post-column derivatization involves the modification of the chromatographic system
to allow the reaction to take place prior to entering the detector by inserting a post
column reactor between the column and the detector. In order to achieve full
resolution of all colorants, a variety of gradient elution programs were tested, using
different mobile phases and changing retention times. But in all optimization
experiments, the flow rate and injection volume were kept constant as 1 ml min−1
and
20 μL, respectively. The post-column reactor is required to fulfill the following functions:
1)Provide a source of reagent and a means of mixing it efficiently with the column
eluent.
2)Ensure the reaction is complete before the derivatized product enters the detector.
3)Minimize the dispersion that takes place in the reactor so that the integrity of the
separation achieved by the column is maintained.
xxi
For post column derivitization technique, in-vitro antioxidant capacity assays
(CUPRAC and CERAC) were combined with HPLC-PDA technique. The elution
program used for the seperation of five synthetic colorants were employed. On-line
HPLC-CUPRAC method assayed by Celik et. al. (2010) was applied directly to
synthetic food colorants separating with the related gradient elution program (Celik
et. al., 2010). Colorants were let to react with CUPRAC reagent in a time period of 1
minute. On-line HPLC-CERAC technique was used for the first time for the
determination of synthetic food colorants. Therefore optimization experiments were
required. For the flow rate optimization of derivatization (CERAC) reagent a fixed
concentration of Ponceau 4R solution was used for the flow rate optimization
experiments. CERAC reagent (kept in a flask away from air and light) was pumped
with increasing flow rates between 0.8-0.2 mL/ min. Chromatograms were displayed
for every flow rate and S/N ratios were calculated. Optimization of derivatization
(CERAC) reagent concentration was performed wit a fixed concentration of Ponceau
4R used for the flow rate optimization experiments. CERAC reagent was pumped to
the reaction coil with a flow rate of 0.5 mL/ min. S/N ratios of Ce(III) peak was
detected at 320 nm.
In this study, determination of five synthetic food colorants was investigated using
spectrophotometric and chromatographic methods. By adapting the novel
spectrophotometric CERAC and CUPRAC assays of total antioxidant capacity to the
determination of total food colorant content, certain beverage samples were easily
and accurately analyzed. The total colorant content was found at low reagent and
instrumentation costs with the use of a UV–vis spectrophotometer easily found in a
conventional laboratory equipped with simple instruments. Moreover, simple sugars
and citric acid, which are not colorants, are not oxidized in the CERAC method and
therefore do not yield errors in colorant content calculations. Among CERAC and
CUPRAC assays, experimental results showed that molar absorption coefficients of
synthetic food colorants with respect to CERAC assay are similar with those of
CUPRAC assay.
HPLC analysis of colorants was performed with two different techniques. In
conventional HPLC method, PDA detector system was used to monitor each colorant
at its maximum absorbance wavelength. The selected mobile phase for the gradient
elution program enabled the shortening of total analysis time when compared to
other chromatographic methods. Furthermore, since acetonitrile as the conventional
solvent was not used in the eluent, solution costs were minimized.
On-line HPLC-CUPRAC method was adapted for the determination of synthetic
food colorants. Optimized gradient elution program was used for the separation of
colorants. Retention time periods were increased due to additional installation for
derivatization coil. However, LOD values were decreased with on-line HPlC-
CUPRAC method.
Optimization experiments of on-line HPLC-CERAC method were performed.
Considering the results, the method was found to be applicable for the determination
of synthetic food colorants. Further experiments will be carried out for the method
development.
xxii
1
1. GĠRĠġ
Gıdalarda dikkatimizi çeken ve gıdaların tadı ya da kalitesi ile ilgili bir fikre sahip
olmamızı sağlayan özelliklerin başında “renk” gelir. Gıda kalitesi ilk olarak rengi ile
eleştirilir; rengi solmuş sebzelerden, ezilmiş meyvelerden, çürümüş et ve fazla pişmiş
yiyeceklerden bu nedenle kaçınılır. Çeşitli testler gıdaya olan ilgimizde rengin
önemini gösterir. Örneğin, limonun sarı rengi ile misket limonun yeşil rengi gibi,
renk ve tad uyuşmazsa gıda renklendirilmesinde başarısız olunmuştur (Du Bose ve
diğ, 1980).
Günümüzde işlenmiş gıdalar görsel olarak cazip olmalıdır. Çekiciliği sağlayan
faktörlerden biri olan gıda rengi, birçok farklı şekilde oluşturulabilir. Ham besin
maddelerinin; sebze, meyve, et ve yumurtanın kendine özgü rengi vardır, ancak
proses uygulamaları ile de renkler oluşturulabilir. Bazı gıda ürünleri ise doğal olarak
renksiz bulunurlar.
Gıdaların renklendirilme nedenleri aşağıdaki gibi özetlenebilir;
Gıdada mevcut olan fakat rengi tüketicinin beklediği kadar yoğun olmayan
rengin güçlendirilmesi için,
Toplu üretimde, üretim serilerinin renk istikrarını sağlamak için,
Herhangi bir gıda prosesine tabi tutulmuş gıdaların kaybolan rengini geri
kazanmak için,
Şekerleme, içecek gibi normalde renksiz olabilecek gıdalara renk sağlamak
için (Food Advisory Comitee, 1987).
1856 yılında Sir William Perkin‟in ilk sentetik boyayı keşfetmesi ile boya endüstrisi
gelişmeye başlamış ve gıdalara sentetik renklendiriciler katılmıştır. Bundan yüzyıllar
önce baharat gibi doğal ürünler gıdaların renk ve tad özelliklerinin geliştirilmesinde
kullanılmıştır. Günümüzde, maliyetin düşük olması, kullanım kolaylığı ve kararlılık
gibi nedenlerle sentetik renklendiriciler daha çok tercih edilmektedir. Literatürde
2
bulunan organik yapıda gıda renklendiricileri; sentetik renklendiriciler, doğala özdeş
renklendiriciler ve doğal renklendiriciler olmak üzere üçe ayrılır.
Sentetik renklendiriciler, doğada bulunmaz ve kimyasal sentez sonucu üretilirler.
(Sunset yellow, tartrazin, eritrosin vb.)
Doğala özdeş renklendiriciler, kimyasal sentez sonucu doğada bulunan
renklendiricilere kimyasal olarak özdeş şekilde üretilirler (Beta karoten, riboflavin,
vb.). Doğal renklendiriciler, yenebilen doğal kaynaklardan gıda hazırlama
yöntemiyle elde edilen organik renklendiricilerdir. Örneğin, zerdeçeldan kurkumin,
annato bitkisi çekirdeğinden biksin, kırmızı meyvelerden antosiyanin elde edilebilir.
Doğal renklendiricilerin bu tanımı amonyak ve tuzları kullanılarak üretilen karameli,
bakır klorofilinleri dışarıda bırakır. Bunlar prosesleme esnasında kimyasal
modifikasyona uğrayarak hazırlanırlar.
Doğal renkelendiricilerin tüm dünya tarafından kullanımına izin vardır. Ancak doğal
renklendiricilerin uluslararası belirlenmiş bir tanımı olmadığı için bazı ülkeler hem
renk hem tad veren maddeleri listeden çıkarmışlardır. Örneğin, zerdeçal, paprika
safran gibi baharatlar İsveç tarafından listeden çıkarılmışlardır. Çünkü bunların tad
özelliklerini veren bileşikler uzaklaştırılmadan renklendirici olarak kullanılmışlardır
(Swedish Food Regulations, 1985). İtalyan gıda yönetmeliğine göre ise renklendirme
etkisi olan doğal maddeler; paprika, zerdeçal, safran, renklendirici olarak değil katkı
maddesi olarak kabul edilirler (Italian Official Gazette, 1968).
Avrupa Birliği, E numaralarıyla belirtilen çoğu doğal renklendiriciden oluşmuş
renklendiricilerin kullanımına izin vermektedir. 94/36/EC yönetmeliği izin verilen
renklendirici kullanımını açıklar ve 20 Haziran 1996 tarihinden itibaren
kullanılmaktadır (Official Journal of The Comission of The European Communities,
1994). Yönetmelik her renklendiricinin kullanım amacını ve hangi oranda
kullanılacağını ayrı ayrı belirtir.
Amerika Birleşik Devletlerinde farklı bir doğal renklendirici değerlendirmesi vardır
ve bu yönetmelik FDA (Food and Drug Administration) tarafından yürütülür.
Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği‟nde yer alan gıda katkı maddesi tanımı şöyledir;
normal koşullarda tek başına tüketilmeyen veya gıda hammaddesi olarak
kullanılmayan, tek başına besleyici değeri olan veya olmayan; seçilen teknoloji
gereği kullanılan işlem veya imalat sırasında kalıntı veya türevleri mamul maddede
3
bulunabilen, gıdanın üretilmesi, tasnifi, işlenmesi, hazırlanması, ambalajlanması,
taşınması, depolanması sırasında; gıda maddesinin tat, koku, görünüş, yapı ve diğer
niteliklerini korumak, düzeltmek amacıyla kullanılmasına izin verilen maddelerdir.
1.1 Tezin Amacı
Günümüzde, gıda endüstrisinde uygun renklendirici seçimi ürünün kabullenilmesi
açısından önemli bir faktördür. Bu nedenle renklendiricinin taşıdığı doğal ve sentetik
sıfatları etiketleme ve pazarlamada oldukça önemlidir. 1800‟lü yıllardan beri
kullanılan sentetik renklendiriciler yerini son zamanlarda doğal renklendiricilere
bırakmıştır. Doğal gıda renklendiricileri bitki, hayvan ve çeşitli
mikroorganizmalardan ekstrakte edilebilir ve yapılarına göre sınıflandırılabilirler.
Bu çalışmanın amacı gıdalarda renklendirme amacıyla kullanılan sentetik
renklendiricilerin tayini için yeni yöntemler geliştirmektir. Bu amaç doğrultusunda
hedeflenen, gıdalarda kullanılan renklendiriciler hakkında bilgilendirmek ve
yönetmelik tarafından izin verilmeyen ya da sınırlandırılan renklendiricilerin
gıdalarda varolup olmadığını araştırararak gıda kontrolünü sağlamaktır.
Çalışmanın ilk bölümünde, in-vitro toplam antioksidan tayin yöntemleri olan
CERAC [Seryum (IV) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite] ve CUPRAC [Bakır
(II) indirgeyici antioksidan kapasite] yöntemlerinin renklendirici tayini için
uygulanabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Literatür araştırmasında doğal
renklendiricilerin antioksidan özelliklerinin araştırıldığı ve toplam antioksidan
kapasite tayin yöntemlerinin uygulandığı çalışmalara rastlanmıştır. Sentetik
renklendiricilerin de toplam antioksidan kapasiteye katkılarının olup olmadığının
araştırılması için seçilen 5 farklı sentetik renklendiriciye tek tek CERAC ve
CUPRAC yöntemleri uygulanmış, herbiri için molar absorplama katsayısı
hesaplanmıştır. Sentetik renklendiriciler ile katkılanmış gerçek örnekler bu
yöntemlerle analiz edilmiştir.
İkinci adım olarak, HPLC tekniği kullanılarak sentetik renklendirici karışımlarının
kromatografik olarak ayrılması hedeflenmiştir. Uygun kromatografik koşulların
belirlenmesi ve etkin ayırımın sağlanması için yapılan denemeler sonucu, bu tez
kapsamında literatüre kazandırılan hızlı, etkin, düşük maliyetli ve çevre dostu yeni
bir yöntem geliştirilmiştir. PDA dedektör kullanarak geliştirdiğimiz bu yöntem, pik
4
teşhislerinin daha sağlıklı yapılabilmesini sağlamıştır. Aynı zamanda, HPLC-PDA
tekniği, hem bir sonraki adım olan kolon sonrası türevlendirmede kullanılacak olan
elüsyon programını oluşturmak, hem de elde edilen deneysel bulguların
korelasyonunu sağlamak amacıyla kullanılmıştır.
Üçüncü analiz metodu olarak karmaşık örnek matrikslerinde kullanılmak üzere hat-
üstü (post kolon) HPLC-CERAC yöntemi ilk defa bu tez kapsamında geliştirilmiş ve
sentetik renklendiricilere uygulanmıştır. Ayrıca, antioksidan bileşiklerin tayini için
geliştirilen hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi bu tez kapsamında sentetik
renklendiricilere uygulanmıştır. Bu yöntemlerle, geleneksel olarak kullanılan HPLC
sistemine reaksiyon sarmalı eklenerek, kolon sonrası türevlendirme reaksiyonun bu
sarmal içinde gerçekleşmesi sağlanmıştır.
5
2. GENEL BĠLGĠ
2.1 Gıda Renklendiricileri Hakkında Genel Bilgi
Gıdalarda renklendirici kullanımı, ilk olarak milattan once 1500‟lü yıllarda Mısır‟da
üretilen şekerlere doğal pigment ekstraktlarının eklenmesiyle başlamıştır. Sanayi
devrimini takiben, gıda endüstrisi “işlenmiş gıda” terimi ile tanıştı. Bu yıllarda
gıdalara Pb3O4 (kırmızı kurşun) ve HgS (vermilyon) gibi mineral metal temelli
bileşikler eklendi. Bilinçsizce kullanılan zehirli kimyasallar ciddi hastalıklara hatta
ölümlere yol açtı.
Gıda renklendiricileri günümüzde genel olarak doğal renklendiriciler ve sentetik
renklendiriciler olmak üzere iki grupta incelenir.
Sentetik renklendiriciler gıda katkı maddelerinin önemli bir sınıfını oluştururlar.
Boyaların gıda katkı maddesi olarak kullanılmasının gıda maddelerini estetik ve
psikolojik olarak daha çekici yaptığı bilinmektedir. Ayrıca boyalar, üretim ve
depolama sırasında doğal rengini kaybeden gıda maddelerinde arzu edilen rengin
sağlanmasında da yaygın olarak kullanılmaktadır. Sentetik gıda boyaları sarı, mavi,
siyah, turuncu, kırmızı, kahverengi, yeşil renkler olmak üzere gruplandırılır.
Sarı boyalar: Tartrazin, Quiniline sarısı, Hızlı sarı, Chrysoine
Turuncu boyalar: Turuncu GGN, Sunset yellow
Kırmızı boyalar: Ponceau 4R, Scarlet GN, Karmisin, Amarant, Eritrosin,
Ponsö SX, Rhodomine B, hızlı kırmızı E, Kırmızı 26, Ponsö 4R
Mavi boyalar: Patent mavi V, Indigo, Parlak mavi FCF
Siyah boya: Parlak siyah
Kahverengi boya: Kahverengi FK
Yeşil boya: Yeşil S
Beyaz boya: Titanyumdioksit
Doğal Renklendiricilerin gıda endüstrisinde kullanımı son 25 yılda gelişen bir
süreçtir. Tüketicinin bilinçlenmesi ve gıda endüstrisine olan güveninin azalması
6
sonucu yaptığı baskı, doğal renklendiricilerin önemini arttırmıştır. Renk doğada
bitkilerin meyve, kök, tohumlarından, böceklerden ve diğer biyolojik türlerden elde
edilebilir. Doğada elde edilen pigmentlerin fiziksel ve kimyasal özellikleri değişim
gösterir. Bu pigmentlerin çoğu oksidasyona, pH değişimine ve ışığa karşı hassastır.
Avrupa Birliği tarafından gıdalarda kullanımına izin verilen doğadan türetilmiş 13
pigment bulunur. Doğal renklendiriciler sentetik renklendiricilere gore daha az
kararlı ve kullanımları zor olmasına rağmen maliyetleri yüksektir.
Doğal renklendiricilerin kendi aralarında sınıflandırılması için iki sistemden
faydalınılır. Bu sistemlerden biri pigmentlerin yapısal afiniteleri temeline
dayanırken, diğeri biyolojide bulundukları doğal halleri ile ilgilenir. Teorik olarak,
biyolojik pigmentlerin neredeyse tümü gelecekte biyoteknolojik üretim için
kullanılma ya da gıda endüstrisinde renklendirici olarak kullanılma potansiyeline
sahiptir.
Tanım olarak doğal pigmentler, yaşayan organizmalardan veya hücrelerden elde
edilen pigmentlerdir. Bunun yanında, bazı doğal pigmentler ise anti-koagulant
kumarinlerin fenolik türevleridir. Doğal olmayan pigmentleri tanımlamak ise doğal
pigmentleri tanımlamaktan daha zordur. Örneğin bitkiden elde edilen indigo, bitkide
bulunduğu haliyle renksiz bir glikoziddir. Ancak ekstraksiyon, oksidasyon ve
hidroliz sonrasında bu madde mavi rengini alır. Bu nedenle doğal renklendiriciler
için genişletilmiş bir tanım kullanılır. Yaşayan ya da ölü bitki hücrelerinden,
hayvanlardan, mantar ya da mikroorganizmalardan elde edilen pigmentler modifiye
edilerek kararlılığı, çözünürlüğü ya da renk şiddeti arttırılarak kullanılır.
Pigmentlerin Elektronik Yapısı: Bir biyolojik molekülün renkli olup olmadığı
elektronik yapısından, molekül büyüklüğünden, çözünürlüğünden ve element
bileşiminden anlaşılır. Doğal pigmentlerin renksiz biyolojik bileşiklerden ayrılmasını
sağlayan birçok ortak özellikleri vardır. Tüm biyolojik moleküller, periyodik tabloda
yeralan sınırlı sayıda elementten oluşur. Bu kısıtlamalara gore renkli bileşikler 3
temel özelliğe sahiptir;
Neredeyse tüm biyolojik moleküller en fazla 17 elementten oluşur. Bu
elementler içinde en baskın olanlar H, C, O ve N „dur.
Genelde tüm renklendirici bileşikler (açık sarı dışında) N, O veya her
ikisini de ihtiva eder.
7
Çoğu biyolojik moleküllerdir. Molekül ağılıkları 200-800 arası değişir.
Pigment polimerlerin molekül ağırlıkları daha fazla olabilir.
Tüm bu sınırlamalarla biyolojik pigmentlerin elektronik yapıları hakkında fikir
yürütülebilir. Renkli olsun veya olmasın, biyolojik moleküllerin üst kabuklarında
belirgin orbitler daha yoğun olarak bulunur. Her kabuki minimum enerji gerektiren
orbitalleri sağlayacak şekilde sınırlı sayıda electron tutar. Bu hal kararlı haldir.
Yeterli enerjiye sahip ışık ile ile uyarılan dış kabuki orbitallerindeki elektronlar, ışık
ile osilasyona uğrayarak kararlı halden uyarılmış hale geçerler. Uyarılmadan sonra,
elektronlar kararlı hale geri dönerek çoğunlukla ısı enerjisi şeklinde enerji yayarlar.
Dört elementten fazla element içermeyen biyolojik moleküller renkli oldukları için d,
p ve n orbitallerine sahiptir. Uyarılma sonrası ise bu orbitallerden d ve p
orbitallerine geçiş olur. En az enerji gerektiren geçiş n p geçişleridir. Bu geçişler N
ve O sübstitüsyonlarına sahip doymamış hidrokarbonlarda görülür. Bu grup genelde
doğal pigmentlerin çoğunu oluşturur.
Bazı biyolojik moleküller renkli olarak bulunurken, çoğu biyolojik molekül
renksizdir. Modifiye olmuş moleküllerde, yapısal olarak gerçekleşen
modifikasyonlar, molekülün nispeten daha uzun dalgaboylarında (daha az enerjili)
ışığı absorplayıp uyarılmasına neden olur. Daha az enerjili dalgaboylarına kaymaya
“batakromik kayma” denir. Batakromik kaymaya neden olan 6 farklı modifikasyon
aşağıda bulunmaktadır.
Zincir uzunluğunda artış
Karbon zincirinin dallanması
Tekli halka yapısında düzenlenme (zincirlenme)
N ya da O eklenmesi
2 ya da daha fazla halka ile bağ kurma
Bazı geçiş metallerinin yapıya katılması
Biyolojik pigmentler 2 farklı yönteme göre sınıflandırılırlar. Birinci yöntem yapısal
afiniteye göredir. Bu yöntem öz ve kısa olması açısından avantajlı olsa da
biyosentetik kökenleri oldukça farklı olan bileşikleri aynı grupta toplaması açısından
dezavantaja sahiptir. Yapısal afiniteye göre tüm biyolojik pigmentler 6 ana sınıfta
8
toplanabilir; tetrapinoller, tetra-terpenoidler, kinonlar, o-heterosiklikler, N-
heterosiklikler, metalloproteinler.
İkinci yöntem pigmentlerin doğada bulunduğu şekle göre sınıflandırmaktır. Böylece
pigmentlerin hangi türe, aileye ya da tipe ait oldukları belirlenebilmektedir.
Bulundukları organizmaya göre pigmentler; algae (yosunda) bulunan pigmentler,
vertabrates (gelişmiş hayvanlarda) bulunan pigmentler, invertebrates (gelişmemiş
hayvanlarda) bulunan pigmentler, likenlerde bulunan pigmentler, bakterilerde
bulunan pigmentler.
2.2 Literatür AraĢtırması
Tez çalışması kapsamında, konuyla ilgili olan diğer araştırmalar hakkında bilgi
edinmek ve tez çalışmasının hedeflerini, özgünlüğünü, kapsamını genişletmek ve
belirlemek amacıyla gıda renklendiricilerinin analizi hakkında son 10 yıl içinde
literatüre geçmiş çalışmalar incelendi. Bu çalışmalar, kromatografik yöntemler
kullanılarak yapılan analizler, spektrofotometrik yöntemler kullanılarak yapılan
analizler, antioksidan tayin yöntemleri kullanılarak yapılan analizler ve diğer
yöntemlerle yapılan analizler olmak üzere dört başlık halinde toplandı.
2.2.1 Kromatografik yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri
Lin, Hseih, Juin Ko ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptığı çalışmada, olgun Basella
Alba L. meyvesinde bulunan ve meyve kabuğuna kırmızı-mor rengi veren doğal
renklendriciler incelenmiştir. Meyvenin etli bölümü %80 metanaol çözeltisi ekstrakte
edilmiştir ve daha sonra katı faz ekstraksiyou, semipreperatif HPLC izolasyonu,
kütle spektrofotometrik analiz ve yapı aydınlatılması gibi işlemlere tabi tutulmuştur.
Majör olarak bulunan kırmızı pigment “gomfrenin I” olarak tanımlanmıştır.
Gomfrerin I miktarının meyve olgunlaşmasına bağlı olarak arttığı, olgun meyvede
36,1mg/100 g oranında bulunduğu görülmüştür. Gomfrerin I‟e ek olarak betanidin
diheksoz ve izobetanidin-dihekzo tayin edilmiştir. Gomfrerin I‟in antioksidan
aktivitesi TEAC, DPPH, indirgeme kuvveti ve antioksidan kapasite tayin
yöntemleriyle sırasıyla 0,534 M troloks, 0,103 M BHT, 0,129 M askorbik asit, 0,068
M BHT olarak bulunmuştur. Meyvenin iltihap sökücü özelliği murin makrofajlarda
lipopolisakkaritlerle 0,025, 0,050, 0,100 M konsantrasyonları için ölçülmüştür.
Çalışma sonucu elde edilen bulgular, B. Alba meyvesinin zengin betalain içeriğinden
9
dolayı gıda renklendiricisi olarak kullanılma potansiyelinin olduğunu göstermiştir
(Lin ve diğ, 2010).
Serd ve Knezevic‟in yaptığı d,iğer bir çalışmada, PDA dedektörlü sıvı kromatografi
sistemi 8 adet sentetik renklendiricinin (E102, E104, E110, E122, E124, E129, E131,
E133) alkolsüz içeceklerde simultane tayini için kullanılmıştır. Renklendirici
karışımı C18 ters faz kolon kullanılarak 15 dakika içinde ayrılmıştır. Trietilamin
hidrojensülfat, metanol ve ultra saf sudan oluşan kademeli hareketli faz çözeltileri
hazırlanmıştır. Ayırma işleminin analitik özellikleri incelenmiştir. İyi bir lineerlik
(r2=0,9988-0,9999), uygun tayin sınırları ve yüksek geri kazanım (%96,3-98,5) elde
edilmiştir. Yöntem 57 alkolsüz içecek örneğine uygulanmıştır. Deneysel sonuçlar
doğrultusunda içeceklerin 34‟ünde renklendirici madde bulunmuştur. Yöntemin
hassasiyetinin, doğruluğunun sentetik organik boyalarda rutin analiz için
kullanımının yapılabileceğini göstermiştir (Serd ve diğ, 2009) .
Kromatografik yöntemle yapılan diğer bir çalışma alkolsüz içeceklerde 3 farklı
sentetik renklendiricinin (amarant, sunset yellow, tartrazin) tayini için hızlı bir
kromatografik yöntem geliştirilmesi hakkındadır. Bu çalışmada 7 farklı içeceğin
uygun çözücülerle çözeltileri hazırlanmış, süzülmüş ve kromatografik sistemle analiz
edilmiştir. Hızlı bir kromatografik ayırım için diode array dedektör tayini sonrası
ikinci dereceden veriler elde edilmiştir ve ikinci dereceden algoritma için kullanılan
iki farklı sistem karşılaştırılmıştır. Gerçek ve sentetik örneklerin analizinde %99-105
arası değişen geri kazanım değerleri elde edilmiştir. 100 mL metanol ve 3 mL
0,008mol/L amonyumasetatın kullanıldığı durumda bütün bir ayırım sağlansa da
geliştirilen hızlı kromatografik yöntemle 0,46 mL metanol ve 1,54 mL 0,008 mol/L
amonyumasetat yeterli olmuştur. Sonuç olarak analiz süresi, çözelti sarfiyatı ve
zamandan tasarruf edildiği görülmüştür.Bu da çevreye olan zararı ve analiz
maliyetini azaltmıştır (Culzoni ve diğ, 2009).
Minioti ve arkadaşları 2007 yılında yaptıkları çalışmada 13 farklı sentetik gıda
renklendiricisinin (tartrazin, kinolin, sunset yellow, carmoisine, amarant, ponceau
4R, eritrosin, red 2G, allura red, patent blue V, indigo karmin, brillant blue, greenS)
tayini için ters faz HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Sabit faz olarak C18 kolon,
hareketli faz olarak ise (20:80 v/v) asetonitril-metanol karışımı ve pH değeri 7,5 olan
amonyum asetat tampon çözeltisi kullanmışlardır. Başarılı bir ayırım için dereceli
elüsyon ile 29 dakika sürede tüm bileşiklere ait pikler elde edilmiştir. Fotodiyot
10
dedektör tüm renklendiricileri 350-800 nm arasında tayin etmiştir. Tayin sınırları tüm
renklendiriciler için 1,59-22,1 µg/ L arasında değişmiştir. Yöntem suda çözünen
farklı gıda örneklerine (meyve tadında içecekler, reçeller, şekerlemeler) basit ön
işlemler sonrasında (suda çözme ve ekstraksiyon) uygulanmıştır (Minioti ve diğ,
2007).
Antosiyaninler doğal renklendiricilerin en önemli gruplarından biridir ve gittikçe
önem kazanmaktadırlar. Patates gibi bazı bitki türleri de antosiyanin içeriklerinden
dolayı önem kazanırlar. Jansen ve Flamme 2006 yılında yaptıkları çalışmada, 27 tür
patatesi antosiyanin içerikleri nedeniyle analiz etmişlerdir. En fazla antosiyanin
içeriğinin 0,65 g/ kg ile patates kabuğunda olduğunu onu sırasıyla kök (0,31 g/kg) ve
patatesin etli bölümün (0,22 g/ kg) takip ettiğini saptamışlardır (Jansen ve diğ, 2007).
2006 yılında yapılan bir diğer çalışmada, alkolsüz içeceklerde yapay tatlandırıcı,
koruyucu madde ve renklendiricilerin simultane tayini için ters faz HPLC yöntemi
geliştirilmiştir. 10µm boyutunda RP18 kolon, ikili eluent (0,18M fosfat tamponu
(pH=4) ve metanol) kademeli elusyon programı ile kullanılmıştır. 20 dakika analiz
süresinde başarılı ayırımlar gerçekleşmiştir. Spektrofotometrik tayin ile 0,1-3,0 mg/
L aralığında tayin sınırları elde edilmiştir. Yöntem doğrudan enjeksiyon yapılarak,
ön işleme gerek duymadan ticari alkolsüz içecekelere uygulanmıştır (Dossi ve diğ,
2006).
Avrupa Birliği 94/36/EC yönetmeliğine göre gıdalara eklenen sentetik
renklendiricilerin üst sınırları denetlenmektedir. Bu nedenle miktarlarının
belirlenmesi için güvenilir yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. E numaralı bazı
renklendiricilerin havyar renklendirilmesinde kullanımına ihtiyaç vardır. Kirschbaum
ve arkadaşlarının 2006 yılında yapmış olduğu çalışmada, havyarda renklendirici
miktarının tayini için kromatografik bir yöntem geliştirilmiştir. Al2O3, XAD-2
reçine, anyon değiştiricilerin ve poliamid-6‟nın 14 sentetik renklendiriciyi geri
kazanımı incelenmiştir. Bunların arasında en iyi geri kazanım verimini poliamid tozu
vermiştir. En verimli renk ekstraksiyonu için havyardan renklendiriciler pH=2
değerinde poliamid üzerine adsorbe edilmişlerdir. Daha sonra bu renklendiriciler
%25 amonyak ve metanol (1/9 v/v) çözeltileri ile desorbe edilmişlerdir. Ayırımı
sağlanan renklendiriciler ters faz HPLC ile PDA dedektör kullanılarak tayin
edilmişlerdir. Birçok havyar örneğinde Avrupa Birliği standartları üzerinde
11
renklendirici miktarı bulunmuştur. Bazılarında ise etiketlerde görülen değerlere
ulaşılamamıştır (Kirschbaum ve diğ, 2006).
Vidotti ve arkadaşlarının geliştirmiş olduğu yeşil yöntemle gıda örneklerinde
tartrazin, brillant blue, sunset yellow tayini gerçekleştirilmiştir. Yöntem katı faz
olarak %0,25 triton X-100 çözeltisi ile pH 7 değerinde uygulanmış C18 kolon ve
hareketli faz olarak herhangi bir ihtiyaç duyulmaksızın surfaktan çözeltisi
kullanılması temeline dayanmaktadır. Kromatografik kolonda ayırma sonrasında
renklendiricilerin 430 nm, 630 nm ve 480 nm‟de tayini gerçekleştirilmiştir.
Kromatografik yöntem süresi 8 dakikadır, her örnek için sadece 15 mg triton X-100
ve 38,8mg fosfat çözeltisi harcanmıştır. Tayin sınırları sırasıyla tartrazin, brillant
blue ve sunset yellow için, 0,125, 0,080, 0,143 mg/ L olarak bulunmuştur. Yöntem
gıda örneklerine uygulanmıştır. HPLC‟de mobil faz olarak sıklıkla kullanılan organik
çözücüler bu çalışmada kullanılmamıştır (Vidotti ve diğ, 2006).
Antosiyanin açısından zengin ekstraktların renk değerlendirmesi için bazı
sınırlamalar vardır. Farklı renk içeriklerine sahip ya da farklı maksimum absorpsiyon
değerlerine sahip örneklerde objektif olma konusunda bazı eksiklikler vardır.
Prodanov ve arkadaşlarının antosiyanince zengin ekstraktların kantitatif ve kalitatif
değerlendirilmesi ile ilgi yapmış oldukları çalışmada bu sorunun üstesinden gelmek
için bazı düzeltmeler kullanılmıştır. Pigment kalitesi bu çalışmada spektral
kolorimetrik değerlendirme ile belirlenmiştir. Antosiyaninler monomer ve kırmızı-
kahve renkte polimer fraksiyonları halinde kromatografik olarak ayrılmış ve yapı-
kalite ilişkisi açıklanmıştır. Bu çalışmada temel hedef antosiyanince zengin olan
ekstraktlar için bazı kalitatif parametrele sınır koyarak, normalize bir refereans veri
grubu elde etmektir (Prodanov ve diğ, 2006).
2005 yılında Falcon ve Gandora tarafından yapılan çalışmada, alkolsüz içeceklerde
doğal renklendiricilerin yanında bulunan 5 sentetik renklendirici, en kısa ayırma
süresi kullanılarak sıvı kromatografisi ile tayin edilmiştir. Yöntem, kolay, hızlı,
ucuzdur ve alkosüz içeceklere kolaylıkla uygulanmıştır. Sonuçlar, tartrazin, kinolin
sarısı, yellow orange, azorubin ve ponsö 4R „nin düşük konsantrasyonlarda simultane
olarak tayin edilmesini sağlamıştır. Yöntem, kalibrasyon grafikleri, doğruluk, tayin
sınırı için gerekli matematiksel ifadeler kullanılarak değerlendirilmiştir. Homojenize
edilmiş ve gazı giderilmiş olan içecek numunesi ters faz HPLC analizine tabi
tutulmuştur ve görünür bölgede tek bir dalgaboyunda tayin edilmiştir. Sentetik
12
renklendirici tayini ortamda doğal renklendirici, aroma ve katkı maddesi
bulunmasında etkilenmemiştir. Sonuçlar örneklerde sentetik renklendiricilerin
görüntülenmesini kanıtladığı için yöntem kalite kontrol laboratuarlarına ve içecek
üreticilerine önerilmiştir (Falcon ve diğ, 2005).
Kirschbaum‟un yaptığı diğer bir çalışma, Avrupa Birliğinin gıda renklendiricilerinin
sadece kalitatif değil aynı zamanda kantitatif olarak tayin edilmesi gerektiği ile ilgili
olarak verdiği yönetmelik doğrultusunda yapılmıştır. 14 sentetik gıda renklendiricisi
ters faz C18 kolon ve 0,1 M asetat tamponu (pH=7) ve asetonitril mobil faz
kullanılarak tayin edilmiştir. Renklendiricilerin tayini için diode array dedektör
kullanılmıştır. Tayin sınırı E142 için 0,02 ng iken E132 için 2,05 ng olarak tespit
edilmiştir. Sinyal/ gürültü oranı 3 olarak belirlenmiştir (Kirschbaum ve diğ, 2006).
2003 yılında Ionue ve araştırma grubu tarafından yapılan çalışmada, gıdalarda
bulunan yalancı safran sarısı gibi doğal renklendiriciler fotodiode array dedektör ile
sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi kullanılarak tayin edilmiştir. LC/PDA ile
yalancı safranda renk verici özelliğe sahip olan bileşenler safflominA ve safflominB
olarak belirlenmiştir. Elektrospray ve LC/MS‟in kullanıldığı hassas ve seçici bir
yöntem geliştirilmiştir (Ionue ve diğ, 2003).
Sudan boyaları lipofilik azo boyalar sınıfına girer. Genelde bilimsel ve endüstriyel
amaçlarla kullanılırlar ancak kanserojen etkilerinden dolayı gıda renklendiricisi
olarak kullanımları yasaklanmıştır. Fakat daha önce yapılan çalışmalarda, özellikle
acı sos, domates sosu gibi ürünlerde sudan boyalarına rastlanmıştır. Rebane ve
çalışma arkadaşları Sudan I-IV boyaları ile ilgili araştırmaları 2010 yılında yaptıkları
çalışmada toplamışlardır.Bu boyaların analizi için çoğunlukla IC-UV-Görünür bölge
ve IC-MS yöntemleri en çok kullanılmıştır. Bu boyalar gıdalarda mg/kg
mertebelerinde bulunduğu için tayin sınırlarının içinde olmaları için ön
zenginleştirme basamağına ihtiyaç duyulmuştur. Sıvı-katı ekstraksiyon yöntemi
örnek zenginleştirmede en etkin yöntem olarak belirlenmiştir (Rebane ve diğ, 2010).
2.2.2 Spektrofotometrik yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri
Ni, Wang ve Kokot karışım halinde bulunan amarant, ponsö 4R, sunset yellow,
tartrazin ve brillant blue‟nun tayini için basit, hassas bir kinetik spektrometrik
yöntem geliştirmişlerdir. Bu yöntem kemometri ile birlikte kullanılmıştır. Kullanılan
yöntemin temeli iki reaksiyona dayanmaktadır. İlk reaksiyonda Fe(III) analitle
13
sodyum asetat ve HCl ortamında pH 1,71‟de Fe(II)‟e indirgenmiştir. Oluşan Fe(II)
ise hekzasiyanoferrat(II) ile 760 nm‟de absorpsiyon veren prusya mavisi oluşturma
temeline dayandırılmıştır. Spektral bilgiler 2 saniyede bir veri toplanarak toplam 600
saniyede 500-1000nm arası dalgaboyu taraması yapılarak elde edilmiştir. Kinetik
veriler 700nm dalgaboyunda 600 saniye sürede toplanmıştır. Kalibrasyon grafiği her
boya için ayrı ayrı elde edilmiştir ve tayin sınırı aralığı 0,04-0,50 mg/L olarak
belirlenmiştir. Kinetik verilerin işlenmesi için birçok model denemiştir. (En küçük
kareler yöntemi, temel bileşen regresyonu vs.). Beş farklı renklendiricinin simultane
tayini gıda örneklerine uygulanmıştır ve sonuçlar referans HPLC yöntemi ile
karşılaştırılmıştır (Ni ve diğ, 2009).
Lachenmeier ve Kessler 2008 yılında , gıda katkı maddeleri ile yapılan çalışmaları
kompleks bir matriksten hedef bileşenleri ayırma ve kromatografik tekniklerle tayin
etme temeline dayandırmıştır. Özellikle sıvı renklendirici tayininde doğrudan
spektrofotometrik tayinler spesifiklikten uzak bulunmuştu çünkü spektral çakışmalar
oluşuyordu. Multivariate Curve Resolution (MCR) yöntemi ile bu sorunun
üstesinden gelinmiştir. MCR karmaşık bir spektral yapıdan istenen bileşenleri
çekebildiği, önbilgiye sahip olmadan kantitatif tayin yapabildiği görülmüştür. Bu
çalışmada absinthe içeceğinde bulunan sarı ve mavi renklendiriciler tayin edilmiştir.
Kalibrasyon standartlarıyla yapılan çalışmalarda MCR‟nin en küçük kareler
regresyonuna göre daha gelişmiş kimyasal bilgi temin ettiği görülmüştür. MCR
yöntemi daha sonra absinthe örneklerine uygulanmıştır. Refereans maddelerle
yapılan çalışmalar da gıda renklendiricilerinin 0,93 hassasiyet ve 0,85 spesifiklikte
tayin edilebildiğini göstermiştir. Suni renklendiricilerin yanında bazı örneklerde
algoritma sayesinde klorofil temelli doğal renklere de rastlanmıştır (Lachenmeier ve
diğ, 2008).
Sakkaroz ve sitrik asit içeren ticari gıda örneklerinde renklendirici tayini için
spektrofotometrik yöntem uygulanmıştır. Ortam pH‟ı fosfat tamponu ile 7‟de
sabitlenerek 300-700nm arasında çalışılmış ve birinci dereceden türev spektroskopisi
uygulanmıştır. Yöntemle elde edilen sonuçlar ve literatüre geçmiş HPLC ile edilmiş
sonuçlar karşılaştırılmıştır. Sonuçlar arasında görülen farkın istatistiki olarak önem
taşımadığı görülmüştür.Yöntem gıda örneklerinin rutin analizi için uygun
bulunmuştur (Altınöz ve diğ, 2002).
14
Valley, Valencia ve Nicolas ponsö 4R renklendiricisinin sülfolanmamış türevi
yanında tayini için integre katı faz spektrofotometrisi ile flow injection analiz
yöntemini kullanmışlardır. Yöntem ponsö 4R‟nin 508 nm‟de ölçümüne
dayanmaktadır, sonrasında türevi olan N2N, C18 silika jel mini kolonundan
geçirilerek elue edilmiş ve 508 nm‟de ölçülmüştür. Yöntemin uygulandığı
konsantrasyon aralığı 0,30-20,0 mg/L arasında, tayin sınırı 0,0052 mg/L ve bağıl
standart sapması % 1,1 olarak bulunmuştur. N2N için ise bu değerler sırasıyla 0,020-
3,0mg/L; 0,003mg/L ve %1,1‟dir. Yöntem az miktarda ponsö 4R ve N2N içeren gıda
ve kozmetik numunelerine uygulanmıştır. %95-105 arasında geri kazanım verimi
elde edilmiştir (Capitan Vallyey ve diğ, 2002) .
Yapılan başka bir çalışmada, H-point standart ekleme yöntemiyle üstüste çakışan
spektrum veren tartrazin, sunset yellow, ponceau 4R üçlü karışımını ayırmak için
basit UV-spektrofotometrik yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemle bir renklendiricinin
konsantrasyonu, çakışan spektrumda iki dalgaboyundan hesaplanmıştır. Diğer iki
renklendirici ise bu dalgaboyunda interfere edici olarak değerlendirilmiştir.Bu
dalgaboyu çiftlerinin bulunması kolay olmuştur ve analitik sonucu en doğru veren
dalgaboyu seçilmiştir. Yöntem kolaylıkla sunset yellow, tartrazin ve ponsö 4R
sentetik üçlü karışımına uygulanmıştır (Ni ve diğ, 2001).
Inoue ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada, zerdeçal bitkisinde bulunan sarı
toz pigmentler flow injection sistemi ile online olarak çalışan UV ve floresans
tayinine dayanmaktadır. Tayin sınırları UV spektrofotometrisi ile 30ng/mL; floresans
ile 2,0ng/mL olarak belirlenmştir. Kurkumine ait lineer kalibrasyon grafiklerinin
korelasyon katsayıları ise 0,999 olarak bulunmuştur. Bu nedenle önerilen yöntem
kurkumin standardı kullanılarak kurkuminoidlerin tayininde faydalı olmuştur (Inoue
ve diğ, 2001).
Özgür, Bozdoğan ve Erçağ, 2001 yılında içecek tozlarında antosiyanin ve ponsö
4R‟nin simultane tayini için ikinci türev spektrometrisini ve multi değişkenli en
küçük kareler spektrofotometrik kalibrasyon yöntemlerini geliştirmişlerdir.
Prosedürler herhangi bir ayırma basamağı içermemektedir. Kullanılan yöntemler
ticari jöle tozlarına uygulanmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır (Özgür ve diğ, 2001).
15
Bir karışımda bulunan eritrosin (E127) ve sunset yellow (E110) tayini için birinci
dereceden türev spektrometrisi yöntemi geliştirilmiştir. Prosedürde herhangi bir
ayırma basamağı kullanılmamıştır. Yöntem ilaç amaçlı kullanılan bir şurupta iki
renklendiricinin tayini için uygulanmıştır. Elde edilen lineerlik, doğruluk, kesinlik ve
seçicilik değerleri oldukça iyidir. Bu nedenle yöntemin rutin analiz için uygun
olduğu belirtilmiştir (Joseph-Charles ve diğ, 2002).
2.2.3 Antioksidan tayin yöntemleri kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi
analizleri
Mor Çin mısırının koçan ve tohumlarının toplam antioksidan içeriği ve antioksidan
aktivitesi pH farklandırma yöntemi, DPPH, FRAP ve TEAC yöntemleriyle tayin
edilmiştir. Mor mısır tohumlarının toplam antioksidan içeriği koçana göre daha fazla
bulunmuştur. BHT yöntemi ile mor mısır koçanı ve tohumlarının antioksidan
aktivitesi DPPH, FRAP ve TEAC yöntemlerine göre daha yüksek bulunmuştur.
Toplam antioksidan içeriği ve antioksidan aktivitesi arasında korelasyon
görülmüştür. Mor mısır koçanlarında 7 farklı tür antosiyanin bulunmuş ve 6 tanesi
ayrılmıştır. Tüm bu analizler ise HPLC-MS yöntemi ile yapılmıştır. Bu çalışmanın
endüstriye katkısı antosiyaninlerin iltihap sökücü ve gıda renklendiricisi olarak
kullanımlarının arttırılması yönünde olmuştur. Çalışma sonuçları, Güney Amerika ve
Çin‟de yetiştirilen mor mısır türünün mükemmel antioksidan aktivitesi ile gıda
renklendiricisi olarak kullanımını desteklemiştir (Yang ve diğ, 2010). Bener ve
çalışma arkadaşlarının 2010 yılında yaptığı bir diğer çalışmada ise CUPRAC
yöntemi ile doğal renklendiricilerin antioksidan kapasiteleri tayin edilerek bulunan
sonuçlar HPLC bulguları ile karşılaştırılmıştır (Bener ve diğ, 2010).
2.2.4 Diğer yöntemler kullanılarak yapılan gıda renklendiricisi analizleri
Gıda renklendiricisi tayininde kullanılan diğer yöntemler arasında en başlıca olanları
arasında elektrokimyasal yöntemler ve kapiler elektroforezin kullanıldığı yöntemler
gelir.
Silva, Garcia, Lima ve Barrado 2007 yılında modifiye polialilamin ile tubuler camsı
karbon elektrod oluşturmuş ve kare dalga voltametrisi kullanaılarak gıda azo
boyaların (tartrazin, sunset yellow, allura red) elektroredüksiyonunu incelemiştir.
Elektrod modifikasyonu yüzey kirlenmesini önlemiş ve analitik sinyal şiddetini
güçlendirmiştir. Bu yöntemle renklendirici tayininde lineerlik aralığı 2,0 × 10-4
M
konsantrasyonuna kadar devam eder. Tayin sınırları sırasıyla tartrazin için 1,8 × 10-6
16
M, sunset yellow için 3,5 × 10-6
M, allura red için 1,4 × 10-6
M‟dır. Yöntem gıda
numunelerinde renklendirici tayini için uygulanmış ancak karşılaştırma yöntemi
olarak kullanılan HPLC yöntemi ile arasında istatistiki olarak anlam taşıyan bir fark
görülmemiştir (Silva ve diğ, 2007)
2007 yılında, kırmızı gıda renklendiricilerinin ayırımı ve hassas tayini için lazer
indüklenmiş floresans tayini yapan kapiler elektroforez cihazı kullanılmıştır. Oldukça
floresans özellik gösteren eritrosin B (E127) için tayin sınırı 0,4 ng/mL (S/N=3)
olarak bulunmuştur. Diğer çalışılan kırmızı katkı maddelerinin tayin sınırları ise
carmoisine (0,5g/ mL), amarant (0,2g/ mL), ponceau 4R (0,3 g/ mL) ve red2G
(0,3 g/ mL) olarak belirlenmiştir. Kapiler elektroforez ve UV-görünür bölge tayin
yöntemiyle bulunan tayin sınırları kapiler elektroforez (lazer indüklenmiş floresans)
yöntemiyle bulunandan 1mertebe düşük bulunmuştur. Bu yöntem, gıda örneklerinin
analizi için yüksek seçiciliği ve matriks etkisini azaltması nedeniyle oldukça
kullanılır. Bu çalışma ile literatürde ilk defa kırmızı gıda renklendiricisi tayini
yapılmıştır (Ryvolova ve diğ, 2007) .
2.2.5 Tez kapsamında kullanılan yöntemler hakkında genel bilgi
2.2.5.1 Kullanılan antioksidan kapasite tayin yöntemleri
Antioksidanlar vücut hücreleri tarafından üretildikleri gibi, gıdalarla da alınan ve
oksidasyona bağlı olarak oluşan lezzet bozulmasını veya gıdadaki acılaşmayı
geciktirebilecek, önleyebilecek özellikteki bir grup kimyasal maddedir.
Antioksidanlar sadece gıdaların son kullanma tarihlerini uzatmakla kalmaz aynı
zamanda uzun yaşamayı ve sağlıklı kalmamızı da sağlar. Oksidatif stres, kendini
çeşitli kalp damar patolojileri (arterioskleroz ve hipertansiyon), diyabet, hücre
yıpranması ve yaşlanma, kıkırdak iltihabından gelen patoloji, solunum yolu
hastalıkları, Down sendromu ve kanser gibi çeşitli insan hastalıklarında hissettirir
(Floyd ve diğ, 2008). Oksidatif strese karşı gerek hastalıkların, gerekse sağlıklı
insanların diyetlerinin koruyucu ve tedavi edici hekimlik bağlamında doğal ve yapay
antioksidanlarla takviye edilmesini gerekli kılmaktadır.
Serbest radikaller ve reaktif karakterli maddeler ile bu maddeleri üreten tüm faktörler
“oksidan” veya “prooksidan” olarak tanımlanır. Orbitallerinde bir ya da daha fazla
çiftlenmemiş elektron taşıyan halojen atomlar (Cl, Br), hidrojen atomu, Na, K gibi
alkali metal atomları ve oksijen redüksiyon ara ürünleri, süperoksit, hidrojen
17
peroksit, hidroksil gibi bağımsız, kısa ömürlü, reaktif atomlar serbest radikal olarak
tanımlanır (Floyd ve diğ, 2008). Antioksidanlar yükseltgenebilen bileşiklere göre
daha düşük konsantrasyonlarda, bileşiklerin prooksidanlarla başlatılan
oksidasyonunu ciddi ölçüde engelleyen ya da geciktiren maddelerdir. Prooksidanlar
ise lipidler, proteinler ve nükleik asitlere oksidatif hasar oluşturabilen ve bunun
sonucunda patolojik olaylara ve hastalıklara yok açabilen zehirli maddelerdir.
Antioksidanlar, hücrelere zarar vere prooksidanları indirgeyerek toksik olmaya
ürünlere dönüştürürler.
Oksidatif stres (gerginlik), oksidatif lezyonlara, doku hasarına, mutasyonlara, hücre
ölümlerine yol açabilen reaktif oksijen ve reaktif azot türlerinin yani serbest
radikallerin aşırı üretimiyle tetiklenir. Serbest radikaller aynı zamanda hücrelerin
genetik kodunu içinde taşıyan nükleik asitlere (DNA) de etki eder. Hücrelerin
genetik kodu değiştiğinde ölebilirler, çünkü ana hücreden gelen mesajı uzun süreli
olarak okuyamazlar. Aşırı hücre ölümü erken yaşlanmaya ve kanser gibi hastalıkları
destekleyen hücre gruplarının oluşmasına neden olur. Dokulardaki hücre yaşlanması,
serbest radikallerin zararları sonucu dokuların erken yaşlanması ile oluşan hücre
kalıntılarının çoğalmasıdır (Fleming ve diğ, 2008). Serbest radikaller pankreasta
yoğunlaşırsa şeker hastalığına, gözde katarakta, kanda ise kalp ve dolaşım
hastalıklarına sebep olur.
Vücudumuz serbest radikalleri tanıyan ve etkisiz hale getiren bir sisteme sahiptir. Bu
sistem enzimler ile antioksidan olan pek çok vitamin ve minerali içerir. Gıdalarda da
dış tesirler sonucu meydana gelen serbest radikallere karşı koymak üzere
vazifelendirilmiş moleküller de bulunmaktadır. İşte bu savunma moleküllerine
“antioksidan” denir. Antioksidan sistem, serbest radikalleri hücre zarına, nükleik
asitlere ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar. Bu yolla
antioksidan gıdalar, kalp hastalıklarına, kalp krizine, kansere, erken yaşlanmaya karşı
koruyucu, gıdalardaki acılaşmayı önleyici ve raf ömrünü uzatıcı maddeler olarak
görev yaparlar.
Antioksidanlar, yağların oksidasyonunu önlemekte veya yavaşlatmakta vazifeli
moleküller olarak da tanımlanır. Yağa veya yağlı gıdalara ilave edildiklerinde
acılaşma olarak bilinen bozulmayı asgariye indirirler. Ayrıca toksik oksidasyon
ürünlerinin oluşmasını engellemede ve gıdanın besin kalitesini muhafaza
edilmesinde rolleri vardır.
18
CUPRAC Yöntemi: Cuprac yöntemi kromojenik bir oksidasyon aracı olan Cu(II)-
Nc (bakır(II)-neokuprin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) reaktifinin indirgen özellikli
antioksidanlar tarafından indirgenmesi sonucu oluşan Cu(I)-Nc (bakır(I)-neokuproin)
kelatının 450 nm‟de absorbansının ölçülmesi esasına dayanan spektrofotometrik
antioksidan kapasite tayin yöntemidir. CUPRAC yöntemi hem hidrofilik hem de
lipofilik antioksidanların toplam miktar tayinine elverişli bir yöntemdir (Apak ve diğ,
2004)
CERAC Yöntemi: Bu yöntemin temelini Ce(IV) ile antioksidanlar arasındaki
redoks reaksiyonu oluşturmaktadır. Başlangıçtaki Ce(IV)‟ün maksimum absorpsiyon
dalgaboyundaki (320nm) absorbans değeri, Ce(IV)‟ün antioksidanlar ile reaksiyonu
sonucu azalmaktadır. Ce(IV)‟ün absorpsiyonundaki bu azalmadan yararlanarak
toplam antioksidan miktarı hesaplanmıştır. CERAC yöntemi ile glikoz bağlı
antioksidanların aktivitesi diğer yöntemlere oranla daha yüksek bulunmuştur. Bu
durum çalışılan ortamda glikoz yapıdaki antioksidanların hidroliz olduğunu
göstermektedir (Ozyurt ve diğ, 2007).
2.2.5.2 Kromatografi
Kromatografi, çeşitli maddelerin, hareketli bir faz yardımıyla sabit bir faz üzerinde,
değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır. Böylece, başka
yöntemlerle birbirlerinden ayrılmaları çok zor olan maddeleri saf olarak ayırmak
mümkündür. Kromatografik yöntemler cam veya metal borular içine ince ya da
gözenekli katı doldurulmasıyla gerçekleştirilirler. Bu dolguya sabit faz ya da kolon
denir. Sistem bu haliyle kullanılabildiği gibi, katıya sıvı emdirilerek bu sıvının sabit
faz olarak kullanılması da görülür. Bu fazların içinden hareketli bir faz geçirilerek
veya yürütülerek maddeler ayrılır. Başlıca kromatografi çeşitleri; adsorpsiyon,
dağılma, kağıt, ince tabaka, iyon değiştirme, gaz olarak sıralanır. Ancak kromatografi
olayında başlıca adsopsiyon ve dağılma olayları etkilidir. (Turgut Gündüz,1999)
Klasik sıvı kromatografisinde, alumina ya da silika gibi bir adsorban kolona
doldurularak uygun bir sıvı ile elue edilir. Kolonun başından verilen ve ayrılması
istenen karışım, kolondan elue edicci bir sıvı ile yıkanır. Ayrılması istenen karışımı
adsorbe olduğu yüzeyden ayırmak için kendinden daha kuvvetli adsorbe edici bir
çözücü kullanılır. Adsorpsiyon kuvveti arasındaki farklılıklar sayesinde çözücülerin
ayrılması mümkündür. Bu yönteme adsorpsiyon ya da sıvı-katı kromatografisi denir.
Kullandığımız sabit fazın sıvı ya da katı olması türlerin ayrılmasını sağlayan
19
sorpsiyon mekanizmasını etkiler. Sıvı-sıvı kromatografisinde sabit inert katı madde
sabit sıvı faz ile doyurulmuştur. Burada ayırım, sabit sıvı faz ve hareketli sıvı faz
arasındaki dağılım katsayılarının farklılığına bağlı olarak gerçekleşir. Normal faz sıvı
kromatografisinde, sabit faz kısmen polar, hareketli faz apolar iken; ters faz sıvı
kromatografisinde sabit faz kısmen apolar,hareketli faz polardır.
Gaz kromatografisi teorisinden bilindiği üzere, sabit faz olarak kullanılan
malzemenin parçacık boyutu azaldıkça etkinlik artmaktadır. Bu mantıkla hareketle
1960‟ların sonunda HPLC tekniği doğmuştur ve malzeme ile cihaz donanımı gitgide
gelişmiştir. Günümüzde sabit faz olarak kullanılan kolonlar, 10,5 – 3,0 m arasında
değişen çaplara sahip gözenekli silika parçacıklarla doldurulmuş mikroparçacık
kolonlardır. Silika parçacıkların yüzeyine kaplanan farklı kimyasal gruplar ile farklı
ayırma mekanizmaları sağlanabilir. Günümüzde, HPLC çalışmalarının %75‟i c-18
alkil gruplarıyla kaplı silika parçacıklarla yürütülür. Kolona sıkıştırılan bu küçük
parçacıkların sıvı akışını sağlamak ancak yüksek basınç ile gerçekleşir. Genelde 10-
25 cm uzunluğunda, 4,6 mm iç çapında tekrar kullanılabilen kolonlar tercih edilir.
Kullanılan kolonların yüksek basınca ve mobil faz çözücülerine dayanıklı olması
gerekir. Bu nedenle en çok paslanmaz çelik olanlar tercih edilir. Analitik HPLC
tekniğinde, mobil faz kolona 1-5 cm3/dakika akış hızında verilir. Eğer mobil faz
bileşimi sabitse “izokritik elüsyon”; değişkense “dereceli (gradiyent) elüsyon”
yöntemi denir. Kademeli elüsyon gaz kromatografisinde sıcaklık değişiminin
kullanıldığı durumlara benzer olarak alıkonma sürelerinin makul olmadığı durumlar
için tercih edilir. Ayrılması istenen karışımda farklı polaritedeki bileşenlerin
bulunması durumunda, çözücü bileşimi polariteye bağlı olarak değiştirilerek
gradiyent elüsyon yöntemi uygulanır.
Bir HPLC cihazı temel olarak;
Yüksek basınç ile hareketli faz dağılımını sağlayan pompa sistemi
Dolgu maddesi ile doldurulmuş yüksek verimlilikte çalışan kolon
Kolona numune girişini sağlayan enjeksiyon birimi
Dedektör
Sinyal dönüştürücüden oluşur.
20
HPLC‟de hareketli faz olarak su, organik çözücüler ya da tampon çözeltiler
kullanılır. Cihazın hareketli faz ile temas eden bölümleri genelde paslanmaz çelik,
teflon ya da diğer inert plastik malzemelerden yapılır. Basınca maruz kalan her parça
yeterince dayanıklılıkta olmalıdır. Cihaz tasarımında önem taşıyan diğer unsur,
numunenin cihaza verilişinden çıkışına kadar cihazda bulunan ölü hacimdir. Ölü
hacim, etkinlik kaybına neden olan herhangi boş alandır. Ölü hacmin nedenleri,
enjeksiyon birimi, tubing ve fitting diye adlandırılan kolon sonlarında ve dedektör
hücrelerinde bulunan bağlantı parçalarıdır.
2.2.5.2.1 Kolon sonrası türevlendirme tekniği
Hassas ve spesifik bir tayin yöntemi olan HPLC, eser madde analizinde oldukça
önem taşır. Eser miktarda bulunan birçok bileşiğin tayini için UV/ görünür bölge
absorbans, floresans ve elektrokimyasal sinyal ölçümüne dayalı dedektörlerle
sağlanır. Ancak bu tayin yöntemlerine cevap verebilecek fiziksel özelliklere sahip
olmayan bir çok analit bulunmaktadır. Bu bileşiklere örnek olarak, amino asitler,
şekerler, bazı anorganik iyonlar ve ilaç-aktif maddeler verilebilir. Absorpsiyon
bandına sahip olmayan, florofor grup ihtiva etmeyen veya elektrokimyasal olarak
aktif olmayan maddeler tayin edilmeden önce kimyasal olarak
türevlendirilmelidirler. Türevlendirme işleme kromatografik ayırmadan önce (pre-
kolon) ya da sonra (post-kolon) gerçekleştirilebilir. Her iki yöntemin de avantaj ve
dezavantajları bulunmaktadır.
Kolon öncesi türevlendirme tekniğinde basit kromatografik sisteme ek olarak ayrı bir
donanım gerekmez, kullanılan türevlendirme bileşikleri ticari olarak uygundur,
türevlendirme reaksiyon süreleri genelde kısadır. Bunun yanında, kromatografik
koşullar, türevlendirme reaktiflerine ve oluşan son ürüne göre ayarlanmalıdır. Eğer
türevlendirilmiş analitlerin standartları mevcut değilse, oluşan piklerin takibi ve
kromatografik koşulların optimizasyonu zorlaşır. Türevlendirme reaksiyonu tam
olarak gerçekleşmediyse, türevlendirme reaktifinin fazlasına ya da türevlendirme
reaksiyonu yan ürününe ait fazladan pikler (yapay pikler) görülebilir.
Türevlendirilmiş analit ise belirlenen kromatografik koşullara uygun olmalıdır.
Kolon sonrası türevlendirme sisteminde, kolon öncesi türevlendirme tekniğinde
görülen olumsuzluklar görülmez. Elde edilen kromatogramlar, analitlerin ayrı ayrı
izlendiği gibidir ve yapay piklere çok rastlanmaz. Reaksiyon mekanizmasının
bilinmesine ve reaksiyonun tamamlanmasını beklemeye gerek yoktur. Önemli olan,
21
türevlendirme reaksiyonunun tekrar edilebilir olmasıdır. Kolon sonrası türevlendirme
sisteminin dezavantajları;
Klasik HPLC cihaz ünitesine ek olarak bir donanım gerektirir.
Kromatografik ayırma optimizasyonu yanısıra kolon sonrası türevlendirme
sistemiyle ilgili bir optimizasyon yapılmalıdır.
Kolon sonrası türevlendirmede kullanılan kimyasalların kromatografik
koşullarla uyumlu olması gerekir, aksi takdirde kullanılan reaktifler çökebilir.
Kolon sonrası türevlendirmenin sebep olduğu hat genişlemesi nedeniyle
ayırma etkinliği azalabilir.
Kullanılan kolon sonrası türevlendirme reaksiyonunun hızlı gerçekleşmesi
gerekir.
Analit tayinini interfere edici yüksek gürültü gözlemlenebilir.
Bu dezavantajlara rağmen, kolon sonrası türevlendirme uygulaması 1980‟lerden
günümüze literatürde bulunan 300‟den fazla uygulamada kullanılan bir yöntemdir.
Kolon sonrası türevlendirme yönteminde, birçok reaksiyon türü kullanılabilir. Bu
reaksiyonların ortak özelliği, reaksiyon ürünlerinin UV/ görünür bölge absorbans,
floresans ya da elektrokimyasal dedektörlerle tayin edilebilir olmasıdır. Post kolon
türevlendirme sisteminin başarısı, yöntemin temelini oluşturan kimyasal
reaksiyonların özelliklerine doğrudan bağlıdır. Reaksiyon sonucu oluşan ürünün,
ticari olarak bulunan dedektörler tarafından tayin edilebilir olmalıdır. Kullanılan
kimyasalların dedektör tarafından görülmez olması önem taşımaktadır. Bu, sistemin
hassasiyetini sınırlandırarak, yüksek gürültü seviyelerinin görülmesini önler. Buna ek
olarak, mobil faz çözücüsü ve kolon sonrası reaksiyonu için kullanılan kimyasallar
uyumlu olmalıdır. Reaksiyon sürei tayin edilebilir bir ürün elde edecek kadar kısa
olmalıdır. Burada önemli olan , reaksiyonun tamamlanmış olması değil, doğru ve
tekrarlanabilir sinyal verecek kadar yeterli olmasıdır. Kısa reaksiyon süresinin,
HPLC sistemindeki ölü zamanı doğrudan etkilediği unutulmamalıdır.
Kolon sonrası türevlendirmede sistemi ikiye ayrılır;
Sıvı faz post-kolon sistemi (Bir ya da daha fazla pompa ile reaksiyon için
gerekli reaktifler sıvı fazda sisteme dağıtılır.)
22
Katı faz post kolon sistemi ( Pompasız sistemdir, ışık irradiasyonu ya da
elektrokimyasal işlemle tayin edilebilir türevlendirilmiş bileşikler elde edilir.)
ġekil 2.1 : Sıvı faz post-kolon sistemini gösteren blok şema (A: Mobil faz rezervuarı,
B: HPLC pompa, C: Enjeksiyon valfi, D: Kolon, E: Karıştırma birimi, F:
Reaktör, G: Dedektör, H: Post-kolon pompası, I: Post kolon reaktif
rezervuarı.
Kolon sonrası türevlendirmede kullanılan reaksiyonlar aşağıda görülmektedir.
pH Modifikasyonu: Ters faz kromatografisinde, iyonlaşma potansiyeline
sahip analitlerin ayrılması için en uygun hal iyonlaşmamış halleridir. Ancak
bilindiği gibi yüklü türlerin molar absorptiviteleri yüksüz türlere gore daha
büyüktür. Bu nedenle kolon sonrası reaksiyonu kullanılarak iyonlaşmamış
türler ayrılarak, yüklü türlere dönüştürülür ve tayin edilmeleri kolaylaşır.
Degredasyon ve Hidroliz Reaksiyonları: Kolon sonrası birimi eklenerek tayin
edilemeyen bileşiklerin degredasyon ve ya hidrolizi ile tayin edilebilir
bileşikler elde edilir. Bu tekniğin ilk uygulaması Bayne ve arkadaşları
tarafından uygulanmıştır. Indometasin ters faz HPLC kolon sonrası sistemi
kullanılarak 0,1N NaOH çözeltisi ile floresans özelliği gösteren bir bileşiğe
hidrolizlenmiştir (Bayne ve diğ, 1981)
Yükseltgenme ve İndirgenme Reaksiyonları: Yükseltgenme ve indirgenme
reaksiyonları tayin edilebilirliği yüksek ürünler oluştururlar. Hidroliz ve
degredasyon reaksiyonlarında görüldüğü gibi reaksiyon sonucu oluşan
ürünün kararsız hali kolon sonrası sistemi gerektirebilir. Penisilinin
civa(II)klorür (Haginaka ve diğ, 1985) ya da bazik sodyumhipoklorit
(Haginaka ve diğ, 1986) ile oluşan oksidasyon ürünleri 280 ve 300nm‟ de
23
güçlü UV absorbansı vermektedir. Bu şekilde kullanılan yöntemle
ampisilindeki serum seviyesi belirlenmiştir (Haginaka ve diğ, 1988). Bazik
ferrisiyaminin post kolon oksidasyonu sonucu oluşan ürünün floresans
şiddetinin ölçülmesiyle tiamin ve tiamin esterlerinin tayini sağlanmıştır
(Yamaguchi ve diğ, 1987)
Spesifik Bir Analit İçin Tipik Ürünler Oluşturan Reaksiyonlar: Bir sınıfa ait
bileşiklerden tayin edilebilir ürünler elde etmek için kullanılan
reaksiyonlardır. Bu tür reaksiyonlar kolon öncesi tekniğiyle kullanılamaz
sadece kolon sonrası tekniği için uygundur. Bu yöntemin ilk uygulaması,
1951‟de Moore ve Stein tarafından iyon değiştirici kolon ile aminoasit
bileşiklerinin ayırımı ve ninhidrinle reaksiyonu sonucu tayin edilmesine
dayanır (Moore ve diğ, 1951).
Kompleksleşme Reaksiyonları: Cassidy ve Karcher inorganic iyonlar ve şelat
yapıcı bileşikleri reaksiyona sokarak kolon sonrası türevlendirme tayininde
kullanmıştır (Cassidy ve diğ, 1971). Bu reaksiyonların faydaları, renkli ya da
floresans özelliğe sahip türler türetilmesi, çoğu kompleksleşme reaksiyon
kimyasının derinlemesine incelenmiş olması ve reaksiyonların çoğunlukla
hızlı olmasıdır.
İyon-Çift Reaksiyonları: İyon çift reaksiyonları, yüklü analitler ve ters yüklü,
renkli ya da floresans özellikteki boya molekülleri arasında oluşur. Bu
reaksiyonların temeline dayanarak kolon sonrası türevlendirme tekniği
kullanılabilir. Bu reaksiyonların dezavantajı, iyon-çift reaksiyon reaktifinin
analitle reaksiyona girmeden önce renkli ya da floresans özellikte olmalarıdır.
Bu nedenle kolon sonrası akımına katılmadan analiti ve iyon-çift reaktifini
ayırmak önemlidir. İyon-çift kolon sonrası türevlendirme sisteminde, HPLC
kolonundan çıkan efluent, HPLC mobil fazıyla karışmayan counter-iyon
çözeltisiyle karıştırılır. Dedeksiyondan önce karışmayan fazlar ayrılmalıdır.
Sulu fazda bulunan yüklü reaktif atığa giderken, iyon çiftini içeren organik
faz dedeksiyon birimine gider. Bu noktada kullanılan faz ayırma sistemi
HPLC ile uyumlu olmalıdır. Bu nedenle iyon çift kolon sonrası türevlendirme
sistemi genelde ticari olarak bulunmaz, uygulaması kısıtlıdr.
24
Kemuluminesans Reaksiyonlar: Kemiluminesans, bir kimyasal reaksiyon
sırasında ışık üretilmesi prensibine dayanır. Kolon sonrası türevlendirme
sisteminde, üretilen bu ışık dedektör tarafından sinyal olarak kullanılır.
Genelde, bu tür reaksiyonlar için floresans dedektörleri ışık kaynakları
kapatılarak kullanılır. Literatürde, çoğunlukla peroksioksalatın
kemiluminesans reaksiyonu uygulamalarına rastlanır. Kobayashi ve Imai
HPLC kolon sonrası dedektör sistemiyle bu reaksiyonu ilk kullanandır
(Kobayashi ve diğ, 1980).
Kimyasal Türevlendirme: Kolon sonrası türevlendirme yönteminde, en çok
kullanılan reaksiyon türüdür. Bu reaksiyonlarla analit ve reaktif, dedeksiyona
duyarlı özellikler gösteren ürünler oluştururlar. Bu zamana kadar
gördüğümüz reaksiyon türlerinin aksine, kimyasal türevlendirme
reaksiyonları hem kolon öncesi hem de kolon sonrası sistemlerde kullanılır.
Birleştirilmiş Reaksiyonlar: Kolon sonrası tekniğinde kullanılabilen
reaksiyonları incelerken son olarak bir ya da birkaç reaksiyonun
birleştirilerek bir kolon sonrası sisteminde kullanılabildiğini de belirtmek
gerekir. Bu birleşmenin en güzel örneği, pestisid ve herbisitlerin tayinidir. Bu
analitler NaOH ile hidrolizlenerek amin bileşikleri oluşturulur daha sonra
OPA ile reaksiyona sokularak floresans özelliğe sahip ürünlere
dönüştürülürler (Hill ve diğ, 1984; Luchtefeld ve diğ, 1985; Engelhardt ve
diğ, 1986; Miles ve diğ, 1988).
Kolon sonrası türevlendirme tekniği kullanılarak yapılan çalıĢmalar: Kolon
sonrası türevlendirme tekniği kullanılarak çalışılmış ve literatüre son 10 yılda
kazandırılmış çalışmalar tez kapsamında araştırıldı. Bunlar, inceleme açısından
faydalı olması düşüncesiyle, hat üstü HPLC ve kolon sonrası türevlendirme
yöntemlerinin birleştirilerek kullanıldığı çalışmalar ve farklı sistemlerin kolon
sonrası türevlendirme ile birlikte kullanıldığı çalışmalar olarak sınıflandırılabilir.
Kolon sonrası ve HPLC tekniğinin birleştirildiği çalışmalar çoğunlukla aflatoksin
analizi ve antioksidan madde analizleri üzerinde yoğunlaşmıştır. 2014 yılında yapılan
çalışmada brezilya fındıklarında aflatoksin düzeyi belirlemek ve bu miktarın sağlığı
olumsuz etkileyebilecek sınırlarda olup olmadığı anlaşılmak istenmiştir. Çalışmada
ticari olarak satın alınan numuneler metanol-su karışımı ile ekstrakte edilmiş, HPLC
25
sistemi kullanılarak metanol ile elue dilmiş aflatoksin bileşikleri bromin ile kolon
sonrası türevlendirme işlemine tabi tutulmuştur. Sonuç olarak hassas ve duyarlı bir
yöntem literatüre kazandırılmış, fındıkta bulunan aflatoksin bileşiklerinin izin verilen
sınır değerleri içinde olduğu görülmüştür (Iamanaka ve diğ, 2014).
Çelik ve çalışma grubunun yayınladıkları makalede ise mürver çiçeğinde bulunan
fenolik antioksidanlar HPLC-CUPRAC yöntemiyle tayin edilmiştir (Çelik ve diğ,
2010). Çalışmada diğer hat üstü HPLC yöntemleri kullanılarak tayin edilmesi
mümkün olmayan flavanoid glikozidler, önce C18 kolonda kademeli elusyon ile (%1
glasial asetik asit: asetonitril mobil fazları ile) ayrılmış daha sonra Cu(II)neokuproin
ile tepkimeye sokularak Cu(I)neokuproin kelatı oluşturulmuş ve 450nm‟de tayin
edilmiştir. Kuersetin ve diğer glikozidler için elde edilen gözlenebilme sınırlarının
kolon sonrası türevlendirme tekniği kullanılarak daha da düşürüldüğü tespit
edilmiştir. Bunun yanısıra antioksidan bileşikler yapılan diğer çalışmalar; bitki
yapraklarında yaprak konumu ve ekstraksiyonun önemini hat üstü HPLC-DPPH
tekniği ile belirlemek (Ou ve diğ, 2010), çilekte bulunan antioksidan maddelerin hat
üstü HPLC-ABTS ve hat üstü HPLC-FRAP yöntemi ile tayin etmek (Raudonis ve
diğ, 2012), oroksylium indicum ekstraktında bulunan radikal süpürücüleri ve ksantin
oksidaz enzimi inhibitörlerini tayin etmek amacıyla HPLC-kolon sonrası
türevlendirme tekniğini kullanarak biyoaktivite ölçümüne dayalı sistem geliştirmek
olarak sıralanılabilir (Li ve diğ, 2014).
Son 10 yılda renklendiricilerle ilgili olarak hat-üstü HPLC tekniğinin kullanıldığı
çalışmaya çok fazla rastlanılmamıştır. Bu çalışmalardan birinde, tarihi önem taşıyan
alizarin, purpurin, karminin ve morinin HPLC ile ayırımı sonrası lazer ile uyarılmış
floresans ışınına maruz tutulduğu kolon sonrası bir sistem ile çalışılmıştır (Surowiec
ve diğ, 2008). Diğer bir çalışmada ise flavanoidler, antrakinoidler ve hidroksi
benzoik asitler ters faz HPLC kullanılarak ayrılmış daha sonra ayrı ayrı Al(III) ve
zirkonil iyonları ile floresans özellikte kompleksler oluşturulduğu kolon sonrası bir
sistem tasarlanmıştır.
26
27
3. MALZEME VE YÖNTEM
3.1 Kullanılan Cihazlar
Çalışmada kimyasal maddelerin tartımı için Gec Avery marka analitik terazi,
hazırlanan çözeltilerin karıştırlmasında Heidolph marka girdap karıştırıcı, çözelti pH
değerlerinin belirlenmesinde Knick pH-metre cihazı, hazırlanan çözeltilerin
homojenizasyonu için BANDELIN RK-100H marka ultrasonik banyo kullanıldı.
Hazırlanan çözeltilerin absorbans ölçümlerinde Varian Cary UV-görünür bölge
spektrofotometresi, ters faz kromatografik analizler için Hitachi L-2130 HPLC
model HPLC pompası, C18 dolgu maddesi ile doldurulmuş paslanmaz çelik kolon
(250 mm 4,6 mm; Hitachi) ve UV-PDA (fotodiyot) dedektörden oluşan Hitachi
HPLC sistemi kullanıldı. Hat üstü HPLC çalışmalar için, yukarıda anlatılan HPLC
cihazına ek oarak Hitachi marka pompa sistemi ve HITACHI marka UV-görünür
bölge dedektör kullanıldı.
Hat-üstü post kolon CUPRAC çalışmaları, İstanbul Üniversitesi Kimya Bölümü
Analitik Kimya anabilimdalında, Waters BreezeTM
2 Model HPLC cihazı (Milford,
MA, USA): 1525 model ikili pompa, termostatlı kolon fırını, 2998 model fotodiyot
dedektör (PDA) (Chelmsford, MA, USA), Hamilton marka 25 μL-şırınga (Reno,
NV, USA) ve ACE C18 analitik kolon (4.6 mm×250 mm, 5 μm) (Milford, MA,
USA) kullanılarak gerçekleştirildi.. HPLC-kolon sonrası sisteminde yer alan RXN-
100 reaksiyon sarmalı (hacim 1 mL, yaklaşık toplam uzunluk 5 m, Waters) içeren
reaksiyon modülü (Waters, USA) kullanıldı.
3.2 Kimyasal Maddeler
Tüm deneysel çalışmalarda analitik saflıkta su kullanıldı. Tartrazin (E102), sunset
yellow FCF (E110), eritrosin (E127), neokuproin (2,9-dimetil-1, 10-fenantrolin)
Aldrich‟den; ponsö 4R (E124) ve indigo karmin (E132), amonyum asetat,
seryum(IV) sulfat tetrahidrat, sodyum sülfat, derişik sülfürik asit, bakırklorür ve
HPLC kullanımına uygun saflıkta metanol ve asetonitril, E. Merck‟ten temin edildi.
28
Renklendiricilerin renk indeks numaraları, Avrupa Birliği tarafından verilen
numaraları (E numaraları) ve kimyasal yapıları, isimleri ile birlikte Çizelge 3.1‟de
gösterilmiştir. Renklendirici çözeltileri ultra saf su kullanılarak farklı derişimlerde
günlük olarak hazırlandı.
29
Çizelge 3.1 : Analizleri yapılan sentetik renklendiricilerine ait renk indeks
numaraları, Avrupa Birliği numaraları ve kimyasal yapıları.
Renk Indeks
(CI)
Numaraları
Avrupa Birliği
Tarafından
Verilen
Numaralar
Renklendirici
Ġsimleri Kimyasal Yapı
19140 E 102 Tartrazin
15985 E 110 Sunset Yellow
FCF
73015 E 132 Indigo Karmin
45430 E 127 Eritrosin
16255 E 124 Ponsö 4R
30
3.3 Çözeltilerin Hazırlanması
3.3.1 Antioksidan kapasite tayin yöntemleri için çözelti hazırlanması
3.3.1.1 CERAC yöntemi için çözelti hazırlanması
CERAC yöntemi için, 2,0 × 10-3
M konsantrasyonunda Ce(IV)sülfat çözeltisi, 0,0808
g Ce(SO4)24H2O tartılarak bir miktar su ile çözüldü ve Ce(IV) iyonu hidrolizini
önlemek amacıyla 17 mL derişik sülfrik asit eklendi. 1,0 M Na2SO4 çözeltisi için
35,50 g tuz bir miktar saf su eklendikten sonra balon jojede 250 mL hacmine
tamamlandı.
3.3.1.2 CUPRAC yöntemi için çözelti hazırlanması
1,0 10-2
M CuCl2.H2O çözeltisi hazırlamak için, 0,08524 g CuCl2 tartılıp 50 mL‟ye
saf su ile tamamlandı. 7,5 x 10-3
M Neokuproin (Nc) çözeltisi ise, 0,078 g Nc tartılıp
50 mL lik balon jojeye etil alkol ile tamamlanmasıyla hazırlandı. 1,0 M amonyum
asetat tampon çözeltisi, 19,27 g NH4Ac tartılıp 250 mL lik balon jojede saf su ile
tamamlanmasıyla hazırlandı.
3.3.2 HPLC yöntemi için çözelti hazırlanması
Mobil faz olarak kullanılan 0,13 M amonyumasetat tampon çözeltisinin hazırlanması
için 5,01 g amonyum asetat tartılarak bidistile su ile 500 mL hacme tamamlandı.
İstenilen pH değerine getirmek amacıyla 0,1 M konsantrasyonunda NaOH çözeltisi
kullanıldı.
HPLC-CUPRAC post kolon yöntemi için ; Kolon sonrası reaksiyon modülünde
kullanılmak için 10 mM bakır(II) klorür çözeltisi ve 1,0 M amonyum asetat tampon
çözeltisi ultra saf su içinde hazırlandı. 7,5 10-3
M neokuproin çözeltisi HPLC
saflıkta etanolde hazırlandı. CUPRAC reaktifi bu çözeltilerin 1:1:1 (v/v/v) oranında
karıştırılmasıyla hazırlandı. Analiz öncesi ve analiz süresince reaktif gün ışığına ve
hava oksijenine karşı muhafaza edildi.
HPLC-CERAC post kolon yöntemi için ; Kolon sonrası reaksiyon modülünde
kullanılmak için 2,0 10-3
M konsantrasyonunda hazırlanan Ce(IV)sülfat çözeltisi ve
1,0 M Na2SO4 çözeltisi bidestile su içinde hazırlandı. CERAC reaktifi bu çözeltilerin
1:7 (v/v) oranında karıştırılmasıyla hazırlandı. Analiz öncesi ve analiz süresince
reaktif gün ışığına ve hava oksijenine karşı muhafaza edildi.
31
3.4 Renklendirici ve Gerçek Örnek Çözeltilerinin Analiz için Hazırlanması
Deneyde kullanılan sentetik renklendirici çözeltilerin hazırlanması amacıyla yaklaşık
0,1 g sentetik renklendirici tartılarak ultra saf su ile 100 mL hacmine tamamlandı.
Uygun seyreltmelerle istenen derişimde hazırlanan sentetik renklendirici
çözeltilerinin homojenizasyonu için her bir çözelti 30 dakika boyunca ultrasonik
banyoda bekletildi.
Kuşburnu ve portakal aromalı toz içecek örnekleri renklendirici içeriği için analiz
edildi. Toz içecek örnekleri spektrofotometrik yöntemler için 1,0 g, kromatografik
yöntemler için yaklaşık 10,0 g miktarında tartılarak saf su ile 50 mL hacmine
seyreltildi. Örnek çözeltilerin homejenizasyonu için, hazırlanan çözeltiler 30 dakika
boyunca ultrasonik banyoda bekletildi. Kromatografik sisteme enjeksiyonlarından
önce 0,45 m gözenek çapına sahip şırınga filtresinden geçirildiler.
3.5 Sentetik Renklendiricilerin Spektrofotometrik Yöntemlerle Tayini
3.5.1 CERAC yöntemi
CERAC Yöntemi ilk olarak 2007 yılında Özyurt ve çalışma arkadaşları tarafından
geliştirildi (Ozyurt ve diğ, 2007) ve 2010 yılında aynı yazarlar tarafından modifiye
edildi (Ozyurt ve diğ, 2010). Bu çalışmada, CERAC yöntemi gıda renklendiricilerine
uygulanarak deneysel çalışmalar gerçekleştirildi.
1,0 mL 2 10-3
M Ce(IV) çözeltisi + 7,0 mL 1,0 M Na2SO4 çözeltisi + x mL
renklendirici çözeltisi 10 mL son hacmine tamamlandı. 30 dakika boyunca ağzı
kapalı olarak bekletilen çözeltilerin absorbans değerleri 320 nm dalgaboyunda saf
suya karşı ölçüldü. Her renklendriciye ait kalibrasyon grafiği yukarıda belirtilen
koşullar altında çizildi (Şekil 4.1- Şekil 4.5).
Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan aromalı toz içecek örneklerinden 0,2 mL
alınarak ayrı ayrı CERAC yöntemi uygulandı, denemeler 3‟er kez tekrarlandı.
Toplam renklendirici içeriği (TRİ) Eşitlik 3.1‟de verilen matematiksel hesaba göre
ponsö 4R cinsinden verildi.
TRİ (g/ 100 g)= ( Absorbans / ponsö 4R ) (toplam hacim / örnek hacmi)
ponsö 4R molekül ağırlığı (g/mol) / örnek miktarı (g) 100 (3.1)
32
Bunun için, molar absorpsiyon katsayısı olarak CERAC yöntemine göre ponsö 4R
için hesaplanan değer kullanıldı.
3.5.2 CUPRAC yöntemi
Apak ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilen CUPRAC yönteminde mavi renkli
Cu(II)-Nc kompleksi antioksidanlarla etkileşip sarı renkli Cu(I)Nc kompleksine
indirgenmektedir (Apak ve diğ, 2004). Bu çalışmada, CUPRAC yöntemi gıda
renklendiricilerine uygulanarak deneysel çalışmalar gerçekleştirildi.
CUPRAC yöntemi için, bir deney tüpü içerisinde 1,0 mL 1,0 10-2
M Cu(II)klorür
çözeltisi, 1,0 mL 7,5 10-3
M Nc çözeltisi ve 1,0 mL 1 M amonyum asetat tampon
(pH 7,0) çözeltisi ilave edildi. Daha sonra x mL gıda renklendiricisi standart
çözeltisinden ve son olarak (1,0 - x) mL distile su ilave edilerek çözeltiler karıştırıldı.
Tüpler oda sıcaklığında ağzı kapalı olarak 30 dakika bekletildi. Süre sonunda
çözeltilerin içinde örnek bulunmayan referans çözeltiye karşı 450 nm‟deki absorbans
değerleri ölçüldü. Her renklendriciye ait kalibrasyon grafiği yukarıda belirtilen
koşullar altında çizildi (Şekil 4.6- Şekil 4.11).
Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan aromalı toz içecek örneklerinden 0,1 mL
alınarak ayrı ayrı CUPRAC yöntemi uygulandı, denemeler 3‟er kez tekrarlandı.
Toplam renklendirici içeriği (TRİ) Eşitlik 3.1‟de verilen matematiksel hesaba göre
ponsö 4R cinsinden verildi. Bunun için, molar absorpsiyon katsayısı olarak
CUPRAC yöntemine göre ponsö 4R için hesaplanan değer kullanıldı.
3.6 Kromatografik Yöntemler
3.6.1 HPLC analizi
Renklendiricilerin kromatografik olarak ayırımı için ters faz C18 kolon sistemi
kullanıldı. Sentetik renklendiricilerin analizi için 0,13 M amonyum asetat çözeltisi
(A), ve metanol (B) ikili çözücü sisteminden oluşan hareketli fazın dereceli
(gradiyent) elüsyonu uygulandı. Mobil faz akış hızı 1mL/ dakika olarak belirlendi.
Renklendiricilere ait pik alanları hem kendi maksimum absorpsiyon yaptıkları
dalgaboylarında, hem hepsi için ortak belirlenen 485 nm dalgaboyunda ölçüldü.
33
Çizelge 3.2 : HPLC-PDA sistemi ile renklendiricilerin ayrılması için optimize edilen
dereceli elüsyon programı [0,13 M amonyum asetat çözeltisi (A), ve
metanol (B)].
t (dak) A (%) B(%)
0 100 0
2 100 0
20 45 55
30 0 100
32 0 100
33 100 0
35 100 0
Akış hızı 1mL/ dakika enjeksiyon hacmi 20 L‟dir. (max(tartrazin): 427 nm; max(indigo):
608 nm; max(sunset yellow): 482 nm; max(ponsö 4R): 508 nm; max(eritrosin) : 528 nm)
Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan aromalı toz içecek örnekleri 0,45 m filtreden
geçirilerek geliştirilen dereceli elüsyon programı uygulandı. Toz içecek
örneklerindeki bileşenler belirlenerek kantitatif değerlendirmeleri yapıldı. Toz içecek
örneklerinin toplam renklendirici içerikleri (TRİ) belirlenerek, bulunan değerler g
ponsö 4R/ 100 g cinsinden, Eşitlik (3.2)‟de verilen denkleme göre hesaplandı.
TRİ HPLC = Ci PERİ i [Toplam örnek hacmi (L) / örnek miktarı (g)] 100 (3.2)
Ponsö 4R eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ) değerinin belirlenmesi için herbir
renklendiriciye ait molar absorpsiyon katsayılarının () aynı deneysel şartlarda
referans ponsö 4R renklendiricisinin molar absorpsiyon katsayısına oranlanarak
hesaplandı. Çizelge 4.16 tez kapsamında çalışılan renklendiricilere ait CERAC ve
CUPRAC yöntemlerine göre hesaplanan PERİ değerlerini göstermektedir.
3.6.2 Hat üstü HPLC yöntemleri
HPLC tekniğinde eser miktardaki maddelerin izlenebilmesi için farklı özelliklerini
ölçen (Spektrofotometrik, floresans ve elektrokimyasal gibi) dedektörler kullanılır.
Ancak analiz örneklerinde, bu tayin yöntemlerine cevap verebilecek fiziksel
özelliklere sahip olmayan birçok analit bulunabilir. Bu bileşiklere örnek olarak,
amino asitler, şekerler, bazı anorganik iyonlar ve ilaç-aktif maddeler verilebilir. Bu
tür bileşiklerin tayini için çoğunlukla bir türevlendirme işlemine gerek duyulabilir.
Bu türevlendirme işlemi (kolon sonrası kimyasal reaksiyon) HPLC gibi yüksek
çözünürlüklü ayırma yöntemi ile aynı hat üzerinde birleştirilerek, kompleks
34
matrikslerdeki bileşiklerin belirlenmesinde etkin olarak kullanılır. Bu çalışmada
sentetik renklendirici bileşikleri bölüm 3.6.1‟de kromatografik olarak ayrıldıktan
sonra kolon sonrası türevlendirme yöntemi (CUPRAC ve CERAC) uygulanarak
kalitatif ve kantitatif olarak tayin edildi.
3.6.2.1 Hat üstü HPLC-CUPRAC yöntemi
Hat üstü HPLC-CUPRAC yöntemi, ilk olarak S. Esin Çelik ve çalışma arkadaşları
tarafından 2010 yılında geliştirilmiştir. Bu yöntemle, karışık bitki matrikslerinde
polifenollerin seçici tayini gerçekleştirilmiştir (Çelik ve diğ, 2010). Bu tez
çalışmasında Çelik ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilmiş yöntem sentetik
renklendiricilerin tayinine uygulanmıştır.
Kolon-sonrası belirlemeli hat-üstü sistem, HPLC sistemine bir kolon-sonrası
reaksiyon modülü (içerisinde yaklaşık 5 m uzunluğunda reaksiyon sarmalı bulunan)
ve CUPRAC reaktif pompasının eklenmesiyle oluşturuldu. Bölüm 3.6.1‟ de tez
kapsamında geliştirilen dereceli elüsyon programı ile, Çelik ve çalışma arkadaşları
tarafından geliştirilen hat-üstü HPLC-CUPRAC tekniği birleştirildi. HPLC
kolonunda ayrılan bileşenler kolon-sonrası reaksiyon modülünde bulunan reaksiyon
sarmalı içinde, reaktif pompasından 0,5 mL/dakika akış hızı ile pompalanan 3,33
10-3
M Cu(II) / 2,5 10-3
M Nc / 0,333 M NH4Ac (1:1:1, v/v/v) oranında belirlenen
CUPRAC reaktifi ile reaksiyona sokuldu. Yaklaşık 1 dakikalık reaksiyon süresi
sonunda Cu(II)-Nc kompleksi sentetik renklendirici bileşikleri tarafından
indirgenerek Cu(I)-Nc kelatına dönüştürüldü. Reaksiyon modülünden dedektöre
gelen reaksiyon ürününün maksimum absorpsiyon yaptığı 450 nm dalgaboyunda
sentetik renklendirici bileşiğe eşdeğer oranda Cu(I)-Nc kelatına ait kromatogram elde
edildi. Hat-üstü sistem ile elde edilen pikler negatif bölgede gösterildiğinden elde
edilen pik “negatif pik”, pik alanı “negatif pik alanı” olarak adlandırıldı.
Portakal ve kuşburnu aromalı toz içecek örnekleri filtreden geçirilerek dereceli
elüsyon programı uygulandı. Örneklerdeki bileşenler belirlendikten sonra kantitatif
olarak değerlendirildi. Toplam renklendirici içerikleri g Ponsö 4R / 100 g cinsinden
Eşitlik (3.3)‟de verilen denkleme göre yapıldı.
TRİ HPLC-CUPRAC = (yi / eğim) Toplam örnek hacmi (L) / örnek miktarı (g) (3.3)
35
Denklemde verilen yi toz içecek örneklerinde tespit edilen bileşenlere ait negatif pik
alanları toplamını, eğim ise 450 nm‟de ponsö 4R kalibrasyon doğrusuna ait eğimi
ifade etmektedir.
3.6.2.2 Hat Üstü HPLC CERAC yöntemi
Toplam antioksidan kapasite tayini için kullanılan ve Ce(IV) iyonun oda sıcaklığında
fenolik antioksidanları yükseltgemesi prensibine dayanan CERAC yöntemi ilk olarak
Özyurt ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirildi (Ozyurt ve diğ, 2007; 2010 ).
Kolon-sonrası türevlendirmeli hat-üstü sistem, HPLC sistemine bir kolon-sonrası
reaksiyon modülü ve CERAC reaktif pompasının eklenmesiyle oluşturuldu. Hat-üstü
HPLC-CERAC yönteminde Ce(IV) iyonu derişimi ve akış hızı optimize edildikten
sonra sentetik renklendiriciler ile HPLC yönteminin dereceli elüsyon şartları
kullanıldı ve dedektör dalgaboyu 320 nm olarak seçildi. Bölüm 3.6.1‟de tez
kapsamında geliştirilen dereceli elüsyon programına göre HPLC kolonunda ayrılan
bileşenler kolon-sonrası reaksiyon modülünde bulunan reaksiyon sarmalı içinde
reaktif pompasından 0,5 mL/ dakika akış hızında pompalanan CERAC reaktifi ile
reaksiyona sokuldu. Yaklaşık 1 dakikalık reaksiyon süresi sonunda Ce(IV) iyonu
sentetik renklendirici bileşikleri tarafından indirgenerek Ce(III) iyonuna
dönüştürüldü. Reaksiyon modülünden dedektöre gelen Ce(IV) iyonunun ışığı
maksimum absorpladığı 320 nm dalgaboyunda sentetik renklendirici bileşiğine
eşdeğer oranda azalan Ce(IV) iyonuna ait kromatogram elde edildi. Sentetik
renklendirici bileşiklerine eşdeğer oranda azalan Ce(IV) pik alanları ölçüldü. Hat-
üstü sistem ile elde edilen pikler negatif bölgede gösterildiğinden elde edilen pik
“negatif pik”, pik alanı “negatif pik alanı” olarak adlandırıldı.
3.7 Ġstatistiksel Analiz
Deneysel analiz sonuçlarının ortalamaları ve ortalamaların standart sapmaları
Microsoft Ofise 2010 Excel programı ile hesaplanmıştır. Sonuçlar, “ortalama değer ±
standart sapma” şeklinde verilmiştir. F testi ve korelasyon katsayıları (r); ANOVA
(ANalysis Of VAriance) yinelemesiz çift etken ve korelasyon (0,00 - 0,25 Çok zayıf
ilişki; 0,26 - 0,49 Zayıf ilişki; 0,50 - 0,69 Orta ilişki; 0,70 - 0,89 Yüksek ilişki; 0,90 -
1,0 Çok yüksek ilişki) programları kullanılarak (Microsoft Excel 2010 Ofis)
hesaplandı. Ayrıca kalibrasyon doğrularının eğim ve kayımları hata değerleri ile
verildi (Miller ve Miller, 1993).
36
37
4. DENEYSEL BULGULAR
4.1 Spektrofotometrik Yöntemler
Literatür araştırmalarında, antioksidan tayin yöntemlerinin gıda renklendiricisi
analizinde (Yang ve diğ, 2010) kullanıldığı görülmüştür. Bu nedenle tezin birinci
bölümünde, çalışma grubumuz tarafından geliştirilen, spektrofotometrik antioksidan
tayin yöntemleri olan CERAC ve CUPRAC yöntemleri ile sentetik renklendiricilerin
analizleri incelendi.
4.1.1 Sentetik renklendiricilerin sulu çözeltilerinin absorpsiyon spektrumları
CERAC ve CUPRAC yöntemlerinin ölçüm absorbans dalgaboyu sırasıyla 320 ve
450 nm‟dir. Bu dalgaboyunda, renklendiricilerin absorpsiyonlarını gözlemlemek
üzere ponsö 4R, tartrazin, eritrosin, sunset yellow ve indigo karmin
renklendiricilerinin Uygun derişimlerde hazırlanan sulu çözeltilerinin absorpsiyon
spektrumları suya karşı 200 - 800 nm dalgaboyu aralığında alındı (Şekil 4.1).
ġekil 4.1 : Sentetik renklendirici çözeltilerinin moleküler absorpsiyon spektrumları
(Ctartrazin: 2,24 × 10-4
M; Cindigo: 5,45 × 10-4
M ; Cponsö 4R: 2,33 × 10-4
M ;
Csunsetyellow : 2,85 × 10-4
M;Ceritrosin : 1,70 × 10-4
M).
38
4.1.2 CERAC yöntemi ile sentetik gıda renklendiricilerin tayini
4.1.2.1 CERAC yöntemine göre renklendiricilerin kalibrasyon grafiklerinin
oluĢturulması
CERAC yöntemi bölüm 3.5.1‟de verildiği gibi gıda renklendiricilerine uygulanarak,
kalibrasyon grafikleri çizildi. Şekil 4.2- 4.6, ponsö 4R, tartrazin, eritrosin, sunset
yellow ve indigo karmin renklendiricilerine ait kalibrsayon eğrilerini ve Çizelge 4.1
molar absorpsiyon katsayılarını, lineer aralıkları, kalibrasyon denklemlerini, lineer
regresyon katsayılarını ve PERİ değerlerini göstermektedir.
ġekil 4.2 : Ponsö 4R çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (4,00 - 24,00 10-6
M ponsö 4R).
y = -2,95 104 C + 0,82 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
Cponsö 4R 106 M
A
39
ġekil 4.3 : Tartrazin çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (2,43 - 19,44 10-6
M tartrazin).
ġekil 4.4 : Eritrosin çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,42 - 8,52 10-6
M eritrosin).
y = -2,10 104C + 0,78 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Ctartrazin 106M
y = -5,72 104 C + 0,83 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Ceritrosin 106 M
A
A
40
ġekil 4.5 : Sunset yellow çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (2,43 - 29,16 10-6
M sunset yellow).
ġekil 4.6 : Indigo çözeltisine ait CERAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon grafiği
(4,68 - 56,2 10-6
M indigo)
y = -2,52 104 C + 0,79 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
Csunsetyellow 106 M
y = -1,11 104 C + 0,81 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00
A
Cindigo 106 M
A
41
Çizelge 4.1 : Sentetik renklendiricilerin CERAC yöntemi ile elde edilen lineer kalibrasyon denklemleri, lineer çalışma aralıkları,
gözlenebilme(LOD), tayin sınırı (LOQ) değerleri ve ponsö eşdeğer renklendirici içeriği için hesaplanan katsayı değerleri (PERİ).
Renklendirici
Adı
(Lmol-1
cm-1
) Lineer çalıĢma
aralığı
(× 10-5
M)
Kalibrasyon denklemi LOD
(M)
LOQ
(M)
PERĠ
Ponsö 4R 2,95 104 0,40 – 2,40 A= -(2,95 ± 0,17) × 10
4 × CPonsö + 0,82 ± 0,0272,
r = 0,9990
1,35 10-6
4,51 10-6
1,00
Tartrazin 1,99 104 0,24 – 1,94 A= -(2,10 ± 1,19) × 10
4 × CTartrazin + 0,78 ± 0,0065,
r = 0,9812
1,15 10-6
3,83 10-6
0,71
Eritrosin 5,74 104 0,14 – 0,85 A= -(5,72 ± 1,81) × 10
4 × Ceritrosin + 0,83 ± 0,0012,
r = 0,9996
0,15 10-6
0,49 10-6
1,94
Sunset
Yellow
2,58 104 0,24 – 2,92 A= -(2,52 ± 0,21) × 10
4 × CSunsetyellow+ 0,79 ± 0,0275,
r = 0,9966
1,14 10-6
3,82 10-6
0,85
Indigo
Karmin
1,11 104 0,47 – 5,62 A= -(1,11 ± 0,15) × 10
4 × Cİndigo + 0,81 ± 0,0469,
r = 0,9912
2,60 10-6
8,70 10-6
0,38
42
4.1.2.2 Ġçecek tozlarına standart katkı yönteminin uygulanması
4.1.2.2.1 Portakal içecek tozuna tartrazin katkısı
CERAC yöntemi için belirlenen deney koşullarında iki seri şeklinde hazırlanan 2,0
10-4
M Ce(IV) çözeltilerinin birinci serisine, son derişimleri 2,43 10-6
M - 19,44
10-6
M arasında değişen tartrazin çözeltisi ilave edildi. İkinci seriye ise birinci seri
çözeltilerine ek olarak, Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan portakal içecek tozu
çözeltisinden 0,2‟şer mL ilave edildi. Hazırlanan çözeltiler, 30 dakika bekletildikten
sonra absorbans değerleri 320 nm‟de suya karşı ölçüldü. Hazırlanan çözeltilerin
derişimleri ile bulunan absorbans değerleri arasında eğriler çizildi (Şekil 4.7).
ġekil 4.7 : Portakal aromalı içecek tozu ile tartrazin etkileşimi (♦: 2,0 × 10-4
M
Ce(IV) + tartrazin; ■: 2,0 × 10-4
M Ce(IV)+ tartrazin+ portakal içecek
tozu çözeltisi).
4.1.2.1.2 KuĢburnu içecek tozuna ponsö 4R katkısı
CERAC yöntemi için belirlenen deney koşullarında iki seri şeklinde hazırlanan 2,0
10-4
M Ce(IV) çözeltilerinin birinci serisine, son derişimleri 0-16,00 10-6
M
arasında değişen ponsö 4R çözeltileri ilave edildi. İkinci seriye ise birinci seri
çözeltilerine ek olarak, Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan kuşburnu içecek tozu
çözeltisinden 0,2‟şer mL ilave edildi. Hazırlanan çözeltiler, 30 dakika bekletildikten
sonra absorbans değerleri 320 nm‟ de suya karşı ölçüldü. Hazırlanan çözeltilerin
derişimleri ile bulunan absorbans değerleri arasında eğriler çizildi (Şekil 4.8).
y = 2,10 × 104 C + 0,78 R² = 0,99
y = -2,05 × 104 C + 0,61 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Ctartrazin 106 (M)
A
43
ġekil 4.8 : Kuşburnu aromalı içecek tozu ile ponsö 4R etkileşimi (: 2,0 10-4
M
Ce(IV) + ponsö 4R; : 2,0 10-4
M Ce(IV)+ ponsö 4R + kuşburnu
içecek tozu çözeltisi).
4.1.2.3 CERAC yönteminin geri kazanımının belirlenmesi
Sentetik renklendiricilere uygulanan CERAC yönteminin geri kazanımının
belirlenmesi için 4.1.2.2‟de verildiği gibi hazırlanan portakal ve kuşburnu içecek
tozu çözeltilerine sırasıyla tartrazin (4,86 10-6
M ve 14,58 10-6
M) ve ponsö 4R
(2,00 10-6
ve 8,00 10-6
M) olacak şekilde katkı yapıldı. Katkı yapılan çözeltilere
CERAC yöntemi uygulandı ve sonuçlar Çizelge 4.2‟de verildi.
Çizelge 4.2 : CERAC yönteminin geri kazanımı.
Ġçecek
Tozlarına
Renklendirici
Katkısı
TRĠ (PERĠ
katsayılarıyla
hesaplanan)
(M)
Eklenen
DeriĢim
(M)
Beklenen
DeriĢim
(M)
Bulunan
DeriĢim
(M)
Geri
Kazanım
(%)
Portakal İçecek
Tozuna
Tartrazin
Katkısı
7,12 10-6
4,86 10-6
11,98 10-6
13,57 10-6
113,2
14,58 10-6
21,86 10-6
25,71 10-6
116,9
Kuşburnu
İçecek Tozuna
Ponsö 4R
Katkısı
6,58 10-6
2,00 10-6
8,58 10-6
9,05 10-6
105,5
8,00 10-6
14,58 10-6
15,08 10-6
103,4
y = -2,95 104C + 0,82 R² = 0,99
y = -2,92 × 104 C + 0,59 R² = 0,95
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00
Cponsö 4R 106 (M)
A
44
4.1.3 CUPRAC yöntemi ile sentetik gıda renklendiricilerin tayini
4.1.3.1 CUPRAC yöntemine göre renklendiricilerin kalibrasyon grafiklerinin
oluĢturulması
CUPRAC yöntemi bölüm 3.5.2‟de verildiği gibi gıda renklendiricilerine
uygulanarak, kalibrasyon grafikleri çizildi. Şekil 4.9 - 4.13, ponsö 4R, tartrazin,
eritrosin, sunset yellow ve indigo karmin renklendiricilerine ait kalibrsayon eğrilerini
ve Çizelge 4.3 molar absorpsiyon katsayılarını, lineer aralıkları, kalibrasyon
denklemlerini, lineer regresyon katsayılarını ve PERİ değerlerini göstermektedir.
ġekil 4.9 : Ponsö 4R çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (4,88 – 39,04 10-6
M ponsö 4R).
y =2,24 104C- 0,02 R² = 0,99
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00
A
Cponsö 4R 106 M
45
ġekil 4.10 : Tartrazin çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (5,80 – 46,4 10-6
M tartrazin).
ġekil 4.11 : Eritrosin çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,00 - 3,81 10-5
M eritrosin).
y = 1,34 104C - 0,01 R² = 0,99
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
y = 5,20 103C + 0,01 R² = 0,99
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00
A
Ctartrazin 106 M
Ceritrosin 105 M
A
46
ġekil 4.12 : Sunset yellow çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen
kalibrasyon grafiği (5,59 - 47,40 10-6
M sunset yellow).
ġekil 4.13 : Indigo çözeltisine ait CUPRAC yöntemi ile elde edilen kalibrasyon
grafiği (1,11 - 9,10 10-5
M indigo).
y = 1,49 104 C+ 0,04 R² = 0,99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
A
y = 1,03 106 C + 0,08 R² = 0,99
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 2 4 6 8 10
A
Cindigo 105 M
Csunset yellow 106 M
47
Çizelge 4.3 : Sentetik renklendiricilerin CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorpsiyon katsayıları, lineer çalışma aralıkları, lineer
kalibrasyon denklemleri, gözlenebilme(LOD), tayin sınırı (LOQ) değerleri ve ponsö eşdeğer renklendirici içeriği için hesaplanan
katsayı değerleri (PERİ).
Renklendirici
Adı (Lmol
-1cm
-1)
Lineer ÇalıĢma
Aralığı (10-5
M)
Kalibrasyon Denklemi LOD
(M)
LOQ
(M) PERĠ
Ponsö 4R 2,24 104 0,48 - 3,90
A= (2,24 ± 0,36) × 104 × CPoncsö4R - 0,0227 ± 0,0073,
r = 0,9990 0,11 10
-6 0,36 10
-6 1,00
Tartrazin 1,34 104 0,58 - 4,64
A= (1,34 ± 0,12) × 104 × CTartrazin– 0,0060 ± 0,0003,
r = 0,9945 1,48 10
-6 4,93 10
-6 0,60
Eritrosin 5,20 103 0,10 - 0,38
A= (5,20 ± 0,31) × 103 × Ceritrosin + 0,0087 ± 0,0020,
r = 0,9996 0,21 10
-6 0,70 10
-6 2,32
Sunset
Yellow 1,49 10
4 0,56 - 4,74
A= (1,49 ± 0,06) × 104 × CSunsetyellow + 0,0151 ±
0,0041
r = 0,9996 1,80 10
-6 6,00 10
-6 0,67
Indigo
Karmin 1,03 10
4 0,11 - 0,91
A= (1,03 ± 0,11) × 104 × Cİndigo + 0,0829 ± 0,0588,
r = 0,9912 1,91 10
-6 6,38 10
-6 0,46
48
4.1.3.2 Ġçecek tozlarına standart katkı yönteminin uygulanması
4.1.3.2.1 Portakal içecek tozuna tartrazin katkısı
CUPRAC yöntemi için belirlenen deney koşullarında iki seri şeklinde hazırlanan 1,0
mL 1,0 10-2
M Cu(II)klorür çözeltisi, 1 mL 7,5 10-3
M Nc çözeltisi ve 1 mL 1 M
amonyum asetat tampon (pH 7,0) çözeltisi üzerine son derişimleri 14,48 10-6
M-
22,69 10-6
M arasında değişen tartrazin çözeltisi ilave edildi. İkinci seriye ise
birinci seri çözeltilerine ek olarak, Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan portakal
içecek tozu çözeltisinden 0,1‟er mL ilave edildi. Hazırlanan çözeltiler, 30 dakika
bekletildikten sonra absorbans değerleri 450 nm‟ de içinde örnek bulunmayan
referans çözeltiye karşı ölçüldü. Hazırlanan çözeltilerin derişimleri ile bulunan
absorbans değerleri arasında eğriler çizildi (Şekil 4.14).
ġekil 4.14 : Portakal aromalı içecek tozu ile tartrazin etkileşimi (:1 mL 10-2
M
CuCl2 + 1 mL 7,5 10-3
M Nc +1 mL 1 M NH4Ac+ tartrazin; : 1 mL
10-2
M CuCl2 + 1 mL 7,5 10-3
M Nc + 1 mL 1M NH4Ac + tartrazin +
portakal içecek tozu çözeltisi).
y =1,34 104 C - 0,06 R² = 1,00
y = 1,37 104 C + 0,13 R² = 0,98
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
A
Ctartrazin 106 M
49
4.1.3.2.2 KuĢburnu içecek tozuna ponsö 4R katkısı
CUPRAC yöntemi için belirlenen deney koşullarında iki seri şeklinde hazırlanan 1,0
mL 1,0 10-2
M Cu(II)klorür çözeltisi, 1mL 7,5 10-3
M Nc çözeltisi ve 1 mL 1 M
amonyum asetat tampon (pH 7,0) çözeltisi üzerine son derişimleri 9,15 10-6
M-
15,24 10-6
M arasında değişen ponsö 4R çözeltisi ilave edildi. İkinci seriye ise
birinci seri çözeltilerine ek olarak, Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan kuşburnu
içecek tozu çözeltisinden 0,1‟er mL ilave edildi. Hazırlanan çözeltiler, 30 dakika
bekletildikten sonra absorbans değerleri 450 nm‟de içinde örnek bulunmayan
referans çözeltiye karşı ölçüldü. Hazırlanan çözeltilerin derişimleri ile bulunan
absorbans değerleri arasında eğriler çizildi (Şekil 4.15).
ġekil 4.15 : Kuşburnu aromalı içecek tozu ile ponsö 4R etkileşimi (:1mL 10-2
M
CuCl2 + 1mL 7,5 10-3
M Nc +1mL 1 M NH4Ac+ ponsö 4R; : 1mL
10-2
M CuCl2 + 1mL 7,5 10-3
M Nc +1mL 1 M NH4Ac+ ponsö 4R +
kuşburnu içecek tozu çözeltisi).
4.1.3.3 CUPRAC yönteminin geri kazanımının belirlenmesi
Sentetik renklendiricilere uygulanan CUPRAC yönteminin geri kazanımının
belirlenmesi için 4.1.2.1‟de verildiği gibi hazırlanan portakal ve kuşburnu içecek
tozu çözeltilerine sırasıyla tartrazin (17,31 10-6
M ve 21,49 10-6
M) ve ponsö 4R
(12,75 10-6
ve 14,32 10-6
M) olacak şekilde katkı yapıldı. Katkı yapılan
çözeltilere CUPRAC yöntemi uygulandı ve sonuçlar Çizelge 4.4‟de verildi.
y = 0,22 106 C - 0,02 R² = 0,99
y = 2,00 104 C + 0,10 R² = 0,99
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00
A
Cponsö 4R106 (M)
50
Çizelge 4.4 : CUPRAC yönteminin gerikazanımı.
Ġçecek
Tozlarına
Renklendirici
Katkısı
TRĠ (PERĠ
katsayıları
ile
hesaplanan)
(M)
Eklenen
DeriĢim
(M)
Beklenen
DeriĢim
(M)
Bulunan
DeriĢim
(M)
Geri
Kazanım
(%)
Portakal
içecek tozuna
tartrazin
katkısı
6,82 10-6
17,31 10-6
24,13 10-6
26,86 10-6
111,0
21,49 10-6
28,31 10-6
32,01 10-6
113,0
Kuşburnu
içecek tozuna
ponsö4R
katkısı
4,58 10
-6 12,76 10
-6
18,23 10-6
16,72 10-6
91,7
14,32 10-6
19,79 10-6
18,38 10-6
92,9
4.2 Sentetik Renklendiricilerin Tayini Ġçin GeliĢtirilen Kromatografik
Yöntemler
4.2.1 HPLC-PDA yöntemi
Minioti ve arkadaşlarının sentetik renklendiricinin tayini için belirlediği
kromatografik koşullardan yola çıkarak, 5 farklı sentetik renklendirici içeren karışım
için yeni çözücü ve dereceli elüsyon programları geliştirildi (Minioti ve diğ, 2007).
İlk olarak, Minioti ve çalışma grubu tarafından geliştirilen, mobil faz olarak A: 0,13
M amonyumasetat (pH:7,5), B: 80:20 metanol / asetonitril çözeltileri kullanarak,
kullandığımız cihaza uygunluk açısından akış hızı 1 mL/ dakika olarak değiştirilerek
aynı dereceli elüsyon programıyla çalışıldı (Çizelge 4.5, Şekil 4.16). Bu
kromatogramda görüldüğü gibi, renklendiricilerin ayırımı uygun bir şekilde sağlansa
da, kullanılan çözeltilerin insan sağlığı ve çevre üzerindeki olumsuz etkileri
nedeniyle, mobil faz olarak 0,13 M amonyumasetat (mobil faz A) ve methanol
(mobil faz B) kullanılması durumundaki sonuçlar araştırıldı. Bundan sonra yapılan
optimizasyon çalışmalarında akış hızı 1 mL/ dakika, enjeksiyon hacmi ise 20 μL
olarak sabit tutuldu. Sabit faz olarak C18 dolgulu kolon kullanıldı. En kısa sürede en
iyi ayırım için çeşitli programlar, çözücü ve çözücü oranları belirlendikten sonra,
süre optimizasyonu için farklı çözücü programları denendi:
51
Çizelge 4.5 : Minioti ve arkadaşları tarafından geliştirilen dereceli elüsyon programı.
t(dk) %A
(0,13 M Amonyumasetat) pH=7,5
%B
(80:20, metanol / asetonitril)
0 100 0
2 100 0
22 47,5 52,5
37,6 0 100
40 0 100
41 100 0
43 100 0
ġekil 4.16 : Minioti ve çalışma arkadaşlarının geliştiridiği dereceli elüsyon
programına göre elde edilen kromatogram ( 1: tartrazin; 2: indigo; 3:
sunset yellow; 4: ponsö 4R; 5: eritrosin).
Yukarıda kullanılan elüsyon programından, asetonitril mobil faz B‟den çıkarılarak
kromatogram alındı (Çizelge: 4.6, Şekil:4.17).
1
2
3
4
5
52
Çizelge 4.6 : Mobil fazlar değiştirilerek oluşturulan dereceli elüsyon programı.
t(dk) %A (0,13M
amonyumasetat)
%B
(metanol)
0 100 0
2 100 0
22 47,5 52,5
37,6 0 100
40 0 100
41 100 0
43 100 0
ġekil 4.17 : Çizelge 4.6‟da verilen dereceli elüsyon programı kullanılarak elde edilen
kromatogram( 1: tartrazin; 2: indigo; 3: sunset yellow; 4: ponsö 4R; 5: eritrosin).
Mobil fazdan asetonitril çıkartılarak alınan kromatogramda ayrılmanın uygun şekilde
sağlandığı görüldü (Şekil:4.17). Sürenin kısaltılması ve daha iyi bir ayırım için,
elüsyon programı değiştirilerek denemeler yapıldı (Çizelge: 4.7 - 4.8, Şekil: 4.18 –
4.19)
2 1 3
2 4
2
5
2
53
Çizelge 4.7 : Süre optimizasyonu için oluşturulan dereceli elüsyon programı.
t(dk) %A (0,13 M
amonyumasetat)
%B (metanol)
0 100 0
2 100 0
22 47,5 52,5
33 0 100
35 0 100
36 100 0
38 100 0
ġekil 4.18 : Çizelge 4.7‟de verilen dereceli elüsyon programı kullanılarak elde edilen
kromatogram( 1: tartrazin; 2: indigo; 3: sunset yellow; 4: ponsö 4R; 5:
eritrosin).
Optimize edilen yeni yöntem ile ilgili olarak (yeni çözücüler ve 1 mL/ dakika akış
hızı) dereceli elüsyon programı Çizelge 4.8‟de görüldüğü gibi belirlendi. Şekil
4.19‟da çeşitli renklendirici standartlarını içeren sentetik karışıma ait kromatogram
ve 3 boyutlu zaman,pik alanı, dalgaboyu grafiği verilmektedir.
1 2
3 4
5
54
Çizelge 4.8 : Süre optimizasyonu ve piklerin belirginliğini arttırmak için oluşturulan
dereceli elüsyon programı.
t(dk) %A
(0,13 M amonyumasetat)
%B (metanol)
0 100 0
2 100 0
20 45 55
30 0 100
32 0 100
33 100 0
35 100 0
ġekil 4.19 : Çeşitli sentetik renklendirici standartlarını içeren sentetik karışıma ait
kromatogram. (1: tartrazin, 2: indigo, 3: sunset yellow, 4: ponsö 4R, 5:
eritrosin).
Geliştirilen yöntem ile validasyon çalışması yapılarak pik alanları ile derişim
arasında çizilen eğrilerin doğru denklemleri, renklendiricilerin maksimum
absorpsiyon dalgaboyları, alıkonma süreleri ve regresyon katsayıları tayin ve
gözlenebilme sınırları Çizelge 4.9‟da verilmektedir.
1
3
2
4
5
55
Çizelge 4.9 : Sentetik renklendiricilerin HPLC yöntemi ile elde edilen alıkonma süreleri, lineer kalibrasyon denklemleri, lineer çalışma
aralıkları, gözlenebilme(LOD) ve tayin sınırı (LOQ) değerleri (Akış hızı: 1mL/ dakika, λ = 485 nm, N=5).
Renklendirici
Adı max
(nm)
tR(dak) Lineer çalışma aralığı
(M)
Kalibrasyon Denklemi
A= mC+n
(A: Pik alanı)
R2 LOD
(M)
LOQ
(M)
Ponsö 4R 508 17,43
0,05
8,27 10-6
- 8,27 10-5
A= (8,0 ± 0,69)×1010
C + (1,07
± 2,50) 105
0,9935 7,56 10-6
25,21 10-6
Tartrazin 427 14,58
0,03
9,20 10-6
- 9,20 10-5
A= (2,06 ± 0,16) × 1011
C +
(1,11 ± 128,5) 105
0,9997 2,02 10-6
6,74 10-6
Eritrosin 528 27,39
0,03
5,68 10-6
- 5,68 10-5
A= (3,39 ± 0,05) 1011
C - (1,06
± 1,17) 105
0,9998 8,64 10-7
28,89 10-7
Sunset
Yellow
482 16,41
0,04
1,11 10-5
- 1,11 10-3
A= (6,60 ± 0,61) 1010
C +
(1,25 ± 2,94) 105
0,9995 1,06 10-6
3,55 10-6
Indigo
Karmin
608 13,53
0,03
1,91 10-6
- 1,91 10-5
A= (2,12 ± 0,18) × 1010
C +
(7,02 ± 17,02) × 103
0,9994 1,47 10-6
4,87 10-6
56
4.2.1.1 HPLC-PDA yönteminin toz içecek örneklerine uygulanması
HPLC-PDA tekniği ile sentetik renklendiricilerin ayırımı için kullanılan dereceli
elüsyon programı ile kuşburnu ve portakal toz içecek örnekleri analiz edildi (Şekil:
4.20 – 4.21). Alınan kromatogramlarda kuşburnu içeceğinde ponsö 4R ve sunset
yellow, portakal içeceğinde ise tartrazin ve ponsö 4R renklendiricilerinin bulunduğu
tespit edildi.
ġekil 4.20 : Kuşburnu içecek tozuna ait gözlemlenen kromatogram (1: sunset
yelow, 2: ponsö 4R; λ = 485 nm).
ġekil 4.21: Portakal içecek tozuna ait gözlemlenen kromatogram. (1: tartrazin, 2:
ponsö 4R; λ = 485 nm).
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
Minutes
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
AU
0.00
0.05
0.10
Minutes
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
1
2
1
2
57
Çizelge 4.10 : Kuşburnu ve portakal aromalı toz içeceklerin sentetik renklendirici
miktarlarının geliştirien HPLC yöntemiyle analiz sonuçları (N=5).
Renklendirici Adı Portakal Ġçecek Tozu
(g/100g içecek tozu)
KuĢburnu Ġçecek Tozu
(g/100g içecek tozu)
Ponsö 4R
0,610,02 0,290,03
Tartrazin 0,070,01 -
Eritrosin - -
Sunset Yellow - 0,240,01
Indigo Karmin - -
Sentetik renklendiricilere uygulanan HPLC-PDA yönteminin geri kazanımının
belirlenmesi için bölüm 3.4‟de verildiği gibi hazırlanan portakal içecek tozu
çözeltisine tartrazin (0,93 10-6
M ve 1,85 10-6
M) ve kuşburnu içecek tozu
çözeltisine ponsö 4R (1,13 10-6
ve 2,26 10-6
M) olacak şekilde renklendirici
katkıları yapıldı. Katkı yapılan çözeltilere HPLC-PDA yöntemi uygulandı ve
sonuçlar Çizelge 4.11‟de verildi.
Çizelge 4.11: HPLC-PDA yönteminin geri kazanımı.
Ġçecek
Tozlarına
Renklendirici
Katkısı
Renklendirici
içeriği
(M)
Eklenen
DeriĢim
(M)
Beklenen
DeriĢim
(M)
Bulunan
DeriĢim
(M)
Geri
Kazanım
(%)
Portakal İçecek
Tozuna
Tartrazin
Katkısı
Portakal içecek
tozunda bulunan
tartrazin (M)
1,68 10-6
0,93 10-6
2,61 10-6
2,74 10-6
104,9
1,85 10-6
3,53 10-6
3,71 10-6
100,5
Kuşburnu
İçecek Tozuna
Ponsö 4R
Katkısı
Kuşburnu içecek
tozunda bulunan
ponsö 4R (M)
9,59 10-6
1,13 10-6
10,72 10-6
10,83 10-6
101,1
2,26 10-6
11,85 10-6
12,26 10-6
103,5
58
4.2.2 Kolon sonrası türevlendirme yöntemleri
Kolon sonrası türevlendirme tekniği kullanılarak yapılan çalışmalarda ilk olarak hat-
üstü HPLC-CUPRAC yöntemi renklendirici standartlarına ve gerçek örneklere
uygulandı. İlk defa tez kapsamında geliştirilen hat-üstü HPLC-CERAC yönteminde
ise öncelikle akış hızı ve reaktif konsantrasyonu gibi parametrelerin optimizasyonu
gerçekleştirildi.
4.2.2.1 Hat-üstü HPLC- CUPRAC yöntemi
0,13 M amonyum asetat çözeltisi (A), ve metanol (B) ikili çözücü sisteminden oluşan
hareketli fazın dereceli elüsyonu ile sentetik renklendiriciler ayrıldı. Dereceli elüsyon
programında 485 nm‟e ayarlanan dalgaboyu hat-üstü CUPRAC yöntemi için 450
nm‟e ayarlandı. Renklendirici standartlarına ait kromatogramda pozitif alan 485
nm‟deki absorbsiyonu ifade ederken, negatif alan 450 nm‟de elde edilen Cu(I)-Nc
kelatının absorbsiyonunu ifade etmektedir (Şekil 4.22). Benzer şekilde toz
içeceklerde bulunan sentetik renklendiricilerin belirlendiği HPLC elüsyon programı
uygulanarak 485 nm (pozitif değerler) ve 450 nm (negatif değerler) dalgaboyundaki
absorbsiyonlar elde edildi. Hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile elde edilen verilere
göre, sentetik renklendirici bileşiklerin derişimi ile negatif pik alanları arasında
kalibrasyon eğrileri çizilerek denklemleri hesaplandı. Bu kalibrasyon denklemleri
kolon sonrası CUPRAC reaktifiyle türevlendirilen ve her bir bileşenle reaktifin
vermiş olduğu reaksiyon ürünü Cu(I)-Nc kelatının 450 nm‟de belirlenmesiyle elde
edildi (Çizelge 4.12).
59
Çizelge 4.12 : Sentetik renklendiricilere ait hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile elde edilen alıkonma süreleri, kalibrasyon denklemleri, linner
aralık, regresyon katsayıları, gözlenebilme sınırı (LOD) ve tayin sınırı (LOQ) değerleri. (Akış hızı: 1mL/ dakika, λ = 450 nm, N=5).
Renklendirici
Adı
tR(dak) Kalibrasyon Denklemi
A=mC(M)+n
R2
(Lmol-1
cm-1
)
Lineer ÇalıĢma
Aralığı
( × 10-6
M)
LOD
(M)
LOQ
(M)
Tartrazin 12,81
0,15
A= (7,27 ± 1,31) × 1011
C
– (1,51 ± 2,49) × 105
0,9937 7,27 × 1011
0,46 – 3,71 4,17 × 10-7
13,90 × 10-5
Sunset
Yellow 17,17
0,08
A= (6,88 ± 0,85) × 1010
C
– (9,92 ± 18,88) ×
104
0,9959 6,88 × 1010
5,70 – 41,20 3,72 × 10-6
12,40 × 10-6
Eritrosin 27,39
0,03
A= (1,25 ± 0,27) × 1011
C
– (1,14 ± 2,73) × 104
0,9990 1,25 × 1011
0,26 – 2,10 0,27 × 10-7
0,90 × 10-7
İndigo
Karmin 14,34
0,03
A= (7,71 ± 2,89) × 1010
C
– (4,73 ± 10,68) ×
105
0,9953 7,71 × 1010
8,95 – 71,60 1,39 × 10-6
2,33 × 10-6
Ponsö 4R 17,43
0,05
A= (8,19 ± 2,08) × 1010
C
– (3,97 ± 4,84) × 105
0,9978 8,19 × 1010
5,65 – 45,20 3,00 × 10-6
10,00 × 10-6
60
Şekil 4.22‟de çeşitli sentetik renklendirici standartlarını içeren karışıma ait HPLC-
CUPRAC post-kolon tekniğiyle elde edilmiş kromatogram verilmektedir. Karışımda
bulunan standart renklendirici konsantrasyonları; tartrazin için 9,35 × 10-7
, sunset
yellow için 11,05 × 10-7
, eritrosin için 5,68 × 10-7
, indigo için 19,04 × 10-7
, ponsö 4R
için 8,27 × 10-7
M‟dır.
ġekil 4.22 : Hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile analiz edilen sentetik
renklendirici karışımına ait 485 nm ve 450 nm de elde edilen kromatogram
(1: tartrazin, 2: indigo, 3: sunset yellow, 4: ponsö 4R, 5: eritrosin).
4.2.2.1.1 Hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminin toz içecek örneklerine
uygulanması
Kuşburnu aromalı toz içecek örneğinde bulunan sentetik renklendiricilerin analizi,
geliştirilen dereceli elüsyon programı ile HPLC-PDA ve hat-üstü HPLC-CUPRAC
teknikleri kullanılarak, yapıldı. Bu tekniklerle, kuşburnu aromalı toz içecek örneğine
ait 485 ve 450 nm‟de gözlemlenen kromatogramlar görülmektedir (Şekil 4.23).
1
2
3 4 5
61
ġekil 4.23 : Kuşburnu içecek tozu örneğine ait 485 nm ve 450 nmde gözlemlenen
kromatogram (1: sunset yellow, 2: Ponsö 4R).
Diğer gerçek örnek olarak seçilen portakal aromalı toz içecek örneğinde bulunan
sentetik renklendiricilerin analizi, geliştirilen dereceli elüsyon programı ile HPLC-
PDA ve hat-üstü HPLC-CUPRAC teknikleri kullanılarak, yapıldı. Bu tekniklerle,
portakal aromalı toz içecek örneğine ait 485 ve 450 nm‟de gözlemlenen
kromatogramlar görülmektedir (Şekil 4.24).
ġekil 4.24 : Portakal içecek tozu örneğine ait 485 nm ve 450 nmde gözlemlenen
kromatogram (1: tartrazin, 2: Ponsö 4R).
1 2
62
Çizelge 4.13 : Kuşburnu ve portakal aromalı toz içeceklerin sentetik renklendirici
miktarlarının geliştirien hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemiyle analiz
sonuçları (N=5).
Renklendirici Adı Portakal Ġçecek Tozu
(g/100g içecek tozu)
KuĢburnu Ġçecek Tozu
(g/100g içecek tozu)
Ponsö 4R 0,450,03 0,280,04
Tartrazin 0,040,01 -
Eritrosin - -
Sunset Yellow - 0,220,01
Indigo Karmin - -
Hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminin geri kazanımının belirlenmesi için portakal
içecek tozundan hazırlanan çözeltiler üzerine tartrazin, kuşburnu içecek tozundan
hazırlanan çözelti üzerine ponsö 4R renklendirici katkıları yapıldı. Katkısı yapılan
çözeltilerin analizi hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile yapıldı. Sonuçlar Çizelge
4.14‟de verilmektedir.
Çizelge 4.14 : Hat-üstü HPLC-CUPRAC tekrarlanabilirliği ve geri kazanımı.
Ġçecek
Tozlarına
Renklendirici
Katkısı
Renklendirici
içeriği
(M)
Eklenen
DeriĢim
(M)
Beklenen
DeriĢim
(M)
Bulunan
DeriĢim
(M)
Geri
Kazanım
(%)
Portakal İçecek
Tozuna
Tartrazin
Katkısı
Portakal içecek
tozunda
bulunan
tartrazin (M)
1,02 10-6
0,93 10-6
1,95 10-6
2,24 10-6
114,8
1,85 10-6
2,87 10-6
3,00 10-6
104,5
Kuşburnu
İçecek Tozuna
Ponsö 4R
Katkısı
Kuşburnu
içecek tozunda
bulunan ponsö
4R (M)
9,77 10-6
1,13 10-6
10,90 10-6
10,12 10-6
92,80
2,26 10-6
12,03 10-6
10,73 10-6
90,12
63
4.2.2.2 Hat-üstü HPLC- CERAC yöntemi
4.2.2.2.1 AkıĢ hızının optimizasyonu
3,57 × 10-6
M ponsö 4R çözeltisi kullanılarak hat-üstü HPLC-CERAC sisteminde
CERAC reaktifinin akış hızı optimize edildi. Öncelikle reaktif bulunan kabın ağzı ve
yüzeyi ışık ve hava almayacak şekilde sarıldı. 0,2 – 0,8 mL/ dakika hızlarında
CERAC reaktifi pompalanarak sentetik renklendiricilerin ayırımı için kullanılan
elüsyon programı uygulandı ve her bir akış hızı için 320 nm‟de Ce(IV) iyonuna ait
kromatogramlar elde edildi. Sabit ponsö 4R derişimine karşılık akış hızları
değiştirilerek sinyal/ gürültü (S/N) oranları HITACHI yazılımı kullanılarak otomatik
olarak hesaplandı. Akış hızları ile S/N değerleri arasında grafik çizildi.
ġekil 4.25 : Farklı akış hızlarında CERAC reaktifine karşı Ponsö 4R çözeltisinin
sinyal/gürültü (S/N) oranları.
Şekil 4.25‟te görüldüğü gibi hat-üstü HPLC-CERAC yönteminde kullanılan
türevlendirme reaktifi için uygun akış hızı 0,5 mL/ dakika olarak belirlendi.
4.2.2.2.2 CERAC reaktifinin deriĢiminin optimizasyonu
3,57 × 10-6
M ponsö 4R çözeltisi kullanılarak hat-üstü HPLC-CERAC sisteminde
CERAC reaktifinin derişimi optimize edildi. 1,0 10-3
M Ce(IV)sülfat / 0,5 M
Na2SO4 1:7 (v/v) ve 2,0 10-3
M Ce(IV)sülfat /1,0 M Na2SO4 1:7 (v/v) oranları
kullanılarak 0,5 mL/ dakika akış hızında CERAC reaktifi kolon-sonrası reaksiyon
modülüne pompalandı. 320 nm‟ de Ce(IV) iyonuna ait kromatogramlar elde edildi.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
S/N
AkıĢ hızı (mL/ dakika)
64
Bu derişimlerdeki Ce(IV) pikinin S/N değerleri, HITACHI yazılımı kullanılarak
otomatik olarak hesaplandı.
Çizelge 4.15‟de farklı derişim oranları kullanılarak 0,5 mL/ dakika akış hızında ve
320 nm‟de dedekte edilen Ce(IV) pikinin S/N değerleri görülmektedir. Bu verilere
göre yüksek S/N değerine sahip CERAC reaktifi derişim oranı 2,0 10-3
M
Ce(IV)sülfat /1,0 M Na2SO4 1:7 (v/v) CERAC reaktif derişimi olarak belirlendi.
Çizelge 4.15 : Farklı CERAC reaktifi derişim oranlarında elde edilen Ce(IV) pikinin
sinyal/gürültü oranları.
CERAC reaktifi deriĢimi Sinyal/gürültü oranı
1,010-3
M Ce(IV)sülfat /0,5M Na2SO
4 1:7 (v/v)
6,62
2,010-3
M Ce(IV)sülfat /1,0M Na2SO
4 1:7 (v/v) 8,73
4.2.2.2.3 Hat-üstü HPLC-CERAC yönteminin Ponsö 4R’e uygulanması
0,13 M amonyum asetat çözeltisi (A), ve metanol (B) ikili çözücü sisteminden oluşan
hareketli fazın dereceli elüsyonu ponsö 4R tayini için kullanıldı. Dereceli elüsyon
programında 485 nm‟e ayarlanan dalgaboyu hat-üstü CERAC yöntemi için 320 nm‟e
ayarlanarak, sentetik renklendiricilerin Ce(IV) ile reaksiyonu sonucu Ce(IV)
absorbansındaki azalış takip edildi. Ponsö 4R standartına ait kromatogramda pozitif
alan 485 nm‟deki absorbsiyonu ifade ederken, negatif alan 320 nm‟de elde edilen
Ce(IV)‟ün absorbsiyonunu ifade etmektedir (Şekil 4.26).
ġekil 4.26 : Hat-üstü HPLC-CERAC yöntemi ile elde edilen ponsö 4R standart
çözeltisine ait kromatogram.
65
4.3 Tez kapsamında geliĢtirilen yöntemlerle toz içecek örneklerinin analizi
Bölüm 3.4‟te verildiği gibi hazırlanan portakal ve kuşburnu aromalı toz içecek
örnekleri spektrofotometrik CERAC yöntemi, spektrofotometrik CUPRAC yöntemi,
HPLC yöntemi ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi ile analiz edildi.
Spektrofotometrik CERAC ve CUPRAC yöntemleri için hazırlanan toz içecek
çözeltilerinden 0,2 mL alınarak ayrı ayrı CERAC ve CUPRAC yöntemi uygulandı.
Denemeler 3‟er kez tekrarlanıp toz içecek örneklerinde toplam renklendirici
içerikleri (TRİ) Eşitlik (3.1) kullanılarak hesaplandı.
HPLC analizi için, hazırlanan toz içecek örnekleri filtreden geçirilerek tez
kapsamında geliştirilen dereceli elüsyon programı uygulandı. Örneklerdeki bileşenler
belirlendikten (Şekil 4.20 – 4.21) sonra her birinin derişimleri kalibrasyon
denklemleri kullanılarak hesaplandı. Çizelge 4.17 toz içecek örneklerinin içerdiği
sentetik renklendiricilerin HPLC analizi ile elde edilen sonuçlarını göstermektedir.
Toz içecek örneklerinin HPLC (CUPRAC hesaplamalı) ve HPLC (CERAC
hesaplamalı) yöntemi ile toplam renklendirici içerikleri (TRİ) CERAC ve CUPRAC
yöntemlerine göre elde edilen ponsö 4R eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ)
değerleri kullanılarak Eşitlik (3.2)‟den hesaplandı.
Hat-üstü HPLC-CUPRAC analizi için, hazırlanan toz içecek örneklerine geliştirilen
dereceli elüsyon programı uygulandıktan sonra bileşenler belirlendikten sonra (Şekil
4.22 – 4.23) toplam negatif pik alanları hesaplandı ve ponsö 4R eşdeğer renklendirici
içeriği (PERİ) değerleri kullanılarak Eşitlik (3.2)‟den hesaplandı. Bulgular %95
güvenilirlik düzeyine göre belirli bir aralıkta verildi. HPLC ve hat-üstü HPLC-
CUPRAC yöntem bulguları ANOVA testi uygulanarak karşılaştırıldı.
66
Çizelge 4.16 : Sentetik renklendiricilerin CERAC ve CUPRAC yöntemlerine göre
hesaplanan ponsö 4R eşdeğer renklendirici içerikleri (PERİ).
Renklendirici Adı PERĠ CERAC PERĠ CUPRAC
Ponsö 4R 1 1
Sunset Yellow 0,85 0,67
Indigo 0,38 0,46
Tartrazin 0,71 0,60
Eritrosin 1,94 2,32
Sentetik renklendirici miktarlarının istatiksel karĢılaĢtırılması
(ANOVA: Yinelemesiz çift etken)
P= 0,05; Fdeneysel = 0,12; Fkritik= 7,71 Fdeneysel < Fkritik
Çizelge 4.17 : HPLC ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemlerine göre toz içecek
örneklerinin renklendirici içerikleri (N=5).
Renklendirici
Adı
Portakal aromalı içecek tozu
(g/100g içecek tozu)
KuĢburnu aromalı içecek tozu
(g/100g içecek tozu)
HPLC-PDA
(485 nm)
Hat-üstü
HPLC-
CUPRAC
(450 nm)
HPLC-PDA
(485 nm)
Hat-üstü
HPLC-
CUPRAC
(450 nm)
Ponsö 4R 0,610,02 0,450,03 0,290,03 0,280,04
Tartrazin 0,070,01 0,040,01 - -
Eritrosin - - - -
Sunset yellow - - 0,240,02 0,220,01
Indigo - - - -
67
Çizelge 4.18 : Spektrofotometrik CERAC, spektrofotometrik CUPRAC, HPLC
(CERAC hesaplamalı), HPLC (CUPRAC hesaplamalı), hat-üstü HPLC-
CUPRAC yöntemlerine göre toz içecek örneklerinin ponsö 4R eşdeğer
toplam renklendirici içerikleri (TRİ).
Örnek Adı CERAC
g Ponsö 4R/
100 g
CUPRAC
g Ponsö 4R/
100 g
HPLC
(CERAC
hesaplamalı)
g Ponsö 4R/ 100 g
HPLC
(CUPRAC
hesaplmalı)
g Ponsö 4R/
100 g
Hat-üstü
HPLC-
CUPRAC
g Ponsö 4R/
100 g
Portakal
aromalı
içecek tozu
1,070,02 0,850,01 0,660,01 0,650,01 0,760,02
Kuşburnu
aromalı
içecek tozu
0,990,04 0,680,02 0,580,01 0,510,01 0,490,01
Sentetik renklendirici
miktarlarının
istatiksel
karĢılaĢtırılması
(ANOVA: Yinelemesiz
çift etken)
CERAC ve CUPRAC P=0,05;
Fdeneysel = 34,68;
Fkritik= 161,45;
Fdeneysel < Fkritik
HPLC (CERAC
hesaplamalı), HPLC
(CUPRAC hesaplamalı) ve
Hat-üstü HPLC-CUPRAC
P= 0,05;
Fdeneysel = 0,26;
Fkritik= 18,51;
Fdeneysel < Fkritik
CUPRAC, HPLC
(CUPRAC hesaplamalı) ve
Hat-üstü HPLC-CUPRAC
P= 0,05;
Fdeneysel = 8,04;
Fkritik= 18,51;
Fdeneysel < Fkritik
68
69
5. SONUÇLAR
Bu tez çalışmasında, gıda endüstrisinde çok çeşitli nedenlerle kullanımlarına
gereksinim duyulan sentetik renklendiricilerin tayini için kolay, ucuz, uygulanabilir
yöntemlerin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda, spektrofotometrik
ve kromatografik yöntemler önerilmiştir. Literatürde antioksidan tayini için
kullanılan CERAC ve CUPRAC spektrofotometrik yöntemlerin reaksiyon
mekanizmaları ve çalışma prensipleri ilk defa sentetik renklendiricilere bu tez
kapsamında uygulanmıştır. Toplam renklendirici içeriği geliştirilen “ponsö 4R
eşdeğer renklendirici içeriği” (PERİ) katsayı değerleri kullanılarak belirlenmiştir.
Kromatografik yöntemler ise HPLC-PDA ve hat-üstü türevlendirme yöntemleri
olmak üzere iki başlık altında incelenmiştir. HPLC-PDA yönteminde sentetik
renklendiricilerin ayırımı için kademeli elüsyon programı geliştirilmiş ve literatüre
kazandırılmıştır. Bu yöntemle ayırımı sağlanan sentetik renklendiricilerin kendi
maksimum absorpsiyon dalgaboylarında tayinleri gerçekleştirilmiştir. Hat-üstü
HPLC-CUPRAC yöntemi ilk defa Esin Çelik ve çalışma arkadaşları tarafından
antioksidan moleküllerin tayini için önerilmiş ve bu çalışma kapsamında ilk defa
sentetik renklendiricilerin tayini için doğrudan uygulanmıştır. Hat-üstü HPLC-
CERAC yöntemi ise ilk defa çalışma kapsamında geliştirilmiş ve optimize edilmiştir.
HPLC yöntemi ile bir antioksidan tayin yöntemi olan CERAC yönteminin çalışma
prensibi birleştirilmiştir.
5.1 Spektrofotometrik Toplam Antioksidan Kapasite Tayin Yöntemlerinin
Renklendirici Tayinine Uygulanması
Gıda endüstrisinde oldukça fazla kullanılan gıda renklendiricilerinin kolorimetrik
olarak tayin edilmesi zordur. Bu nedenle, renklendiricilerin yükseltgenme-
indirgenme özelliklerinden faydalınılarak daha seçici ve doğru yöntemler
kullanılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, yükseltgenme-indirgenme tepkimelerinin
temel alındığı toplam antioksidan tayin yöntemleri olan CERAC ve CUPRAC
yöntemleri, gıdalarda toplam renklendirici tayini için kullanılmıştır.
70
Ce(IV) sülfatın kromojenik yükseltgeme ajanı olarak kullanıldığı CERAC yöntemi
ile renklendiriciler UV-görünür bölge spektrofotometrisi kullanılarak Ce(IV)‟ün
maksimum absorpsiyon dalgaboyu olan 320 nm‟de tayin edilmiştir. Ce(IV)/Ce(III)
redoks çiftinin standart potansiyelinin azaltılması için Na2SO4‟ın kullanıldığı
modifiye CERAC yöntemi ile (Ozyurt ve diğ, 2007; 2010), gıdalarda
renklendiricilerle birlikte kullanılan sitrik asit ve şeker gibi moleküllerin yanında
renklendiricilerin tayini gerçekleştirilmiştir. CERAC yöntemi kullanılarak, beş farklı
sentetik renklendirici bileşiklerine (sunset yellow, ponsö 4R, eritrosin, tartrazin,
indigo karmin) ait kalibrasyon grafikleri çizilmiş ve her bileşik için lineer
kalibrasyon denklemleri, korelasyon katsayıları (r), molar absorpsiyon katsayıları (),
lineer çalışma aralıkları, gözlenebilme (LOD) ve tayin sınırları (LOQ) hesaplanmıştır
(Çizelge 4.1). Ayrıca, toplam renklendirici içeriğinin belirlenmesi ve yöntemlerin
kıyaslanması için geliştirilen “ponsö eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ) katsayısı
tanımlanmıştır.
Toplamsallık ilkesini belirlemek amacıyla kullanılan bir yöntem olan standart katkı
yönteminde, seçilen çözelti ortamında tek başına sunset yellow ve ponsö 4R‟nin ve
toz içeceklere ilave edilen sunset yellow ve ponsö 4R‟nin kalıbrasyon doğruları
modifiye CERAC yöntemi ile çizilmiştir. Elde edilen doğruların eğimleri gözönünde
bulundurularak, renklendiricilerin Beer Kanunun‟ndan kimyasal sapmalara yol
açacak şekilde etkileşime girmediği söylenebilir (Şekil 4.7-Şekil 4.8). Son olarak
modifiye CERAC yönteminin tekrarlanabilirliği ve geri kazanımını belirlemek
amacıyla portaka içecek tozu ve kuşburnu içecek tozu çözeltilerine sırasıyla sunset
yellow ve ponsö 4R katkıları yapılmış geri kazanım yüzdelerinin uygun olması
nedeniyle yöntemin toz içecek örneklerinde toplam renklendirici içeriğinin
belirlenmesi için kullanılabileceği görülmüştür (Çizelge 4.2).
Kromojenik bir oksidasyon aracı olan Cu(II)-Nc (bakır(II)-neokuproin (2,9-dimetil-
1,10-fenantrolin) reaktifinin sentetik renklendiriciler tarafından indirgenmesi sonucu
oluşan Cu(I)-Nc (bakır(I)-neokuproin) kelatının 450 nm‟de absorbans ölçümüne
dayanan CUPRAC yöntemi ile toplam renklendirici miktarı tayin edilmiştir. Yöntem,
beş farklı sentetik renklendirici bileşiklerine (sunset yellow, ponsö 4R, eritrosin,
tartrazin, indigo karmin) uygulanarak her bir renklendiriciye ait kalibrasyon
grafikleri çizilmiş ve her bileşik için lineer kalibrasyon denklemleri, korelasyon
katsayıları (r), molar absorpsiyon katsayıları (), lineer çalışma aralıkları,
71
gözlenebilme (LOD) ve tayin sınırları (LOQ) hesaplanmıştır (Çizelge 4.3). Ayrıca,
toplam renklendirici içeriğinin belirlenmesi ve yöntemlerin kıyaslanması için
geliştirilen “ponsö eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ) katsayısı tanımlanmıştır
(Çizelge 4.3).
Standart katkı yöntemi ile toplamsallığı belirlemek için seçilen çözelti ortamında tek
başına tartrazin ve ponsö 4R‟nin ve toz içeceklere ilave edilen tartrazin ve ponsö
4R‟nin kalibrasyon doğruları CUPRAC yöntemi ile çizilmiştir (Şekil 4.14-Şekil
4.15). Elde edilen doğruların eğimleri gözönünde bulundurularak, renklendiricilerin
Beer Kanunun‟ndan kimyasal sapmalara yol açacak şekilde etkileşime girmediği
söylenebilir. Katkı çalışması sonucu hesaplanan geri kazanım yüzdeleri ile yöntemin
sentetik renklendiriciler için validasyonu gerçekleştirilmiştir (Çizelge 4.4) .
Spektrofotometrik yöntemler arasındaki korelasyonu incelemek amacıyla her sentetik
renklendirici standartı için ayrı ayrı hesaplanan molar absorpsiyon katsayıları Şekil
5.1‟ de görülmektedir.
ġekil 5.1 : Sentetik renklendiriciler için hesaplanan molar absorpsiyon katsayıları
kullanılarak çizilen, CERAC ve CUPRAC yöntemleri arasındaki
korelasyonu gösteren şekil (r= 0,9557).
Modifiye CERAC ve CUPRAC yöntemleri ile elde edilen molar absorpsiyon
katsayıları korelasyonun yüksek ilişkili olduğu (r=0,9557) gözlemlenmiştir. Sonuç
olarak toplam antioksidan kapasite tayin yöntemleri olan modifiye CERAC ve
CUPRAC yöntemleri, toz içecek örneklerinin toplam renklendirici içeriklerinin
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
CERAC
72
belirlenmesi amacıyla başarıyla uygulanmıştır. Her laboratuvarda kolaylıkla
bulunabilen UV-görünür bölge spektrofotmetresi kullanılarak gıda örneklerinde
toplam renklendici analizi pahalı çözelti ve laboratuvar ekipmanına gerek
duyulmaksızın sağlanmıştır.
5.2 Kromatografik Yöntemler
Tez çalışması kapsamında sentetik renklendiricilerin tayini için kromatografik
yöntemler kullanıldı. Sentetik renklendiricilerin ayırımı için ters faz C18 kolonun ve
PDA (fotodiyot) dedektörün kullanıldığı HPLC yöntemi uygulandı. Literatürde
bulunan HPLC yöntemlerden farklı olarak sentetik renklendiricilerin analizi için
sıklıkla kullanılan asetonitril kullanılmayarak çevre dostu ve maliyeti düşük bir
dereceli elüsyon programı geliştirilmiştir.
Çalışmanın üçüncü aşamasında, tez kapsamında geliştirlen HPLC-PDA tekniği ile
in-vitro antioksidan kapasite tayin yöntemleri birleştirilmiştir. Sentetik
renklendiricilerin ayırımı için geliştirilen dereceli elüsyon programı kullanılmıştır.
HPLC ile entegre edilmiş kolon sonrası dedeksiyonlu hat-üstü HPLC-CUPRAC
yöntemi olarak adlandırılan ve antioksidan bileşiklerin tayini için kullanılan (Çelik
ve diğ, 2010) teknik ilk defa sentetik renklendiricilerin analizi için adapte edilmiştir.
Hat-üstü CUPRAC tekniğinde, analitik kolonda ayrılan renklendiriciler kolon sonrası
bir pompa ile sisteme eklenen CUPRAC reaktifi (Cu(II)-Nc kompleksi) ile
reaksiyona girmekte ve bu redoks tepkimesi sonucu renklendiricilere eşdeğer oranda
Cu(I)-Nc kelatı oluşmaktadır. Kromatografik ayırma ile sentetik renklendirici
tayininin eş zamanlı gerçekleştiği bu hat-üstü sistemde elde edilen
kromatogramlardan pozitif yönlü olanlar ilgili bileşenlerin 485 nm‟deki
absorbsiyonunu, negatif yönlü olanlar ise 450 nm‟de bileşenlere eşdeğer oranda
oluşan Cu(I)-Nc kelatının absorbsiyonunu göstermektedir. Sentetik renklendiricilerin
tayini için kullanılan hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminde akış hızı ve CUPRAC
reaktifi derişimi sırasıyla 0,5 mL/dakika ve 3,33 mM Cu(II) / 2,5 mM Nc / 333 mM
NH4Ac (1:1:1, v/v/v)‟ dır. Geliştirilen HPLC-PDA sistemine ek olarak kolon sonrası
reaksiyon sarmalının eklenmesi bileşenlerin alıkonma sürelerini arttırmıştır. Ancak
Şekil 4.9‟da görüldüğü gibi, daha sade bir kromatogram elde edilmiştir. Aşağıdaki
tabloda HPLC-PDA tekniğine ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemine ait
renklendiricilerin alıkonma süreleri ve gözlenebilme sınırları (LOD)
73
kıyaslanmaktadır (Çizelge 5.1). Tabloda görüldüğü gibi, tayin sınırları hat-üstü
HPLC-CUPRAC yönteminde daha düşük bulunmuştur. Hat-üstü HPLC-CUPRAC
yöntemi ile daha duyarlı sonuçlar elde edildiğini söyleyebiliriz.
Çizelge 5.1 : HPLC-PDA ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemleri ile elde edilen
alıkonma süreleri (dakika) ve gözlenebilme sınırları (LOD).
Renklendirici
Adı
tR (HPLC-
PDA)
tR (hat-üstü
HPLC-
CUPRAC)
LOD (HPLC-
PDA; 485 nm)
LOD (hat-
üstü HPLC-
CUPRAC,
450 nm)
Ponsö 4R 17,43 0,05 18,16 0,03
7,56 10-6
2,80 10-6
Tartrazin 12,03 0,03 12,81 0,15
2,02 10-6
4,17 10-7
Eritrosin 27,39 0,03 28,27 0,06
8,64 10-7
2,70 10
-8
Sunset Yellow 16,41 0,04
17,17 0,08 1,06 10-6
3,72 10
-7
Indigo 13,53 0,03 14,34 0,03 1,42 10-6
1,39 10-6
Hat-üstü HPLC-CERAC yöntemi ise ilk defa tez kapsamında geliştirilmiş ve sentetik
renklendiricilerden ponsö 4R tayini için uygulanmış bir yöntemdir. Optimizasyon
çalışmalarında, ponsö 4R renklendiricisi temsili olarak seçilerek, akış hızı ve
CERAC reaktif derişimi gibi parametreler araştırılmıştır. Kolon sonrası sistemlerle
ilgili olarak, türevlendirme reaktifinin derişimi azaldıkça gürültü oranının da azaldığı
bilinmektedir. Bu nedenle sinyal/gürültü oranının en yüksek olduğu durumlar
belirlenerek akış hızı 0,5 mL/dakika ve CERAC reaktifi derişimi 2,010-3
M
Ce(IV)sülfat /1,0M Na2SO4 1:7 (v/v) olarak optimize edilmiştir (Şekil 4.10- Çizelge
4.8). Elde edilen kromatogramda pozitif taraf, ponsö 4R standart çözeltisinin HPLC-
PDA yöntemiyle tayin edilmesi sonucu 485 nm de elde edilen piki, negatif taraf ise
kolon sonrası türevlendirme reaksiyonu sonucu Ce(IV)‟ün azalışının görüldüğü 320
74
nm‟de elde edilen piki göstermektedir (Şekil 4.10). Çalışma kapsamında geliştirlen
hat-üstü HPLC-CERAC yöntemi sadece ponsö 4R renklendiricisinin tayini için
uygulanabilirliği gözlemlenmiştir.
5.3 Gerçek Örnek Uygulamaları
CERAC ve CUPRAc yöntemlerini kromatografik yöntemlerle kıyaslayabilmek için
tanımlanan ponsö 4R eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ) değerleri sentetik
renklendiriciler için ayrı ayrı hesaplandı. CERAC ve CUPRAC yöntemlerine göre
bulunan PERİ değerleri sıralaması; PERİeritrosin> PERİsunsetyellow> PERİtartrazin>
PERİindigo şeklindedir. Çizelge 4.16 Eşitlik 3.2 kullanılarak hesaplanan PERİ
değerlerini göastermektedir. Bulunan sonuçlara yinelemesiz çift etkenli ANOVA
testi uygulanarak, %95 güven aralığında sonuçların kesinlikleri arasında anlamlı bir
fark olmadığı (P= 0,05; Fdeneysel = 0,1219; Fkritik= 7,7086 Fdeneysel < Fkritik )
gözlemlenmiştir.
Toz içecek örneklerinde toplam sentetik renklendirici miktarını belirlemek için
CERAC, CUPRAC, HPLC ve hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemleri kullanıldı.
CERAC ve CUPRAC yöntemleriyle örneklerdeki toplam renklendirici içeriği
belirlendiği için, HPLC-PDA yöntemiyle elde edilen sonuçları kıyaslayabilmek
amacıyla, HPLC-PDA yöntemi ile bulunan sonuçlar CERAC hesaplamalı ve
CUPRAC hesaplamalı olarak CERAC ve CUPRAC yöntemlerine göre elde edilen
ponsö 4R eşdeğer renklendirici içeriği (PERİ) değerleri kullanılarak Eşitlik (3.2)‟den
hesaplandı. Hat-üstü HPLC-CUPRAC analizi için, hazırlanan toz içecek örneklerine
geliştirilen dereceli elüsyon programı uygulandıktan sonra bileşenler belirlendikten
sonra (Şekil 4.22 – 4.23) toplam negatif pik alanları hesaplandı ve ponsö 4R eşdeğer
renklendirici içeriği (PERİ) değerleri kullanılarak Eşitlik (3.2)‟den hesaplandı.
Portakal ve kuşburnu toz içecek örneklerinde bulunan toplam sentetik renklendirici
miktarları ponsö eşdeğer olarak Çizelge 4.18‟de verilmiştir. Uygulanan yinelemesiz
çift etkenli ANOVA testi CERAC ve CUPRAC (P=0,05; Fdeneysel = 34,68; Fkritik =
161,45; Fdeneysel < Fkritik); HPLC (CERAC hesaplamalı), HPLC (CUPRAC
hesaplamalı) ve hat-üstü HPLC-CUPRAC (P= 0,05; Fdeneysel = 0,26; Fkritik= 18,51;
Fdeneysel < Fkritik) yöntemlerine uygulandı, %95 güven aralığında sonuçların
kesinlikleri arasında anlamlı bir fark olmadığı Çizelge 4.18‟de görülmektedir.
75
KAYNAKLAR
Altınöz, S., Toptan, S. (2002). Simultaneous determination of indigotin and
ponceau-4R in food samples by using Vierort‟s Method , ratio spectra
first order derivative UV spectrophotometry. Journal of Food
Composition and Analysis, 15, 667-683.
Apak R., Güçlü K., Özyürek M., Karademir S.E. (2004). A novel total antioxidant
capacity index for dietary polyphenols, vitamin C and E, using their
cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine:
CUPRAC Method. Journal of Agric. Food Chem, 52, 7970-7981.
Arnous A., Dimitri P., Kafalas P. (2010). Correlation of pigment and flavonoid
content with antioxidant properties in selected aged regional wines
from Greece. Journal of Food Composition and Analysis,15, 655-665.
Bao J., Cai Y., Sun M., Wang G., Corke H. (2005). Anthocyanins, flavonoids and
free reduced scavenging activity of Chinese properties and stability. J.
Agric. Food Chem, 53, 2327-2332.
Bayne, W. F., East, T., and Dye, D. (1981). High-pressure liquid chromatographic
method with postcolumn, in-line hydrolysis and fluorometric detection
for indomethacin in biological fluids. Pharm. Sei. 70, 458-459.
Bener M., Özyürek M., Güçlü K., Apak M.R. (2010). Polyphenolic Contents Of
Natural Dyes Produced From Industrial Plants Assayed By Hplc And
Novel Spectrophotometric Methods. Industrial crops and products,
32, 499-506.
Benzei, I.F.F., Strain, J.J. (1999). Ferric reducing/ antioxidant power assay: direct
measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified
version for simultaneous measurement of total antioxidant power and
ascorbic acid concentration. Meth. Enzymol, 299, 15-27.
Capitan-Vallvey, L.F.,Valencia, M.C., Nicolas, A. (2002). Flow injection analysis
with on-line solid phase extraction for spectrophotometric
determination of ponceau 4R and its subsidiary unsulfonated dye in
sweets and cosmetic products. Microchimica Acta, 138, 69-76.
Cassidy, R., and Karcher, B. D. (1986). In I. S. Krull, (Eds) Reaction Detection in
Liquid Chromatography (pp 129-194) New York: Marckel Decker.
Culzoni, M.J., Schenone, V., Llamas, N.E. (2009). Fast chromatographic method
for the determination of dyes in beverages by using high performance
liquid chromatography--diode array detection data and second order
algorithms. J. Chromatogr. A 12, (16) 7063–7070.
76
Dossi, N., Toniolo, R., Susmel, S., Pizzariello, A., Bontempelli, G. (2006).
Simultaneous RP-LC determination of additives in soft drinks.
Chromatographia, 63, 557-562.
Du Bose, C.N., Cardello, A.V., and Maller, O.J. (1980). Effects of colorants and
flavorants on identificiation, perceived flavor intensity, and hedonic
quality of fruit flavored beverages and cake. Food Science, 45,1393-
1399.
Engelhardt, H., and Lillig, B. (1986). Optimization of a reaction detector for
analysis at the femtomol level of carbamate insecticides by HPLC.
Chromatographia, 21, 136-142.
Fleming, J., Miguel, J., Econimos, A. (1982). Is cell aging caused by respiration
dependent injury to the mithochondrial genome, Gerontol, 28-44.
Floyd R. ve diğ. (1990). Role of oxygen free radicals in carcinogenesis
nadbrainischemia. FASEB Journal, 4, 2587-2597.
Food Advisory Comitee. (1987). Fd AC/REP/4, HMSO, London.
Gündüz T. (1999) İnstrümental Analiz, (11. bs.) Ankara: Gazi Yayınevi.
Haginaka J, Wakai J. (1985). High-performance liquid chromatographic assay of
ampicillin, amoxicillin and ciclacillin in serum and urine using a pre-
column reaction with 1,2,4-triazole and mercury(II) chloride. Analyst.
110, 11, 1277–1281.
Haginaka J, Wakai J. (1987). Liquid chromatographic determination of amoxicillin
and its metabolites in human urine by postcolumn degradation with
sodium hypochlorite. J Chromatogr, 23, (413), 219–226.
Haginaka, J., Wakai, J. (1988). Liquid chromatographic determination of
penicillins by postcolumn alkaline degradation using a hollow-fiber
membrane reactor. Anal. J. Biochem., 168, 132-140.
Hill, K. M., Hollowell, R. H., and DalCortivo, L. A. (1984). Determination of N-
methylcarbamate pesticides in well water by liquid chromatography
with post-column fluorescence derivatization. Anal. J. Chem. 56,
2465-2468.
Iamanaka B., Nakanoa F., Lemesa D., Ferrantia L. S., Taniwakia M. H. (2014).
Aflatoxin evaluation in ready-to-eat brazil nuts using reversed-phase
liquid chromatography and postcolumn derivatisation. Food Additives
& Contaminants: Part A, 31, (5) , 917–923.
Inoue, K., Yamashita, Y., Yoshimura, Y., Yamada, M., Nakamura, M., Ito, Y.,
Nakazawa, H. (2003). Analysis of safflower yellow in food by liquid
chromatography with photodiode array and electrospray mass
spectrometric detection. Journal of Liquid Chromatography and
Related Technologies, 26, 1207-1217.
Inoue, K., Yoshimura, Y., Nakazawa, H. (2001). Evaluation of the turmeric
(Curcuma Longa L.) based on the flow injection analysis with
ultraviolet and fluorometric detections. Analytical Letters, 34, 1711-
1718.
77
Jansen, G., Flamme, W. (2006). Colored potatoes (Solanum Tuberosum L.) –
anthocyanin content and tuber quality. Genetic resources and crop
evaluation, 53, 1321-1331.
Joseph-Charles, J., Langlois, M., Montagut, M., Boyer, C., Dubost, J.P. (2000).
Simultaneous determination of 2 synthetic dyes erythrosine and sunset
yellow in pharmaceutical syrup by first derivative visibe
spectrophotometry. Analytical Letters, 33, 1567-1575.
Kirschbaum, J., Krause, C., Brückner, H. (2006). Liquid chromatographic
quantification of synthetic food colorants in fish roe and caviar, Eur.
Food. Res. Technol, 222, 572-579.
Kirschbaum, J., Krause, C., Pfalzgraf, S., Brückner, H. (2006). Development and
evaluation of an HPLC-DAD method for determination of synthetic
food colorants, Chromatographia, 57, 115-119.
Kobayashi, S., and Imai, K. (1980). Determination of fluorescent compounds by
high performance liquid chromatography with chemiluminescence
detection, Anal. Chem, 52, 424-427.
Lachemeier, D., Kessler, W. (2008). Multivariete curve resolution of
spectrophotometric data for the determination of artificial food colors,
J. Agric. Food Chem., 56, 5463-5468.
Labrinea, E. P., Georgiou, C. A. (2004). Stopped-flow method for assessment of
pH and timing effect on the ABTS total antioxidant capacity assay,
Anal. Chim. Acta, 526, (1), 63-68.
Li D.Q., Zhao J., Li S.P. (2014). High-performance liquid chromatography coupled
with post-columndual-bioactivity assay for simultaneous screening of
xanthine oxidaseinhibitors and free radical scavengers from complex
mixture, J. Chromatogr. A 1345, 50-56.
Lin, S.M., Lin, B., Hseih, W., Ko, H.J., Liu, C., Chen, L., Chou, Y. (2010),
Structural identification and bioactivities of red-violet pigments
present in basella alba fruits, J. Agric. Food Chem, 58, 10364-10372.
Luchtefeld, R. G. (1985). An HPLC detection system for phenylurea herbicides
using post-column photolysis and chemical derivatisation,
Chromatogr. Sei. 23, 516-520.
Matsukura, S., Inoue, K., and Shibuya, N. (1987) J. Biochem. Nutr. 2, 203-216.
Miles, C. J., and Moye, H. A. (1988). Postcolumn photolysis of pesticides for
fluorometric determination by high-performance liquid
chromatography , Anal. J. Chem. 60, 220-226.
Miller, N. J., Rice-Evans, C., Davies M.J., Gopinathan, V., Milner, A. (1993). A
novel method for measuring antioxidant capacity and its application to
monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin.
Sciences, 84, 407-412.
Miller R., Hotz J. (1993). Conditional choice probabilities and the estimation of
dynamic models. Review of Economic Studies, 60, 497-529.
78
Minioti, K., Sakellariou, C.F., Nikolas, S.T. (2007). Determination of 13 synthetic
food colorants in water-soluble foods. Analytica Chimica Acta 583,
103–110.
Moore S., Stein W. (1951). Chromatography of amino acids on sulfonated
polystyrene resins. J Biol Chem., 192, 2, 663–681.
Ni, Y., Qi, M., Kokot, S. (2001). Simultaneous spectrophotometric determination of
ternary mixture of Tartrazine, Sunset Yellow and Ponceau 4R by H-
point standard addition method. Analytical Letters, 34, 2585-2596.
Ni, Y., Wang, Y., Kokot, S. (2009). Simultaneous kinetic spectrophotometric
analysis of five synthetic food colorants with the aid of chemometrics,
Talanta, 78, 432-441.
Obon J. M., Castellar M. O., Cascales J. A., Fernandez-Lopez J. A. (2005).
Assesment of the TEAC method for determining the antioxidant
capacity of synthetic red food colorants, Food Research International,
38, 843-845.
Official Journal of The Comission of The European Communities. (1994) L237,
37.
Ozyurt D., Demirata B., Apak R. (2007). Determination of total antioxidant
capacity by a new spectrophotometric method based on Ce(IV)
reducing capacity measurement, Talanta, 71, 1155-1165.
Ozyurt D., Demirata B., Apak R. (2010). Modified cerium(IV)-based antioxidant
capacity (CERAC) assay with selectivity over citric acid and simple
sugars, Journal of Food Composition and Analysis, 23, 282-288.
Ou Z., Schmierer D., Radesc T., Larsen L., McDowell A. (2013). Application of
an online post-column derivatization HPLC-DPPH assay to detect
compounds responsible for antioxidant activity in Sonchus oleraceus
L. leaf extracts Royal Pharmaceutical Society. Journal of Pharmacy
and Pharmacology, 65, 271–279.
Özgür, M., Bozdoğan, A., Erçağ, A., Koyuncu, Ġ. (2001). Simultaneous
determination of anthocyanine and drink powders by derivative
spectrophotometry and partial least squares multivariate
spectrophotometric clibration, Monatschefte für Chemie, 132, 669-
673.
Prodanov, M.P., Domınguez, J.A., Blazquez, I., Salinas, M.R., Alonso G.R.
(2006). Some aspects of the quantitative and qualitative assessment of
commercial anthocyanin- rich extracts, Food Chemistry, 90, 585-596.
Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical
cation decolorization assay, Free Radical Biology Medical, 26, 1231-
1237.
Rice-Evans, C., Miller, N. J. (1994). Total antioxidant status in plasma and body
fluids, Meth. Enzymol, 234, 279-293.
Ryvolova, M., Taborsky,P., Vrabel, P., Krasensky, V., Preisler. (2007).
Sensitive determination of erythrosine and other red food colorants
79
using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence
detection. J. of Chromatography A, 1141, 206-211.
Serdar, M., Knezevic, Z., ve diğ. (2009). Determination of artificial sweeteners in
beverages and special nutritional products using high performance
liquid chromatography. Chromatographia, 70, 1519-1521.
S. E. Celik, M. Ozyurek, K. Guclu and R. Apak. (2010). Determination of
antioxidants by a novel on-line HPLC-cupric reducing antioxidant
capacity (CUPRAC) assay with post-column detection. Anal. Chim.
Acta, 674, 79–88.
Silva, M.S., Garcia, M.B.Q., Lima, L.F.C., Barrado, E. (2007). Voltammetric
determination of food colorants using a polyallyamine modified
tubular electrode in a multicommutated flow system. Talanta, 72, 282-
288.
Swedish Food Regulations. (1985) Food Additives, SLVFS.
Teow C., Truong V.D., Mc Feeters R.F. (2007). Antioxidant activities, phenolic
and Β-carotene contents of sweet potato genotypes with varying flesh
colours. Food Chemistry, 103, 829-838.
Vidotti, E.C., Costa, W.F., Oliviera, C. (2006). Development of a green
chromatographic method for determination of colorants in food
samples, Talanta, 68, 516-521.
Wicklind T., Rosenfeld H., Martinsen K. (2005). Antioxidant capacity and colour
of strawberry jam as influenced by cultivar and storage conditions, 38,
387-391.
Yang, Z., Zhai, W. (2010). Identification and antioxidant activity of anthocyanins
extracted. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 11,
169-176.
80
81
ÖZGEÇMĠġ
Ad Soyad: Fatoş Ayça Özdemir Olgun
Doğum Yeri ve Tarihi: 03/10/1983
Adres: Ataköy 5. kısım E1-4 A Kapısı D:10, Bakırköy, İstanbul
E-Posta: [email protected], [email protected]
ÖĞRENĠM DURUMU:
Lisans: İstanbul Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği
Bölüm
Yüksek Lisans : İstanbul Teknik Üniversitesi, Kimya Metalurji Fakültesi
Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü
MESLEKĠ DENEYĠM VE ÖDÜLLER
İstanbul Teknik Üniversitesi Kimya Bölümünde 2006-2014 yılları arasında araştırma
görevlisi olarak çalışmış bulunmaktayım.
DOKTORA TEZĠNDEN TÜRETĠLEN YAYINLAR/SUNUMLAR
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B, Apak R., (2012), Determination of synthetic
food colorants in water-soluble beverages individually by HPLC and totally by
Ce(IV)-Oxidative Spectrophotometry, Food Anal. Methods.
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B., (2011), Determination Of Synthetic Food
Colorants in Water Soluble Foods and Beverages by HPLC and Novel
Spectrophotometric Methods, 5th
International Symposium On Recent Advances
in Food Analysis, Nov 1-4 2011, Prague, Czech Republic.
Tetik A., Ozdemir Olgun F. A., Demirata B., (2011), Determination of
Synthetic Food Colorants by Total Antioxidant Capacity Methods, Colloquium
Spectroscopicum Internationale XXXVII, 28.08- 2.09 2011, Buzios - Rio de
Janeiro, Brazil.
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B., Apak R., (2012), Determination of
Synthetic Food Colorants in Water-Soluble Beverages Individually by HPLC and
82
Totally by Ce(IV)-Oxidative Spectrophotometry” Paint Istanbul 2012 Boya
Sanayi, Hammadde ve Yardımcı Maddeler Fuar ve Kongresi.
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B, Apak R., (2014). Development of novel
methods for the determination of synthetic food colorants, Antioxidant
Workshop, October 27- October 29.
DĠĞER YAYINLAR, SUNUMLAR VE PATENTLER
SCI, SSCI, AHCI indekslerine giren dergilerde yayınlanan makaleler
Ozdemir F. A., Demirata B., Apak R., (2009). Adsorptive Removal of
Methylene Blue from Simulated Dyeing Wastewater with Melamine
Formaldehyde-Urea Resin, Journal of Applied Polymer Science,
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B., Apak R., (2012). Determination of
synthetic food colorants in water-soluble beverages individually by HPLC and
totally by Ce(IV)-Oxidative spectrophotometry, Food Anal. Methods.
Berker K. I., Ozdemir Olgun F. A., Ozyurt D., Demirata B., Apak R., (2013).
Modified Folin−Ciocalteu antioxidant capacity assay for measuring lipophilic
antioxidants, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61, 4783-4791.
Ozdemir Olgun F. A., Ozyurt D., Demirata B., Berker K. I., Apak R., (2014),
Folin-Ciocalteu spectrophotometric assay of ascorbic acid in pharmaceutical
tablets and orange juice with pH adjustment and preextraction of lanthanum
(III)- flavonoid complexes. Journal of the Science, Food and Agricultural, 94,
12, 2401-2408.
Hakemli Konferans/ sempozyumların bildiri kitaplarında yer alan yayınlar
Ozdemir F. A., Demirata B., (2008). Adsorption of humic substances on
melamine formaldehyde urea resin from different natural source waters, “XIII
Italian-Hungarian symposium on Spectrochemistry Environmental
Contamination and Food Safety”, 20-24, Italy.
Ozdemir F. A., Demirata B., (2010). Investigation of A New Method For
Removal of Phosphate From Waste-Waters, 3rd EuCheMS Chemistry
Congress, September, Nurnberg, Germany.
Ozdemir F. A., Demirata B., (2010). Preconcentration of Phosphorus in
Drinking Water Samples by Sorption on Fe(III) Immobilized Melamine-
Formaldehyde-Urea Resin to GFAAS Determination European Symposium
On Atomic Spectrometry, ESAS 2010, Poland.
Ozdemir F. A., Demirata B., (2011). Determination Of Synthetic Food
Colorants in Water Soluble Foods and Beverages by HPLC and Novel
Spectrophotometric Methods, 5th
International Symposium On Recent
Advances in Food Analysis, Nov 1-4, Prague, Czech Republic.
Tetik A., Ozdemir F. A., Demirata B., (2011). Determination of Synthetic
Food Colorants by Total Antioxidant Capacity Methods, Colloquium
Spectroscopicum Internationale XXXVII,28 August-2 September 2011,
Buzios - Rio de Janeiro, Brazil.
83
Kamer G. M., Ozdemir F. A., Demirata B., (2011). Synthesis and
Characterization of Fe3O4/HA/Ag Nanoparticles, 7th Nanoscience and
Nanotechnology Conference, 27.06- 01.07, Istanbul, Turkey.
Kamer G. M., Ozdemir F. A., Demirata B., (2011).Synthetic Applications of
Fe3O4/HA/Ag Nanoparticles for the Removal of Heavy Metals, Tenth
International Conference on Materials Chemistry, 4-7 July, Manchester, UK.
Ozdemir F. A., Demirata B., (2012). Development of a New Method for
Phosphate Removal from Environmental Waters, 8th Aegean Analytical
Chemistry Days AACD2012.
Ozdemir F. A., Demirata B., Apak R., (2012).Determination of Synthetic
Food Colorants in Water-Soluble Beverages Individually by HPLC and
Totally by Ce(IV)-Oxidative Spectrophotometry” Paint Istanbul 2012 Boya
Sanayi, Hammadde ve Yardımcı Maddeler Fuar ve Kongresi
Ozdemir Olgun F. A., Demirata B, Apak R., (2014). Development of novel
methods for the determination of synthetic food colorants, Antioxidant
Workshop, October 27- October 29.
84
