Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Heterotrimere G-Proteine in Pilzen:
Die Funktion der Gα-Untereinheit GSA1 in der Entwicklung
des Modellorganismus Sordaria macrospora
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik
vorgelegt von Christian Schäfers
aus Witten
Bochum Februar, 2011
Heterotrimeric G proteins in fungi:
The function of the Gα subunit GSA1 in the development
of the model organism Sordaria macrospora
Dissertation to obtain the degree
Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) Submitted to the International Graduate School of Biosciences,
Faculty of Biology and Biotechnology at the Ruhr University Bochum, Germany
Thesis performed at the Department of General and Molecular Botany
Submitted by Christian Schäfers
from Witten
Bochum February, 2011
Theresa
Everything has a purpose; it’s for you to make the best use of it. (Dan Millman)
Danksagung Ich danke vor allem meinem akademischen Lehrer und Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Ulrich
Kück für die interessante und aktuelle Themenstellung, das mir entgegengebrachte
Vertrauen, die geistige und materielle Unterstützung sowie die konstruktiven Diskussionen
und sein großes Interesse an der Fortführung dieser Arbeit.
Herrn PD Dr. Markus Piotrowski danke ich für die freundliche Übernahme des
Korreferats.
Bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls für Allgemeine und Molekulare
Botanik möchte ich mich herzlich für die nette Atmosphäre bedanken. Ein besonderer
Dank gilt dabei Frau Regina Ricke und Frau Katja Schmitt, die mir seit Beginn meiner
Laborarbeit fachlich und freundschaftlich zur Seite stehen. Des Weiteren möchte ich mich
bei Frau Ingeborg Godehardt für die Konstruktion einiger Plasmide, Frau Susanne
Schlewinski für die Durchführung genetischer Arbeiten und Frau Elke Adolph als
unverzichtbare Hilfe durch ihre Autoklaven-Arbeit bedanken. Frau Gabriele Frenßen-
Schenkel danke ich für die Mitarbeit bei einigen Abbildungen. Bei Frau Gianna Triller und
Frau Nicole Schnaß bedanke ich mich für die Mithilfe bei dieser Arbeit während ihrer
Bachelorarbeit bzw. ihres Praktikums. Meinen Doktorschwestern und Doktorbrüdern
danke ich für die schöne Zeit und den regen Gedankenaustausch. Besonders bei Frau Dr.
Sandra Bloemendal möchte ich mich für die schöne Zeit im gemeinsamen Labor und bei
Herrn Dr. David Löper für viele unvergessliche Momente während dieser Zeit bedanken.
Für die immerwährende Unterstützung möchte ich mich bei Frau Dr. Ines Teichert, Frau
Dr. Birgit Hoff und Herrn Dr. Jens Kamerewerd bedanken, die viel zum Erfolg dieser
Arbeit beigetragen haben. Weiterhin möchte ich einen besonderen Dank an Frau Dr.
Nicole Nolting und Herrn Dr. Skander Elleuche senden, die mich wissenschaftlich geprägt
haben und darüber hinaus einen besonderen Platz in meinem Leben einnehmen.
Für die Liebe und Anerkennung meiner Familie in Börger und Bochum bin ich unendlich
dankbar. Aus tiefstem Herzen geht dabei ein Dank an meine Frau Theresa, die jeden Tag
meines Lebens zu einem Geschenk macht und die ein großes Vorbild für mich darstellt das
eigene Schicksal anzuerkennen und das Beste daraus zu erschaffen.
Diese Arbeit wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 480: „Molekulare Biologie
komplexer Leistungen von botanischen Systemen“, durch die DFG gefördert.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I EINLEITUNG ............................................................................................................ 1
1. Einführung ............................................................................................................................................ 1
2. G-Protein-vermittelte Signaltransduktion in Mensch und Hefe ...................................................... 2 2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen .......................................... 3
2.1.1. Struktur der humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Beschreibung der Signalaufnahme ....................................................................................................................... 5
2.1.2. Struktur der G-Protein-Untereinheiten und deren Schalterfunktion in Signalwegen .............. 6 2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse in Saccharomyces cerevisiae .................................. 8
2.2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Pheromonantwort in S. cerevisiae ................................. 8 2.2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Glukosewahrnehmung in S. cerevisiae ....................... 10
3. Regulation von G-Protein-vermittelter Signaltransduktion ........................................................... 11 3.1. Negative Regulation durch Hemmung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors .............................. 11 3.2. Negative Regulation durch Hemmung der G-Protein-Aktivierung ................................................ 12
3.2.1. GAP - GTPase aktivierende Proteine .................................................................................... 12 3.2.2. GDI - Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren .......................................................... 16 3.2.3. Positive Regulation durch Guanosin-Austauschfaktoren - GEF ........................................... 16
4. Zusammenfassung: ............................................................................................................................ 17
II PROBLEMSTELLUNG .......................................................................................... 18
III MATERIAL UND METHODEN ........................................................................... 22
1. Material ............................................................................................................................................... 22 1.1. Stämme .......................................................................................................................................... 22 1.2. Plasmide ......................................................................................................................................... 25 1.3. Verwendete Starteroligonukleotide ................................................................................................ 26 1.4. Chemikalien ................................................................................................................................... 27 1.5. Enzyme .......................................................................................................................................... 28 1.6. Antikörper ...................................................................................................................................... 28 1.7. Kits ................................................................................................................................................. 28 1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen....................................................................................... 28 1.9. Nährmedien .................................................................................................................................... 30 1.10. Software ......................................................................................................................................... 31
2. Methoden ............................................................................................................................................ 32 2.1. Kulturbedingungen ........................................................................................................................ 32 2.2. Transformationsverfahren .............................................................................................................. 32 2.3. Isolierung von Nukleinsäuren ........................................................................................................ 33
2.3.1. Plasmid-DNA-Isolierung aus E. coli ..................................................................................... 33 2.3.2. Plasmid-DNA-Isolierung aus S. cerevisiae ........................................................................... 33
2.4. Gesamt-DNA-Isolierung aus S. macrospora ................................................................................. 33 2.5. Gelelektrophoretische Auftrennungsverfahren .............................................................................. 34 2.6. DNA-Isolierung aus Agarosegelen ................................................................................................ 34 2.7. DNA-Sequenzierung und Oligonukleotidsynthese ........................................................................ 34
2.7.1. Radioaktive Markierung von DNA ....................................................................................... 34 2.8. Southern-Blot-Hybridisierungen .................................................................................................... 34 2.9. cDNA Synthese mittels reverser Transkriptase ............................................................................. 35 2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................................. 35 2.11. Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae ..................................................................................... 35 2.12. Proteinbiochemische Verfahren ..................................................................................................... 36
2.12.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................................ 36 2.12.2. Immunologischer Nachweis von Proteinen (Western Blot-Analyse) .................................... 36
Inhaltsverzeichnis
2.13. Interaktionsstudien ......................................................................................................................... 36 2.13.1. β-Galaktosidase-Tests: ONPG und Filter-LacZ-Test ............................................................ 36 2.13.2. Ko-Immunopräzipitation in S. cerevisiae .............................................................................. 37
2.14. Aufreinigung von Fusionsproteinen in E. coli aus „Inclusion bodies“ .......................................... 37 2.15. Messung der GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora ............................ 38 2.16. Bioinformatorische Methoden ....................................................................................................... 38 2.17. Sicherheitsbestimmungen .............................................................................................................. 38
IV ERGEBNISSE .......................................................................................................... 39
1. Herstellung konstitutiver GSA1-Varianten aus Sordaria macrospora ........................................... 39
2. Funktionsanalysen mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GSA1-Derivaten .............. 42 2.1. Herstellung von Komplementationsstämmen ................................................................................ 42 2.2. Charakterisierung des vegetativen Wachstums von Komplementationsstämmen ......................... 43 2.3. Charakterisierung der sexuellen Entwicklung von Komplementationsstämmen ........................... 45
3. Interaktionsstudien mit GSA1-Varianten aus S. macrospora ........................................................ 47 3.1. Hefe-2-Hybrid-Analysen zur Identifikation von GSA1-Interaktionspartnern ............................... 47 3.2. Charakterisierung des RGS-Proteins ROG1 (Regulator of GSA1) als Interaktionspartner der
konstitutiv aktiven Gα-Form aus S. macrospora ........................................................................... 52 3.3. Interaktionsstudien mit GSA1 und der Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 ............................... 57
4. Messung der GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora ........................... 61
V DISKUSSION ........................................................................................................... 66
1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege in Hyphenpilzen .............................................. 66
2. Die sexuelle Entwicklung des Hyphenpilzes Sordaria macrospora ist abhängig vom Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit GSA1 ................................................................................. 67
3. Das GSA1 bindende RGS-Protein ROG1 ist ein putativer negativer Regulator des G-Protein-Signalweges in Sordaria macrospora ............................................................................... 71
4. Die Gα-Untereinheit GSA1 interagiert mit Phospholipid-assoziierten Proteinen ........................ 77
5. Interaktionsnetzwerk der Gα-Untereinheit GSA1 in Sordaria macrospora .................................. 81
VI ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................... 86
VII SUMMARY .............................................................................................................. 87
VIII LITERATUR ............................................................................................................ 88
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AD Aktivierungsdomäne des Gal4-Transkriptionsfaktors in S. cerevisiae AS Aminosäure BD Bindedomäne des Gal4-Transkriptionsfaktors in S. cerevisiae cDNA zur mRNA komplementäre DNA („complementary DNA“) bp Basenpaare cAMP zyklisches Adenosintriphosphat (cyclic adenosine monophosphate) C-Terminus Carboxy-Terminus DNA Desoxyribonukleinsäure GAP GTPase aktivierendes Protein GDI Guanosin-Dissoziations-Inhibitor gDNA genomische DNA GDP Guanosindiphosphat GEF Guanosin-Austauschfaktor GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor (G protein-coupled receptor) GRK G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase GTP Guanosintriphosphat kb Kilobasen kDa Kilodalton N-Terminus Amino-Terminus OD optische Dichte PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction) Pi anorganisches Phosphat PtdIns3P Phosphoinositoltriphosphat rpm Umdrehung pro Minute (revolts per minute) RGS Regulator des G-Protein-Signalweges RT Raumtemperatur Allgemein gebräuchliche Abkürzungen sowie Maßeinheiten sind nicht gesondert aufgeführt. Aminosäuren sind anhand des üblichen Einbuchstaben-Codes abgekürzt.
Häufig verwendete Abkürzungen von Genen und Genprodukten
gsa1 Gen für die Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora gsa1_ca Gen für die konstitutiv aktive GSA1-Variante GSA1_CA aus S. macrospora gsa1_ci Gen für die dominant negative GSA1-Variante GSA1_CI aus S. macrospora gsa2 Gen für die Gα-Untereinheit GSA2 aus S. macrospora gsa3 Gen für die Gα-Untereinheit GSA3 aus S. macrospora Smvps34 Gen für die Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 aus S. macrospora rog1 Gen für das RGS-Protein ROG1 aus S. macrospora pre1 Gen für den Pheromonrezeptor PRE1 aus S. macrospora pre2 Gen für den Pheromonrezeptor PRE2 aus S. macrospora ste12 Gen für den Transkriptionsfaktor STE12 aus S. macrospora
I Einleitung 1
I Einleitung
1. Einführung Eine Zelle überlebt, in dem sie in ständigem Kontakt mit ihrer Umwelt steht. Diese
Kommunikation umfasst eine Wahrnehmung und Aufnahme exogener Signale, so
genannter Stimuli, deren Verarbeitung und die anschließende Weiterleitung in andere
Kompartimente. Ein breites Spektrum von Stimuli aus physikalischen und chemischen
Anreizen, Nährstoffen, Hormonen oder Stress, veranlasst die Zelle zu einer entsprechend
weitgefächerten Reizantwort. Dabei stellen ein Signalempfänger, ein Schalter sowie
weiterleitende Komponenten (Effektoren) die für die Zellantwort essentiellen Elemente
dar. Der Empfänger ist ein Rezeptor, der in der Membran verankert (membranständig) oder
in der Zelle (intrazellulär) vorliegen kann. Die am weitesten verbreiteten Rezeptoren sind
dabei membranständig und besitzen eine extrazelluläre Domäne, über die sie Liganden
binden, sowie eine intrazelluläre Domäne, die zur Signalweiterleitung ins Zellinnere dient.
Aufgrund ihrer Struktur und des damit verbundenen Wirkmechanismus sind
membranständige Rezeptoren in zwei Klassen unterteilt, den ionotropen und metabotropen
Rezeptoren. Innerhalb der metabotropen Klasse bilden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
(GPCR für G protein-coupled receptor) die größte Gruppe, bei denen die
Signalweiterleitung über so genannte G-Proteine vollzogen wird. G-Proteine können dabei
zytosolisch monomer oder membranständig heterotrimer vorliegen. Heterotrimere
G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten Gα, Gβ und Gγ und befinden sich im Fokus
der vorliegenden Arbeit.
Monomere G-Proteine besitzen eine molekulare Masse zwischen 20-29 kDa, weshalb sie auch als kleine GTPasen bezeichnet werden. Sie wirken als Schalter in Signaltransduktionen, da sie zwischen einer inaktiven GDP-gebundenen und einer aktivierten GTP-gebundenen Form wechseln und nur im aktivierten Zustand das Signal an ihre Effektoren weiterleiten (Valencia et al. 1991). Monomere G-Proteine werden anhand ihrer Struktur in 5 Klassen, Ras, Rac/Rho, Ran, Arf und Raf eingeordnet (Macara et al. 1996). Ihr regulatorischer Einfluss ist für Prozesse des Zellwachstums, der Proteinsekretion und der intrazellulären Interaktion von Vesikeln beschrieben (Ellis et al. 1981; Hall 1990).
In dieser Arbeit wurde die Gα-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins und die
darüber vermittelte Signaltransduktion im Hyphenpilz Sordaria macrospora untersucht.
Daher werden im Folgenden G-Protein-vermittelte Signalwege ohne Berücksichtigung der
monomeren Vertreter allgemein vorgestellt und anschließend anhand der beiden
eukaryotischen Modellsysteme im Menschen sowie in der Hefe detaillierter beschrieben.
I Einleitung 2
2. G-Protein-vermittelte Signaltransduktion in Mensch und Hefe Heterotrimere G-Proteine und ihre vermittelten Signalwege sind seit ihrer Entdeckung
durch Ross und Gilman (1977) vermehrt untersucht worden, wodurch der Großteil der zu
Grunde liegenden Prozesse innerhalb der Signaltransduktion identifiziert wurden (Bourne
1997; Gilman 1987; Oldham und Hamm 2006; Siderovski und Willard 2005). In der
Membran verankert wirken G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als
Signalempfänger, die spezifische Liganden binden können. Durch die Ligandenbindung
ausgelöste Konformationsänderungen initiieren den Übergang vom inaktiven Rezeptor in
seine aktivierte Form (Ballesteros et al. 2001; Farahbakhsh et al. 1995; Farrens et al. 1996).
Ein angeregter GPCR wirkt als Guanosin-Austauschfaktor (GEF für Guanine exchange
factor) aktivierend auf das nachgeschaltete heterotrimere G-Protein. Diese besitzen eine
durchschnittliche molekulare Masse von 100 kDa und bestehen wie oben bereits
beschrieben aus drei Untereinheiten, Gα, Gβ und Gγ. Heterotrimere G-Proteine wirken als
Schalter in der Signaltransduktion, da die Gα-Untereinheiten innerhalb ihres
Aktivierungszyklus nur im GTP-gebundenen Zustand eine Signaltransduktion über
spezifische Effektoren ermöglichen (Abb. 1).
Abbildung 1: Standard-Modell der heterotrimeren G-Protein-vermittelten Signaltransduktion. Der Zyklus der GPCR-vermittelten G-Protein-Aktivierung mit Signalweiterleitung über Gα bzw. Gβγ ist dargestellt. Regulatorische Aktivitäten, wie die GEF-, GAP- und GDI-Aktivität sind rot markiert, die entsprechenden Regulatoren sind mit roten Pfeile verbunden. Abkürzungen: GPCR: G-Protein-gekoppelter Rezeptor, GDP: Guanosindiphosphat, GTP: Guanosintriphosphat, GEF: Guanosin-Austauschfaktor, GAP: GTPase aktivierendes Protein, GDI: Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitor, Pi: anorganisches Phosphat, RGS: Regulator des G-Protein-Signalweges, α, β, γ: Untereinheiten des heterotrimeren G-Proteins. Nähere Erläuterungen siehe Text (nach Neubig und Siderovski 2001).
I Einleitung 3
In Abbildung 1 ist der Aktivierungszyklus einer Gα-Untereinheit dargestellt, der im
Folgenden beschrieben wird. In der Rezeptor-assoziierten, inaktiven Form bildet das
heterotrimere G-Protein einen Komplex mit GDP, welches an Gα gebunden vorliegt
(Gilman 1987; Spiegel 1987). Zu diesem Zeitpunkt erfüllt das Gβγ-Dimer zwei Funktionen
für Gα, zum einen die Anbindung an den GPCR und zum anderen die eines Guanosin-
Nukleotid-Dissoziations-Inhibitors (GDI), wodurch der spontane Austausch von GDP zu
GTP unterbunden wird (Bourne 1997; Brandt und Ross 1985; Gilman 1984; Higashijima et
al. 1987; Siderovski und Willard 2005).
Die GEF-Aktivität des GPCR ersetzt das an Gα gebundene Nukleotid Guanosindiphosphat
(GDP) durch ein Guanosintriphosphat (GTP) und aktiviert Gα (Siderovski und Willard
2005). Aktiviert und GTP-gebunden dissoziiert Gα vom Gβγ-Dimer was in der Bildung
von zwei Komplexen resultiert, Gα und das Gβγ-Dimer. Beide aktivieren spezifische
Effektoren wie z.B. die Adenylatzyklasen oder PI3-Kinasen (weitere humane Effektoren
sind in Tab. 1 aufgeführt) und leiten das Signal ins Innere der Zelle weiter (Oldham und
Hamm 2008). Nur aktiviert, d.h. GTP-gebunden, leitet Gα Signale weiter, weshalb die
Lebensdauer von Gα-GTP die Länge der aktivierten Phase des Signalweges bestimmt
(Sprang 1997). Bei vollständiger Hydrolyse des GTP zu GDP wird die Gα-Untereinheit
inaktiviert und reassoziiert mit Gβγ, um erneut als heterotrimeres G-Protein am GPCR zu
binden, wodurch auch der Signalweg abgeschaltet wird (Spiegel 1987).
Die GTP-Hydrolyse von Gα wird von RGS-Proteinen (Regulatoren des G-Protein-
Signalweges) als GAP (GTPase aktivierendes Protein) beschleunigt, wodurch eine
Inaktivierung von Gα vorangetrieben wird (Übersicht bei Ross und Wilkie 2000). Die
Schnelligkeit des Wechsels zwischen GDP- und GTP-gebundener Gα-Form ist durch
verschiedene regulatorische Faktoren beeinflussbar, die im späteren Verlauf dieser
Einleitung beschrieben werden. Im Folgenden soll zunächst beispielhaft die sehr gut
untersuchte heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion beim Menschen und in
dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae vorgestellt werden.
2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen Nachfolgend soll die heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen
vorgestellt werden, da eine breit gefächerte Auswahl an Prozessen durch diese gesteuert
wird. Dazu gehören neben der Wahrnehmung und Verarbeitung von Reizen wie Licht,
Gerüchen und Geschmacksrichtungen, die Steuerung der Chemotaxis, der Zellproliferation
I Einleitung 4
und der Zelldifferenzierung (Adler et al. 2000; Buck und Axel 1991; Drucker 2003;
Verghese et al. 1987; Wheeler et al. 1977). Um auf die vielen extrazellulären Signale mit
einer spezifischen Antwort reagieren zu können, ist das humane
Signalweiterleitungssystem komplex aufgebaut. Das Genom von H. sapiens weist mit 33
Genen für G-Protein Untereinheiten (16 Gα, 5 Gβ, 12 Gγ) bzw. 802 Genen für G-Protein-
gekoppelte Rezeptoren (GPCR) eine extrem hohe Anzahl von Genen auf, die für Faktoren
der G-Protein-gekoppelten Signaltransduktion kodieren (Downes und Gautam 1999;
Fredriksson et al. 2003; Venter et al. 2001). Die Spezifität im humanen System wird neben
der hohen Genanzahl von der Kombination der jeweiligen Faktoren bestimmt. Dabei wird
ein striktes System von spezifischen Paarungen aus GPCR, G-Protein und jeweiligen
Effektoren verfolgt, um spezifische Prozesse einzuleiten (Tab. 1).
Daten aus der „Human-gpDB“-Datenbank, die Interaktionen humaner G-Proteine mit
humanen GPCR und Effektoren beinhaltet, zeigen, dass 88 % der GPCR-Unterfamilien
(708) spezifisch mit nur einer Gα-Familie wechselwirken (623/708) bzw. nur die TSH
(Thyroid stimulierendes Hormon)-Rezeptorfamilie mit allen Gα-Familien interagiert
(Satagopam et al. 2010). Durch diese strikte Zuteilung auf exklusive Signalwege können
spezifische Antworten auf Reize erfolgen. Leider entstehen durch diese strenge Einteilung
bei Mutationen in GPCRs bzw. G-Proteinen schwer zu kompensierende Störungen, die zu
Krankheitsbildern beim Menschen führen (Übersicht bei Spiegel und Weinstein 2004).
Bei GPCR- oder G-Protein-assoziierten Krankheiten wird unterschieden, ob die vorherrschende Mutation einen Verlust der Funktion des Gens (loss of function) oder einen Gewinn der Genfunktion (gain of function) nach sich zieht. Beispielhafte Krankheitsbilder für „loss of function“-Muationen sind Netzhautdegeneration (Retinitis pigmentosa) durch mutierte Rhodopsin-Rezeptoren oder eine Schilddrüsenunterfunktion bei Mutationen in TSH-Rezeptoren. Die „gain of function“-Mutation bei Rhodopsin-Rezeptoren resultiert im Gegensatz dazu in einer angeborenen Nachtblindheit oder kann bei Störung der TSH-Rezeptoren zu Tumoren in der Schilddrüse führen, die durch deren Überfunktion initiiert werden (Berson et al. 2002; Corvilain et al. 2001; Spiegel und Weinstein 2004).
In diesem Kontext ist zu erwähnen, dass 30 % aller Arzneimittel direkt auf GPCRs wirken
und einen jährlichen Umsatz von USD 50 Milliarden auf dem Weltmarkt erzielen (Hopkins
und Groom 2002; Jacoby et al. 2006). Studien zur Aufklärung der humanen
G-Protein-gekoppelten Signaltransduktion dienen daher, neben der Grundlagenforschung,
vor allem der Suche nach neuen Wirkstoffen sowie der Aufklärung des Wirkorts und der
Wirkmechanismen. Dabei wurden große Erfolge anhand von Strukturanalysen der GPCR
sowie der G-Protein-Untereinheiten erzielt, auf die im Folgenden näher eingegangen wird
(Übersicht bei Kristiansen 2004 sowie Oldham und Hamm 2006).
I Einleitung 5
2.1.1. Struktur der humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Beschreibung der
Signalaufnahme Alle humanen GPCRs besitzen eine konservierte Struktur aus
sieben Transmembrandomänen (TM1-TM7), die als α-Helices ausgebildet sind. Dabei
liegen der N-Terminus immer extrazellulär und der C-Terminus intrazellulär vor, die
jeweils drei interhelikale Schleifen beidseitig der Membranen ausbilden. Die Struktur
variiert N-terminal in der Länge oder in den ausgebildeten Domänen, so dass
Sequenzanalysen eine Einteilung der humanen GPCRs in fünf Familien ermöglichen. Die
GRAFS-Klassifizierung bezeichnet sie als Glutamat (G)-, Rhodopsin (R)-, Adhesion (A)-,
Frizzled/Taste2 (F)- und Secretin (S)-Familien, von denen die R-Familie die größte und die
am besten beschriebene Familie ist (Fredriksson et al. 2003). Eine Einteilung von GPCRs
in sechs Klassen, in denen auch die pilzlichen Vertreter berücksichtigt werden, ist ebenfalls
beschrieben (Kolakowski 1994).
Die N-terminalen Unterschiede der GPCRs untereinander sind ausschlaggebend für die
Wahl des Liganden. Eine darüber hinaus gehende Spezifität ergibt sich durch das „Ligand
directed signalling“, bei dem die Bindung verschiedener Liganden am gleichen Rezeptor
zu Interaktionen mit unterschiedlichen Gα-Untereinheiten führt (Kenakin 2003; Perez und
Karnik 2005). Eine Liganden-abhängige Strukturveränderung am C-Terminus hat die
Aktivierung des heterotrimeren G-Proteins, welches an der dritten helikalen Schleife
gebunden ist, zur Folge.
Studien am Photorezeptor Rhoidopsin und dessen assoziiertem G-Protein, Transducin (Gt),
in der visuellen Signaltransduktion des Menschen, führten zu einem besseren Verständnis
bei der Anregung des G-Proteins, die im Folgenden beschrieben wird. Eine Aktivierung
von Transducin wurde in diesem Zusammenhang nur nach einer Auflockerung der
Rezeptorstruktur durch Auflösen von Salzbrücken, des sogenannten „ionic-locks“,
zwischen Transmembrandomäne TM3 und TM6 beobachtet (Farrens et al. 1996; Sheikh et
al. 1996). Weiterhin wird diese Veränderung sehr schnell vollzogen (~ 6 ms), so dass eine
nachfolgende Aktivierung des G-Proteins nur durch eine schnelle Komplexbildung mit
dem GPCR möglich ist (Palczewski 2006). Bisher sind zwei Theorien über die Entstehung
der Komplexbildung beschrieben. Das bereits 1978 dokumentierte „Collision coupling“-
Modell postuliert eine Interaktion des Rezeptors mit dem G-Protein nach seiner
Aktivierung, da er erst zu diesem Zeitpunkt durch laterale Diffusion in die
Plasmamembran zum G-Protein gelangt (Tolkovsky und Levitzki 1978). Das zweite
System beschreibt eine Interaktion des G-Proteins mit dem inaktiven GPCR, so dass ein
I Einleitung 6
Komplex vor der Aktivierung entsteht (Gales et al. 2006). Die Aktivierung des G-Proteins
wird über GEF-Aktivität des angeregten GPCRs bewirkt, wodurch eine Freilassung des an
die Gα-Untereinheit gebundenen GDPs und dann eine Bindung des GTP erreicht wird. Ein
nukleotidfreies Gα besitzt sowohl eine Affinität zu GTP als auch zu GDP, so dass die
Bindung zu GTP durch einen Überschuss von diesen im umgebenden Milieu erreicht wird
(Oldham und Hamm 2008). Nach Aktivierung durch den GPCR trennt sich Gα von dem
Gβγ-Dimer und beide Komplexe setzen durch die nachfolgende Aktivierung ihrer
Effektoren die Signaltransduktion fort, die im Folgenden beschrieben wird.
2.1.2. Struktur der G-Protein-Untereinheiten und deren Schalterfunktion in Signalwegen Im humanen Genom kodieren durch alternatives Spleißen 16 Gene für 23
Gα-Untereinheiten, 5 Gene für 6 Gβ-Untereinheiten und 12 Gene für 12
Gγ-Untereinheiten (Downes und Gautam 1999; Venter et al. 2001). Heterotrimere
G-Proteine sind durch eine individuelle Gα-Untereinheit geprägt und in vier Klassen, Gαs,
Gαi, Gαq und Gα12/13, eingeordnet (Downes und Gautam 1999; Simon et al. 1991). Des
Weiteren wurde 2009 mit Gv eine fünfte Klasse identifiziert (Oka et al. 2009).
Die Funktion von Gα als GTP-gebundener Schalter in der Signaltransduktion ist strukturell
determiniert. Gα weist eine konservierte GTPase- und eine individuelle, helikale Domäne
auf. Die GTPase-Domäne besteht aus drei Switch-Regionen, die als Schlaufen ausgebildet
sind und eine Nukleotid-Bindetasche formen. Sie vermittelt darüber hinaus die intrinsische
GTPase-Aktivität um GTP zu GDP zu spalten, wodurch Gα sich selbst und den Signalweg
inaktiviert. Bindungen mit dem GPCR, dem Gβγ-Dimer sowie mit Effektoren werden
ebenfalls in dieser Domäne strukturell determiniert. Die individuelle Struktur der
Gα-Untereinheit legt hingegen die helikale Domäne fest, die aus einem Bündel von sechs
α-Helices aufgebaut ist. Anhand ihrer Struktur ermöglicht sie den Verschluss der
Nukleotid-Bindetasche, wodurch ein gebundenes Nukleotid festgehalten werden kann
(Oldham und Hamm 2008; Sprang 1997).
Die Struktur der ersten Gβ-Untereinheit wurde 1996 von Sondek und Mitarbeitern gelöst.
Sie besteht aus sieben β-Faltblättern, die WD40 besitzen und die Form eines Propellers
ausbilden. Durch eine Konformationsänderung von Gβ, die in einer α-helikalen Struktur
resultiert, wird die Bindung an eine N-terminale „coiled-coil“-Struktur in Gγ ermöglicht,
was zur Bildung des Gβγ-Dimers führt (Sondek et al. 1996; Wall et al. 1995). Von diesem
Dimer trennt sich Gα-GTP durch Konformationsänderung der Switch-Regionen, so dass
I Einleitung 7
beide Komponenten ein Signal auf ihre jeweiligen Effektoren übertragen, die es über
sekundäre Botenstoffe weiterleiten.
Einer dieser Botenstoffe ist das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP für cyclic adenosine monophosphate), welches durch Adenylatzyklasen produziert wird, die von G-Proteinen der Klasse Gs aktiviert bzw. durch die der Klasse Gi gehemmt werden (Hildebrandt et al. 1983; Ross et al. 1977). Vertreter der Klasse Gq aktivieren die Phospholipase C, welche die sekundären Botenstoffe Diazylglyzerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) produziert (Rhee 2001). Die Klasse G12/13 interagiert mit RhoGEFs und aktiviert darüber die kleine GTPase RhoA (Ras homolog gene family, member A) (Worthylake et al. 2000).
Ein Überblick über diese humanen Effektoren ist der Tabelle 1 zu entnehmen.
Tabelle 1: Auflistung von spezifischen Effektoren der G-Protein-Untereinheiten. Eine Stimulation durch das G-Protein wird mit einem (+), eine Hemmung mit einem (-) gekennzeichnet. ACTH: Adrenokortikotropes Hormon, GABA: γ-Aminobuttersäure, EDG: Endotheliales Differenzierungsgen, PAR: Protease-aktivierte Rezeptoren.
G-Protein GPCR (Auswahl) Effektor (Auswahl)
Gsα ACTH-Rezeptor
Olfaktorische Retzeptoren β-Adrenorezeptoren1
Adenylatzyklasen (+) Kaliumkanäle (+)
Tyrosinkinasen (+)2
Gi/oα
Adenosinrezeptoren (A1) α2-Adrenorezeptoren
m2/4-Acetylcholinrezeptoren Dopamin D2-Rezeptor
GABAB3
Adenylatzyklase (-) MAP-Kinase (+) Kaliumkanäle (-)
Tyrosinkinasen (+) Kalziumkanäle (+)
Cdc42 (GTPase) (+) cGMP-PDE (+)2
Gqα
Adenosinrezeptoren (A3) α1-Adrenorezeptoren
m3-Acetylcholinrezeptoren Neurokinin-Rezeptor4
Phospholipase C (+)2
G12/13α EDG-Rezeptoren (1-7)
Thromboxan A2-Rezeptor PAR-1, 2, 34
Phospholipase D (+) RhoGEFs von RhoA (+)2
Gβ/γ (β1-5 /γ1-12) /
Phospholipase Cβs (+) Adenylatzyklase I (+)
Adenylatzyklase II, IV, VII (-) PI3-Kinasen (+)
Kaliumkanäle (+) Kalziumkanäle (-) Tyrosinkinasen (+)
Proteinkinase D (+) 2
1Spiegel (1987); 2Milligan und Kostenis (2006); 3Selbie und Hill (1998); 4Billington und Penn (2003)
I Einleitung 8
Neben dem bislang beschriebenen humanen System werden heterotrimere G-Protein-
vermittelte Signaltransduktionen vor allem in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund
der geringeren Komplexität der Signalwege untersucht. Im nachfolgenden Abschnitt wird
diese näher erläutert.
2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse in Saccharomyces cerevisiae Das Genom der einzelligen Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae weist zwei Gα-, eine
Gβ- und eine Gγ-Untereinheit sowie drei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) auf. In
diesem Zusammenhang wurden die beiden Gα-Untereinheiten GPA1 und GPA2 anhand
von cDNA-Klonen der humanen Vertreter Giα2 und Goα identifiziert, aufgrund derer eine
entsprechende Homologie zum Menschen beschrieben werden kann (Nakafuku et al. 1987;
Nakafuku et al. 1988; Nakayama et al. 1985; Whiteway et al. 1989). Von G-Proteinen
werden in der Hefe mit der Pheromonantwort und der Wahrnehmung von Glukose zwei
Prozesse vermittelt, auf die im Folgenden detaillierter eingegangen wird (Dohlman und
Thorner 2001; Versele et al. 2001).
2.2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Pheromonantwort in S. cerevisiae Eine Zelle der Bäckerhefe S. cerevisiae vollzieht den größten Teil ihres Daseins im
diploiden Stadium. In Abhängigkeit des vorherrschenden Nährstoffangebots wird zwischen
der vegetativen und der sexuellen Vermehrung gewechselt. Vegetativ vermehrt sich die
Hefe bei ausreichender Nährstoffversorgung durch Knospung, in deren Verlauf sie
Tochter- und Mutterzellen ausbildet. Bei Nährstoffmangel hingegen wird der sexuelle
Zyklus gewählt, aus dem vier haploide Ascosporen entstehen, von denen jeweils zwei den
MATα- und zwei den MATa-Kreuzungstypen aufweisen. Sobald die Ascosporen den
Ascus (Meiosporangium) verlassen, fusionieren sie wieder mit anderen, um die bevorzugte
diploide Lebensform auszubilden. Diese Fusion bzw. Paarung kann nur von Zellen
eingegangen werden, die einen unterschiedlichen Kreuzungstyp, also MATa und MATα,
aufweisen. Daher ist es für jede Hefezelle essentiell den Kreuzungstyp von anderen
Hefezellen in der Umgebung wahrnehmen zu können. Dieser Prozess wird durch die
G-Protein-vermittelte Pheromonantwort vollzogen, die in haploiden Hefezellen die
Wahrnehmung, den Kontakt und die Fusion mit anderen Zellen steuert, was zur Bildung
von diploiden Zellen führt. (Blumer und Thorner 1991).
I Einleitung 9
Zu Beginn jeder Fusion sekretieren Hefezellen Kreuzungstyp-spezifische Pheromone, die
vom jeweilig anderen Kreuzungstyp durch Bindung an spezifische GPCR, den
Pheromonrezeptoren, wahrgenommen werden. Der MATα-Typ setzt den α-Faktor frei, der
an STE2, dem α-Faktor-spezifischen Pheromonrezeptor bindet, der an der Oberfläche von
Zellen des MATa-Typs lokalisiert ist. Analog dazu bindet das MATa-Typ-Pheromon, der
a-Faktor, an STE3 auf der Oberfläche von MATα-Zellen. Die Aktivierung des G-Proteins
aus GPA1 (Gα), STE4 (Gβ) und STE18 (Gγ) erfolgt analog zum humanen System über
Konformationsänderung der STE3- bzw. STE2-Rezeptorstruktur (Dohlman 2002).
Während im humanen System die Signaltransduktion vor allem über Gα-Effektoren
abläuft, wird die Pheromonantwort in S. cerevisiae über das Gβγ-Dimer auf die Effektoren
übertragen (Dohlman und Thorner 2001). Einer der Effektoren, STE20, aktiviert durch
Interaktion mit der MAP (Mitogen-activated protein)-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK)
STE11, die MAP-Kinase Kaskade, in deren Verlauf die MAPK-Kinase STE7 und die
MAP-Kinase FUS3 durch Phosphorylierung aktiviert werden. FUS3 reguliert Prozesse des
Zellzyklus über das FAR1-Protein, um diesen in der G1-Phase zu stoppen. So wird
gewährleistet, dass sich beide Zellen in der gleichen Phase befinden, bevor sie fusionieren
(Peter et al. 1993).
Weiterhin reguliert FUS3 durch Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor STE12 die
Transkription von Genen, die an Prozessen wie dem Zellzyklus-Arrest, der Konjugation
oder an morphologischen Veränderungen beteiligt sind (Song et al. 1991). Die gegenteilige
Wirkung der Transkriptionshemmung wird durch Interaktion mit den Faktoren DIG1 und
DIG2 vollzogen, die als Inhibitoren an STE12 binden können (Cook et al. 1996). FUS3
reguliert ebenfalls den Regulator des G-Protein Signalweges (RGS-Protein) SST2, das als
GTPase aktivierendes Protein (GAP) die intrinsische GTPase-Aktivität der
Gα-Untereinheit GPA1 beschleunigt und die Termination des Signalweges herbeiführt
(Garrison et al. 1999). Die Inaktivierung des Signalweges bewirkt FUS3 ebenfalls über
einen Rückkopplungseffekt als negativer Regulator auf den Pheromonrezeptor STE3, den
es phosphoryliert (Feng und Davis 2000b; Lefkowitz 1998). Eine weitere Komponente
dieses Rückkopplungsprozesses ist das „Scaffold“-Protein STE5, ebenfalls ein
Gβγ-Effektor, der eine Translokalisation des STE5-assoziierten STE11-STE7-FUS3-
Komplexes zur Plasmamembran ermöglicht, wodurch FUS3 in räumliche Nähe des
Rezeptors STE3 gelangt (Feng und Davis 2000b; Pryciak und Huntress 1998). Analog zu
anderen „Scaffold“-Proteinen fungiert STE5 als Bindeglied der einzelnen Komponenten
der MAP-Kinase-Kaskade und gewährleistet somit die STE11-vermittelte Aktivierung des
I Einleitung 10
Gβγ-Dimers (Burack und Shaw 2000; Elion 1998; Feng et al. 1998). Darüber hinaus bindet
STE5 an den N-Terminus der MAPKK-Kinase STE11, um eine Selbstinhibierung von
STE11 zu verhindern. MAPKK-Kinasen hemmen ihre eigene Kinase-Aktivität, in dem der
N-Terminus an den katalytisch aktiven C-Terminus des Proteins bindet (Choi et al. 1994;
Marcus et al. 1994).
Neben der Steuerung von Transkription und Signalaufnahme über STE20 und STE5
regulieren Gβγ-Effektoren ebenfalls das polare Wachstum, um eine Zellfusion zu
ermöglichen. Das Gβγ-Dimer interagiert zu diesem Zweck mit FAR1 und CDC24, welches
als Guanosin-Austauschfaktor aktivierend auf die kleine GTPase CDC42 wirkt. Während
der Zellteilung reguliert das aktive CDC42 die Knospung und während der
Pheromonantwort das polare Wachstum (Simon et al. 1995; Zhao et al. 1995). Die Zelle
wächst am Pheromongradienten ausgerichtet, chemotropisch zur zweiten Zelle und bildet
eine so genannte „Shmoo“-Form aus, um mit der anderen Zelle zu fusionieren (Segall
1993; Valtz et al. 1995). Fehlt dieser Gradient, wechseln die Hefezellen zurück zur
Knospung. Neben Gβγ-Effektoren sind einzelne Gα-Effektoren wie das RNA-bindende
Protein SCP160 oder die Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 bekannt, deren Einfluss auf die
Pheromonantwort bisher jedoch ungeklärt ist (Guo et al. 2003; Slessareva et al. 2006).
Neben der Pheromonantwort steuern G-Proteine mit der Wahrnehmung von Glukose einen
zweiten Prozess in S. cerevisiae, der im nächsten Abschnitt beschrieben wird.
2.2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Glukosewahrnehmung in S. cerevisiae Zellen der Bäckerhefe können sowohl mit Sauerstoff (aerobe Bedingung) als auch ohne
Sauerstoff (anaerob) wachsen, obwohl das aerobe Wachstum bevorzugt wird, da in diesem
Fall mehr Energie in Form von ATP gewonnen wird. In beiden Fällen kann die Hefe den
Einfachzucker Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle verwenden, wobei unter anaeroben
Bedingungen durch Fermentation Ethanol entsteht. Durch eine hohe Verträglichkeit
gegenüber Ethanol besitzen Hefezellen einen Wachstumsvorteil gegenüber
konkurrierenden Organismen in ihrer Umgebung, deren Wachstum durch Ethanol
gehemmt wird (Versele et al. 2001). Die Prozesse, die es der Hefezelle ermöglichen
Glukose wahrzunehmen, sind noch nicht so detailliert beschrieben wie die Prozesse,
welche die Pheromonantwort ermöglichen. Bekannt ist jedoch, dass das fermentative
Wachstum durch Bindung von Glukose an GPR1, der dritte GPCR neben STE2 und STE3,
eingeleitet wird, der daraufhin die gebundene Gα-Untereinheit GPA2 aktiviert (Colombo et
al. 1998; Kraakman et al. 1999). Es ist bisher kein GPA2-assoziiertes Gβγ-Dimer
I Einleitung 11
beschrieben worden, welches an der Wahrnehmung von Glukose beteiligt ist. Vielmehr
erfolgt die Signaltransduktion über die Gα-Untereinheit, da GPA2, analog zu den humanen
Vertretern Gsα, die Adenylatzyklase (CDC35/CYR1) aktiviert. Dadurch wird nachfolgend
cAMP produziert, wodurch wiederum die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA)
angeregt wird (Colombo et al. 1998). Über diesen G-Protein-vermittelten Signalweg
innerhalb der Glukosewahrnehmung wird letztlich das Wachstum stimuliert und die
Stressresistenz gehemmt (Fabrizio et al. 2001; Kraakman et al. 1999; Kubler et al. 1997).
Nachdem in den vorherigen Kapiteln die G-Proteine sowie die über sie vermittelte
Signaltransduktion anhand der beiden Modellsysteme im Menschen und in der Hefe
vorgestellt wurden, befassen sich die nächsten Abschnitte mit Faktoren, die regulatorisch
auf diese Signalweiterleitung einwirken.
3. Regulation von G-Protein-vermittelter Signaltransduktion Die Dauer einer G-Protein-vermittelten Signaltransduktion hängt vom Nukleotidaustausch,
der GTP-Hydrolyse sowie der Reassoziation des heterotrimeren G-Proteins ab (Sprang et
al. 2007). Jeder einzelne Prozess wird durch regulatorische Faktoren beeinflusst, die darin
unterschieden werden, ob sie einen positiven oder einen negativen Effekt ausüben und ob
der GPCR oder das G-Protein reguliert werden. Im Folgenden werden zuerst mit den G-
Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen (GRKs), den Regulatoren des G-Protein-
Signalweges (RGS-Proteine) und den Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren
(GDIs) die negativen Faktoren vorgestellt, um danach mit den positiven Regulatoren, den
Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange factor) diese Einleitung zu
beenden.
3.1. Negative Regulation durch Hemmung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors Um Ligandengradienten wahrzunehmen oder eine kontinuierlich andauernde Stimulation
des Signalweges zu vermeiden, werden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vom Stimulus
getrennt. Der Rezeptor wird dazu zuerst sensitiviert, dann internalisiert, um letztlich
degradiert oder resensitiviert zu werden. Diese Prozesse sind sowohl in der Hefe als auch
beim Menschen beschrieben (Feng und Davis 2000a; Hicke et al. 1998; Reiter und
Lefkowitz 2006). Beim Menschen wird die Desensitivierung durch G-Protein-gekoppelte
Rezeptor-Kinasen (GRKs) durchgeführt, die exklusiv an aktivierte GPCR binden und
deren C-Terminus phosphorylieren (Palczewski und Benovic 1991). Die nachfolgende
I Einleitung 12
Assoziation von Arrestinen blockiert die Bindestelle zum G-Protein, wodurch der GPCR
vom G-Protein entkoppelt wird. Darauf folgt die Internalisierung des GPCR durch eine
Clathrin vermittelte Endozytose, die durch eine Interaktion von Arrestin mit Clathrin
gestartet wird (Claing et al. 2001; Shenoy und Lefkowitz 2003). Nun wird der GPCR
entweder über Lysosome degradiert oder über „Recycling“-Endosome resensitiviert und
zurück zur Plasmamembran rekrutiert (Moore et al. 2007). Sieben humane GRK sind bei
der Sensitivierung von GPCR beschrieben, die in visuelle GRK (GRK1, GRK7), in
β-Adrenorezeptor-Kinasen (GRK2, GRK3) und in GRK4 (GRK4, GRK5, GRK6)
unterteilt werden (Penela et al. 2010).
In S. cerevisiae phosphorylieren Caseinkinasen (YCK1 YCK2, YCK3) den GPCR und
anstelle von Arrestin vermittelt Ubiquitin die Internalisierung des Rezeptors ins Zellinnere
sowie die Degradation des Rezeptors (Hicke et al. 1998; Panek et al. 1997). Eine
Resensitivierung des Rezeptors fehlt in der Hefe, da immer ein kompletter Abbau erfolgt.
Das Signal wird an der Plasmamembran wieder durch kontrolliert neu synthetisierte GPCR
aufgenommen (Jenness und Spatrick 1986).
3.2. Negative Regulation durch Hemmung der G-Protein-Aktivierung Ein weiterer Weg der negativen Regulation erfolgt über die Hemmung des G-Proteins, bei
der die Gruppe der Regulatoren des G-Protein-Signalweges (RGS-Proteine) eine wichtige
Rolle spielt und die im Folgenden beschrieben wird.
3.2.1. GAP - GTPase aktivierende Proteine GTPase aktivierende Proteine (GAPs) fungieren als negative Regulatoren im
Aktivierungszyklus von G-Proteinen. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde ein
RGS-Protein mit putativer GAP-Aktivität in S. macrospora identifiziert, weshalb auf diese
Gruppe von Regulatoren in diesem Kapitel detaillierter eingegangen wird, die GAPs der
monomeren G-Proteine werden jedoch nicht berücksichtigt (Übersicht bei Scheffzek und
Ahmadian 2005). GTPase aktivierende Proteine binden exklusiv an aktiviertes Gα-GTP
und wirken direkt auf die Inaktivierung des G-Proteins, in dem sie die intrinsische
GTPase-Aktivität um den Faktor 100 beschleunigen (Berman et al. 1996). Aufgrund
dessen werden sie als RGS-Proteine (Regulatoren des G-Protein-Signalweges) bezeichnet
und ihre Existenz konnte die Diskrepanz zwischen niedrigen GTPase-Aktivitäten, die bei
in vitro aufgereinigten Gα-Untereinheiten ermittelt werden, und den Messungen einer
I Einleitung 13
schnellen Inaktivierung der GPCR-vermittelten Signaltransduktionen in vivo aufklären
(Arshavsky und Pugh 1998; Zerangue und Jan 1998). Die ersten RGS-Proteine wurden
1996 in Saccharomyces cerevisiae (SST2 für super sensitive to pheromone 2) und
Caenorhabditis elegans (EGL-10 für EGg laying defective) beschrieben.
Das RGS-Protein SST2 aus S. cerevisiae wurde anhand einer Deletionsmutante identifiziert, die im Pheromon-induzierten Zellzyklus-Arrest verharrte. Die fehlende Adaption entstand durch Verlust der GAP-Aktivität (Chan und Otte 1982a, b; Dohlman et al. 1996). Das RGS-Protein EGL-10 aus C. elegans wurde ebenfalls durch die Generierung einer Deletionsmutante identifiziert, deren Phänotyp sich in einer veränderten Frequenz der abgelegten Eier zeigt, die bei C. elegans G-Protein-vermittelt wird und EGL-10 somit als GAP für die Gα-Untereinheit GOA-1 wirkt (Koelle und Horvitz 1996).
Anhand von Sequenzvergleichen mit SST2 und EGL-10 konnte ebenfalls das erste humane
RGS-Protein, GAIP (G alpha interagierendes Protein) identifiziert werden (De Vries et al.
1995). Die folgende Tabelle 2 zeigt alle bislang identifizierten RGS-Proteine im Menschen
und in der Hefe. Ihre Domänenstruktur und speziell die Homologie in der ungefähr 120
Aminosäuren großen RGS-Domäne stellt die Grundlage dieser Klassifizierung dar (nach
Neubig und Siderovski 2002; Siderovski und Willard 2005). Die neun Familien A-H
werden oft nochmals in zwei Gruppen unterteilt, A-D mit RGS-Domäne und E-H mit einer
RGS-homologen Domäne (RH). Die RGS-Box, die aus neun α-Helices aufgebaut ist,
bindet innerhalb der Switch-Regionen der Gα-Untereinheit und ist essentiell für die
GAP-Aktivität von RGS-Proteinen (Berman et al. 1996; de Alba et al. 1999; Popov et al.
1997; Tesmer et al. 1997; Watson et al. 1996). Alle G-Proteine werden von RGS-Proteinen
mit starker Spezifität zu den jeweiligen Unterfamilien reguliert. Die meisten RGS-Proteine
(Familie A-D) wirken auf Gi/o (Cowan et al. 1998; De Vries et al. 1996; Zhou et al. 2001).
G-Proteine der Gq-Familie werden sowohl von Familie B als auch von GRK2 aus Familie
G inaktiviert (Carman et al. 1999; Druey et al. 1999). Familie F wirkt als GAP auf G12α
und SNX13 (Familie H) ist das erste GAP, welches auf Gsα wirkt (Kozasa et al. 1998;
Zheng et al. 2001). Neben der RGS-Box weisen die RGS-Proteine weitere konservierte
Domänen auf, die Funktionen vermitteln, die ihre GAP-Aktivität modulieren oder von
dieser unabhängig sind (Siderovski und Willard 2005). So wird beispielsweise die
membranassoziierte Lokalisation vermittelt, um in die Nähe der Zielproteine zu gelangen,
wie es für DEP-Domänen aus Familie C, PX und PXA-Domänen aus Familie H oder die
PH-Domäne der RGS-Proteine aus den Familien F und G der Fall ist (Hu und Wensel
2002; Kozasa et al. 1998; Zheng et al. 2001).
I Einleitung 14
Tabelle 2: RGS-Proteine mit Domänenstruktur bei H. sapiens und S. cerevisiae1. Angegeben sind der Organismus, die RGS-Familie, das RGS-Protein, die beschriebene GAP-Aktivität und die jeweilige Domänenstruktur des repräsentativen Vertreters jeder Familie, der fett markiert dargestellt ist. Abk.: Cys: poly-Cystein, RGS: Regulatoren des G-Protein-Signalweges, DEP: Dishevelled, EGL-10 und Pleckstrin, GGL: G-Protein Gamma ähnlich, PDZ: PSD95/Dlg/ZO-1-Homologie, PTB: Phosphotyrosin-Bindedomäne, RBD: Ras-Bindedomäne, GoLoco: Gαi/o-Loco Interaktion, βCat: β-Catenin, GSK3β: Glukogen Synthase-Kinase 3β, PP2A: Protein Phosphatase 2A, DIX: Dishevelled, DH: Dbl-Homologie, PH: Pleckstrin-Homologie, TM: Transmembrandomäne, PXA: Phox-assoziiert, PX: Phox, H.s.: Homo sapiens, S.c.: Saccharomyces cerevisiae
RGS- Familie
RGS- Protein
GAP- Aktivität Domänenstruktur (schematisch)2
H.s.
A/RZ RGS17
Gi RGS19 RGS20
B/R4
RGS1
Gi, Gq
RGS2 RGS3 RGS4 RGS5 RGS8 RGS13 RGS16 RGS18 RGS21
C/R7
RGS6
Gi RGS7 RGS9
RGS11
D/R12 RGS10
Gi RGS12 RGS14
E/RA Axin, Axin2 /
F/GEF
p115-Rho-GEF
G12 LARG PDZ-
RhoGEF G/GRK GRK1,2-7 Gq
H/SNX SNX13
Gs SNX14 SNX25
D-AKAP2 / RGS22 G12/13, Gq
S.c.
RGS2 / RAX1 GPA2 SST2 / MDM1 GPA1
1nach Neubig und Siderovski 2002, 2nach Siderovski und Willard 2005
I Einleitung 15
RGS-Proteine können auch unabhängig von ihrer GAP-Funktion auf die
Signaltransduktion wirken, wie bei Vertretern aus Familie C beschrieben wurde. Diese
binden über ihre GGL–Domäne an Gβ und blockieren somit eine Gγ-Anbindung, was eine
Reassoziation des heterotrimeren G-Proteins durch Gα verhindert (Posner et al. 1999;
Snow et al. 1998). Auch RGS-Proteine der Familie D (RGS 12/14) wirken neben ihrer
GAP-Funktion, über die GoLoco-Domäne als GDIs hemmend auf die G-Proteine (Kimple
et al. 2001; Siderovski et al. 1999). Die G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen aus der
Familie G und ihre negative Regulation auf Rezeptoren wurden oben bereits beschrieben.
Ihre GAP-Aktivität auf Gqα-Untereinheiten ist sehr gering, so dass ihre Regulation stärker
über die GPCRs als über die G-Proteine erfolgt (Carman et al. 1999). GAP-Aktivität bei
Vertretern der Familie E konnte bisher noch nicht ermittelt werden, sondern wird nur durch
ihre homologe Domänenstruktur postuliert. Die RhoGEFs, die als Gα-Effektoren bekannt
sind, gehören zur Familie F und besitzen GEF- und GAP-Aktivität. Sie aktivieren Ras-
Homologe und hemmen G12/13 (Hart et al. 1998; Kozasa et al. 1998). Eines der letzten
beschriebenen RGS-Proteine, RGS22, interagiert mit G12/13 und Gq in der Spermiogenese
bei Säugetieren (Hu et al. 2008b).
In S. cerevisiae sind vier RGS-Proteine beschrieben worden (Chasse et al. 2006). Diese
weisen analog zu ihren humanen Verwandten unterschiedliche Domänenarchitekturen auf
(Tab. 2). RGS2 und RAX1 besitzen, wie die Vertreter der humanen RGS-Familien A und
B, nur eine RGS-Box als funktionelle Domäne. Bei RAX1 deuten putative
Transmembrandomänen auf eine Membranintegration hin. SST2 besitzt neben der
RGS-Domäne noch zwei DEP-Domänen, wodurch es Vertretern der humanen C-Familie
gleicht. Für RGS2 und SST2 sind GAP-Aktivitäten in unabhängigen Signaltransduktionen
beschrieben. RGS2 inaktiviert die Gα-Untereinheit GPA2 und den darüber vermittelten
cAMP-Signalweg innerhalb der Wahrnehmung von Glukose (Kap. 2.2.2.) (Versele et al.
1999). SST2 reguliert die Pheromonantwort durch seine GAP-Aktivität auf die involvierte
Gα-Untereinheit GPA1 (Ballon et al. 2006). Das vierte Protein MDM1 ist ein Sonderfall
innerhalb der RGS-Proteine, da die Zugehörigkeit zu den RGS-Proteinen nicht eindeutig
geklärt ist. Chasse und Mitarbeiter bezeichnen es als RGS-Protein, obwohl ihm eine
klassische RGS-Domäne fehlt (Zheng et al. 2004). RAX1 und MDM1 interagieren mit
GPA1, jedoch viel schwächer als SST2 (Chasse et al. 2006). Zusammenfassend zeigt sich
in S. cerevisiae analog zum Menschen eine Spezifität von RGS-Proteinen zu einzelnen
Gα-Untereinheiten (Tab. 2). Mit den beiden Paaren aus GPA1 und SST2 bzw. GPA2 und
RGS2 bildet die Hefe für jedes G-Protein einen prozessspezifischen GAP aus.
I Einleitung 16
3.2.2. GDI - Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren Im Gegensatz zu RGS-Proteinen oder G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen (GRKs)
inaktivieren Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren (GDIs) nicht direkt das G-
Protein bzw. den GPCR, sondern blockieren durch Bindung an Gα die Reassoziation mit
Gβγ und die Bildung des heterotrimeren G-Proteins am GPCR. In diesem Zusammenhang
wird von einem „ungekoppelten“ Rezeptor gesprochen, da Gβγ von Gα ungebunden
vorliegen und die Aktivierung der Gβγ- Effektoren unabhängig von Gα verlängert wird
(De Vries et al. 2000; Kimple et al. 2001; Peterson et al. 2000; Takesono et al. 1999). Das
für GDI charakteristische 19 Aminosäuren große GoLoco-Motiv bildet strukturell eine
α-Helix aus, die bei Bindung von Gα im Bereich der Switch II-Region und der dritten
α-Helix, die Struktur derart modifiziert, dass eine Gβ-Bindung nicht mehr vollzogen
werden kann (Kimple et al. 2002). Die bislang beschriebenen Vertreter der GDIs aus
Säugern weisen entweder ein einziges GoLoco-Motiv (RGS12, RGS14, RAP1GAP) oder
mehrere GoLoco-Motive auf (GPSM1-4 für G-protein modulator protein) und wirken
exklusiv auf G-Proteine der Klasse Gi/o (Übersicht bei Siderovski und Willard 2005). In
Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans interagieren Proteine mit GoLoco-
Motiven mit Gα-Untereinheiten und üben eine essentielle Funktion für die Ausbildung von
asymmetrischen Zellteilungen aus (Gonczy et al. 2000; Schaefer et al. 2000). Kürzlich
wurde in S. cerevisiae mit dem eukaryotischen Translations-Initiationsfaktor, eIF5 der
erste GDI beschrieben, der auf das G-Protein eIF2 wirkt und an der Proteinsynthese
beteiligt ist (Jennings und Pavitt 2010). Nachdem mit den RGS-Proteinen, den GRKs und
den GDIs, negative Regulatoren der Signaltransduktion beschrieben wurden, wird zum
Ende der Einleitung mit Guanosin-Austauschfaktoren die positive Regulation vorgestellt.
3.2.3. Positive Regulation durch Guanosin-Austauschfaktoren - GEF Die bekanntesten Vertreter der Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange
factor) sind membranständige GPCR, die durch Konformationsänderung das
Gα-gebundene GDP durch ein GTP ersetzen, wodurch Gα aktiviert wird. Neben diesen
Rezeptor-GEFs konnte in C. elegans mit RIC-8, der erste „non-receptor“-GEF beschrieben
werden, der unabhängig von Rezeptoren eine GEF-Aktivität auf Gα-Untereinheiten ausübt
(Miller et al. 1996). Homologe von RIC-8 konnten in D. melanogaster und in Säugern
identifiziert werden, in denen sie ebenfalls GEF-Aktivität aufweisen (Tall et al. 2003;
Wang et al. 2005). Bei Säugern gibt es RIC-8 in zwei Isoformen RIC-8A (Synembryn) und
I Einleitung 17
RIC-8B, von denen RIC-8A eine GEF-Aktivität auf G-Proteine der Klassen Giα, Goα und
Gqα und RIC-8B auf Gqα und Gsα ausübt (Tall et al. 2003). Die Vermutung, dass RIC-8 als
Rezeptor-unabhängiger GEF eine Strukturähnlichkeit zu heptahelikalen Rezeptoren
aufweist, konnte durch biophysikalische Strukturberechnungen des RIC-8-Homologs in
Xenopus laevis, xRIC-8, gestützt werden (Figueroa et al. 2009). Ein Unterschied zu einem
Rezeptor-GEF besteht darin, dass RIC-8 nur mit Gα interagiert, wenn dieses frei, d.h. vom
Gβγ-Dimer gelöst, vorliegt (Tall et al. 2003). Die Funktionen von RIC-8 sind in der
Ausbildung der asymmetrischen Zellteilung bei C. elegans und D. melanogaster sowie
innerhalb eines Signalkomplexes beim Menschen, zur Orientierung des Spindelapparates
während der Mitose beschrieben (Afshar et al. 2004; Wang et al. 2005; Woodard et al.
2010). In S. cerevisiae konnten Lee und Dohlman mit ARR4 ebenfalls einen Rezeptor-
unabhängigen Guanosin-Austauschfaktor identifizieren, der analog zu RIC-8, nur freies Gα
bindet. Die GEF-Funktion von ARR4 ist abhängig von Kupfer und kann funktionell der
Pheromonantwort zugeordnet werden. Diese Beobachtung zeigt, dass ARR4 nicht
essentiell für die Pheromonantwort ist, aber eine unterstützende Rolle für den
Pheromonrezeptor übernimmt (Lee und Dohlman 2008). Zum Abschluss der Einleitung
sind die wichtigsten Aspekte der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und ihrer
Regulation kurz zusammengefasst.
4. Zusammenfassung: G-Protein-vermittelte Signaltransduktionen steuern ein großes Spektrum an Prozessen bei
höheren Eukaryoten wie dem Menschen und niederen Eukaryoten wie der Hefe. Dabei
besteht das System stets aus einem konserviert vorliegenden Kernkomplex aus G-Protein-
gekoppelten Rezeptoren und G-Proteinen. Die Auswahl der GPCR-G-Protein-Paare und
die Aktivierung sind dabei sehr strikt und prozessspezifisch festgelegt. In den letzten
Jahren wurde das Modell der Signaltransduktion aus GPCR, G-Protein und Effektoren
durch Identifikation regulatorischer Faktoren weiter vervollständigt. Die Existenz von
RGS-Proteinen, GDIs und GEFs mit ihren spezifischen Wirkmechanismen, deutet dabei
auf einen weitaus komplexeren Aufbau von G-Protein-vermittelten Signalwegen hin, als es
anhand vorheriger Beschreibungen vermuten ließ. Erkenntnisse über diese Regulation
werden dazu beitragen, dass das Verständnis der G-Protein-vermittelten
Signaltransduktionen verbessert wird.
II Problemstellung 18
II Problemstellung
Studien von durch heterotrimere G-Proteine vermittelten Signaltransduktionen sind seit der
Entdeckung von Rodbell und Kollegen Anfang der 1970er Jahre bis heute Gegenstand
aktueller Forschung (Rodbell et al. 1971). In diesem Kontext wurden insbesondere Säuger
mit ihrem komplex aufgebauten System als auch die Hefe Saccharomyces cerevisiae mit
einer weniger komplex aufgebauten Signaltransduktion, als Modellorganismen verwendet.
Dabei konnte ein Kernkomplex aus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und
G-Proteinen identifiziert werden, der die Weiterleitung der Signale steuert und der in allen
bislang beschriebenen Systemen vorliegt. Die Homologie im Aufbau der
Signaltransduktion wurde bereits für Studien genutzt, in denen mittels chimärer
Gα-Strukturen vertebrale GPCR mit der Pheromonantwort in der Hefe verknüpft wurden,
um bis dahin unbekannte Faktoren aus dem vertebralen System identifizieren zu können
(Cismowski et al. 1999). Nachteilig an diesen Studien ist der Kompromiss, der
eingegangen werden muss, da Prozesse eines mehrzelligen Organismus (Säuger), in einem
Organismus rekapituliert werden, der stets in einer einzelligen Lebensform vorliegt und
geringere Zelldifferenzierungsstrukturen aufweist.
Vor diesem Hintergrund betrachtet, stellt die Gruppe der filamentösen Pilze eine
ausgezeichnete Möglichkeit dar, Studien der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion an
mehrzelligen Organismen mit einer großen Anzahl unterschiedlicher
Zelldifferenzierungsstadien zu untersuchen (Engh et al. 2010). Aus diesem Grund wurden
vermehrt Studien in filamentösen Pilzen durchgeführt, in deren Verlauf G-Protein-
gekoppelte Rezeptoren und G-Proteine identifiziert wurden (Hicks et al. 1997;
Kamerewerd et al. 2008; Mayrhofer und Pöggeler 2005; Turner und Borkovich 1993).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Schlauchpilz Sordaria macrospora für Studien der
G-Protein-vermittelten Signaltransduktion verwendet. Als homothallischer Ascomycet ist
S. macrospora zur Selbstung befähigt, so dass er ohne Anwesenheit eines
Kreuzungspartners seinen Lebenszyklus im Labor innerhalb von sieben Tagen vollzieht
(Esser und Straub 1958). Der Lebenszyklus beginnt damit, dass sich ausgehend von einer
Ascospore ein weit verzweigtes vegetatives Myzel bildet, an dem sich Ascogone
abschnüren und diese über das Stadium der Protoperithezien (Vorfruchtkörper) zu reifen
Fruchtkörpern, den Perithezien, heranreifen. Innerhalb dieser Perithezien entwickeln sich
Asci mit jeweils acht linear angeordneten Ascosporen, die durch Meiose I, Meiose II und
postmeiotischer Mitose entstehen. Im reifen Zustand werden die Sporen aus dem
II Problemstellung 19
Perithezium herausgeschleudert. Nach der Keimung der Sporen beginnt ein neuer Zyklus
(Esser und Straub 1958). Ein weiterer Vorteil dieser Lebensweise ist, dass rezessive
Mutationen ohne nachfolgende Kreuzung direkt im Phänotyp detektierbar sind, wodurch in
den letzten Jahren eine Reihe von Entwicklungsmutanten analysiert und so Faktoren
identifiziert werden konnten, die an der Fruchtkörperentwicklung beteiligt sind
(Bloemendal et al. 2010; Engh et al. 2007; Masloff et al. 1999; Nowrousian et al. 2007;
Nowrousian et al. 1999; Pöggeler et al. 2006). Die essentielle Funktion einer G-Protein-
vermittelten Signaltransduktion innerhalb dieser Fruchtkörperentwicklung konnte anhand
genetischer Studien beschrieben werden (Kamerewerd et al. 2008; Mayrhofer et al. 2006).
In S. macrospora wurden zwei Gene für Pheromonrezeptoren, pre1 und pre2 (pheromone
receptor), mit hoher Homologie zu ste2 und ste3 aus S. cerevisiae mitsamt ihrer Liganden
ppg1 und ppg2 (pheromone precursor gene) identifiziert und ihre Notwendigkeit für die
sexuelle Entwicklung beschrieben (Mayrhofer und Pöggeler 2005; Mayrhofer et al. 2006;
Pöggeler 2000; Pöggeler und Kück 2001). Die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion
wurde darüber hinaus durch Identifikationen dreier Gα-Untereinheiten, gsa1-3 (G-Protein
Sordaria alpha subunit) sowie einer Adenylatzyklase, sac1 (Sordaria adenylyl cyclase 1),
ergänzt (Kamerewerd et al. 2008). Eine Übersicht identifizierter Gene für GPCR und
G-Proteine aus S. macrospora, Homo sapiens und S. cerevisiae zeigt Tabelle 3.
Tabelle 3: Aufstellung identifizierter Gene für GPCR und G-Protein-Untereinheiten
H. sapiens S. cerevisiae S. macrospora
Gα 16 Gene/ 21 Proteine
unterteilt in 4 Klassen: Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13
1/2
Gpa1p (Gi)4 Gpa2p (Gi/s)5
GSA1 (Gi)9 GSA29/11
GSA3 (Gi/s)9
Gβ 5 Gene/ 6 Proteine1/2 Ste4p6 GSB11
Gγ 12 Gene1/2 Ste18p6 GSG11
GPCR
802 Gene in 5 Klassen2/3: G: 15 GPCR R: 701 GPCR A: 24 GPCR F: 24 GPCR S: 15 GPCR
Ste2p7 Ste3p7 Gpr1p8
PRE110 PRE210 GPR-111
(GPR-2)11 (GPR-3)11 (GPR-4)11 (GPR-5)11 (GPR-6)11 (NOP-1)11 (ORP-1)11
1Simon et al. (1991); 2Venter et al. (2001); 3Fredriksson et al. (2003); 4Nakafuku et al. (1987); 5Nakafuku et al. (1988); 6Whiteway et al. (1989); 7Nakayama et al. (1985); 8Yun et al. (1997); 9Kamerewerd et al. (2008); 10Pöggeler und Kück (2001), 11 Nowrousian et al. (2010)
II Problemstellung 20
Aktuell konnten im Zuge der Genomsequenzierung von S. macrospora acht weitere
putative GPCR sowie jeweils eine Gβ- und eine Gγ-Untereinheit identifiziert werden
(Tab. 3) (Nowrousian et al. 2010). Zur Charakterisierung der G-Protein-vermittelten
Signaltransduktion und ihren Einfluss auf die Fruchtkörperentwicklung in S. macrospora
erzeugten Kamerewerd et al. Deletionsmutanten der drei Gα-Untereinheiten sowie der
Adenylatzyklase und kreuzten diese untereinander und mit Deletionsmutanten von pre1,
pre2 sowie dem Transkriptionsfaktor ste12. Die daraus resultierenden Ergebnisse wurden
zu einem Modell zusammengefasst, das in Abbildung 2 dargestellt ist. Innerhalb dieser
Signaltransduktion laufen zwei Signalwege parallel voneinander ab, von denen die
Pheromonantwort über die beiden Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 initiiert wird, die
daraufhin das Signal nach Bindung von PPG1 bzw. PPG2 über die Gα-Untereinheiten
GSA1 und GSA2 an den Transkriptionsfaktor STE12 weiterleiten, der anschließend
vielfältige Prozesse in der Fruchtkörperentwicklung reguliert. Bei der Pheromonantwort ist
GSA1 der Hauptfaktor, da GSA2 bei Verlust von GSA1 diesen funktionell nicht ersetzen
kann. Der parallel verlaufende cAMP-Signalweg beginnt über einen bislang nicht
identifizierten Rezeptor, der GSA3 aktiviert. GSA3 wiederum regt die Adenylatzyklase
SAC1 an, wodurch Prozesse in der Ascosporenkeimung bei S. macrospora gesteuert
werden. Beide Signalwege sind über die Interaktion von GSA1 und SAC1 miteinander
verbunden.
Abbildung 2: Modell der durch heterotrimere G-Proteine vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora (nach Kamerewerd et al. 2008). Innerhalb der Pheromonantwort leiten die beiden Gα-Untereinheiten GSA1 und GSA2 das Signal von PRE1 und PRE2 an STE12 weiter, um Prozesse in der Fruchtkörperentwicklung zu steuern. GSA3 hingegen ist im parallel verlaufenden cAMP-Signalweg involviert und steuert über Interaktion mit der Adenylatzyklase SAC1 die Ascosporenkeimung. Prozesse von denen nicht geklärt ist, ob sie direkt oder indirekt über bislang ungeklärte Faktoren ablaufen, sind in den jeweiligen Formen der Faktor mit einem (?) gekennzeichnet.
II Problemstellung 21
Neben den beschriebenen Faktoren fehlen aber noch zahlreiche interagierende
Komponenten, so dass das Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifikation und
Charakterisierung weiterer Faktoren war, die über das bekannte Modell hinaus, an der
G-Protein-vermittelten Signalweiterleitung beteiligt sind. Die zentrale Rolle von GSA1
innerhalb dieser Signaltransduktion, die Verbindung zu beiden Signalwegen und die damit
assoziierte Funktion während der Fruchtkörperentwicklung prädestinierten GSA1 in
diesem Zusammenhang als Ausgangspunkt bei der Suche nach neuen Faktoren. Dabei
sollten konstitutive Formen von GSA1 mittels direkter Mutagenese des Gens gsa1
hergestellt und als Beute innerhalb eines Hefe-2-Hybrid-Systems verwendet werden, um
vom Aktivierungsstatus der Gα-Untereinheit abhängige Interaktionspartner identifizieren
zu können. Mögliche Zielproteine waren Regulatoren oder Effektoren, für die eine
Spezifität zu Gα-Untereinheiten, in Abhängigkeit von ihrem Aktivitätszustand, d.h. von
ihrem gebundenen Nukleotid, beschrieben ist (Berman et al. 1996; Tall et al. 2003). Die
einzelnen Aminosäuren, die zur Herstellung konstitutiver Formen der Gα-Untereinheiten
zu modifizieren waren, sind bekannt gewesen und analoge konstitutive Varianten in Pilzen
beschrieben worden (Apanovitch et al. 1998; Coca et al. 2000; Coleman et al. 1994;
Regenfelder et al. 1997; Yang und Borkovich 1999). Zur Bestätigung der identifizierten
Interaktionen sollten Ko-Immunopräzipitationsanalysen durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit sollte die physiologische Charakterisierung von
S. macrospora-Stämmen sein, die mit DNA dieser konstitutiven GSA1-Formen
transformiert werden sollten. Die Möglichkeit für diese Untersuchung einen
Deletionsstamm von gsa1 zu verwenden, schließt einen Effekt der Wildtyp-Kopie von
gsa1 aus. Für die vorliegende Arbeit sollte in diesem Zusammenhang die ∆gsa1/∆gsa2-
Deletionsmutante als Rezipient verwendet werden. Aus vorherigen Studien war bekannt,
dass eine Transformation mit gsa1 ausreicht, um den sterilen Phänotyp der Doppelmutante
zu komplementieren, so dass dieser Stamm wieder eine vollständige Fertilität aufwies
(Kamerewerd et al. 2008).
Ziel war es hierbei anhand von Transformanten einen Effekt der jeweiligen konstitutiven
Form der Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora beschreiben zu können, der auf die
Entwicklung des Hyphenpilzes ausgeübt wird.
III Material und Methoden 22
III Material und Methoden 1. Material 1.1. Stämme Escherichia coli XL1-Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac-, [F',
proAB, lacIq ZΔM15, Tn10(tetr)]; Rezipientenstamm zur schnellen und umfangreichen Replikation von Plasmiden (Bullock et al. 1987).
BL21-Gold (DE3) E. coli B F- ampT hsdS(rB-mB-) dcm+ Tet’, galλ(DE3) endA The. Rezipientenstamm zur Expression heterologer Gene (Weiner et al. 1994)
Sordaria macrospora In Tabelle 4 befinden sich alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme von S. macrospora, die mit ihrem Genotyp und der jeweiligen Referenz aufgeführt sind. Tabelle 4: Verwendete Stämme von Sordaria macrospora
Stamm Genotyp Referenz
S91327 Wildtyp Stammsammlung AMB
S96888 ∆ku70::nat, natR (Pöggeler und Kück 2006)
S93465 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, hygR (Kamerewerd et al. 2008)
CA_3 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, mit pCA_nat, hygR, natR diese Arbeit
CI_7 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, mit pCI_nat, hygR, natR diese Arbeit
III Material und Methoden 23
Saccharomyces cerevisiae In Tabelle 5 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme von S. cerevisiae mit ihrem Genotyp und der jeweiligen Referenz aufgelistet. Zur besseren Übersicht wurden die Stämme anhand ihres Verwendungszwecks unterteilt. Tabelle 5: Verwendete S. cerevisiae-Stämme
Stamm Genotyp Referenz Rezipientenstämme
AH109
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ, MEL1
(James et al. 1996) Clontech, Heidelberg
Y187
MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, met-, gal80∆, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1
(Harper et al. 1993)
PJ69-4a
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3- 200, gal4Δ, gal80Δ, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MET2::GAL7UAS-GAL7TATA-lacZ
(James et al. 1996)
Hefestämme für die Verwendung innerhalb des Y2H-Screens AH109 + pGADT7-Rec + cDNA Bank
AH109, transformiert mit Expressionsplasmid pGADT7 + cDNA Bank, leu+
Teichert, persönliche Mitteilung
Y187+pB1_CA Y187, transformiert mit Expressionsplasmid pB1_CA, trp+ diese Arbeit
Y187+pB1_CI Y187, transformiert mit Expressionsplasmid pB1_CI, trp+ diese Arbeit
Hefestämme für die Verwendung in direkten Interaktionsstudien Interaktionsstudien mit VPS34 und GSA1-3, GSA1_CA, GSA1_CI
PJ69-4a+pA1_CA +pBV34
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1_CA +pBV34n
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1_CA +pBV34c
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1_CI +pBV34
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit
III Material und Methoden 24
Stamm Genotyp Referenz
PJ69-4a+pA1_CI +pBV34n
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1_CI +pBV34c
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1 +pBV34
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1 +pBV34n
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1 +pBV34c
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA2 +pBV34
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA2 und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA2 +pBV34n
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA2 und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA2 +pBV34c
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA2 und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA3 +pBV34
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA3 und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA3 +pBV34n
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA3 und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA3 +pBV34c
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA3 und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit
Interaktionsstudien mit ROG1 und GSA1_CA
PJ69-4a+pA1_CA +pBROG1
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBROG1, trp+, leu+ diese Arbeit
Kontrollen innerhalb der Interaktionsstudien
PJ69-4a+pA1_CA +pGBKT7
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1_CI +pGBKT7
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA1 +pGBKT7
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit
III Material und Methoden 25
Stamm Genotyp Referenz
PJ69-4a+pA2 +pGBKT7
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA2 und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pA3 +pGBKT7
PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA3 und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit
PJ69-4a+pGBKT7 PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pGBKT7, trp+
diese Arbeit
1.2. Plasmide Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in Tabelle 6 aufgelistet. Zur besseren Übersicht sind sie anhand ihres Verwendungszwecks eingeteilt. Tabelle 6: Auflistung der verwendeten Plasmide
Plasmid Rezipient Charakteristika Referenz Ausgangsplasmide
pGBKT7 Expressionsvektor zur Herstellung von Fusionsproteinen mit GAL4-Bindedomäne und cMYC-Tag für Y2H-Studien
Clontech, Heidelberg
pGAD7
Expressionsvektor zur Herstellung von Fusionsproteinen mit GAL4- Aktivierungsdomäne und HA-tag für Y2H-Studien
Clontech, Heidelberg
pG-Nat1 In vitro Transpositionsvektor (Dreyer et al. 2007)
pGADT7-Derivate für Interaktionsstudien
pA1CA pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit Q204L Mutation diese Arbeit
pA1CI pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit G203R Mutation diese Arbeit
pA1 pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora diese Arbeit
pA2 pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa2 aus S. macrospora diese Arbeit
pA3 pGADT7 1,1 kb NdeI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa3 aus S. macrospora diese Arbeit
pGBKT7-Derivate für Interaktionsstudien
pBROG1 pGBKT7 3,8 kb NdeI/PstI cDNA-Volllänge von smrog1aus S. macrospora diese Arbeit
III Material und Methoden 26
Plasmid Rezipient Charakteristika Referenz
pB1CA pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit Q204L Mutation diese Arbeit
pB1CI pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit G203R Mutation diese Arbeit
pB1 pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora diese Arbeit
pBV34 pGBKT7 2,7 kb NdeI/PstI cDNA-Volllänge von smvps34 aus S. macrospora diese Arbeit
pBV34n pGBKT7 1 kb NdeI/EcoRI cDNA Fragment des N-Terminus (1-1014 bp) von smvps34 aus S. macrospora
diese Arbeit
pBV34c pGBKT7 1,7 kb EcoRI/PstI cDNA Fragment des C-Terminus (1015-2753 bp) von smvps34 aus S. macrospora
diese Arbeit
Komplementationsvektoren für Transformation in ∆gsa1/∆gsa2
pCA_nat pDCA
1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora mit Q204L- Mutation, nat1 Resistenzgen mittels in vitro-Transposition durch pG-Nat1 eingebracht
diese Arbeit
pCI_nat pDCI
1 kb EcoRI/SmaI cDNA Fragment des gsa1-Gens aus S. macrospora mit G203R- Mutation, nat1 Resistenzgen mittels in vitro-Transposition durch pG-Nat1 eingebracht
diese Arbeit
Überexpressionsstudien in E.coli
pSG3-3 E. coli-Überexpressionsvektor, mit cDNA-Volllänge von gsa1, C-terminaler StrEP-tag-Sequenz,
diese Arbeit
1.3. Verwendete Starteroligonukleotide Nachfolgend zeigt Tabelle 7 alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide aufgelistet. Die für Klonierungen relevanten Schnittstellen sind unterstrichen dargestellt. Zur Ausgangssequenz veränderte Basen, die für eine direkte Mutagenese eingesetzt wurden, sind durch fettgedruckte kleine Buchstaben gekennzeichnet. Die Synthese der Oligonukleotide erfolgte durch die Firmen Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) und Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland).
III Material und Methoden 27
Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide
Oligonukleotid Sequenz (5' - 3') Spezifität
gsa1_f GAATTCATGGGTTGCGGAATGAGTAC gsa1 (1-20 nt)
gsa1_r CCCGGGTCAGATCAAACCGCAGAGA gsa1( 1062-1044 nt)
gsa2_f GAATTCATGTGTTTCGGGGGTCGTGG gsa2 (1-20 nt)
gsa2_r CCCGGGTTACAGGATAAGTTGTTTGA gsa2 (1068-1049 nt)
gsa3_f CATATGGGCGCATGCATGAGCACG gsa3 (1-21 nt)
gsa3_r CCCGGGTCAGATTCCGGAGTCTTTAAG gsa3 (1068-1048 nt)
q204l_f CGACGTCGGTGGACtGCGTAGCG gsa1 (597-619 nt) Q204L-Mutation
g203r_f CGACGTCGGTcGACAGCGTAGCG gsa1 (597-619 nt) G203R-Mutation
h1m1_f CATATGGCTCTTCGAGGGAGAG Smrog1 (1-19 nt)
h1m1_r CGAGGCGACGCAAGTAAACC Smrog1 (1129-1110 nt)
h2m1_f GCAGGAGAATGTCGACCAGG Smrog1 (1092-1111 nt)
h2m1_r CTGCAGTTACGCCTCTGGCTGCTGC Smrog1 (3789-3771 nt) 1.4. Chemikalien Acrylamid (AppliChem), Agar-Agar (Kobe), Agarose (Lonza), Ameisensäure (Riedel de Haën), Ammoniumsulfat (Baker), Ampicillin hydrochlorid (Serva), APS = Ammoniumperoxidsulfat (Baker), Bactotrypton (Difco), „Bacto“ Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids (Difco), β-Mercaptoethanol (Roth), Biomalz (Dachser), Borsäure (AppliCem), Bromphenolblau (Merck), Bradford-Reagens (Biorad), BSA = Rinderserumalbumin (Serva), Calciumchlorid (Riedel de Haën), Chloroform (VWR-International), Coomassie Brilliant Blue R 250 (Serva), D(+)-Glucose-Monohydrat (AppliChem), Desoxynukleosid-5’-Trisphosphate (Roth), DTT = Dithiothreitol (AppliChem), EDTA = Ethylendianitrilotetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (Boehringer), Essigsäure (Riedel de Haën), Ethanol (VWR-International), Ethidiumbromid (AppliChem), Formaldehyd (VWR International), Formamid (VWR Interantional), Gene Ruler DNA Ladder Mix (Fermentas), Glycin (Riedel de Haën), Glycerin (Riedel de Haën), Hefeextrakt (Difco), Hygromycin B (Calbiochem), Isopropanol (VWR International), Isoamylalkohol (Riedel de Haën), IPTG = Isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranosid (Roth), Kaliumchlorid (Riedel de Haën) Kanamycin (AppliChem), Maismehl (Mühle Levers, Bochum), Methanol (VWR International), Natriumhydrogencarbonat (Roth), Natriumchlorid (VWR International), Natriumhydroxid (Baker), Natriumacetat (Baker), Nourseothricin (WERNER BioAgents), ONPG = 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (AppliChem), PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas), PEG 6000 = Polyethylenglykol 6000 (Fluka), Phenol (Baker), PVDF Western Blotting Membranes (Roche), Röntgenfilme (Fuji Medical X-Ray-Film), Saccharose (Baker), Salzsäure (VWR
III Material und Methoden 28
International), Sterilfilter (Milipor), SDS = Natriumdodecylsulfat (AppliChem), Serva Agar (Serva), TEMED = N, N, N’, N’,-Tetramethylethylendiamin (Merck), Tetrazyklin (Serva), Tris = Tris(hydroxylmethyl)-aminomethan (AppliChem), Triton X (Roche), Trypton (Roth), Tween®20 = Polyoxyethylenesorbitanmonolaurate (Serva), X-Gal = 5-Bromo-5-chloro-3-indoyl-beta-D-galactopyranosid (AppliChem) Radiochemikalien: [α32P]-dCTP, Aktivität 110 TBq/mmol (Hartmann Analytik) Feinchemikalien, die nicht angegeben sind, wurden in Analyse-Qualität verwendet und von den oben aufgelisteten Firmen erworben. 1.5. Enzyme DNase A (Fermentas), Glucanex 200G (Novozymes), Go-Taq-Polymerase (Promega), Klenow Polymerase (Promega), Phusion Polymerase (Finnzymes), verschiedene Restriktionsendonukleasen Typ II (Fermentas, Roche, New England Biolabs), RNase A (Fermentas), Superscript II Reverse Transkriptase (Invitrogen), T4 DNA-Ligase (Roche) 1.6. Antikörper c-Myc Monoklonaler Antikörper (1:3000) (Clontech), HA-Antikörper (1:200) (Santa Cruz), anti-Maus IgG Peroxidase gekoppelter Antikörper (1:3000) (Cell Signaling Technology), anti-Kaninchen IgG Peroxidase gekoppelter Antikörper (1:3000) (Cell Signaling Technology) 1.7. Kits DECAprime™ II Kit (Ambion), DNase A (Fermentas), E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega), GTPase assay kit (high sensitivity) (Innova Biosciences), In-Fusion® Advantage PCR Cloning Kit (Clontech), Nucleobond® AX (Macherey & Nagel), Nucleo-Spin Extract II (Macherey & Nagel), PCR-Cloning Kit (Qiagen), Yeast Buster Kit (Novagen) 1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen Tabelle 8 zeigt die in dieser Arbeit häufig verwendeten Puffer und Lösungen.
III Material und Methoden 29
Tabelle 8: Verwendete Puffer und Lösungen
Puffer Zusammensetzung Blocking-Lösung 5 % Magermilchpulver in PBS-T Puffer Blotpuffer (10x) 3 % Tris
14,41 % Glycin 0,2 % SDS
PBSKMT-Puffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 100 mM NaCl 5 mM EDTA 10 % (v/v) Glycerol 0,1 % (v/v) Triton X-100
Coomassie Färbelösung 0,2 % (w/v) Coomassie 7 % (v/v) Eisessig 50 % (v/v) Methanol
Elektrophorese-Puffer (10x) 3 % Tris 18,8 % Glycin 1 % SDS
Elutionspuffer für Streptag- Aufreinigung
Puffer W + 2,5 mM Desthiobiotin
Lysepuffer für Inclusion body- Aufreinigung
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 5 mM EDTA
Protoplasten Puffer 13 mM Na2HPO4 x 2 H2O
45 mM KH2PO4 600 mM KCl pH 6,0
Refolding Puffer für Inclusion body-Aufreinigung
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,4 M L-Arginin 1 µg/ml Leupeptin und Pepstatin 0,2 mM PMSF 0,5 mM GSSG Glutathion oxidiert 5 mM GSSH Glutathion reduziert
Regenerationspuffer für Streptag-Aufreinigung (Puffer R)
Puffer W + 1 mM HABA
Sammelgelpuffer (4x) 0,5 mM Tris/HCl 0,1 % (w/v) SDS pH 6,8
III Material und Methoden 30
STET-Puffer 50 mM EDTA 10 mM Tris 8 % Sucrose 0,5 % Triton X-100 pH 8,0
TBE Puffer 100 mM Tris/HCl 100 mM Borsäure 2 mM EDTA, pH 8,3
Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris/HCl 0,1 % (w/v) SDS pH 8,8
Tris-Glycin-Urea-Puffer 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 50 mM Glycin 8 M Urea
Waschpuffer für Streptag- Aufreinigung (Puffer W)
100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 1mM PMSF
1.9. Nährmedien Escherichia coli Luria Bertani (LB)- Medium
1 % (w/v) Bacto-Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, pH 7,2 Transformanten wurden durch Selektion auf Ampicillin oder (60 µg/ml), Kanamycin (30 µg/ml), isoliert, Festmedien mit 1,5 % (w/v) Agar-Agar; „Blau-Weiß-Selektion“ nach Zugabe von 0,004 % X-Gal sowie 0,2 mM IPTG (Ausubel et al. 1995; Ullmann et al. 1967)
SOB-Medium 2 % (w/v) Bacto Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, pH 7,5
SOC-Medium SOB-Medium + 20 mM Glukose
III Material und Methoden 31
Saccharomyces cerevisiae SD-Medium
0,67 % Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 2 % Glukose, 10 % Aminosäure-Stocklösung (10x) pH 5,8
YEPD-Medium 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Trypton, 2 % (w/v) Glukose, pH 5,8
YPDA-Medium YEPD + 0,003 % (w/v) Adeninhemisulfat Sordaria macrospora
BMM
0,8 % Biomalz in Maisextrakt, pH 6,5 Festmedien mit 1,5 % (w/v) Agar-Agar, Transformanten wurden durch Selektion auf Hygromycin B (80 U/ml), Nourseothricin (50 µg/ml) isoliert, Keimung von Einzelsporisolaten mit 0,5 % (w/v) NaAc
CM 0,15 % (w/v) KH2PO4, 0,05 % (w/v) KCl 0,05 % (w/v) MgSO4 0,37 % (w/v) NH4Cl 1 % (w/v) Glukose 0,2 % (w/v) Trypton 0,2 % (w/v) Hefeextrakt Spurenelemente pH 6,5
CMS CM-Medium + 10,8 % (w/v) Saccharose 2 % (w/v) Agar-Agar; Transformanten wurden nach Überschichtung mit NaCl Topagar (0,8 M NaCl, 0,8 % (w/v) Agar, 80 U/ml Hygromycin B, Nourseothricin (50 µg/ml)) isoliert.
1.10. Software Sequenzierungen wurden mit dem Programm „Sequence Scanner“ (Applied Biosystems) bearbeitet. Das Programm „Clone-Manager 9“ wurde innerhalb dieser Arbeit zur Ausarbeitung von Klonierungsstrategien und Sequenzvergleichen verwendet (SciEd Software). Für Bildbearbeitungen wurde die „Adobe Creative Suite 4“ von Adobe Systems Incorporated verwendet und Textverarbeitungen, Präsentationen und Tabellenkalkulationen wurden mittels Microsoft Office 2007 angefertigt. Als Geldokumentationssoftware wurde BioDoc-Analyze von Biometra verwendet.
III Material und Methoden 32
2. Methoden
Alle Standardmethoden, die innerhalb des Kapitels nicht beschrieben wurden, sind nach Sambrook et al. (2001) durchgeführt worden. 2.1. Kulturbedingungen Escherichia coli E. coli-Bakterien wurden in LB-Flüssigkulturen über Nacht (ü.N.) bei 300 rpm und 37 °C sowie auf LB-Festmedium bei 37 °C ü.N. inkubiert. Sordaria macrospora Die Anzucht von S. macrospora erfolgte in Flüssigmedium (BMM oder CM) oder auf Festmedium (BMM oder CMS) bei 27 °C und Dauerlicht. Im Falle von Einzelsporisolaten wurden die Perithezien auf Präparationsagar (6 % Agar in H2O) geöffnet und die einzelnen Sporen aus den Asci isoliert. Diese Isolate wurden auf BMM-Platten mit 0,5 % NaAc überimpft und nach der Keimung zur Selektion auf BMM-Platten angezogen, die zusätzlich mit Hygromycin B, Nourseothricin oder mit beiden Antibiotika versetzt wurden. Saccharomyces cerevisiae Die Anzucht von S. cerevisiae erfolgte auf YEPD- und auf SD-Medium. Flüssigkulturen wurden bei 200 rpm und 30 °C über Nacht inkubiert. Bei Kulturen auf Festmedien (SD, YEPD) wurde eine Inkubation bei 30 °C über mehrere Tage gewählt. Transformanten wurden aufgrund einer erworbenen Prototrophie auf Selektionsmedien identifiziert. Auf die Expression der Reportergene ade2 und his3 wurde selektioniert, um Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System zu identifizieren. 2.2. Transformationsverfahren Escherichia coli Transformationen in E. coli wurden entweder in elektrokompetenten Zellen durch Elektroporation in einem Multiporator (Eppendorf) vorgenommen oder in chemischkompetenten Zellen mittels Hitzeschock durchgeführt (Dower et al. 1988; Hanahan 1983). Saccharomyces cerevisiae Bei S. cerevisiae wurde in dieser Arbeit die Transformation mittels Elektroporation durchgeführt, bei der ein Stromfluss von 1,5 kV in einem Multiporator (Eppendorf) verwendet wurde (Becker und Lundblad 2001).
III Material und Methoden 33
Sordaria macrospora Der Hyphenpilz S. macrospora wurde über 2-3 Tage in Flüssigmedium angezogen. Die Transformation wurde mit der Protoplastierungsmethode verändert nach Skatrud et al. (1987) durchgeführt. Dazu wurde das Myzel abgenutscht und in einer Glucanex-Lösung (40 mg/ml) bis zu einer vollständigen Protoplastierung bei 27 °C inkubiert. Die gewonnenen Protoplasten wurden mit Hilfe einer Fritte (Porengröße 1, Schott) vom Myzel isoliert und nach mehrmaligen Waschschritten mit Protoplastenpuffer in Transformationspuffer aufgenommen. Dieses Volumen wurde je nach Gebrauch aliquotiert und 20 µg DNA dazugegeben. Es folgte ein 10-minütiger Inkubationsschritt auf Eis, wonach die Zellen mit 200 µl PEG 6000 vermischt wurden. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten (min) bei RT wurden die Protoplasten auf CMS-Medium ausgestrichen. Die Selektion erfolgte nach einem Tag Inkubation bei 27 °C durch das Überschichten der CMS-Platten mit einem NaCl-Topagar, der die Antibiotika Hygromycin B und/oder Nourseothricin beinhaltete. 2.3. Isolierung von Nukleinsäuren 2.3.1. Plasmid-DNA-Isolierung aus E. coli Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte anhand eines modifizierten Protokolls nach Holmes und Quigley (1981). Darüber hinaus wurde für Aufarbeitungen im Mini-Maßstab das E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega) und für Maxi-Präparationen das Nucleobond®AX Kit (Macherey & Nagel) verwendet. Diese Kits wurden nach den Vorgaben der Hersteller verwendet. 2.3.2. Plasmid-DNA-Isolierung aus S. cerevisiae Das E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega) wurde in modifizierter Ausführung ebenfalls für die Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae verwendet. Dazu wurde eine 20 ml Flüssigkultur über Nacht bei 30 °C inkubiert und bei 12000 rpm und 4 °C geerntet. Die Lyse der Zellen erfolgte mittels S1-Puffer (mit RNase) und 250 µl Glasperlen (0,25 mm). Anschließendes Vortexen unterstützte eine vollständige Lyse und Resuspendierung der Zellen. Die nachfolgenden Schritte wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 2.4. Gesamt-DNA-Isolierung aus S. macrospora Bei S. macrospora wurde genomische DNA mittels eines abgeleiteten Protokolls nach Lecellier und Silar (1994) isoliert. Dabei wurde als erstes das Myzel nach Anzucht in CM-Medium geerntet und mit Lysepuffer versetzt. Anschließend wurden die Zellen abwechselnd gevortext, in flüssigen Stickstoff eingefroren und bei 70 °C wieder aufgetaut, um die Lyse der Zellen zu gewährleisten. Danach wurde der Ansatz pelletiert und durch eine Phenol-Chloroform-Behandlung extrahiert. Die Fällung wurde durch Zugabe von Isopropanol durchgeführt. Die isolierte DNA wurde für 3-4 Stunden (h) getrocknet und in 30 µl A. dest aufgenommen.
III Material und Methoden 34
2.5. Gelelektrophoretische Auftrennungsverfahren Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wurde bei einer Spannung von 5-15 V/cm in horizontalen Gelelektrophoreseapparaturen der Firma Eurogentec, Gibco oder Biorad durchgeführt. Bei Mupid-Kammern wurde 0,5x TBE-Puffer sowie bei Gibco-Kammern und Biorad-Subcell-Systemen 1x TBE-Puffer als Elektrophorese-Puffer verwendet. Weiterhin wurde ein parallel mitlaufender DNA-Marker (Gene-Ruler, DNA-Ladder Mix, MBI Fermentas) als Größenstandard mitgeführt. Die genaue Detektion der einzeln aufgetrennten DNA-Fragmente erfolgte nach Behandlung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht mittels BioDoc-Analyze von Biometra. 2.6. DNA-Isolierung aus Agarosegelen Die durch Gelelektrophorese aufgetrennte DNA wurde mit dem Kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel GmbH & CoKG, Düren) isoliert. Dabei wurde sich an die Angaben des Herstellers gehalten. Dieses Kit wurde ebenfalls für die Aufreinigung von Amplifikaten aus PCR-Reaktionen verwendet. Auch hier wurde den Angaben des Herstellers Folge geleistet. 2.7. DNA-Sequenzierung und Oligonukleotidsynthese Die Synthese von Oligonukleotiden und die Sequenzierung von DNA wurden von der Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) und vom Sequenzierservice des Lehrstuhls für Neurobiochemie an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. 2.7.1. Radioaktive Markierung von DNA
Die radioaktive Markierung von immobilisierter DNA erfolgte immer mit dem Phosphorisotop 32P und wurde anhand des DECAprime™ II Kits (Ambion) und den Herstellerangaben Folge leistend durchgeführt. Durch Dextranblau-Lösung wurde die Reaktion terminiert und nicht gebundene radioaktiv markierte Nukleotide mittels Sephadex G50-Säulen vom Ansatz getrennt. 2.8. Southern-Blot-Hybridisierungen Innerhalb dieser Arbeit wurden Southern-Blot-Hybridisierungen sowohl von genomischer DNA aus S. macrospora als auch von PCR-Fragmenten aus S. cerevisiae mit Hilfe von radioaktiv markierter DNA (Kap. 2.7.1.) durchgeführt. Genomische DNA von S. macrospora wurde mittels geeigneter Restriktionsendonuklasen hydrolisiert und wie unter 2.5. beschrieben, gelelektrophoretisch aufgetrennt, bevor der Transfer auf die Nylonmembran vollzogen wurde. PCR-Fragmente aus S. cerevisiae wurden ebenfalls mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, bevor ihre DNA auf eine Nylonmembran übertragen wurde (verändert nach Southern 1975). Dazu wurde das Gel zuerst für 30 min in
III Material und Methoden 35
Denaturierungspuffer und danach für weitere 30 min in Neutralisierungspuffer geschwenkt. Durch Anwendung eines Kapillarblots, der in 20x SSPE-Puffer getränkt vorlag, wurde die DNA auf die Nylonmembran übertragen. Eine anschließende Quervernetzung mit der Membran erfolgte im UV-Stratalinker™ 1800 (Stratagene, Modus „AUTO“) mittels UV-Licht. Die darauf folgende Vorhybridisierung wurde für mindestens 1 h bei 37 °C im Hybridisierungspuffer (50 % Formamid, 5x SSPE, 0,2 % SDS, 5x Denhardt’s, 200 µg/ml Heringssperma-DNA) durchgeführt. Zu diesem Ansatz wurde anschließend das 32P-markierte DNA-Fragment (Sonde) hinzugegeben, nachdem diese im Vorfeld für 5 min bei 100 °C denaturiert wurde. Danach wurde der Ansatz ü.N. bei 37 °C inkubiert und unspezifische Bindungen der Sonde wurden mittels Waschpuffer (5x SSPE, 0,2 % SDS) bei Temperaturen zwischen 55 °C und 70 °C abgewaschen. Die Signale wurden nach einer Expositionzeit von 2-3 Tagen durch Autoradiografie detektiert. 2.9. cDNA Synthese mittels reverser Transkriptase Die Herstellung von cDNA wurde nach Nowrousian und Cebula (2005) durchgeführt. Dabei wurde DNA-freie RNA als Template verwendet, welche durch DNase I-Behandlung einer Gesamtnukleinsäurelösung gewonnen wurde. Als Enzym wurde die „Superscript II Reverse Transkriptase“ von Invitrogen verwendet, wobei sich an die Angaben des Herstellers gehalten wurde. Die Aufreinigung der Ansätze erfolgte über Amicon YM-30-Säulen von Milipore. Nach anschließendem Trocknen der Proben wurden sie in 20 µl A. dest aufgenommen. 2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bei jedem PCR-Ansatz wurde je nach Taq-Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers verfahren. Die Go-Taq-(Promega) oder die Phusion-Polymerase (Finnzymes) wurden verwendet. Dem Standard-PCR-Ansatz wurde neben der Template-DNA und der Taq-Polymerase, 10x PCR-Puffer, Starteroligonukleotide und dNTPs zugegeben und auf ein Volumen zwischen 25 und 50 µl mit A. dest aufgefüllt. Das Standard-Programm beinhaltete den ersten Denaturierungschritt von 2 min bei 94 °C, auf den eine 40-fache Wiederholung der einzelnen Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Elongations-Schritte folgte. Die Parameter der einzelnen Schritte variierten je nach Schmelztemperatur der Oligonukleotide und der Länge des Amplifikats. Es wurden als PCR-Gerät MyCycler (Biorad) oder „GeneAmp PCR System 9700“ (Applied Biosystems) verwendet. 2.11. Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae Kulturen der Bäckerhefe S. cerevisiae wurden bei einer OD600 von 0,8 – 1,0 geerntet. Nach Sedimentierung des Ansatzes wurden die Zellen gewaschen und mittels Stickstoff eingefroren. Das Pellet wurde danach auf Eis in äquivalentem Volumen PBSKMT-Puffer (zzgl. Proteaseinhibitoren 0,5 µl/ml Leupeptin und Pepstatin) resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurde das gleiche Volumen an Glasperlen hinzugegeben und der Ansatz 5 Zyklen lang, 3 min mit jeweils 1 min Pause, auf Eis gevortext. Der aus der folgenden Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, 4 °C) gewonnene Überstand enthielt die
III Material und Methoden 36
Gesamtproteinfraktion aus S. cerevisiae und wurde für weitere Untersuchungen wie beispielsweise die Ko-Immunopräzipitation verwendet. 2.12. Proteinbiochemische Verfahren 2.12.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Um Proteine innerhalb einer Gelelektrophorese nach ihrer molekularen Größe aufzutrennen, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Die Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine wurde egalisiert, indem die Ansätze in der Probenvorbereitung mit einem Überschuss an SDS bei 95 °C für 10 min denaturiert wurden. Die nachfolgend durchgeführte diskontinuierliche Elektrophorese nach Laemmli (1970) verhinderte die Aggregation der Proteine beim Eintritt in das Gel durch Trennung der Gelmatrix in zwei Bereiche mit unterschiedlicher Zusammensetzung und pH-Bereichen (Davis 1964; Ornstein 1964). Die SDS-PAGE wurde bei konstanten 40 mA durchgeführt. Als Größenreferenz wurde der PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas) verwendet. Das SDS-Gel diente weiterführenden Western-Blot Analysen oder wurde mit Coomassie-Blau-Färbelösung für 20 min gefärbt und mit 10 % Essigsäure entfärbt. 2.12.2. Immunologischer Nachweis von Proteinen (Western Blot-Analyse) Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Western Blot-Analysen wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine aus der Polyacrylamidmatrix auf eine PVDF-Membran übertragen (Renart et al. 1979; Towbin et al. 1979). Der Blotvorgang wurde mit einer Wetblot Apparatur (Biorad) für 1 h bei konstanten 100 V oder ü.N. bei konstanten 30 V durchgeführt. Anschließend wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit Blocking-Lösung inkubiert. Darauf folgte in Abhängigkeit des verwendeten Antikörpers eine spezifische Proteinmarkierung, die entsprechend nach den jeweiligen Angaben des Herstellers durchgeführt wurde. Die abschließende Detektion der Proteine wurde mit Hilfe des BM Chemiluminescence Western Blotting Kit (Roche) und durch Exposition spezieller Röntgenfilme (Fujifilm Super RX) durchgeführt. 2.13. Interaktionsstudien 2.13.1. β-Galaktosidase-Tests: ONPG und Filter-LacZ-Test Um eine Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System identifizieren zu können, wurde in dieser Arbeit sowohl ein quantitativer LacZ-Test mit O-nitrophenyl-β-D-galaktosid (ONPG) als auch ein qualitativer Filter-LacZ-Test mit X-Gal durchgeführt (Rose und Botstein 1983). Durch die Interaktion zweier Fusionsproteine wird das Reportergen lacZ exprimiert, wodurch das Enzym β-Galaktosidase gebildet wird, welches entweder das farblose ONPG in das gelb gefärbte Reaktionsprodukt O-Nitrophenol (ONP) und Galaktose spaltet oder innerhalb des Filter-LacZ-Test das im Puffer verwendete 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) in Galaktose und ein Nebenprodukt spaltet, das zum blauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo oxidiert. Der Umsatz des gebildeten ONP kann anhand einer photometrischen Messung quantitativ
III Material und Methoden 37
bestimmt werden. Dafür wurden die S. cerevisiae-Kulturen über Nacht bei 30 °C in 20 ml SD-Flüssigmedium angezogen und bei einer OD600 = 1,6 geerntet (Rose und Botstein 1983). Die Kulturen wurden pelletiert und in 400 µl 250 mM Tris, 20 µl PMSF und 0,3 g Glasperlen resuspendiert. Zum Aufschluss der Zellen wurden sie 2 min gevortext, pelletiert und der Überstand weiter verwendet. Es wurden für eine Proteinbestimmung nach Bradford 5 µl der Proteinprobe eingesetzt und 100 µl der Proteinprobe mit 900µl LacZ-Puffer (+27 µl/10 ml β-Mercaptoethanol) für den eigentlichen ONPG-Test gemischt. Beim ONPG-Test und der Bradford-Bestimmung wurden drei Ansätze pro Probe gemessen. Im ONPG-Test wurde den Ansätzen nach 5 min Inkubationszeit bei 28 °C in einem Thermomixer (Eppendorf) ONPG zugegeben und weiter inkubiert, bis sich eine deutliche Gelbfärbung der Proben ergab. Die Reaktion wurde mit 1 M Na2CO3 gestoppt. Danach folgte die quantitative photometrische Messung bei OD417. Die Formel anhand derer die β-Galaktosidase-Aktivität, die zur Quantifizierung der Protein-Protein-Interaktion genutzt wurde, berechnet wird, lautet: U/mG-Protein = OD417*1,7/(0,0047*t*mG-Protein*0,001). Dabei gilt: OD417=0,0047≙1 nmol/ml ONP, Probenvolumen ist 1,7 und (t) ist Zeit in min. Für den Filter-LacZ-Test werden Hefekulturen von einer Platte auf einen sterilen Filter überimpft und durch Stickstoff lysiert. Danach werden die Filter in LacZ-Puffer für 2-5 h bei 27 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Inkubation für 30 min bei 60 °C gestoppt. Hefezellen, mit einer Protein-Protein-Interaktion zweier Fusionsproteine, können anhand einer Blaufärbung identifiziert werden. 2.13.2. Ko-Immunopräzipitation in S. cerevisiae Nach der unter 2.11. beschriebenen Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae wurde die Proteinlösung mit c-MYC Antikörper konjugierten „beads“ (Clontech) für 2 h bei 4 °C rotierend inkubiert. Nach mehrmaligen Waschschritten mit PBSKMT-Puffer (1 ml PBSKMT-Puffer, 2000 rpm, 5 min) wurden die „beads“ mit Laemmli-Probenpuffer versetzt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot-Analysen und dem jeweiligen Antikörper (c-MYC- bzw. HA-Antikörper) detektiert. c-MYC-Antikörper wurde 1:3000 und HA-Antikörper 1:200 verdünnt. Die entsprechenden Zweitantikörper wurden 1:3000 verdünnt. 2.14. Aufreinigung von Fusionsproteinen in E. coli aus „Inclusion bodies“ E. coli-Zellen wurden in einer 5 ml-LB-Vorkultur ü.N. angezogen und dienten der Anzucht einer entsprechenden Hauptkultur am darauffolgenden Tag. Diese wurde bei einer OD600= 0,4 - 0,6 mit 200 ng Anhydrotetrazyklin induziert und über einen Zeitraum von 3 h inkubiert. Die Zellen wurden anschließend pelletiert, mit Stickstoff eingefroren und bei -70 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Das Pellet wurde in einem äquivalenten Volumen Lysepuffer (zzgl. 0,5 % (v/v) Triton X-100; 0,1 mM PMSF; 1 mM DTT) resuspendiert und per Ultraschall (6 x 30 sec; 30 sec Pause auf Eis) aufgeschlossen. Es folgte eine Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur nach Zugabe von 10 mM MgSO4 mit anschließender Pelletierung des Ansatzes. Es folgten mehrere Zyklen aus Ultraschall- und Zentrifugationsschritten mit einer abschließenden denaturierenden Harnstoffbehandlung (Tris-Glycin-Urea-Puffer) für 2 h bei 4 °C. Nach erneuter Pelletierung des Ansatzes wurden die aus den „Inclusion bodies“ freigelösten Proteine im Überstand zur Renaturierung tröpfchenweise in Puffer R gegeben und ü.N. bei 4 °C inkubiert. Die Aufreinigung des Strep tag-Fusionproteins wurde über die Strep-Tactin®
III Material und Methoden 38
Superflow® Säule durchgeführt. Nach Äquilibrierung des Säulenmaterials mit Puffer W (6-fache Menge des Säulenmaterials) wurde der Ansatz im Refolding Puffer auf die Strep-Tactin® Superflow® Säule gegeben. Nach mehrmaligem Waschen mit Puffer W (6-fache Menge des Säulenmaterials) wurde mit Puffer E (6-fachen Menge des Säulenmaterials) eluiert. Von jedem Schritt wurden Aliquots zur Überprüfung der Aufreinigung genommen. Die Proteinkonzentration der einzelnen Elutionen wurde mittels Bradford-Messung bestimmt und ausgewertet. Die eluierten Proteine wurden bis zur weiteren Verwendung bei -70 °C gelagert. 2.15. Messung der GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora Bei der Messung der GTPase-Aktivität wurden die aus „Inclusion bodies“ aufgereinigten GSA1-Proteine eingesetzt. Es wurde das Kit „GTPase assay kit (high Sensitivity)“ von Innova Biosciences nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Messung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 635 nm. Die gemessene GTPase-Aktivität wurde anhand einer vorher durchgeführten Eichgerade aus freiem Phosphat Pi, das in Lösung übergeht, ermittelt. 2.16. Bioinformatorische Methoden Reverse komplementäre Sequenzen wurden durch Verwendung des Programms „Reverse Complement“ auf der Internetseite http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html hergestellt. Sequenzvergleiche wurden stets mit dem Programm „LALIGN“ auf der Internetseite http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html durchgeführt (Huang und Miller 1991; Pearson 2000). Multiple Alignments wurden durch das Programm „ClustalW“ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ errechnet (Chenna et al. 2003) und mit „GeneDoc“ auf http://www.psc.edu/biomed/genedoc weiterverarbeitet (Nicholas et al. 1997). Lokale Alignments wurden mit BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool) unter http://0-www.ncbi.nlm.nih.gov.library.vu.edu.au/BLAST/ angefertigt (Altschul et al. 1990). Zur Bestimmung der Schmelztemperatur von Starteroligonukleotiden wurde die Internetseite http://www.iit-biotech.de/iit-cgi/oligo-tm.pl verwendet. Bei Analysen im Kontext der Proteinanalytik wurde der Expasy Proteomics Server unter http://expasy.org/ und den darauf angebotenen Programmen verwendet (Gasteiger et al. 2003). 2.17. Sicherheitsbestimmungen Gentechnische Experimente der Sicherheitsstufe SI wurden nach den Richtlinien des Gentechnikgesetzes (GenTG) vom 16.12.1993 (zuletzt geändert durch das zweite Gesetz zur Änderung des Gentechnikgesetzes vom 16.08.2002) durchgeführt.
IV Ergebnisse 39
IV Ergebnisse
1. Herstellung konstitutiver GSA1-Varianten aus Sordaria macrospora Einen zentralen Punkt dieser Arbeit stellte die Herstellung konstitutiver Varianten der
Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora mittels direkter Mutagenese des Gens gsa1 dar.
Die dabei enstandenen konstitutiv aktiven und dominant negativen GSA1-Formen wurden
als Beute innerhalb eines Hefe-2-Hybrid-Systems eingesetzt, um vom Aktivierungsstatus
der Gα-Untereinheit abhängige Interaktionspartner identifizieren zu können. Weiterhin
wurden sie für die Komplementation der ∆gsa1/∆gsa2-Mutante verwendet, um einen
Einfluss des Gα-Aktivitätszustandes auf die Entwicklung von S. macrospora zu
untersuchen. Im Folgenden wird die Herstellung der konstitutiven GSA1-Formen
beschrieben, bei der die Aminosäuren innerhalb der hochkonservierten Switch II-Region
verändert wurden (Abbildung 3, rot umrandet), die durch publizierte Beispiele bekannt
waren (Freissmuth und Gilman 1989; Yu et al. 1996). Die Switch II-Region ist anhand des
Sequenzvergleichs in Abbildung 3 dargestellt, bei dem Aminosäuresequenzen von
Gα-Vertretern aus H. sapiens (Go, Gi, Gz, Gs, Gq, G13), der Hefe S. cerevisiae (GPA1), der
Pflanze Arabidopsis thaliana (Arab1) und der beiden Hyphenpilze N. crassa (GNA1) und
S. macrospora (GSA1) verglichen werden.
Abbildung 3: Sequenzvergleich der Switch II-Region von Gα-Untereinheiten verschiedener Spezies sowie der hergestellten konstitutiven GSA1-Formen (GSA1_CA, GSA1_CI) aus S. macrospora. Schwarz dargestellte Aminosäuren sind in allen 12 Sequenzen und grau dargestellte Aminosäuren in mindestens 9 Sequenzen identisch. Es wurden Gα-Sequenzen aus S. macrospora (GSA1, (gi|193227759|)), N. crassa (GNA1, (gi|1698500|)), S. cerevisiae (GPA1, (gi|6321792|)), H. sapiens (Gi (gi|33946324|), Go (gi|162461738|), Gz, (gi|4504051|), Gq (gi|40254462|), G13 (gi|24111250|), Gs (gi|4504047|)) und A. thaliana (Arab1, gi|15225278|) verwendet. Durchgeführte DNA-Modifikationen zur Herstellung konstitutiver GSA1-Formen sind rot umrandet dargestellt. GTP2 und GTP3: GTP-Bindedomänen, EBD1: Effektor-Bindedomäne.
IV Ergebnisse 40
Bei der konstitutiv aktiven GSA1-Form GSA1_CA und der dominant negativen
GSA1-Form GSA1_CI aus S. macrospora wurden im Sequenzvergleich in Abbildung 3 die
Aminosäuren 204 (rot) und 203 (grün) farbig hervorgehoben, da diese bei der Herstellung
der jeweiligen Variante durch Modifikationen auf DNA-Ebene verändert wurden. Bei der
Herstellung von GSA1_CA wurde in der gsa1-Sequenz durch Austausch von Adenin zu
Thymidin an Position 611 die betreffende Aminosäure 204 im Protein GSA1 von Glutamin
zu Leucin verändert. Diese Mutation resultiert laut zahlreicher Publikationen in einem
drastischen Rückgang der intrinsischen GTPase-Aktivität bei Gα-Untereinheiten
(Freissmuth und Gilman 1989; Graziano et al. 1989; Segers und Nuss 2003). Zur
Herstellung der GSA1_CI-Form wurde an Position 607 von gsa1 ein Guanin durch ein
Cytosin ausgetauscht, wodurch bei GSA1 im Zuge der Translation die Aminosäure 203,
Glycin, durch ein Arginin ersetzt wurde. Durch diese G203R-Modifikation wird die
Dissoziation der Gα-Untereinheit vom Gβγ-Dimer geblockt, so dass eine dominant
negative Gα-Form vorliegt (Coca et al. 2000; Fang und Dean 2000; Yu et al. 1996). Um
die jeweilige beschriebene Punktmutation in die Sequenz von gsa1 einzufügen wurde eine
direkte PCR-Mutagenese durchgeführt, deren Vorgehensweise in Abbildung 4 schematisch
dargestellt ist. Als Matrize diente das in dieser Arbeit klonierte Plasmid pB1, das die
komplette cDNA-Sequenz von gsa1 aufweist und für ein Fusionsprotein aus GSA1,
c-MYC-Tag und GAL4-Bindedomäne (BD) kodiert.
Abbildung 4: Herstellung konstitutiver GSA1-Formen aus S. macrospora mittels direkter Mutagenese. Dargestellt sind gsa1-Kopien vor der Insertion der Punktmutation im Plasmid pB1 (A) und nach der Modifikation mit den Sequenzen gsa1_ca und gsa1_ci, die jeweils für konstitutive GSA1-Formen kodieren (B). Graue Pfeile stellen Oligonukleotide dar, die zur Herstellung des modifizierten gsa1-Amplifikats (graues Liniensegment in pB1CA und pB1CI unter B) verwendet wurden. Ihre Sequenzen sind im Vergleich zur Ausgangssequenz unter dem Schema aufgelistet. Klonierungsrelevante Restriktionsschnittstellen (AatII und SmaI) sind unterstrichen dargestellt.
IV Ergebnisse 41
In Abbildung 4 wird das Gen gsa1 vor der durchgeführten Modifikation und nach
Integration der Punktmutationen innerhalb des Plasmids pB1 dargestellt. Durch
Verwendung des Plasmids pB1 als Matrize sowie der Oligonukleotidpaare q204l_f und
gsa1_r bzw. g203r_f und gsa1_r (graue Pfeile in Abb. 4) wurden mittels PCR 472 bp große
Fragmente des 3‘-Endes von gsa1 amplifiziert, in denen die jeweilige Punktmutation
(Q204L: A-T, G203: G-C) über die Oligonukleotide q204l_f bzw. g203r_f eingefügt
wurde. Weiterhin wurden über diese Oligonukleotide Erkennungssequenzen der
Restriktionsenzyme AatII und SmaI an das jeweilige Amplifikat gehängt. Aufgrund dieser
ebenfalls singulär im Plasmid pB1 vorkommenden Restriktionsschnittstellen, wurden sie
verwendet, um die nicht modifizierte Sequenz aus pB1 herauszuschneiden und das
jeweilige modifizierte Amplifikat (als graue Linie in Abb. 4 dargestellt) mit pB1 zu
ligieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden modifizierten gsa1-Sequenzen,
gsa1_ca (pB1CA) und gsa1_ci (pB1CI) erfolgreich ins Rückgrat von pB1 ligiert und zur
Bestätigung über Restriktionen und Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft.
Die Plasmide pB1CA und pB1CI kodieren jeweils für ein Fusionsprotein aus konstitutiv
aktivem GSA1_CA, c-MYC-Tag und GAL4-Bindedomäne (pB1CA) oder für ein
dementsprechendes Protein mit dominant negativem GSA1_CI (pB1CI). Die
Fusionsproteine, welche in pB1CA bzw. pB1CI kodiert vorliegen, wurden nachfolgend für
Komplementations- und Interaktionsstudien verwendet. Die in diesen Studien erzielten
Ergebnisse werden in den nächsten beiden Kapiteln beschrieben.
Mittels direkter Mutagenese wurden in der vorliegenden Arbeit mit GSA1_CA
(konstitutiv aktives GSA1 mit Q204L-Mutation) und GSA_CI (dominant negatives
GSA1 mit G203R-Mutation) zwei konstitutive Formen der Gα-Untereinheit GSA1
aus S. macrospora hergestellt.
IV Ergebnisse 42
2. Funktionsanalysen mit konstitutiv aktiven und dominant negativen
GSA1-Derivaten
2.1. Herstellung von Komplementationsstämmen Zur funktionellen Analyse der konstitutiven GSA1-Formen GSA1_CA und GSA1_CI
wurden die in dieser Arbeit hergestellten Plasmide pCA_nat und pCI_nat in die bereits
vorhandene Deletionsmutante ∆gsa1/∆gsa2 transformiert (Kamerewerd et al. 2008). Diese
Doppelmutante bot sich anhand ihres sterilen Phänotyps für die vorliegende funktionelle
Analyse der konstitutiven GSA1-Formen an, da diese Ausprägung durch gsa1 allein
komplementiert werden kann (Kamerewerd et al. 2008). Die Plasmide pCA_nat bzw.
pCI_nat kodieren neben den modifizierten gsa1-Sequenzen gsa1_ca bzw. gsa1_ci für das
Resistenzgen nat1, das Transformanten eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum
Nourseothricin verleiht. S. macrospora-Transformanten des Hygromycin-B resistenten
Stammes ∆gsa1/∆gsa2, mit ektopischer Integration des Plasmids pCA_nat bzw. pCI_nat
wurden demzufolge über eine Resistenz gegenüber Nourseothricin und Hygromycin B
identifiziert. Transformanten, die über mehrere Wochen eine Resistenz aufwiesen, werden
in der vorliegenden Arbeit als stabil bezeichnet. Demnach wurden in dieser Arbeit zwei
stabile pCA_nat- und drei stabile pCI_nat-Transformanten erzeugt und mittels Southern-
Analyse charakterisiert (Abb. 5). Bei der Southern-Hybridisierung wurde ein 472 bp
großes radioaktiv markiertes Amplifikat von gsa1 als Sonde eingesetzt.
Abbildung 5: Southern-Analyse von ∆gsa1/∆gsa2-Komplementationstransformanten. Für den Southern-Blot wurde ein 472 bp großes radioaktiv markiertes Amplifikat von gsa1 als Sonde verwendet, um ektopische Integrationen der gsa1-Sequenz im jeweiligen Stamm nachzuweisen. In den Spuren wurde genomische DNA von den Transformanten ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_1 und CA_3), ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt (CI_1, CI_7 und CI_11) sowie die des Rezipienten (∆gsa1/∆gsa2) und des Wildtyps von S. macrospora (WT) nach SacI-Verdau aufgetragen.
IV Ergebnisse 43
Die Ansätze unter Verwendung der genomischen DNA der stabilen
pCA_nat-Transformanten CA_1 und CA_3, auch ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt genannt, weisen
aufgrund einer einzelnen ektopischen Integration der gsa1_ca-Sequenz ein singuläres
Signal im Autoradiogramm auf. Bei den beiden pCI_nat-Transformanten, CI_7 und CI_11,
auch ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt genannt, wurde eine einzelne ektopische Integration der
gsa1_ci-Sequenz nachgewiesen. Die Transformante CI_1 ist dagegen eine „multicopy“-
Transformante und weist durch zahlreiche Integrationen der gsa1_ci-Sequenz mehrere
Signale im Autoradiogramm auf. Als Kontrollen wurden zwei Ansätze genomischer DNA
des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 und ein Ansatz des Wildtyps von S. macrospora verwendet.
Beim Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde erwartungsgemäß durch vorhandene Deletion der
beiden Gene gsa1 und gsa2 keine gsa1-Kopie nachgewiesen (Abb. 5). Der Wildtyp zeigt
ein schwaches Signal bei etwa 10000 bp, was auf die genomische gsa1-Kopie, die nach
SacI-Verdau der genomischen DNA auf einem 10384 bp großen Fragment liegt,
zurückzuführen ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwei stabile
∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt-Transformanten, CA_1 und CA_3, und drei stabile
∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt -Transformanten, CI_1, CI_7 und CI_11, in S. macrospora erzeugt
und nachfolgend in detaillierten Analysen in Hinblick auf die sexuelle und vegetative
Entwicklung untersucht wurden.
2.2. Charakterisierung des vegetativen Wachstums von Komplementationsstämmen
Nach erfolgreicher Transformation der modifizierten gsa1-Sequenzen in die
∆gsa1/∆gsa2-Mutante wurde das vegetative Wachstum der gsa1_ca-Transformanten CA_1
und CA_3 (konstitutiv aktives GSA1-Derivat) sowie der gsa1_ci-Transformanten CI_1,
CI_7 und CI_11 (dominant negative GSA1-Derivat) im Vergleich zum Wildtyp und dem
Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 in Rennrohrtests auf Vollmedium untersucht (Abb. 6). Für jeden
untersuchten Stamm wurden die zurückgelegte Strecke pro Tag sowie die Gesamtstrecke
nach acht Tagen gemessen und für das in Abbildung 6 dargestellte Liniendiagramm
verwendet. In den nachfolgenden Beschreibungen werden Daten der Transformanten
CA_3 und CI_7 stellvertretend für alle in dieser Arbeit hergestellten und untersuchten
Komplementationstransformanten verwendet, da die Daten übereinstimmend ausfielen.
IV Ergebnisse 44
Abbildung 6: Vegetatives Wachstum der erzeugten Transformanten CA_3 und CI_7 im Vergleich zum Wildtyp und ∆gsa1/∆gsa2. Das vegetative Wachstum der einzelnen Transformanten CA_3 und CI_7, des Wildtyps und des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde auf Vollmedium in doppelten Ausführungen über eine Dauer von acht Tagen gemessen. Der jeweilige Mittelwert ist als Punkt innerhalb des Diagramms dargestellt. Die jeweilige Standardabweichung ist für jeden Punkt ermittelt worden und im Diagramm angegeben. Dabei wurden z.T. marginale Standardabweichungen ermittelt, so dass nicht in allen Punkten Abweichungen sichtbar sind.
Bei der in dieser Arbeit erstellten Transfomante CA_3 mit ektopischer Integration von
gsa1_ca wurde mit 23,4 cm der Wachstumsdefekt der Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2
(16,7 cm) behoben (Kamerewerd et al. 2008). Nach acht Tagen zeigte CA_3 damit ein
20 % stärkeres vegetatives Wachstum als der Wildtyp (19,2 cm). Im Gegensatz dazu
konnte bei der Transformante CI_7 nach Integration der gsa1_ci-Sequenz kein
signifikanter Unterschied im vegetativen Wachstum zum Rezipienten beschrieben werden,
da dieser Stamm mit 17,1 cm ein ähnliches Wachstum wie die ∆gsa1/∆gsa2-Mutante mit
16,7 cm aufwies. Ein weiterer Unterschied des vegetativen Wachstums zwischen CA- und
CI-Stämmen besteht darin, dass sich nach dem vierten Tag sowohl beim Stamm CA_3 als
auch beim Wildtyp die zurückgelegte Strecke pro Tag verringert, was anhand eines
„Knicks“ (Abb. 6, Pfeil) zu erkennen ist, der beim Stamm CI_7 und ∆gsa1/∆gsa2 nicht
nachzuweisen ist. Eine Erklärung dafür könnte die zu diesem Zeitpunkt einsetzende
sexuelle Entwicklung des Pilzes sein, die den Großteil der Energie verbraucht. Die sich
hier andeutende unterschiedliche Ausprägung in der sexuellen Entwicklung bei CA- und
CI-Stämmen wurde in dieser Arbeit untersucht und wird im Folgenden beschrieben.
IV Ergebnisse 45
2.3. Charakterisierung der sexuellen Entwicklung von Komplementationsstämmen
Die beiden Transformanten CA_3 und CI_7 wurden über einen Zeitraum von 16 Wochen
neben ihrem vegetativen Wachstum in Bezug auf ihre sexuelle Entwicklung untersucht.
Der Rezipient ∆gsa1/∆gsa2 besitzt einen sterilen Phänotyp. Dieser Stamm durchläuft die
sexuelle Entwicklung nur bis zum Stadium der Protoperithezien und bildet keine
Perithezien mehr aus. Vor diesem Hintergrund wurden die Transformanten CA_3 und
CI_7 auf Vollmedium angeimpft und ihre sexuelle Entwicklung, insbesondere ihre
Fruchtkörperbildung untersucht. Abbildung 7 stellt die ermittelten Phänotypen innerhalb
der sexuellen Entwicklung bei den drei untersuchten Stämmen CA_3, CI_7 und
∆gsa1/∆gsa2 gegenüber.
Abbildung 7: Charakterisierung der sexuellen Entwicklung bei den Komplementanten CA_3 und CI_7 im Vergleich zum Rezipienten. Abgebildet sind die Phänotypen während der sexuellen Entwicklung von CA_3, CI_7 und dem Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 in Bezug auf das Wachstum auf Vollmedium (A), ihrer Fruchtkörperbildung (B) und, sofern Perithezien und Ascosporen ausgebildet wurden in Bezug auf die Ascosporogenese (C). Der Maßstabbalken symbolisiert 100 µm.
IV Ergebnisse 46
Bei einer makroskopischen Beschreibung der Fruchtkörperbildung der Transformanten
CA_3, CI_7 und des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde bei CA_3 bereits nach 5 Tagen eine
Bildung von Perithezien beobachtet, während die Transformante CI_7 und der Rezipient
nach 16 Wochen Protoperithezien, aber keine Perithezien ausbilden (Abb. 7A, B). Die
gebildeten Perithezien der CA_3-Transformante wurden isoliert, aufgebrochen und anhand
der Ascosporogenese untersucht. Dabei konnten Asci mit acht linear angeordneten, reifen
Ascosporen analog zum Wildtyp identifiziert werden (Abb. 7C). Diese Ascosporen wurden
wie beim Wildtyp nach ca. 8-10 Tagen aus den Perithezien herausgeschleudert und zeigten
eine wildtypische Keimungsaktivität (Daten nicht gezeigt). Demnach konnte nur bei
gsa1_ca-Transformanten durch Integration einer gsa1_ca-Sequenz (kodiert für konstitutiv
aktive GSA1-Form) eine vollständige Fertilität beobachtet werden, wohingegen der sterile
Phänotyp des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 durch Integration von gsa1_ci nicht behoben
werden konnte. Tabelle 9 fasst abschließend die ermittelten Phänotypen der
Transformanten zusammen, von denen stellvertretend CA_3 und CI_7 an dieser Stelle
beschrieben wurden. Die Phänotypen sind repräsentativ für alle in Tabelle 9 aufgelisteten
und innerhalb dieser Arbeit erzeugten stabilen Transformanten.
Tabelle 9: Komplementationsstämme und deren sexuelle und vegetative Entwicklung
∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt (CI_7) ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_3) stabile
Transformanten 3 2
Effekt auf die veg. Entwicklung
analog zum Rezipienten: 10 % geringeres Wachstum
als der WT
Wiederherstellung des veg. Wachstumsdefekts:
>20 % mehr Wachstum als WT >30 % mehr als Rezipient
Effekt auf die sex. Entwicklung
steril, Bildung von Protoperithezien;
keine Perithezien nach 16 Wochen
fertil, Perithezien nach 5 Tagen;
wildtypische Ascosporogenese
Die kodierenden Sequenzen gsa1_ca und gsa1_ci konnten erfolgreich in die sterile
Mutante ∆gsa1/∆gsa2 integriert werden. Bei gsa1_ca-Transformanten wurde in
dieser Arbeit ein stärkeres vegetatives Wachstum als bei dem Wildtyp und eine
komplette Fertilität beobachtet. Bei den untersuchten gsa1_ci-Transformanten
konnten dagegen keine signifikanten Unterschiede in der sexuellen und vegetativen
Entwicklung zum Rezipienten beobachtet werden, was darauf hinweist, dass ein
inaktives GSA1 keine entscheidende Funktion in der Entwicklung des Pilzes spielt.
IV Ergebnisse 47
3. Interaktionsstudien mit GSA1-Varianten aus S. macrospora
3.1. Hefe-2-Hybrid-Analysen zur Identifikation von GSA1-Interaktionspartnern Zur Identifikation von GSA1 interagierenden Proteinen, die in Abhängigkeit vom
vorherrschenden Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit an diese binden, wurde das
„Matchmaker™ cDNA library Kit“ (Clontech) verwendet und eine cDNA-Bank aus
S. macrospora nach Interaktionspartnern durchmustert. Die Vorgehensweise bei dieser
Methode wird in Abbildung 8A gezeigt. Für die Synthese der Köderproteine wurden die in
der vorliegenden Arbeit klonierten Plasmide pB1CA und pB1CI (siehe Kap. 2.1.)
verwendet. Das Plasmid pB1CA kodiert für ein 62 kDa großes Fusionsprotein aus der
konstitutiv aktiven GSA1-Form, GSA1_CA, in Fusion mit einem c-MYC-Tag und der
GAL4-Bindedomäne (BD). Analog dazu kodiert pB1CI für ein Fusionsprotein aus
dominant negativer GSA_CI-Form in Fusion mit der GAL4-BD und dem c-MYC-Tag.
Nach erfolgreicher Transformation in den Hefestamm Y187 (MATα) und Selektion auf
Tryptophan-Prototrophie wurde die Synthese der Köderproteine mittels Western-Blot
überprüft (Abb. 8B).
Abbildung 8: Methode des verwendeten Hefe-2-Hybrid-Systems und Nachweis der Köderproteine. Schematische Darstellung der Vorgehensweise des verwendeten Hehe-2-Hybrid_Systems (A) und Nachweis der Synthese der 62 kDa großen Köderproteine GSA1_CA und GSA1_CI mittels Western-Blot-Analyse (B).
IV Ergebnisse 48
Beide Fusionsproteine konnten in den entsprechenden Hefestämmen mit Hilfe eines
c-MYC-Antikörpers bei ~ 62 kDa detektiert werden. Dabei zeigt sich eine distinkte Bande
des jeweiligen Köderproteins im Western-Blot ohne einen Hinweis auf möglichen Abbau
der Proteine durch Proteaseaktivität aufzuzeigen (Abb. 8B). Durch den erfolgreichen
Nachweis der synthetisierten Fusionsproteine in der Hefe konnten sie als Köderproteine
innerhalb des Hefe-2-Hybrid-Systems eingesetzt werden.
Die Stämme Y187 + pB1CA sowie Y187 + pB1CI wurden anschließend gegen eine
cDNA-Bank aus S. macrospora im Hefestamm AH109 (MATa) gekreuzt, in der die
Beuteproteine auf Plasmiden kodiert vorlagen, die cDNA-Fragmente in Fusion mit einem
HA-Tag und der GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) aufwiesen. Aus dieser Kreuzung sind
diploide Hefezellen hervorgegangen, in denen sowohl Köder- als auch Beuteplasmide
vorlagen. Durch diese Methode wurden in den durchgeführten Ansätzen mit GSA1_CA
bzw. GSA1_CI als Köderprotein, Kreuzungseffizienzen von 48 % erreicht, so dass 4 x 107-
(GSA1_CA-Ansatz) bzw. 5 x 107-Zellen (GSA1_CI-Ansatz) nach Interaktionspartnern von
GSA1 durchmustert werden konnten. Nach Kreuzung der Stämme wurden die Ansätze auf
Mangelmedien ohne Adenin und Histidin ausgestrichen, um auf Transformanten zu
selektionieren, bei denen durch Expression der beiden Reportergene his3 und ade2, ein
prototrophes Wachstum der Hefezellen ermöglicht wurde (Abb. 8A). In den beiden parallel
durchgeführten Ansätzen wurden jeweils 1500 selektionierte Transformanten mit putativen
Interaktionspartnern anhand von β-Galaktosidase-Tests überprüft und die
Interaktionsstärke durch ihre Blaufärbung quantifiziert. Bei 350 Transformanten (225 bei
GSA1_CA und 125 bei GSA1_CI), die eine starke Blaufärbung aufwiesen, wurde mittels
PCR das cDNA-Fragment des jeweiligen Beuteplasmids amplifiziert und anschließend bei
192 Klonen sequenziert. Kodierte Proteine wurden mittels „BLAST“-Sequenzvergleichs
identifiziert (Altschul et al. 1990). Für die weitere Charakterisierung von GSA1-
Interaktionspartnern konzentriert sich diese Arbeit auf die 22 Proteine, die mehr als einmal
beschrieben werden konnten und läßt die restlichen 15 Proteine als Einzeltreffer
unberücksichtigt. Diese 22 Proteine wurden spezifisch für den jeweiligen Hefe-2-Hybrid-
Ansatz als Tortendiagramm in Abbildung 9 dargestellt. In den Tortendiagrammen grau
dargestellte Proteine binden aktivitätsunabhängig an der Gα-Untereinheit GSA1, da sie
sowohl mit GSA1_CI (Abb. 9A) als auch mit GSA1_CA (Abb. 9B) als Köder interagieren.
Blau markierte Proteine sind exklusive Interaktionspartner der jeweiligen GSA1-Form und
weisen damit eine vom Gα-Aktivitätszustand abhängige Bindung an GSA1 auf.
IV Ergebnisse 49
Abbildung 9: Auswahl von Beuteproteinen der beiden konstitutiven GSA1-Formen. Abbildung 9A zeigt eine Auflistung möglicher Interaktionspartner der dominant negativen GSA1-Form und Abbildung 9B dementsprechend interagierende Proteine aus dem GSA1_CA-Ansatz. Für diese Tortendiagramme wurden nur die Beuteproteine berücksichtigt, die häufiger als einmal als Interaktionspartner identifiziert werden konnten. Die Zahl zeigt dabei die Anzahl von Identifikationen des Proteins als Interaktionspartner an. Die Größe der Tortenstücke stellt den Anteil der Identifikationen in Relation zur Gesamtanzahl der identifizierten Interaktionspartner dar. Grau dargestellte Proteine wurden mit beiden Ködern identifiziert, blau gefärbte Proteine sind spezifisch für den jeweiligen Köder. Ausgestellte Tortenstücke stehen für Proteine, deren Interaktion mit GSA1 im Text eingehender beschrieben wird. EF1α: Elongationsfaktor 1α.
IV Ergebnisse 50
Innerhalb der in dieser Arbeit durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Analysen konnten
zusammenfassend 16 vom Gα-Aktivitätszustand abhängige (Abb. 9, blau markiert) und 6
vom Gα-Aktivitätszustand unabhängige Interaktionspartner (Abb. 9 grau markiert) der
Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora identifiziert werden. Unter diesen
aktivitätsunabhängigen Interaktionspartnern befinden sich eine α-Amylase, der
Elongationsfaktor EF-1α, Proteine mit Funktion in der Deubiquitinierung sowie
verschiedene vorhergesagte Proteine, deren Funktion noch nicht beschrieben ist. Eines
dieser bisher nicht charakterisierten Proteine stellte den am häufigsten identifizierten
Interaktionspartner von GSA1 dar, da es 59-mal identifiziert wurde, jedoch keine
Homologie zu bereits beschriebenen Proteinen aufweist.
Bei den aktivitätsabhängigen Beuteproteinen des dominant negativen GSA1_CI-Köders,
die exklusiv an der GDP-gebundenen Form der Gα-Untereinheit GSA1 binden, wurde der
Transkriptionsfaktor STE12 beschrieben, dessen genetische Assoziation mit GSA1 bereits
aus vorherigen genetischen Studien bekannt war (Kamerewerd et al. 2008). Somit konnte
in der vorliegenden Arbeit STE12 aufgrund seiner physikalischen Interaktion mit GSA1
erfolgreich als Interaktionspartner bestätigt werden. Bei den beiden weiteren spezifischen
Interaktionspartnern der GDP-gebundenen GSA1-Form handelt es sich um vorhergesagte
Proteine mit fehlender Funktionsbeschreibung, durch die keine weiteren Hinweise auf
mögliche Funktionen von GSA1 in S. macrospora gewonnen werden konnten (Abb. 9A).
In der Hefe-2-Hybrid-Analyse mit der konstitutiv aktiven Gα-Form GSA1_CA als
Köderprotein (Abb. 9B) konnten neben den sechs bereits erwähnten
Gα-aktivitätsunabhängigen bindenden Proteinen 13 exklusive Interaktionspartner
identifiziert werden. Diese Interaktionspartner lassen sich erfolgreich Proteingruppen
zuordnen, von denen Assoziationen mit G-Proteinen im Speziellen oder mit Signalwegen
im Allgemeinen beschrieben vorlagen. Unter anderem handelt es sich bei einem dieser
identifizierten Faktoren um ein RGS-Protein (Regulator des G-Protein-Signalweges), also
einen putativen regulatorischen Faktor innerhalb der G-Protein-vermittelten
Signaltransduktion (vgl. Kap. 3.2.1.). Darüber hinaus konnte mit einer Phosphoinositol-
Phosphatase (PIPase) ein spezifischer Effektor von GTP-GSA1 identifiziert werden,
wodurch GSA1 mit Phospholipid-assoziierten Prozessen in Verbindung gebracht wird.
Weitere GTP-GSA1-interagierende Proteine waren aufgrund ihrer
Funktionsbeschreibungen aus anderen Organismen als Faktoren innerhalb der De- und
Ubiquitinierung von Proteinen bekannt.
IV Ergebnisse 51
Bei der Identifikation der oben beschriebenen Bindeproteine wurden unter anderem mit der
Gruppe der RGS-Proteine und den Proteinen, die eine mögliche Ubiquitinierung von
GSA1 vermitteln, spezifische, in der Literatur beschriebene, Interaktionspartner von
Gα-Untereinheiten identifiziert, wodurch die Aussagekraft der in dieser Arbeit ermittelten
Daten bekräftigt wird (Torres et al. 2009; Watson et al. 1996). Die Identifizierung einer
Phosphoinositol-Phosphatase als exklusiver Interaktionspartner einer GTP-gebundenen
Gα-Untereinheit war allerding bislang nicht beschrieben. Vor dem Hintergrund, dass
Gα-Untereinheiten nur GTP-gebunden mit ihren Effektoren interagieren und
Phospholipide ihrerseits Signalwege vermitteln, stellte diese Interaktion für die vorliegende
Arbeit eine interessante Entdeckung dar. Eine mögliche Aktivierung der Phosphatase als
Effektor durch GSA1 könnte demnach eine mögliche Verbindung der beiden Signalwege
darstellen. Diese Verbindung wurde für S. cerevisiae bereits beschrieben, da die für die
Pheromonantwort wichtige Gα-Untereinheit GPA1 mit der Phosphoinositol-3-Kinase
VPS34, dem Gegenspieler der Phosphatase, am Endosom interagiert (Slessareva et al.
2006). VPS34 synthetisiert das Phosphoinositoltrisphosphat (PtdIns3P), welches als
Substrat von der oben identifizierten Phosphoinositol-Phosphatase verwendet wird.
Insgesamt konnten innerhalb der vorliegenden Arbeit mittels Hefe-2-Hybrid-Analysen
sowohl 16 Gα-aktivitätsabhängige als auch sechs Gα-aktivitätsunabhängige
Interaktionspartner identifiziert werden. Anhand der beschriebenen physikalischen
Interaktion der dominant negativen GDP-gebundenen Gα-Untereinheit GSA1_CI mit dem
Transkriptionsfaktor STE12 wurde eine genetische Interaktion der beiden Proteine aus
vorherigen Studien bestätigt (Kamerewerd et al. 2008). Da sowohl STE12 als auch GSA1
einen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung von S. macrospora ausüben, stellt die
Aufschlüsselung einer möglichen Funktion dieser Interaktion eine interessante
Fragestellung für weitergehende Studien dar. Allerdings wurde diese Interaktion in der
vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht, da STE12 mit der dominant negativen
GDP-gebundenen Gα-Untereinheit interagiert und somit als klassischer Effektor im
G-Protein-vermittelten Signalweg ausscheidet, da Effektoren nur mit GTP-GSA1
wechselwirken. Deshalb liegt der Fokus dieser Arbeit auf den spezifischen
Interaktionspartnern der GTP-gebundenen Gα-Form GSA1_CA, bei denen es sich sowohl
um Effektoren als auch um Regulatoren handeln könnte. Zu diesen interagierenden
Proteinen gehören ein RGS-Protein, eine Phosphoinositol-Phospatase und Proteine, die
eine mögliche Ubiquitinierung von GSA1 bewirken. Basierend auf diesen Ergebnissen
IV Ergebnisse 52
wurden nachfolgend die Interaktionen von GSA1 mit einem RGS-Protein und mit
phospholipid-assoziierten Proteinen untersucht.
3.2. Charakterisierung des RGS-Proteins ROG1 (Regulator of GSA1) als
Interaktionspartner der konstitutiv aktiven Gα-Form aus S. macrospora Das innerhalb der im vorangegangenen Kapitel beschriebenen Hefe-2-Hybrid-Analyse mit
der konstitutiv aktiven Gα-Form als Köder identifizierte RGS-Protein wird im weiteren
Verlauf dieser Arbeit als ROG1 (Regulator of GSA1) bezeichnet. Die in der vorliegenden
Arbeit durchgeführte Charakterisierung des ROG1-Proteins als GSA1-Interaktionspartner
wird im Anschluss beschrieben. Dabei sollte mittels Ko-Immunopräzipitationsanalysen die
Bindung von ROG1 an GTP-GSA1 durch eine vom Hefe-2-Hybrid-System-unabhängigen
Methode bestätigt werden.
In den Hefe-2-Hybrid-Analysen wurden nur cDNA-Fragmente des rog1-Gens, aber nie das
gesamte Gen identifiziert, so dass zur Aufklärung der Genstruktur das komplette rog1-Gen
aus genomischer und cDNA amplifiziert, sequenziert und anschließend für das Genom von
S. macrospora annotiert werden musste. Das rog1-Gen („Locus tag“-Nr. SMAC_06353)
umfasst 3865 bp und enthält ein 76 bp großes Intron im Bereich der Basen 3693 und 3768.
Das Gen kodiert für ein 140 kDa großes Protein aus 1262 Aminosäuren, das neben der für
RGS-Proteine charakteristischen RGS-Box in seiner Domänenstruktur weitere konservierte
Regionen aufweist. Die Domänenarchitekturen von ROG1 und dessen homologen
Proteinen aus ausgewählten pilzlichen Organismen sowie aus dem Menschen sind in
Abbildung 10 schematisch dargestellt. Die dargestellte Proteinstruktur von ROG1 zeigt
deutlich, dass mit diesem Protein ein Vertreter der RGS-Proteine identifiziert wurde, da es
eine zentrale, 139 Aminosäuren umfassende RGS-Box aufweist, die charakteristisch für
die RGS-Proteinfamilie ist. Über diese Domäne üben RGS-Proteine eine GAP-Aktivität
(GTPase aktivierendes Protein) auf Gα-Untereinheiten aus und stimulieren deren
Inaktivierung, wodurch sie als negative Regulatoren G-Protein-vermittelte Signalwege
steuern (Hepler 1999).
IV Ergebnisse 53
Abbildung 10: Schematische Darstellung der Domänenstruktur des RGS-Proteins ROG1 aus S. macrospora und seiner Homologen. Es sind neben der Proteinstruktur von ROG1 aus S. macrospora (Sm_ROG1, gi|289615465|) pilzliche Homologe aus N. crassa (Nc_NCU03739, gi|40882341|), Magnaporthe grisea (Mg_MGG_00990, gi|145018055|), Penicillium chrysogenum (Pc_MDM1, gi|211585205|), Aspergillus fumigatus (Af_MDM1, gi|70995010|) und S. cerevisiae (Sc_MDM1, gi|6323532|) sowie das Homolog aus Homo sapiens (Hs_SNX13, gi|17864088|) dargestellt. Die fehlende RGS-Domäne von Sc_MDM1 wurde durch ein durchgestrichenes rotes Oval dargestellt. Die Domänenarchitektur von ROG1 wurde durch eine rote Umrandung hervorgehoben. Die Domänenstrukturen basieren auf in silico-Vorhersagen, die mit dem Programm „inter pro scan“ durchgeführt wurden (Hunter et al. 2009). Verwendete Abkürzungen: S: Signalpeptid, T: Transmembrandomäne, PXA: Phox-assoziierte-Domäne, CC: Coiled-Coil-Domäne, PX: Phox-Domäne. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die entsprechenden Aminosäurebereiche der Domänen und die jeweilige Größe des Proteins.
Bei ROG1 handelt es sich um ein RGS-Protein, das unter den Ascomyceten weit verbreitet
ist und Homologe in den beiden Modellorganismen für G-Protein-vermittelte
Signaltransduktionen, dem Menschen (HsSNX13, Sorting Nexin 13) und der Hefe
(ScMDM1, Mitochondrial, distribution and morphology 1), aufweist (Abb. 10). Neben
seiner zentral positionierten RGS-Domäne besitzt ROG1 eine PX-Domäne (Phox-Domäne)
am C-Terminus und eine N-terminale PXA-Domäne (Phox-assoziierte Domäne), über die
das Protein eine Bindung an Phospholipiden eingehen könnte. PX- und PXA-Domäne
binden spezifisch an Phospholipide und bewirken eine Rekrutierung der entsprechenden
Proteine an Orten mit hohen Phospholipidkonzentrationen. Durch die Identifikation einer
Phosphoinositol-Phosphatase als GSA1-Interaktionspartner wurde darüber hinaus im
vorherigen Hefe-2-Hybrid-Ansatz ein möglicher Effektor von GSA1 identifiziert, der eine
Verbindung zu Phospholipiden aufweist. Diese Kombination von RGS-, PXA- und
IV Ergebnisse 54
PX-Domäne findet sich innerhalb der RGS-Proteine in Familie H (Kap. 3.2.1.), in denen
die „Sorting-Nexin“-Proteine eingeteilt sind. Eine für diese Proteinklasse charakteristische
C-terminale Nexin-Domäne (Nexin C) weisen ROG1 und alle ROG1-homologen Proteine
auf (Abb. 10). „Sorting Nexine“ sind an der zielgerichteten Translokalisation von
Proteinen beteiligt und ein Beispiel aus dieser Familie ist das Protein SNX13, das als
humanes ROG1-Homolog in Abbildung 10 dargestellt ist. Dieses Protein wird auch als
RGS-PX1 bezeichnet und besitzt neben der Proteintranslokalisation eine beschriebene
GAP-Aktivität für Gα-Untereinheiten (Zheng et al. 2001). Neben diesen Domänen wurde
bei ROG1 eine C-terminale „Coiled-Coil“-Region identifiziert, über die Protein-Protein-
Interaktionen vermittelt werden. Am N-Terminus weist ROG1 ein Signalpeptid sowie eine
Transmembrandomäne auf, wodurch eine membranassoziierte Lokalisation für ROG1
festgelegt werden könnte. Neben den humanen „Sorting-Nexin“-Proteinen zeigt ROG1
eine starke Homologie zu pilzlichen MDM1-Homologen, deren Bezeichnung sich vom
Homolog aus S. cerevisiae, MDM1 ableitet. MDM1 steht für „Mitochondrial Distribution
and Morphology 1“ und leitet sich von der Funktion des Proteins in der Hefe ab. Es regelt
die mitochondriale und nukleäre Vererbung an die Tochterzelle während der Zellteilung
(McConnell und Yaffe 1993). Eine Besonderheit des ROG1-Homologs MDM1 aus
S. cerevisae ist die Einteilung in die Klasse der RGS-Proteine, obwohl die charakteristische
RGS-Domäne nicht in der Proteinstruktur nachgewiesen werden kann. Bis zum jetzigen
Zeitpunkt wurden mit MDM1 aus S. cerevisiae und SNX13 (RGS-PX1) aus H. sapiens
zwei ROG1-Homologe als Interaktionspartner von Gα-Untereinheiten beschrieben (Chasse
et al. 2006). Bei SNX13 wurde darüber hinaus eine GAP-Funktion auf Gα-Untereinheiten
der Klasse Gs ermittelt (siehe Kap. 3.2.1) (Zheng et al. 2001).
Um eine Interaktion des identifizierten RGS-Proteins ROG1 aus S. macrospora mit der
Gα-Untereinheit GSA1 über das Ergebnis des Hefe-2-Hybrid-Systems hinaus zu
bestätigen, wurden Ko-Immunopräzipitationsanalysen mit GSA1 und ROG1 durchgeführt.
In der vorliegenden Arbeit wurden für die durchgeführten Ko-Immunopräzipitationen der
c-MYC-Tag und der HA-Tag verwendet, um die Interaktion zwischen HA-GSA1_CA und
c-MYC-ROG1 zu untersuchen. Das in dieser Arbeit klonierte Plasmid pBROG1
synthetisiert ein Fusionsprotein aus ROG1 mit GAL4-Bindedomäne und c-MYC-Tag
(c-MYC-ROG1). Das ebenfalls in dieser Arbeit hergestellte Plasmid pA1CA kodiert für
ein Fusionsprotein aus der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1_CA fusioniert mit
GAL4-Aktivierungsdomäne und einem HA-Tag (HA-GSA1_CA).
IV Ergebnisse 55
Die Plasmide wurden in den Hefestamm PJ69-4a ko-tranformiert, anschließend auf
Selektionsmedien ausplattiert und auf eine ausreichende Synthese beider Fusionsproteine
hin untersucht. Nach Auswahl eines Hefestammes, der die beiden Fusionsproteine c-
MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA in ausreichender Menge produzierte, wurde dieser
Stamm für die Durchführung von Ko-Immunopräzipitationen verwendet. Ein
Gesamtproteinextrakt des Hefestammes, wurde für 2 Stunden mit einer c-MYC-Matrix
inkubiert. Über mehrere Waschschritte wurden unspezifisch bindende Proteine entfernt
und spezifisch gebundene Proteine über Zugabe von SDS-Probenpuffer in einer
gemeinsamen Fraktion eluiert. Aliquots vom Gesamtproteinextrakt (Abb. 11, „Input“) und
das Eluat (Abb. 11, „IP:c-MYC“) wurden auf ein SDS-Gel aufgetragen und für Western-
Blot-Analysen verwendet. Abbildung 11 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer in dieser
Arbeit durchgeführten Ko-Immunopräzipitation mit c-MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA.
Die Identifikation von ROG1 erfolgte über Western-Blot-Analysen mit c-MYC- und die
Identifikation des untersuchten Bindungspartner, GSA1_CA mittels
HA-Antikörperdetektionen. In diesen Ansätzen wurde als Kontrolle zum Ausschluss
unspezifischer Bindungen über den c-MYC-Tag oder der beiden GAL4-Domänen, ein
Kombination von Fusionsproteinen aus GAL4-BD mit c-MYC-Tag sowie GSA1_CA mit
HA-Tag und GAL4-AD durchgeführt. Anhand der in Abbildung 11 dargestellten
Ko-Immunopräzipitation wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion des RGS-
Proteins ROG1 mit der konstitutiv aktiven Gα-Form GSA1_CA aus S. macrospora
bestätigt. Beide Proteine wurden in der eluierten Fraktion anhand ihrer extrapolierten
Größen von 160 kDa für c-MYC-ROG1 und 62 kDa für HA-GSA1_CA detektiert
(Abb. 11, IP:c-MYC).
Abbildung 11: Bestätigung der ROG1-Bindung an GSA1_CA über Ko-Immunopräzipitation. Die Zeichen über den einzelnen Proteinnachweisen zeigen die Existenz (+) oder das Fehlen des Proteins (-) an. Als Ladekontrolle wurden die äquivalenten Mengen von GSA1_CA in den Ansätzen verwendet. Die Western-Blot-Analysen wurden zur Detektion von ROG1 mit c-MYC-Antikörper und bei GSA1_CA mit einem HA-Antikörper durchgeführt. Die Mengen von c-MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA im eingesetzten Gesamtproteinextrakt sind im Input und die Elution der Ko-Immunopräzipitation ist unter IP:c-MYC dargestellt.
IV Ergebnisse 56
Der Nachweis der beiden Proteine in der eluierten Fraktion bestätigt eine Assoziation von
GSA1_CA und ROG1, die dabei so stark ausgeprägt ist, dass beide Proteine nach sechs
Waschschritten noch ko-immunopräzipitiert werden. Darüber hinaus wurde GSA1_CA
nicht in Waschschritten detektiert, wodurch eine spezifische Bindung an ROG1
nachgewiesen wird (Daten nicht gezeigt). Eine unspezifische Bindung der beiden Proteine
über den jeweiligen „Tag“ oder über Interaktion der beiden GAL4-Domänen
untereinander, konnte darüber hinaus durch die eingesetzte Kontrolle ausgeschlossen
werden, da HA-GSA1_CA obwohl es im Kontrollansatz im Input nachgewiesen wird,
nicht in der Elution der Kontrolle detektierbar war (Abb. 11). Demnach bindet GSA1_CA
nicht an den alleinigen c-MYC-Tag und es findet auch keine Interaktion der beiden
GAL4-Domänen statt, so dass GSA1_CA nur durch Interaktion mit c-MYC-ROG1
ko-immunopräzipitiert werden kann.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit ROG1 das erste RGS-Protein in
S. macrospora beschrieben und dessen Interaktion mit GSA1 über zwei unabhängige
Interaktionsstudien (Hefe-2-Hybrid-Analysen und Ko-Immunopräzipitationen) bestätigt
werden. Aussagen über eine mögliche GAP-Aktivität von ROG1 können aufgrund der in
dieser Arbeit durchgeführten Experimente nicht gemacht werden, doch ist die exklusive
Identifizierung von ROG1 mit dem konstitutiv aktiven, GTP-gebundenen GSA1_CA ein
Hinweis darauf. ROG1 ist in Ascomyceten weit verbreitet und besitzt darüber hinaus mit
SNX13 (RGS-PX1) ein Homolog im Menschen, bei dem eine GAP-Aktivität auf
Gα-Untereinheiten beschrieben ist. Weiterhin konnte ROG1 anhand seiner
Domänenarchitektur und seiner zentralen RGS-Box in die Familie H der
RGS-Superfamilie eingeteilt werden. Seine Proteinstruktur gibt darüber hinaus Hinweise
auf eine mögliche Assoziation zu Phospholipiden. Bei GSA1 kann in diesem
Zusammenhang durch Interaktion mit der Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 ebenfalls eine
mögliche phospholipid-assoziierte Funktion beschrieben werden die im weiteren Verlauf
dieser Arbeit untersucht wurde und im nächsten Abschnitt beschrieben wird.
IV Ergebnisse 57
3.3. Interaktionsstudien mit GSA1 und der Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 Die Identifikation einer Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als exklusiven
Interaktionspartner der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1_CA in
Hefe-2-Hybrid-Analysen zeigte einen ersten Hinweis auf eine Verbindung von GSA1 und
Phospholipiden. Die zweite Verbindung zu Phospholipiden wurde durch die Identifikation
des RGS-Proteins ROG1 und dessen Proteinstruktur gelegt. ROG1 besitzt PXA- und
PX-Domänen, die spezifisch an Phospholipide binden. Eine dritte Verknüpfung mit
Phospholipiden war aus der Hefe bekannt, in der die Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K)
VPS34 mit der Gα-Untereinheit GPA1 am Endosom interagiert (Slessareva et al. 2006).
Diese Hinweise gaben den Anstoß in der vorliegenden Arbeit dieser Verbindung
nachzugehen und sie weiter zu entschlüsseln.
In dieser Arbeit konnte mittels Hefe-2-Hybrid-Analysen die Phosphoinositol-Phosphatase
als GSA1-Interaktionspartner identifiziert werden. Es wurde im weiteren Verlauf auf eine
Bestätigung dieser Interaktion verzichtet, da bereits mit STE12 und ROG1, zwei weitere
Interaktionspartner aus diesem Ansatz durch verschiedene Ergebnisse (genetische
Analysen, Ko-Immunopräzipitation) als interagierende Proteine bestätigt werden konnten.
Daher ist davon auszugehen, dass es sich auch bei der Phosphoinositol-Phosphatase um ein
spezifisch bindendes Protein handelt. Darüber hinaus ist aus der Hefe mit der
Phosphoinositol-3-Kinase VPS34, der Gegenspieler der Phosphoinositol-Phosphatase
bekannt, der ebenfalls als Interaktionspartner einer Gα-Untereinheit (GPA1) beschrieben
werden konnte (Slessareva et al. 2006).
Da ein cDNA-Klon des VPS34-Homologs SmVPS34 in S. macrospora bereits vorhanden
war, wurde in der vorliegenden Arbeit daraufhin eine möglichen Interaktion mit GSA1
über Hefe-2-Hybrid- und Ko-Immunopräzipitationsanalysen untersucht, die nachfolgend
beschrieben werden (Pöggeler, persönliche Mitteilung). Das Alignment in Abbildung 12
zeigt SmVPS34 mit anderen Klasse III-PI3-Kinasen im Bereich der katalytischen Domäne
PI3Kc, die zur Klassifizierung der Kinasen verwendet wird. Der Sequenzvergleich der PI3-
Kinasen wurde in der vorliegenden Arbeit dazu verwendet im Vorfeld der
Interaktionsstudien SmVPS34 als Klasse III-PI3-Kinase analog zu den VPS34-Vertretern
im Menschen und in der Hefe einzuordnen. Diese Klassifizierung als Vertreter der Klasse
III-PI3-Kinasen ist anhand der hohen Homologie innerhalb des Sequenzvergleichs in
Abbildung 12 deutlich abzulesen.
IV Ergebnisse 58
Abbildung 12: Alignment der PI3-Kinase SmVPS34 mit Vertretern aus Mensch und Hefe. Der Sequenzvergleich zeigt die Klasse III-PI-3-Kinase SmVPS34 mit Homologen aus H. sapiens (Hs_VPS34, gi|34761064|) und S. cerevisiae (ScVPS34, gi|6323269|) im Bereich der katalytischen Untereinheit PI3Kc, die zur Klassifizierung der Kinasen herangezogen wird. Konservierte Aminosäuren sind in Schwarz und Identitätsgleichheit in 2 von 3 Sequenzen in Grau dargestellt.
Nach der Bestätigung von SmVPS34 als PI3-Kinase wurde das Protein in direkten Hefe-
2-Hybrid-Analysen eingesetzt, um eine Interaktion mit Gα-Untereinheiten zu untersuchen.
Neben den drei Gα-Untereinheiten GSA1, GSA2 und GSA3 wurden die beiden
konstitutiven GSA1-Formen GSA1_CA und GSA1_CI eingesetzt, um eine mögliche
Spezifität von SmVPS34 zur GTP- (GSA1_CA) oder GDP-gebundenen Gα-Untereinheiten
(GSA1_CI) beschreiben zu können.
Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit Plasmide hergestellt, die für Fusionsproteine der
drei Gα-Untereinheiten mit Gal4-Aktivierungsdomäne (AD) und HA-Tag kodieren (pA1,
pA2, pA3). Darüber hinaus wurden das bereits im Kapitel 3.2. beschriebene Plasmid
pA1_CA (GSA1_CA mit Gal4-AD und HA-Tag) und das dementsprechende pA1_CI
(GSA1_CI mit Gal4-AD mit HA-Tag) verwendet. Im Fall von SmVPS34 wurden Plasmide
in dieser Arbeit kloniert, die entweder für das gesamte Protein SmVPS34 in Fusion mit
c-MYC-Tag und der Gal4-Bindedomäne (pBV34) oder für entsprechende Fusionsproteine
des N-Terminus (pBV34n) bzw. C-Terminus (pBV34c) des VPS34-Proteins kodierten.
Das zu untersuchende Interaktionspaar wurde in den Hefestamm PJ69-4a transformiert und
anhand von Wachstumstests und β-Galaktosidase-Tests auf eine mögliche Interaktionen
hin untersucht. Tabelle 10 zeigt zusammengefasst die Ergebnisse aus den durchgeführten
Hefe-2-Hybrid-Analysen.
IV Ergebnisse 59
Tabelle 10: Ergebnisse der Hefe-2-Hybrid-Analysen mit SmVPS34 und GSA1-3. Die Daten basieren auf β-Galaktosidase-Tests und Wachstumsanalysen auf Selektionsmedium. Die angegebenen Zahlen zeigen die Enzymaktivität in β-Galaktosidase-Tests an. Nur wenn in beiden Fällen eine Interaktion detektiert wurde sind die entsprechenden Felder der Proteinkombination farbig hervorgehoben. Eine Interaktion innerhalb der Wachstumstests wurde durch Reportergenexpression (ade2, his3) bzw. beim β-Galaktosidase-Test über die Aktivität des durch Expression des Reportergens lacZ synthetisierten Enzyms β-Galaktosidase beschrieben, falls diese höher ausfiel als der dreifache Wert der Negativkontrolle (AD). Alle Werte stammen aus Dreifachbestimmungen.
SmVPS34
BD-VPS34_FL (AS 1-916)
BD-VPS34_N (AS 1-338)
BD-VPS34_C (AS 339- 916)
GSA
AD-GSA1_CA 24,59 ± 3,2 22,07 ± 2,56 3,75 ± 0,99
AD-GSA1_CI 22 ± 0,54 19,3 ± 0,04 2,78 ± 0,09
AD-GSA1 27,78 ± 0,75 24,57 ± 2,25 3,22 ± 0,44
AD-GSA2 17,31 ± 0,63 n.d. n.d.
AD-GSA3 9,2 ± 0,86 n.d. n.d.
AD 4,5 ± 0,02 2,79 ± 0,44 n.d.
Nur Interaktionen, die anhand von Reportergenexpression bei Wachstumstests auf
Selektionsmedien als auch durch β-Galaktosidase-Tests beschrieben wurden, sind in
Tabelle 10 farbig hervorgehoben. Eine β-Galaktosidase-Aktivität ist nur bei Interaktion der
beiden Fusionsproteine durch Expression des Reportergens lacZ und der Bildung des
Enzyms β-Galaktosidase messbar. Bezugnehmend darauf interagiert das SmVPS34-
Volllängenprotein (BD-VPS34_FL) nur mit der Gα-Untereinheit GSA1 und unabhängig
von der Aktivitätsform, da die ermittelten β-Galaktosidase-Aktivitäten mit 24,59 U/mg-
Protein für GSA1_CA, 22 U/mg-Protein für GSA1_CI und 27,78 U/mg-Protein keine
signifikanten Unterschiede aufwiesen. Eine Interaktion von SmVPS34 mit den beiden Gα-
Untereinheiten GSA2 oder GSA3 konnte nicht nachgewiesen werden. Obwohl mittels
β-Galaktosidase-Tests mit 17,31 U/mg-Protein eine Enzymaktivität bei dem Ansatz aus
BD-VPS34_FL und AD-GSA2 nachgewiesen wurde, zeigten die entsprechenden
Hefeklone auf Selektionsmedien kein Wachstum, so dass diese Interaktion nicht eindeutig
geklärt werden konnte.
IV Ergebnisse 60
Neben der exklusiven Interaktion von SmVPS34 zur Gα-Untereinheit GSA1 wurde in
dieser Arbeit festgestellt, dass die Kinase über ihren N-Terminus (AS 1-338) die
Interaktion mit GSA1 eingeht. Diese Kombinationen zeigten Wachstum auf
Selektionsmedien und Enzymaktivitäten in β -Galaktosidase-Tests von 22,07 U/mg-Protein
(GSA1_CA + VPS34_N), 19,3 U/mg-Protein (GSA1_CI + VPS34_N) und 24,57 U/mg-
Protein, die den dreifachen Wert der Negativkontrolle übertrafen und somit als signifikante
Interaktion beschrieben wurden. Im Gegensatz dazu zeigten Ansätze mit dem C-Terminus
von SmVPS34 (AS 339-916) und GSA1 keine Enzymaktivitäten. Demnach liegt der mit
GSA1 interagierende Bereich des Proteins SmVPS34 innerhalb der N-terminalen
Aminosäuren 1 bis 338.
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Hefe-2-Hybrid-Analyse eine Interaktion der
Klasse III-PI3-Kinase SmVPS34 mit der Gα-Untereinheit GSA1 sowie den beiden
konstitutiven Formen GSA1_CA und GSA1_CI in S. macrospora nachgewiesen. Zur
Bestätigung dieser Interaktionen wurden analog zu den Analysen mit dem RGS-Protein
ROG1 Ko-Immunopräzipitationen durchgeführt, bei denen die Bindung von SmVPS34 an
GSA1, GSA1_CA und GSA1_CI untersucht wurde. Für diese Studien wurden die in den
oben beschriebenen Hefe-2-Hybrid-Analysen eingesetzten Plasmide pBV34, pA1,
pA1_CA und pA1_CI verwendet. Die Durchführung der Ko-Immunopräzipitationen
erfolgte analog zu den in Kapitel 3.2. beschriebenen ROG1-Studien. Die Ergebnisse der
Ko-Immunopräzipitationen mit SmVPS34 sind in Abbildung 13 dargestellt, wodurch eine
exklusive Interaktion der PI3-Kinase SmVPS34 mit der konstitutiv aktiven
Gα-Untereinheit GSA1_CA nachgewiesen werden konnte.
Abbildung 13: Nachweis einer Bindung von SmVPS34 an GSA1_CA mittels Ko-Immunopräzipitationsanalysen. Die Darstellung und Beschriftung wurde analog zu Abbildung 10 durchgeführt. Im Gegensatz dazu wurden bei diesen Ansätzen die äquivalenten Mengen von SmVPS34 als Ladekontrolle verwendet. Die Western-Blot-Analysen wurden zur Detektion von SmVPS34 mit c-MYC-Antikörper und bei GSA1_CA, GSA1_CI und GSA1 mit einem HA-Antikörper durchgeführt.
IV Ergebnisse 61
GSA1_CA bindet an SmVPS34 und wurde über SmVPS34 assoziiert aufgereinigt, so dass
beide Proteine in der Elution mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden
konnten. Im Gegensatz dazu wurden in den Ansätzen mit SmVPS34 und der dominant
negativen GSA1-Form GSA1_CI sowie im Ansatz mit SmVPS34 und der wildtypischen
GSA1-Form nur sehr schwache Signale des HA-GSA1_CI- bzw. des HA-
GSA1-Fusionproteins in der Elution nachgewiesen (Abb. 13). Die schwachen Signale der
dominant negativen und wildtypischen GSA1-Form sind unabhängig von der eingesetzten
Menge des jeweiligen Fusionsproteins, da diese sich nicht von der Menge des
Fusionsprotein GSA1_CA unterscheidet, mit der SmVPS34 deutlich
ko-immunopräzipitiert werden konnte (Abb. 13, Input). Ein Vergleich der drei Ansätze
untereinander deutet auf eine bevorzugte Interaktion von SmVPS34 mit der konstitutiv
aktiven GSA1-Form GSA1_CA hin, die spezifisch eingegangen wird, da keine Proteine im
Kontrollansatz detektiert werden konnten. Anhand von Ko-Immunopräzipitationsstudien
konnte eine Spezifität in der Interaktion von SmVPS34 mit GSA1 beschrieben werden, die
über die ermittelten Daten der durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Analysen hinaus gehen.
Durch Interaktionsstudien mit konstitutiven GSA1-Formen konnte in der
vorliegenden Arbeit mit ROG1 das erste RGS-Protein aus S. macrospora identifiziert
und als Interaktionspartner der konstitutiv aktiven GSA1-Form mittels
Hefe-2-Hybrid- und Ko-Immunopräzipitationsanalysen bestätigt werden. Mit der
PI3-Kinase SmVPS34 und der Phosphoinositol-Phosphatase wurden zwei Proteine
des Phospholipid-Signalweges als GSA1-Interaktionspartner beschrieben, so dass
eine Assoziation dieses Signalweges mit G-Proteinen in S. macrospora möglich ist.
Darüber hinaus wurde mit der physikalischen Interaktion der dominant negativen
GSA1-Form und STE12 eine genetische Interaktion aus vorangegangenen Studien
bestätigt.
4. Messung der GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus
S. macrospora
Aufgrund der Identifikation eines RGS-Proteins und dessen möglicher GAP-(GTPase
aktivierendes Protein) Aktivität auf die Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora wurde
zum Abschluss dieser Arbeit die intrinsische GTPase-Aktivität von GSA1 gemessen. Diese
IV Ergebnisse 62
Messungen stellen vorbereitende Arbeiten für eine Charakterisierung der GAP-Aktivität
des RGS-Proteins ROG1 dar, die in nachfolgenden Studien der funktionellen Analyse von
ROG1 dienen soll, die mit der Identifikation, Annotation und den Interaktionsstudien in
dieser Arbeit begonnen wurde.
Für die Messung der GTPase-Aktivität wurden große Mengen des Proteins GSA1 benötigt,
die in der vorliegenden Arbeit durch Verwendung des One-STrEP™-Systems (IBA) und
Überexpressionsstudien im Bakterium E. coli hergestellt wurden (Schmidt und Skerra
2007). Für diese Studien wurde das in dieser Arbeit hergestellte Plasmid pSG3-3
verwendet, das für ein Fusionsprotein aus GSA1 und C-terminalem STrEP-Tag
(GSA1_CSTREP) kodiert. pSG3-3 wurde in BL21-Zellen transformiert und die Synthese
des Fusionsproteins über Zugabe von Anhydrotetrazyklin (AHT) induziert. Nach Zugabe
von AHT wird die Expression des Gens durch den TetA-Promotor eingeleitet. In
Abbildung 14 ist das Ergebnis einer durchgeführten Überexpressionsstudie mit pSG3-3
dargestellt, mit Hilfe derer das 43,9 kDa große Fusionsprotein aus GSA1 mit C-terminalem
STrEP-Tag hergestellt werden konnte.
Abbildung 14: Induktionsreihe zur Synthese des Fusionsproteins aus GSA1 und einem C-terminalen STrEP-Tag in E. coli. Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden aus E. coli-Kulturen gewonnen, die 1 h, 2 h oder 3 h nach Induktion mit 200 µg/L Anhydrotetrazyklin geerntet wurden. Die Bande des synthetisierten GSA1_CSTREP wurde durch einen Pfeil auf der vorhergesagten Höhe von 43,9 kDa markiert.
IV Ergebnisse 63
In der vorliegenden Arbeit wurden nach einer Induktionszeit von drei Stunden und unter
Verwendung von 200 µg/l Anhydrotetrazyklin detektierbare Mengen von GSA1_CSTREP
als Bande anhand der extrapolierten Größe von 43,9 kDa in SDS-Gelen nachgewiesen
(Abb. 14, Pfeil). Das Protein GSA1_CSTREP befand sich nach kürzester Induktionszeit in
Einschlusskörperchen (Inclusion bodies), wodurch die Menge des GSA1_CSTREP
Proteins in der für eine Aufreinigung des Proteins relevanten löslichen Fraktion sehr gering
ausfiel und der Großteil des Proteins im Sediment verblieb. Durch Erhöhung des
Harnstoffanteils während der Aufarbeitung der E. coli-Kulturen wurde GSA1_CSTREP
erfolgreich aus diesen Einschlusskörperchen extrahiert und der Großteil des Proteins in die
lösliche Form übertragen, um es aufzureinigen. Aufgrund der denaturierenden
Bedingungen wurde bei der Aufarbeitung eine Renaturierung von 24-48 Stunden des
GSA1_CSTREP durchgeführt. Ein repräsentatives Ergebnis einer durchgeführten
Aufreinigung von GSA1_CSTREP wird in Abbildung 15 dargestellt.
Abbildung 15: Aufreinigung des GSA1_CSTREP-Proteins über eine Strep-Tactin®-Säule. Die verwendeten Proteine wurden aus einer 1 L umfassenden E. coli-Kultur aufgearbeitet, die mit Ausnahme der Induktionskontrolle (Induktion 0 h) nach 3 h geerntet wurden. Die Proben „Pellet IB“ und „Überstand IB“ stellen die Proteinansätze nach der Behandlung mit 8 M Harnstoff dar, die zum Auflösen der Einschlusskörperchen durchgeführt wurde und das Protein zum Großteil in die lösliche Fraktion brachte („Überstand IB“). Nach Rückfaltung des Proteins wurde der Ansatz „Überstand IB“ über eine Säule mit 2 ml Strep-Tactin®-Superflow®-Säulenmaterial aufgereinigt. Aliquots des Durchlaufs, des ersten und letzten Waschschritts sowie zwei der zwölf Elutionen wurden ebenfalls auf das Gel aufgetragen. Die Bande des synthetisierten Fusionsproteins GSA1_CSTREP wurde durch einen Pfeil auf der vorhergesagten Größe von 43,9 kDa markiert.
IV Ergebnisse 64
Das Fusionprotein GSA1_CSTREP wurde über eine 2 ml-Strep-Tactin®-Superflow®-Säule
aus E. coli-Kulturen aufgereinigt. Auf Höhe von 43,9 kDa ist das Protein anhand einer
ausgeprägten Bande im SDS-Gel von Beginn der Aufarbeitung an im Ansatz
„Induktion 3 h“ bis zum Endpunkt der Aufreinigung in den beiden Elutionen nachzuweisen
(Abbildung 15, Pfeil). Ein Aliquot der Kultur vor Induktion (Induktion 0 h) beweist eine
spezifische Induktion von GSA1_CSTREP. Die in Abbildung 15 dargestellte Aufreinigung
ergab eine eluierte GSA1_CSTREP-Proteinmenge von 6,9 mg (0,58 µg/ml). Da die
Bindungskapazität des Strep-Tactin®-Superflow®-Säulenmaterials bei 8,78 mg Protein
lag und ein Proteinverlust über die Dauer der Aufreinigung stattfindet, sind Mengen an
GSA1_CSTREP im Durchlauf und im ersten Waschschritt durch eine aufgearbeitete
Proteinmenge zu erklären, welche die Bindungskapazität der Säule überschritten hat. Eine
spezifische Elution des GSA1_CSTREP-Proteins zeigt sich daran, dass kein Protein in
Waschritt 6 detektiert und GSA1_CSTREP erst durch Zugabe von Desthiobiotin eluiert
wird (Abb. 15 Elution 1 und 2). Das aufgereinigte GSA1_CSTREP wurde für Messungen
der GTPase-Aktivität von GSA1 eingesetzt, wie in Abbildung 16 dargestellt.
Abbildung 16: Konzentrationsabhängige GTPase-Aktivitätsmessungen mit der Gα-Untereinheit GSA1. Unterschiedliche Konzentrationen des Fusionsproteins GSA1_CSTREP wurden für 60 Minuten mit GTP inkubiert. Durch GTPase-Aktivität frei werdendes anorganisches Phosphat Pi führt zu Farbveränderungen des Ansatzes, die photometrisch bei einer Wellenlänge von A635 gemessen wurden. Die Daten beruhen auf Mittelwerten aus einer Dreifach-Messung. Die Mittelwerte sind mit Standardabweichungen angegeben. Die Nullkontrolle wurde über eine gestrichelte Linie mit dem nächsten Messpunkt verbunden, da sie keine Aktivität aufweist und zum Ausschluß einer Verunreinigung von freiem Pi in der Probe diente.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
0 0,0025 0,005 0,0075 0,01
GT
Pase
-Akt
ivitä
t(A
635 nm
)
GSA1_CSTREP [µM]
IV Ergebnisse 65
Insgesamt wurde in der vorliegenden Arbeit ca. 20 mg GSA1_CSTREP aus E. coli-
Kulturen aufgereinigt, einkonzentriert und in verschiedenen Konzentrationen für
GTPase-Aktivitäts-Messungen eingesetzt. Alle GTPase-Aktivitäts-Messungen wurden mit
dem GTPase Assay Kit (Innova Biosciences) durchgeführt, mit dem eine GTPase-Aktivität
photometrisch ermittelt wird (Garcia-Regalado et al. 2008). Nach Hydrolyse des
Nukleotids GTP zu GDP durch GSA1_CSTREP wird ein anorganisches Phosphat Pi
freigesetzt, das einen Komplex mit dem im Ansatz beigefügten Farbstoff Malachitgrün
bildet, wodurch ein Farbumschlag entsteht, der photometrisch quantifiziert wird.
Die ermittelten GTPase-Aktivitätswerte der Gα-Untereinheit GSA1 anhand des
eingesetzten Proteins GSA1_CSTREP sind in Abbildung 16 durch Absorptionswerte bei
einer Wellenlänge von 635 nm angegeben. Bei der gemessenen Aktivität von GSA1
konnte eine Konzentrationsabhängigkeit beobachtet werden, die deutlich an den
unterschiedlich hohen Absorptionswerten der eingesetzten Konzentrationen von
GSA1_CSTREP abzulesen ist (Abb. 16). Die höchste GTPase-Aktivität wurde mit
10 nM GSA1_CSTREP und die geringste mit 2,5 nM GSA1_CSTREP ermittelt. Eine
Sättigung der GTPase-Aktivität wurde anhand der in dieser Arbeit eingesetzten
Enzymmengen nicht beobachtet. Eine mögliche Verunreinigung der Probe mit Pi wurde
durch die Null-Probe ausgeschlossen, bei der die maximale GSA1_CSTREP-
Konzentration (10 nM) zum Messansatz hinzugegeben wurde nachdem die GTPase-
Reaktion bereits gestoppt wurde. Da dieser Ansatz keine Absorption aufweist, kann eine
Kontamination durch Pi in der aufgereinigten Proteinprobe ausgeschlossen werden. In
weiterführenden Studien wäre eine Erhöhung der eingesetzten Menge an GSA1_CSTREP
zur Identifikation einer möglichen Sättigung ratsam. Die Identifizierung einer intrinsischen
GTPase-Aktivität von GSA1 diente als Abschluss der funktionellen Analyse als Vertreter
einer Gα-Untereinheit aus S. macrospora und als vorbereitendes Experiment für eine
mögliche Stimulation der GTPase-Aktivität durch das in dieser Arbeit identifizierte
RGS-Protein ROG1.
Die Gα-Untereinheit GSA1 besitzt eine messbare konzentrationsabhängige
GTPase-Aktivität. Anhand dieser konnte in der vorliegenden Arbeit ein weiteres
Charakteristikum einer Gα-Untereinheit beschrieben werden. Durch Identifizierung
der GTPase-Aktivität ist weiterhin eine Voraussetzung geschaffen worden, um eine
mögliche GAP-Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1
identifizieren und charakterisieren zu können.
V Diskussion 66
V Diskussion
1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege in Hyphenpilzen Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege werden seit den 1990er Jahren vermehrt
in Hyphenpilzen untersucht, bei denen sie essentielle Funktionen während verschiedener
Entwicklungsprozesse regulieren (Bölker 1998; Turner und Borkovich 1993). Neben den
beiden gut untersuchten Systemen beim Menschen und in der Bäckerhefe S. cerevisiae
eignen sich Hyphenpilze für Studien der Signaltransduktion vor allem durch ihren
mehrzelligen Habitus und der ausgeprägten Zelldifferenzierung in der
Fruchtkörperentwicklung, die im Gegensatz zur einzelligen Lebensweise der Hefe als
Modell für die eukaryotische Zelldifferenzierung in vielzelligen Organismen verwendet
werden kann (Pöggeler und Kück 2004). Bei Hyphenpilzen, für die ein filamentöses
Wachstum mit tubulärem Spitzenwachstum namensgebend ist, sind analog zu den
beschriebenen Modellen im Menschen und in der Hefe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
(GPCR) und heterotrimere G-Proteine identifiziert worden (Übersicht bei Li et al. 2007).
Sie besitzen in der Regel drei Gα-Untereinheiten, die in drei Klassen eingeteilt werden,
sowie eine Gβ- und eine Gγ-Untereinheit.
Bei Pilzen werden Gα-Untereinheiten in drei Klassen unterteilt (Klasse I, II, III). Gα-Untereinheiten der Klasse I sind homolog zu Giα- und der Klasse III zu Gsα-Untereinheiten, deren charakteristische Funktion die Hemmung (Gi für Inhibitor) bzw. die Stimulation (Gs für Stimulator) von Adenylatzyklasen darstellt (Simon et al. 1991). Zu Gα-Untereinheiten der Klasse II sind bislang keine Homologe zu Vertretern in Säugetieren identifiziert worden (Bölker 1998).
Durch Gα-Untereinheiten der Klasse I besitzen Hyphenpilze Homologe zur humanen
Klasse Gi und ermöglichen in Kombination mit den oben erwähnten Charakteristika
Studien über G-Protein-vermittelte Signaltransduktionen, die Rückschlüsse auf das
komplexe humane System zulassen. Bei Hyphenpilzen wurden unter anderem die sexuelle
und vegetative Entwicklung, die Pathogenität sowie der Sekundärmetabolismus als durch
heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse beschrieben (Übersicht bei Li et al . 2007).
Auch bei dem in dieser Arbeit verwendeten Hyphenpilz S. macrospora konnte durch
vorherige Studien gezeigt werden, dass die Fruchtkörperentwicklung über eine
heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion induziert wird (Kamerewerd et al.
2008). Diese Ergebnisse wurden in der vorliegenden Arbeit durch eine detaillierte
Charakterisierung der Gα-Untereinheit GSA1 als zentraler Regulator auf die Entwicklung
des Hyphenpilzes S. macrospora erweitert.
V Diskussion 67
2. Die sexuelle Entwicklung des Hyphenpilzes Sordaria macrospora ist
abhängig vom Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit GSA1 In der vorliegenden Arbeit wurden erfolgreich konstitutive Formen der Gα-Untereinheit
GSA1 aus S. macrospora durch direkte Mutagenese hergestellt. Dabei wurde für eine
konstitutiv aktive GSA1-Variante der aus anderen Organismen bekannte
Aminosäureaustausch Q204L innerhalb der Switch II-Region durchgeführt, der eine
drastische Reduktion der intrinsischen GTPase-Aktivität bei Gα-Untereinheiten auslöst
und zu einer konstanten Signalweiterleitung führt (Coleman et al. 1994). Zur Herstellung
einer dominant negativen GSA1-Form wurde die G203R-Modifikation eingefügt, wodurch
die Dissoziation von Gα-Untereinheiten vom Gβγ-Dimer verhindert wird und der
Signalweg kontinuierlich ausgeschaltet bleibt (Yu et al. 1996). Der Einsatz analoger
Gα-Formen in Kombination mit assoziierten Knockoutmutanten führte in den letzten
Jahren zu einer Charakterisierung einer Vielzahl von Prozessen, an denen G-Protein-
Untereinheiten beteiligt sind (Fang und Dean 2000; Ivey et al. 2010; Segers und Nuss
2003; Yang und Borkovich 1999). Dazu gehört neben dem Einfluss auf die vegetative und
sexuelle Entwicklung bei Hyphenpilzen, die Regulation des Sekundärmetabolismus sowie
der Pathogenität. Bezüglich des Sekundärmetabolismus werden Beispiele für positive und
auch negative Regulationen durch Gα-Untereinheiten beschrieben. Die Gα-Untereinheit
PGA1 in Penicillium chrysogenum, beispielsweise, wird als positiver Regulator des
Sekundärmetabolismus beschrieben, da eine konstitutive Aktivierung von PGA1 die
Produktion der drei Sekundärmetaboliten Penicillin, Chrysogenin und Roquefortin, einem
Mykotoxin, stimuliert (Garcia-Rico et al. 2008). Die Funktion als negativer Faktor
bezüglich des Sekundärmetabolismus wurde stattdessen der Gα-Untereinheit FADA in
Aspergillus nidulans zugeschrieben, deren konstitutive Aktivierung die Produktion des
Mykotoxins Sterigmatocystin hemmt (Hicks et al. 1997; Wieser et al. 1997). Beim
pathogenen Pilz Cryphonectria parasitica wurde durch konstitutive Aktivierung der
Gα-Untereinheit CPG-1 eine Funktion als negativer Regulator in der Virulenz des Pilzes
beschrieben (Segers und Nuss 2003).
An der Vielzahl der identifizierten Funktionen von Gα-Untereinheiten zeigt sich deren
Vielseitigkeit bei der Regulation von Prozessen innerhalb der Hyphenpilze und die
Effizienz von Funktionsanalysen, die anhand von konstitutiven Gα-Formen in
Kombination mit Knockoutmutanten erreicht werden kann. Aus diesem Grund wurden in
der vorliegenden Arbeit ebenfalls konstitutive Formen zur funktionellen Charakterisierung
von GSA1 eingesetzt. Dafür wurden die modifizierten gsa1-Sequenzen in einen
V Diskussion 68
Doppel-Knockoutstamm der Gα-Untereinheiten gsa1 und gsa2 transformiert
(∆gsa1/∆gsa2), wodurch gewährleistet werden konnte, dass nur mutierte gsa1-Transkripte
produziert wurden. In der vorliegenden Arbeit konnte in S. macrospora anhand von
Charakterisierungen der hergestellten Stämme mit konstitutiv aktiver bzw. dominant
negativer Form der Gα-Untereinheit GSA1 eine vom Gα-Aktivitätsstatus abhängige
Funktion auf die sexuelle und vegetative Entwicklung beschrieben werden.
Bei der sexuellen Entwicklung zeigte der verwendete sterile Rezipient ∆gsa1/∆gsa2 nur
nach Transformation des modifizierten Gens gsa1_ca, das für eine konstitutiv aktive
GSA1-Form kodiert, eine vollständige Fertilität in Form von reifen Perithezien mit reifen
Ascosporen. Die verwendete dominant negative Form der Gα-Untereinheit zeigte hingegen
keinen positiven Einfluss auf die sexuelle Entwicklung, da in diesem Fall der sterile
Phänotyp von ∆gsa1/∆gsa2 nach Transformation von gsa1_ci in der entsprechenden
Transformante konstant vorherrschte (Abb. 7). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die
Fruchtkörperbildung bei S. macrospora ausschließlich über die GTP-gebundene Form der
Gα-Untereinheit GSA1 abläuft und anhand von GSA1-Effektoren ausgeführt wird. Eine
wahrscheinliche Erklärung für das Ausbleiben der Fruchtkörperentwicklung bei Ansätzen
mit der dominant negativen GSA1-Form ist, dass ein inaktives GSA1 GDP-gebunden mit
dem Gβγ-Dimer assoziiert vorliegt, wodurch Gα-Effektoren nicht aktiviert werden und
eine nachfolgende Signaltransduktion ausbleibt. Hierdurch werden Prozesse der
Fruchtkörperentwicklung und auch der vegetativen Entwicklung (siehe unten) nicht
eingeleitet.
In dem zu S. macrospora nahe verwandten heterothallischen Ascomyceten Neurospora
crassa wird die sexuelle Entwicklung ebenfalls über Gα reguliert. Das GSA1-Homolog
GNA-1 steuert in diesem Fall die weibliche Fertilität, da Knockoutmutanten von gna-1
weiblich steril sind und eine konstitutive Aktivierung von GNA-1 zur Wiederherstellung
der weiblichen Fertilität in den Knockoutstämmen führt (Yang und Borkovich 1999).
Der Begriff „weibliche Fertilität“ leitet sich aus dem Lebenszyklus von N. crassa ab. Für eine sexuelle Reproduktion ist in diesem Fall die Anwesenheit eines Kreuzungspartners mit entgegengesetztem Kreuzungstyp notwendig. Die Kreuzungstypen werden bei N. crassa mit A und a bezeichnet. Während des sexuellen Zyklus bilden sich sowohl weibliche Gametangien (Ascogone), als auch männliche Gameten (Makro- bzw. Mikrokonidien) an einem zweidimensional wachsenden Myzel aus. Sobald sich zwei Stämme mit unterschiedlichem Kreuzungstyp wahrnehmen, bildet das weibliche Gametangium, das nun Protoperithezium benannt wird, eine spezialisierte Hyphe (Trychogyne) aus, um durch Hyphenanastomose einen Kern aus einem männlichen Gameten aufzunehmen. Dies führt zur Bildung von ascogenen Hyphen, die zu Hakenzellen und Asci ausdifferenzieren, in denen durch Karyogamie, Meiose und postmeiotischer Mitose acht haploide Ascosporen entstehen (Kück 2005). Durch diesen Lebenszyklus bedingt wird bei N. crassa unterschieden, welcher
V Diskussion 69
Stamm die Protoperithezien bildet (weiblich) und welcher die Konidien spendet (männlich). Daraus ergeben sich die Bezeichnungen weiblich fertil/steril bzw. männlich steril/fertil.
Im Gegensatz zu der in dieser Arbeit beschriebenen Gα-GTP-abhängigen Regulation der
Fruchtkörperbildung bei S. macrospora ist die Steuerung der weiblichen Fertilität bei
N. crassa jedoch vom GNA-1-Aktivitätsstaus unabhängig. Stämme mit konstitutiv aktiver
Form werden als ebenso weiblich fertil beschrieben wie Stämme mit dominant negativem
GNA-1 (Yang und Borkovich 1999). In diesem Zusammenhang wird die Regulation der
sexuellen Entwicklung bei N. crassa - anders als es für S. macrospora in der vorliegenden
Arbeit ermittelt wurde - nicht allein durch Gα-Effektoren gefördert. Vielmehr wird
zusätzlich eine indirekte Regulation der Fruchtkörperbildung über die Gβ-Untereinheit,
gnb-1, und die Gγ-Untereinheit, gng-1, beschrieben, welche die vorherrschende Menge des
GNA-1-Proteins in der Zelle regulieren (Krystofova und Borkovich 2005; Yang et al.
2002).
Darüber hinaus liegen bei Pilzen neben der für S. macrospora und N. crassa beschriebenen
positiven Regulation der sexuellen Entwicklung auch Beschreibungen von negativen
Einflüssen oder einer Kombination aus positiver und negativer Regulation über
Gα-Untereinheiten vor, wodurch die Vielseitigkeit der durch Gα-Untereinheiten
vermittelten Regulationen deutlich wird. In der Pheromonantwort bei S. cerevisiae wird
beispielsweise eine negative Regulation über Gα (GPA1) beschrieben, da in diesem
speziellen Fall die Signaltransduktion über das Gβγ-Dimer (STE4/STE18) gesteuert wird
und durch Reassoziation von GPA1 mit STE4/STE18 die Aktivierung der Gβγ-Effektoren
gestoppt wird (Kap. 2.2.1.) (Dohlman und Thorner 2001). Eine Kombination aus positiver
und negativer Regulation der sexuellen Entwicklung mittels zweier Gα zeigt sich auch in
dem humanpathogenen Basidiomyceten Cryptococcus neoformans, bei dem die eine
Gα-Untereinheit GPA2 stimulierend und die GPA3-Untereinheit hemmend wirkt (Hsueh et
al. 2007). Bei S. macrospora sind neben GSA1 mit GSA2 und GSA3 ebenfalls weitere
Gα-Untereinheiten an der sexuellen Entwicklung beteiligt. GSA3 aktiviert die
Adenylatzyklase SAC1 und steuert über den cAMP-vermittelten Signalweg Prozesse
während der Ascosporogenese, wohingegen GSA2 nur eine GSA1-untergeordnete und
nicht essentielle Funktion bei der Pheromonantwort in S. macrospora ausübt (Kamerewerd
et al. 2008).
Neben der positiven Regulation der sexuellen Entwicklung wirkt die aktivierte
Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora ebenfalls stimulierend auf das vegetative
Wachstum: Nach Transformation der modifizierten Sequenz gsa1_ca in die
V Diskussion 70
Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2 konnte in der vorliegenden Arbeit ein gesteigertes
vegetatives Wachstum beobachtet werden. Dabei wird durch die vorherrschende
konstitutive Aktivierung der Gα-Untereinheit GSA1 nicht nur der Wachstumsdefekt des
Rezipienten komplementiert, sondern das Wachstum über den Level des Wildtyps hinaus
stimuliert. Dahingegen wurde bei Transformanten mit dominant negativer Gα-Untereinheit
keine signifikante Änderung des vegetativen Wachstums beobachtet und der
Wachstumsdefekt der Ausgangsmutante war weiterhin vorhanden (Abb. 6). Ein
vergleichbarer Effekt einer Gα-Untereinheit auf Prozesse der vegetativen Entwicklung
konnte auch bei dem GSA1-Homolog GNA-1 aus N. crassa beobachtet werden, da die
konstitutive Aktivierung von GNA-1 in einer 60 %igen Steigerung der produzierten
Biomasse im Vergleich zum Wildtyp resultierte (Yang und Borkovich 1999).
Für die Diskussion der Auswirkungen von konstitutiv aktiven GSA1-Formen muss
berücksichtigt werden, dass die beschriebenen Effekte auch durch einen frei vorliegendes
Gβγ-Dimer ausgelöst werden könnten, der zu einer kontinuierlichen Aktivierung von
Gβγ-Effektoren führt (Birnbaumer 1992). Deshalb wurden analog zur Vorgehensweise
anderer Studien, die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Phänotypen der Stämme von
konstitutiv aktiven und dominant negativen Gα-Untereinheiten zum einen untereinander
und zum anderen mit dem Phänotyp der Knockoutmutante ∆gsa1/∆gsa2 verglichen. Bei
einer Übereinstimmung des Phänotyps der Knockoutmutante und des Stammes mit
konstitutiv aktiver GSA1-Variante kann dieser dem Gβγ zugeschrieben werden, da in
beiden Fällen das Gβγ-Dimer frei vorliegt und eine Signalweiterleitung über
Gβγ-Effektoren erfolgt. Bei einem phänotypischen Unterschied hingegen ist ausschließlich
die Gα-Untereinheit der für den Phänotyp verantwortliche Faktor (Yang und Borkovich
1999). Bei S. macrospora unterscheidet sich der Stamm ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_3),
bei dem GSA1 konstitutiv aktiviert vorliegt, anhand seiner Fertilität und seines vegetativen
Wachstums, sowohl von der sterilen Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2 als auch von sterilen
Stämmen mit dominant negativer GSA1-Form. Bei beiden wurde ein Defekt im
vegetativen Wachstum beobachtet. Der beschriebene Effekt auf die sexuelle und vegetative
Entwicklung in S. macrospora lässt sich somit eindeutig auf die Gα-Untereinheit GSA1
zurückführen. Eine darüber hinaus mögliche indirekte regulatorische Funktion des
Gβγ-Dimers in S. macrospora kann an dieser Stelle aufgrund fehlender Daten nicht
vollständig ausgeschlossen werden und sollte somit das Ziel nachfolgender Studien sein. In
diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass im Genom von S. macrospora jeweils ein
V Diskussion 71
Gen für eine Gβ- und ein Gen für eine Gγ-Untereinheit identifiziert wurden, wie es für
Hyphenpilze charakteristisch ist (Nowrousian et al. 2010).
3. Das GSA1 bindende RGS-Protein ROG1 ist ein putativer negativer
Regulator des G-Protein-Signalweges in Sordaria macrospora Durch Komplementationsstudien mit konstitutiven GSA1-Formen konnte eine zentrale
Rolle der aktiven Gα-Untereinheit GSA1 in der Fruchtkörperentwicklung von
S. macrospora beschrieben werden, so dass mögliche Effektoren oder Regulatoren von
GSA1 im Fokus der weiteren Aufklärung dieser spezifischen Funktion stehen. In diesem
Zusammenhang konnten in der vorliegenden Arbeit durch in vivo-Interaktionsstudien mit
der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora exklusive
Interaktionspartner der aktiven, GTP-gebundenen Gα-Form beschrieben werden. Als
möglicher negativer Regulator des G-Protein-vermittelten Signalweges in S. macrospora
wurde mit ROG1 (Regulator of GSA1), ein spezifischer GSA1-GTP Interaktionspartner
identifiziert, der aufgrund seiner RGS-Domäne zur Familie der Regulatoren des G-Protein-
Signalweges (RGS-Proteine) gezählt werden kann.
Die Entdeckung von RGS-Proteinen als assoziierte Bindepartner von Gα-Untereinheiten
begann 1996 mit der parallel beschriebenen Identifikation der Proteine SST2 in
S. cerevisiae, EGL-10 aus C. elegans und GAIP aus H. sapiens (De Vries et al. 1996;
Dohlman et al. 1996; Koelle und Horvitz 1996). Ausgehend von diesen Studien ist die Zahl
der identifizierten RGS-Proteine stetig gewachsen, und führte bis zum jetzigen Zeitpunkt
zu einer Vielzahl von Charakterisierungen in Säugetieren, Pflanzen und Pilzen (Johnston et
al. 2008; Willars 2006; Xue et al. 2008; Yu et al. 1996). Eine umfassende Beschreibung
der RGS-Proteine und den unterschiedlichen Vertretern wurde bereits in der Einleitung in
Kapitel 3.2.1. vorgenommen, weshalb an dieser Stelle nur diskussionsrelevante Eckpunkte
beschrieben werden.
RGS-Proteine wirken über eine negative Regulation auf Gα-Untereinheiten und
inaktivieren dadurch den vermittelten Signalweg. Ihre Entdeckung führte zur Erklärung der
in vivo beobachteten schnellen Abfolge von Signaleinleitung und Signalbeendigung durch
heterotrimere G-Proteine, obwohl in vitro nur gering gemessene intrinsische
GTPase-Aktivitäten von Gα-Untereinheiten beschrieben werden konnten (Arshavsky und
Pugh 1998; Chen et al. 2000). RGS-Proteine wirken entgegengesetzt zu positiven
Regulatoren wie den Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange factor) die
V Diskussion 72
das an Gα-gebundene Guanosindiphosphat (GDP) durch ein Guanosintriphosphat (GTP)
ersetzen und eine Aktivierung der Gα-Untereinheit bewirken. Somit komplementiert die
Funktion der RGS-Proteine durch Stimulation der GTP-Hydrolyse den Aktivierungszyklus
einer Gα-Untereinheit, wie er in Abbildung 1 dieser Arbeit dargestellt ist. Ihre negative
Regulation auf die Signaltransduktion üben RGS-Proteine durch eine charakteristische 120
Aminosäure große RGS-Domäne aus, über die sie als GAP (GTPase aktivierendes Protein)
stimulierend auf die intrinsische GTPase-Aktivität von Gα-Untereinheiten wirken und ihre
Inaktivierung beschleunigen (Siderovski und Willard 2005). Strukturell betrachtet bindet
die aus neun α-Helices bestehende RGS-Domäne innerhalb der Switch-Regionen von
Gα-Untereinheiten, wodurch der „Transition-State“ während der GTPase-Reaktion
stabilisiert wird und die Beschleunigung der Hydrolyse von GTP zu GDP ausgeführt
werden kann.
Als charakteristisches Merkmal der RGS-Proteine wird eine exklusive Bindung an
aktivierte GTP-gebundene Gα-Untereinheiten beschrieben (Popov et al. 1997; Tesmer et
al. 1997), wie sie ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bei dem identifizierten RGS-Protein
ROG1 aus S. macrospora bobachtet werden konnte. In Hefe-2-Hybrid-Analysen konnte
ROG1 nur mit dem konstitutiv aktiven Köder GSA1_CA als GTP-GSA1-bindendes
Protein identifiziert werden, was darüber hinaus mittels Ko-Immunopräzipitationsstudien
in vitro bestätigt wurde (Abb. 9 und Abb. 11). Diese Interaktion des RGS-Proteins ROG1
mit GTP-GSA1 sowie die charakteristische RGS-Domäne sind deutliche Hinweise auf eine
GAP-Aktivität von ROG1, wodurch eine negative Regulation auf die G-Protein-vermittelte
Signaltransduktion in S. macrospora angenommen werden kann. Als Grundlage für
nachfolgende Studien zur Charakterisierung einer GAP-Aktivität von ROG1 konnte in der
vorliegenden Arbeit bereits die intrinsische GTPase-Aktivität von GSA1 anhand eines
aufgereinigten Proteins aus E. coli ermittelt werden (Abb. 16).
Die GAP-Aktivität und die damit verbundene Inaktivierung der Gα-Untereinheit macht
RGS-Proteine zu entscheidenden Regulatoren für die Festlegung der Dauer, in der eine
Signalantwort ausbleibt, da eine schnelle Inaktivierung von Gα auch eine schnelle
Reaktivierung ermöglicht. In diesem Kontext wird eine Funktion von RGS-Proteinen als
Gerüstproteine („Scaffold“-Proteine) beschrieben, welche Gα-Untereinheiten zur schnellen
Reaktivierung in räumliche Nähe zum Rezeptor bringen (Smith et al. 2009; Zhong et al.
2003). In S. macrospora stellen zwei Pheromonrezeptoren, PRE1 und PRE2, welche in der
Fruchtkörperbildung involviert sind, in diesem Kontext mögliche Bindepartner des
RGS-Proteins ROG1 und der Gα-Untereinheit GSA1 dar (Mayrhofer und Pöggeler 2005;
V Diskussion 73
Mayrhofer et al. 2006; Pöggeler 2000; Pöggeler und Kück 2001). Da es sich bei diesen
Rezeptoren um membranständige Proteine handelt, kann eine ausbleibende Identifikation
von PRE1 und PRE2 als GSA1-Interaktionspartner in den durchgeführten
Hefe-2-Hybrid-Analysen aufgrund einer fehlenden nukleären Lokalisation erklären. Die
Interaktionsnetzwerke von PRE1 und PRE2 sind Bestandteil in von dieser Arbeit
unabhängigen Studien und sollen zu einer weiteren Aufklärung der G-Protein-vermittelten
Signaltransduktion beitragen (Teichert und Güttel, persönliche Mitteilung). Eine direkte
Bindung des RGS-Proteins an Rezeptor und G-Protein wird über zusätzliche Domänen
vermittelt, die sie neben der RGS-Domäne aufweisen. Als Beispiel kann das humane
RGS11 genannt werden, das eine GGL-Domäne (G-Protein gamma like) und eine DEP-
Domäne (Dishevelled/EGL-10/Pleckstrin-Homologie) besitzt. Über die GGL-Domäne
bindet RGS11 an eine Gβ-Untereinheit (Gβ5), wodurch beide Proteine einen Gβγ-Dimer-
ähnlichen Komplex bilden. Dieser interagiert mit Gα und bewirkt nachfolgend eine
Bindung an einen membranständigen GPCR, da RGS11 über die DEP-Domäne
membran-assoziiert in räumlicher Nähe zum Rezeptor lokalisiert wird (Ballon et al. 2006;
Jones et al. 2004; Siderovski und Willard 2005; Sondek und Siderovski 2001).
Ein solcher Multidomänencharakter wie bei RGS11 ist charakteristisch für viele
RGS-Proteine und wird dazu verwendet die humanen Vertreter anhand ihrer
Domänenstruktur zu klassifizieren (Ross und Wilkie 2000). Die Klassifizierung der
RGS-Proteine mit entsprechend dargestellter Domänenstruktur ist in Tabelle 2 dieser
Arbeit dargestellt. Bei dem in dieser Arbeit identifizierten RGS-Protein ROG1 aus
S. macrospora handelt es sich ebenfalls um ein Multidomänenprotein, bei dem neben der
zentralen RGS-Box eine Phox-Domäne (PX), eine Phox-assoziierte-Domäne (PXA) sowie
eine C-terminale Nexin-Domäne (Nexin-C) identifiziert werden konnten (Abb. 10).
Aufgrund dieser Domänenarchitektur besitzt ROG1 die größte Homologie zu Proteinen der
humanen RGS-Familie H. Diese besteht aus drei Vertretern der sogenannten „Sorting
Nexine“ und in dieser Proteinfamilie sind mögliche Hinweise auf eine Funktion des
ROG1-Proteins zu finden. Die Bezeichnung der PX-Domäne leitet sich von den
Untereinheiten p40phox und p47phox der NADPH-Oxidase ab, bei denen diese Domäne das
erste Mal beschrieben wurde, und sie gehören zu den Phospholipid-bindenden Motiven,
die eine Lokalisation der Proteine an Phospholipid-angereicherten Membranen
ermöglichen (Ponting 1996; Xu et al. 2001). Die weiteren Domänen (PXA und Nexin C)
des ROG1-Proteins sind in Bezug auf ihre Funktion nicht weiter beschrieben, aber wie die
PX-Domäne charakteristisch für die Proteinfamilie der „Sorting Nexine“, die im Menschen
V Diskussion 74
an der Endozytose und Translokalisation von Proteinen in Abhängigkeit ihrer
Bindungsspezifität an Phospholipide beteiligt sind (Worby und Dixon 2002). Für die
vorliegende Charakterisierung von ROG1 aus S. macrospora und seiner möglichen
GAP-Aktivität ist die beschriebene Beteiligung von „Sorting Nexinen“ an
Signaltransduktionen besonders interessant. So ist bekannt, dass sie sowohl die
Lokalisation von Signalkomplexen gewährleisten als auch direkt mit endozytierten
Rezeptoren interagieren und deren Lokalisation und Transport während des
„Turnover“-Prozesses koordinieren (Cullen 2008; Sorkin und von Zastrow 2009; Worby
und Dixon 2002).
Nach der Endozytose eines Membran-assoziierten Rezeptors über Clathrin-Vesikel und deren Fusion mit frühen Endosomen führen „Sorting Nexine“ die weitere Lokalisation des Rezeptors durch. Es gibt dabei zwei Möglichkeiten. (1) Der Rezeptor wird zu späten Endosomen geleitet, die sich zu Lysosomen ausdifferenzieren und die Degradierung des Rezeptors einleiten. In diesem Fall wird ein Rezeptor neu synthetisiert und an die Plasmamembran translokalisiert, um das Signal aufzunehmen. (2) Der Rezeptor gelangt über Recycling-Endosomen zurück an die Plasmamembran, wobei ebenfalls „Sorting Nexine“ diese Transportwege steuern. Dieser Ablauf von Degradierung, Neusynthese bzw. Recycling, Transport und Rekrutierung des Rezeptors an die Membran wird als „Turnover“ des Rezeptors bezeichnet (Worby und Dixon 2002).
Besonders interessant in Bezug auf die Funktion von ROG1 ist, dass innerhalb der
„Sorting Nexin“-Familie mit SNX13, SNX14 und SNX25 drei Proteine mit
RGS-Domänen beschrieben sind, von denen ROG1 aus S. macrospora die größte
Homologie zu SNX13 aufweist, das nach der Identifikation seiner RGS-Domäne in
RGS-PX1 umbenannt wurde (Abb. 10).
Während die meisten RGS-Proteine auf Gαi-Untereinheiten wirken, handelt es sich bei
RGS-PX1 um das erste und bislang einzige RGS-Protein, für das eine GAP-Aktivität auf
Gα-Untereinheiten der Klasse Gs beschrieben wurde (Neubig und Siderovski 2002; Zheng
et al. 2001). Hierdurch wirkt es als negativer Regulator auf cAMP-Signalwege. ROG1 aus
S. macrospora würde im Gegensatz dazu als positiver Regulator der cAMP-Signalwege
fungieren, da es als GAP für GSA1, eine Gα-Untereinheit aus der Klasse Gi inaktiviert,
deren Vertreter hemmend auf die Adenylatzyklase und somit auf den cAMP-Weg wirken
(Simon et al. 1991). Trotz dieser unterschiedlichen Spezifität in Bezug auf die
Gα-Untereinheit ist RGS-PX1 für die vorliegende Arbeit und eine mögliche
Funktionsbeschreibung von ROG1 sehr interessant, da beide Faktoren eine Kombination
von „Sorting Nexin“ und RGS-Protein darstellen.
Eine mögliche Rezeptorregulation von ROG-Homologen zeigte eine Überexpression von
RGS-PX1, die zur Degradation des EGF (Epidermal Growth Factor)-Rezeptors führte.
V Diskussion 75
Darüber hinaus wiesen Knockoutmutanten bei Mäusen dramatische Defekte in der
Endozytose und Translokalisation von Proteinen auf, die zu einer embryonalen Letalität
führten (Zheng et al. 2001; Zheng et al. 2006). Bezugnehmend auf diese Beschreibung von
RGS-PX1 könnte ROG1 ebenfalls an Prozessen der Translokalisation von Proteinen oder
an der Endozytose der beiden Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 beteiligt sein. Um dies
zu bestätigen sind Knockoutstudien von ROG1 nötig, um einen möglichen Defekt in
diesen Prozessen untersuchen zu können. Da die PX-Domäne bei RGS-PX1 eine für
„Sorting Nexine“ typische Lokalisation am Phospholipid-angereicherten Endosom bewirkt,
ergeben sich zum wiederholten Mal Hinweise auf eine endosomale Assoziation von ROG1
in der Literatur. In Säugern interagiert RGS-PX1 am Endosom mit Gαs, wodurch eine
räumliche Nähe zu internalisierten Rezeptoren geschaffen wird und eine
Signalweiterleitung am Endosom vermutet werden kann (von Zastrow und Mostov 2001).
Diese im Jahr 2001 bei Säugetieren publizierte endosomale Translokalisation eines
Signalkomplexes konnte 2006 von Slessareva und Mitarbeitern ebenfalls in der
Pheromonantwort der Hefe S. cerevisiae beschrieben werden.
In der Hefe wird die GTP-gebundene Gα-Untereinheit GPA1 an das Endosom
translokalisiert und interagiert dort mit der katalytischen Untereinheit der
Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K) VPS34 (Slessareva et al. 2006). Da mittels dieser
Interaktion Phosphoinositol-3-Phosphat (PtdIns3P) hergestellt wird und eine Rekrutierung
von Proteinen mit PX-Domänen an das Endosom bewiesen werden konnte, ergibt sich
anhand dieses Signalkomplexes aus der Hefe eine Verbindung zu ROG1 als GAP eines
analogen Komplexes in S. macrospora. Diese hypothetische ROG1-Funktion ist darüber
hinaus sehr interessant, da Slessareva und Mitarbeiter eine Beteiligung eines RGS-Proteins
zwecks Inaktivierung der Gα-Untereinheit GPA1 vermuten, aber bislang keines der aus der
Hefe bekannten RGS-Proteine mit diesem Komplex in Verbindung bringen konnten. Dies
kann dadurch begründet sein, dass in der Hefe kein RGS-Protein mit der Domänenstruktur
von ROG1 oder RGS-PX1 identifiziert worden ist.
In S. cerevisiae gibt es vier RGS-Proteine, SST2, RGS2, RAX1 und MDM1, von denen MDM1 das ROG1-Homolog in der Hefe ist. Das Protein SST2 aus S. cerevisiae war eines der ersten identifizierten RGS-Proteine, die 1996 beschrieben wurden und übt eine GAP-Aktivität auf GPA1 aus, wodurch es als negativer Regulator die Pheromonantwort steuert (Apanovitch et al. 1998). RGS2 wirkt als GAP auf die Gα-Untereinheit GPA2 und reguliert den cAMP-Signalweg in der Glukose-Wahrnehmung (Versele et al. 1999). Für RAX1 und MDM1 sind bislang keine GAP-Aktivität beschrieben worden (Chasse et al. 2006).
V Diskussion 76
Das S. cerevisiae-Protein MDM1 (Mitochondrial distribution and morphology 1) besitzt
die Domänen PXA, PX und Nexin C als Charakteristika der „Sorting Nexine“, wodurch es
mittels in silico-Analysen als ROG1-Homolog identifiziert werden kann. Darüber hinaus
unterscheidet sich das Protein MDM1 aus der Hefe jedoch deutlich von ROG1 aus
S. macrospora und dem humanen RGS-PX1, da es keine RGS-Domäne aufweist
(Abb. 10). Des Weiteren reguliert MDM1 mit der Vererbung der Organellen von der
Tochter- zur Mutterzelle während der Zellteilung einen Prozess, bei dem bislang kein
Einfluss von G-Proteinen beschrieben werden konnte (Fisk und Yaffe 1997). Aufgrund
seiner Funktion und der fehlenden RGS-Domäne ist eine GAP-Aktivität des
MDM1-Proteins aus S. cerevisiae sehr unwahrscheinlich und liefert für die vorliegende
Arbeit keine weiteren Hinweise auf eine mögliche Funktion von ROG1 als negativer
Regulator der Fruchtkörperentwicklung in S. macrospora. Die Hypothese einer
endosomalen Rekrutierung des ROG1-Proteins über seine PX-Domäne wird in diesem
Zusammenhang hingegen angesichts einer beschriebenen Bindung von MDM1 an
PtdIns3P bekräftigt (Yu und Lemmon 2001).
Weitere ROG1-Homologe konnten in Genomen von Hyphenpilzen wie Magnaporthe
grisea, P. chrysogenum, Aspergillus fumigatus, C. neoformans und N. crassa identifiziert
werden (Abb. 10). Obwohl diese Proteine noch nicht funktionell beschrieben sind, könnte
die gleiche Domänenstruktur aus PXA-, PX- und RGS-Domäne auf eine ROG1-ähnliche
Funktion hinweisen, die in weiteren Studien untersucht werden sollte.
Für ROG1 aus S. macrospora ergibt sich resultierend aus der Beschreibung des humanen
ROG1-Homologs, RGS-PX1, und der Verwandtschaft zu „Sorting Nexinen“ eine
hypothetische endosomal-assoziierte GAP-Funktion für die Gα-Untereinheit GSA1. Die
identifizierte RGS-Domäne des ROG1-Proteins sowie die bestätigte, spezifische Bindung
an GTP-GSA1 bekräftigen diese Hypothese, da sie charakteristische Eigenschaften der
GAP-Proteine darstellen. Die Translokalisation des ROG1-Proteins zum Endosom könnte
diesbezüglich über die identifizierte PX-Domäne vermittelt werden, die als
Phospholipid-bindendes Motiv in der Literatur beschrieben wird. Weitere Hinweise auf
einen endosomal-assoziierten Signalkomplex in S. macrospora werden im nächsten
Kapitel hinsichtlich einer Interaktion der Gα-Untereinheit GSA1 mit der PI3-Kinase
SmVPS34 diskutiert, deren Lokalisation am Endosom aufgrund des Hefe-Homologs,
VPS34 bekannt ist (Herman et al. 1991; Huh et al. 2003).
V Diskussion 77
4. Die Gα-Untereinheit GSA1 interagiert mit Phospholipid-assoziierten
Proteinen Die im vorherigen Kapitel beschriebene Phospholipid-assoziierte Lokalisation von
ROG1-Homologen im Menschen und in der Hefe sowie die putative GAP-Funktion des
ROG1-Proteins für die Gα-Untereinheit GSA1 deuten auf eine mögliche Funktion von
GSA1 am phospholipidreichen Endosom hin. Diese These wird im Folgenden durch
Ergebnisse aus in dieser Arbeit durchgeführten in vivo-Interaktionsstudien bestärkt,
demzufolge eine Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-Kinase) und deren Gegenspieler, eine
Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als weitere spezifische Interaktionspartner der
GTP-gebundenen Gα-Untereinheit GSA1 identifiziert werden konnten.
Die Funktion von Phosphoinositol-Phosphatasen besteht in der Dephosphorylierung von
Phosphoinositolen (PtdIns), bei der jede Phosphatase eine eigene Substratspezifität besitzt
(Strahl und Thorner 2007). Bei Sequenzvergleichen mit der PIPase konnten homologe
Proteine in N. crassa, Chaematomium globosum. M. oryzeae, Podospora anserina und
S. cerevisiae identifiziert werden. In Bezug auf die Bestimmung einer Substratspezifität
der identifizierten PIPase konnte anhand des bereits charakterisierten Hefe-Homologs
INP52 eine Spezifität in der Dephosphorylierung von Phosphoinositoltriphosphat
(PtdIns3P) zu Phosphoinositol (PtdIns) und von Phosphoinositoldiphosphat (PtdIns[3,5]P2)
zu Phosphoinositol ermittelt werden (Strahl und Thorner 2007). Mit der
Dephosphorylierung von PtdIns3P zu PtdIns wirkt die PIPase entgegengesetzt zu
Phosphoinsoitol-3-Kinasen (PI3-Kinasen), die PtdIns zu PtdIns3P phosphorylieren.
PtdIns3P wirkt im Zusammenhang mit Signaltransduktionen als sekundärer Botenstoff,
über den das primäre Signal von der Plasmamembran ausgehend intrazellulär weiterleitet
wird.
Das Spektrum der Prozesse, die durch Phospholipide vermittelt werden ist breitgefächert
und umfasst den vesikulären Transport, das Zellwachstum und die Regulation der
Apoptose (Damilano et al. 2010; Engelman et al. 2006; Khwaja et al. 1997; Leevers et al.
1996; Rapoport et al. 1997; Wurmser und Emr 1998). Für die als
GSA1-Interaktionspartner identifizierte PIPase konnte zwar bislang keine Funktion im
Bereich der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in der Literatur gefunden werden,
doch ergibt sich anhand des entgegengesetzt wirkenden Enzyms, der PI3-Kinase VPS34
und ihrer Beschreibung als spezifischer Effektor der Gα-Untereinheit GPA1 in der Hefe,
eine weitere Verbindung von Gα-Untereinheiten zu Phospholipiden (Slessareva et al.
2006). PI3-Kinasen werden aufgrund ihrer katalytischen Domäne und ihrer
V Diskussion 78
Substratspezifität in drei Klassen unterteilt, von denen in Pflanzen, der Hefe S. cerevisiae
und dem Hyphenpilz S. macrospora mit VPS34 nur der Vertreter aus Klasse III
identifiziert wurde (Nowrousian et al. 2010; Vanhaesebroeck et al. 2001). PI3-Kinasen
stellen einen häufigen Interaktionspartner von G-Proteinen dar. Neben VPS34 in der Hefe
sind z.B. auch PI3-Kinasen aus Klasse I in Säugetieren als Effektoren des G-Protein-
Signalweges bekannt (Leopoldt et al. 1998; Stoyanov et al. 1995; Yeung und Wong 2010).
Der Aufbau der PI3-Kinase aus einer katalytische Untereinheit, VPS34 und einer
regulatorischen Untereinheit VPS15 ist in allen Eukaryoten konserviert und ist neben dem
vesikulären Transport, der Proteinsynthese und der Regulation des mTOR-Signalweges vor
allem aufgrund ihrer Beteiligung an einem endosomalen Signalweg in S. cerevisiae für
diese Arbeit interessant (Burda et al. 2002; Nobukuni et al. 2005; Schu et al. 1993;
Slessareva et al. 2006). In der Literatur wird darin eine Aktivierung der PI3-Kinase VPS34
am Endosom durch die Gα-Untereinheit GPA1 beschrieben, wodurch der sekundäre
Botenstoff PtdIns3P hergestellt und über die Aktivierung der MAP-Kinase FUS3 die
bevorstehende Paarung der Hefezellen eingeleitet wird (Pheromonantwort in der Hefe,
siehe Kap. 2.2.1.). Die GDP-gebundene Form von GPA1 interagiert ebenfalls am Endosom
mit der regulatorischen Untereinheit der PI3-Kinase, VPS15, die hinsichtlich eines WD40-
Motivs die analoge Struktur einer Gβ-Untereinheit ausbildet. Für VPS15 wurde darüber
hinaus die Funktion eines Gerüstproteins für einen Signalkomplex aus GPA1 (Gα) und
ATG14 (putative Gγ-Untereinheit) beschrieben, wodurch wahrscheinlich ein komplettes
heterotrimeres G-Protein am Endosom vorliegt (Dohlman und Slessareva 2006; Heenan et
al. 2009). Obwohl die Daten aus der Hefe darauf hindeuten, dass die Gα-Untereinheit
GPA1 in beiden Aktivitätszuständen endosomal lokalisiert ist, konnte bislang keine
Reaktivierung nötiger Regulatoren wie eines Guanosin-Austauschfaktors oder eine
Inaktivierung über ein GTPase-aktivierendes Protein beschrieben werden. Eine
diesbezüglich diskutierte Rekrutierung solcher Faktoren über Phospholipid-bindende
Motive wie eine FYVE- oder PX-Domäne durch die Produktion von PtdIns3P deutet auf
eine mögliche Beteiligung des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1 hin
(Slessareva et al. 2006). ROG1 ist aufgrund seiner Domänenstruktur und seiner putativen
Funktion als GAP prädestiniert für die Regulation eines dementsprechenden Komplexes in
S. macrospora, weshalb in der vorliegenden Arbeit eine mögliche Interaktion von GSA1
und dem VPS34-Homolog aus S. macrospora SmVPS34 untersucht wurde. Bei
S. macrospora ist SmVPS34 analog zur Hefe die einzige PI3-Kinase, die ebenfalls anhand
ihrer katalytischen Domäne PI3-Kc als Klasse III-PI3-Kinase eingeordnet werden kann
V Diskussion 79
(Abb. 12). Die annotierte Sequenz von SmVPS34 lag bereits vor, da es auch in Studien zur
Aufklärung der Autophagie bei S. macrospora untersucht wird (Pöggeler, persönliche
Mitteilung). VPS34-Homologe sind in vielen eukaryotischen Organismen als wichtiger
Bestandteil eines regulatorischen Multiproteinkomplexes während der Autophagie
beschrieben, deren Einfluss auch im Hinblick auf die sexuelle Entwicklung untersucht wird
(Hu et al. 2008a; Juhasz et al. 2008; Kihara et al. 2001; Zhong et al. 2009; Zhou und Wang
2010). In diesem Kontext konnte in VPS34-unabhängigen Studien die Notwendigkeit der
Autophagie für die Fruchtkörperentwicklung bei S. macrospora beschrieben werden
(Nolting et al. 2009).
Als Autophagie wird ein katabolischer Prozess bezeichnet, in dessen Verlauf eine Zelle ihre Makromoleküle und Organellen über spezielle Vesikeltransporte ins Lumen der Vakuole bei der Hefe bzw. bei Säugern ins Lysosom transportiert, diese dort degradiert und für den Metabolismus wiederverwertet. Bei Säugern wird die Autophagie im Verlauf der Erneuerung alter Proteine und Organellen angewendet, wohingegen in der Hefe die Autophagie durch Nährstoffmangel induziert wird (Funderburk et al. 2010; He und Klionsky 2009).
Eine mögliche Assoziation von SmVPS34 mit G-Protein-vermittelten Signalwegen wurde
in der vorliegenden Arbeit mittels in vivo-Interaktionsstudien mit den drei
Gα-Untereinheiten GSA1, GSA2 und GSA3 sowie der beiden konstitutiven Formen
GSA1_CA (konstitutiv aktiv) und GSA1_CI (dominant negativ) in S. macrospora
untersucht. Dabei konnte eine spezifische Interaktion von SmVPS34 mit der
Gα-Untereinheit GSA1 nachgewiesen werden. Aufgrund der in dieser Arbeit
durchgeführten Ko-Immunopräzipitationsanalysen bestätigte sich die Bindung von
SmVPS34 an GSA1 in vitro, die darüber hinaus in Abhängigkeit vom Aktivitätszustand
der Gα-Untereinheit ausgebildet wurde. SmVPS34 bindet präferiert an die GTP-gebundene
Form von GSA1, da nur die konstitutiv aktive Form GSA1_CA mit SmVPS34 in
aussagekräftigen Mengen ko-immunopräzipitiert werden konnte. Zwar sind innerhalb der
Ansätze mit dem wildtypischen GSA1 und der dominant negativen Form schwache
Banden der Gα-Untereinheit in der Elution zu erkennen, doch zeigen diese im Vergleich zu
den Ansätzen des konstitutiv aktiven GSA1_CA eine dominante Bindungsaffinität von
SmVPS34 zu der aktiven GSA1-Form GSA1_CA (Abb. 13). Darüber hinaus konnte in der
vorliegenden Arbeit erfolgreich der mit GSA1 interagierende Bereich von SmVPS34
innerhalb des N-terminalen Bereichs (AS 1-337) eingegrenzt werden (Tab. 10). Dieser
trägt die C2-Domäne, deren Funktion bei Protein-Protein-Interaktionen bereits für das
humane VPS34-Homolog hVPS34 beschrieben wurde. In diesem Fall bindet das Protein
Beclin1 (VPS30 in der Hefe) über die C2-Domäne an hVPS34, um die Autophagie
V Diskussion 80
einzuleiten (Liang et al. 2006). Eine weitere Bestätigung ergibt sich darüber hinaus für das
Hefe-Homolog VPS34, dessen C-Terminus durch die regulatorische Untereinheit VPS15
gebunden vorliegen muss, da eine Assoziation dieser beiden Proteine die Rekrutierung von
GPA1 zum Endosom gewährleistet (Heenan et al. 2009; Slessareva und Dohlman 2006;
Strahl und Thorner 2007).
Durch die Identifizierung einer exklusiven Interaktion der GTP-gebundenen GSA1-Form
mit der PI3-Kinase, SmVPS34, und der entgegengesetzt wirkenden
Phosphoinsoitol-Phosphatase konnten in der vorliegenden Arbeit zwei neue Gα-Effektoren
in S. macrospora beschrieben werden, die eine Spekulation über eine Phospholipid-
vermittelte Signalweiterleitung ermöglichen. In diesem Zusammenhang wurde aktuell die
Notwendigkeit eines anderen Phospholipids, Phosphoinositoldiphosphat (PtdIns[4,5]P2) für
die MAP-Kinase-vermittelte Pheromonantwort in der Hefe beschrieben, in der über das
Phospholipid die Rekrutierung eines Signalkomplexes in Richtung der
Pheromonprojektion eingeleitet wird (Garrenton et al. 2010). In S. macrospora könnte die
Interaktion von GSA1 mit der PI3-Kinase SmVPS34, analog zu Daten aus der Hefe, die
Produktion von PtdIns3P einleiten. Nachfolgend könnte dieses Phospholipid als mögliches
Signal für die Phosphorylierung einer MAP-Kinase-Kaskade wirken, wie es für die
MAP-Kinase FUS3 in S. cerevisiae vermutet wird (Slessareva et al. 2006). Eine mögliche
Funktion einer MAP-Kinase innerhalb von Entwicklungsprozessen bei Hyphenpilzen
wurde diesbezüglich in N. crassa für das FUS3-Homolog MAK2 in der Regulation des
vegetativen und sexuellen Wachstums beschrieben (Li et al. 2005; Slessareva et al. 2006).
Ergänzend dazu wird bei N. crassa aufgrund einer Überschneidung der weiblich sterilen
Phänotypen der MAP-Kinase MAK2 und der Gα-Untereinheit GNA1 eine Regulation des
MAP-Kinase-Kaskade-Weges über Gα spekuliert, wofür der in dieser Arbeit identifizierte
Signalweg über den sekundären Botenstoff PtdIns3P ein möglicher Kandidat sein könnte
(Li et al. 2005). In S. macrospora könnte GSA1 bei Regulation über PtdIns3P sowohl die
Aktivierung eines entsprechenden Signalweges (Interaktion mit VPS34 und anschließender
Produktion von PtdIns3P) als auch dessen Beendigung (Aktivierung der
Phosphoinositol-Phosphatase und anschließender Dephosphorylierung von PtdIns3P) über
die Konzentration des sekundären Botenstoffes PtdIns3P steuern. Eine Voraussetzung für
diese Regulation ist, dass die Interaktion von GSA1 mit beiden Proteinen zu einer
Aktivierung ihrer Funktion führt, was in nachfolgenden Studien detaillierter untersucht
werden sollte.
V Diskussion 81
Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit zwei Effektoren der
Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora beschrieben werden, was auf eine mögliche
Signaltransduktion über Phospholipide hindeutet, die am Endosom lokalisiert sein könnte.
Das identifizierte RGS-Protein ROG1 stellt in diesem Zusammenhang einen möglichen
negativen Regulator des Signalweges dar. Im nächsten Kapitel wird abschließend ein
zusammenfassendes Arbeitsmodell der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in
S. macrospora dargestellt, wie es sich anhand der erzielten Ergebnisse dieser Arbeit
ableiten lässt.
5. Interaktionsnetzwerk der Gα-Untereinheit GSA1 in Sordaria
macrospora In der vorliegenden Arbeit konnte für die Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora durch
Einsatz von konstitutiven Formen sowie die Identifikation von interagierenden Proteinen
eine Rolle für GSA1 als zentraler Regulator in der sexuellen und vegetativen Entwicklung
beschrieben werden. Für beide Funktionen ist die Aktivierung von GSA1 durch GTP
notwendig, wodurch GSA1-GTP-interagierende Proteine als mögliche Effektoren eine
wichtige Rolle einnehmen. Darauf bezugnehmend stellt Abbildung 17 ein aktuelles
Arbeitsmodell der über GSA1 vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora dar. Es
basiert auf den in dieser Arbeit identifizierten Effektoren und Regulatoren der aktiven
Gα-Untereinheit GSA1 und beinhaltet bis auf VPS15 und dem Gβγ-Dimer nur Proteine,
die innerhalb dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden. Bei VPS15 wurden
Daten aus dem homologen Modell des endosomalen Signalkomplexes von S. cerevisiae
zur Darstellung herangezogen (Slessareva et al. 2006). Das Arbeitsmodell in Abbildung 17
wurde für eine übersichtlichere Beschreibung in drei Abschnitte untergliedert, die im
Folgenden nacheinander beschrieben werden.
(1) Zu Beginn der Signaltransduktion durchläuft GSA1 den allgemein bekannten
Aktivierungszyklus einer Gα-Untereinheit, der in S. macrospora durch Bindung eines
Pheromonvorläufers (PPG1 bzw. PPG2) an den jeweiligen Pheromonrezeptor (PRE1 bzw.
PRE2) initiiert wird (Mayrhofer et al. 2006; Pöggeler 2000). Durch Bindung des
Pheromons wirkt der Rezeptor als Guanosin-Austauschfaktor (GEF) und ersetzt das an
GSA1 gebundene Nukleotid Guanosindiphosphat (GDP) durch ein Guanosintriphosphat
(GTP). GTP-gebunden dissoziiert GSA1 vom Gβγ-Dimer und aktiviert stromabwärts
liegende Effektoren. Diese Aktivierung von GSA1, die zur GTP-gebundenen GSA1-Form
V Diskussion 82
führt, ist essentiell für die Fruchtkörperentwicklung bei S. macrospora, wie es in der
vorliegenden Arbeit anhand von konstitutiven Varianten gezeigt werden konnte.
(2) Die GTP-gebundene Form von GSA1 wird vermutlich zum Endosom translokalisiert
und aktiviert dort die PI3-Kinase SmVPS34 (VPS34 in Abb. 17). Eine endosomale
Lokalisation der Kinase könnte in diesem Fall wie bei S. cerevisiae über die regulatorische
Untereinheit SmVPS15 (VPS15 in Abb. 17) eingeleitet werden (Slessareva et al. 2006).
Die Endozytose von GSA1 und daher eine endosomale Lokalisation könnte über Ubiquitin
vermittelt werden. Hinweise darauf ergeben sich aus in vivo-Interaktionsstudien, bei denen
Proteine der Ubiquitinierung und Deubiquitinierung als mögliche Interaktionspartner von
GSA1 in dieser Arbeit identifiziert werden und diese spezifische Assoziation in der
Literatur bekräftigt wird (Terrell et al. 1998; Torres et al. 2009). Durch eine GSA1-
vermittelte Aktivierung der PI3-Kinase am Endosom wird der sekundäre Botenstoff, das
Phosphoinositol-3-Phosphat (PtdIns3P), gebildet, über das die intrazelluläre
Signalweiterleitung erfolgt. Darüber hinaus bewirkt PtdIns3P vermutlich die endosomale
Rekrutierung des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1 über dessen
PX-Domäne. In räumlicher Nähe zur Gα-Untereinheit GSA1 wird für ROG1 aufgrund
seiner RGS-Domäne eine Funktion als GAP postuliert, so dass GSA1 inaktiviert und der
Signalweg ausgeschaltet wird. Dementsprechend wird ein endosomal lokalisierter
Signalkomplex aus Gα-Untereinheit und RGS-Protein analog zum ROG1-Homolog
RGS-PX1 in Säugetieren postuliert (von Zastrow und Mostov 2001; Zheng et al. 2001).
Inaktiviert könnte das GDP-gebundene GSA1 entweder an die regulatorische Untereinheit
VPS15 binden, da für das VPS15-Homolog in der Hefe eine Gβ-Untereinheit-ähnliche
Struktur beschrieben wurde, oder mit Gβγ reassoziieren, wodurch der
Gα-Aktivierungszyklus abgeschlossen wäre und ein am GPCR gebundenes, inaktives
heterotrimeres G-Protein vorliegen würde, das durch erneute Ligandenbindung reaktiviert
werden kann und den Signalweg erneut anschaltet.
V Diskussion 83
Abbildung 17: Modell der heterotrimeren G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora mit Fokus auf den zentralen Regulator GSA1. Durch Bindung des Liganden am Pheromonrezeptor wird durch GEF-Aktivität des GPCR das GDP der Gα-Untereinheit durch ein GTP ersetzt und Gα-GTP dissoziiert vom Gβγ-Dimer (1). Die Weiterleitung über Gβγ ist in dieser Arbeit nicht berücksichtigt worden, weshalb dieser Bereich verblasst dargestellt ist. GSA1 ist der zentrale Regulator innerhalb der Signaltransduktion und aktiviert nach Dissoziation von Gβγ die katalytische Untereinheit der Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K) VPS34 am Endosom, wodurch der sekundäre Botenstoff PtdIns3P hergestellt wird, über den das Signal weitergeleitet wird. Durch PtdIns3P wird der negative Regulator ROG1 über die PX-Domäne zum Endosom rekrutiert und inaktiviert GSA1 als GAP (GTPase aktivierendes Protein), wodurch der Signalweg beendet wird und GSA1 entweder an die Plasmamembran zurückkehrt oder eine Bindung mit der regulatorischen Untereinheit der PI3-Kinase VPS15 aufgrund ihrer Gβ-ähnlichen Struktur eingeht. Zur negativen Steuerung des PtdIns3P-Spiegels wird eine Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als GSA1-Effektor aktiviert, wodurch PtdIns3P dephosphoryliert wird und die Signalweiterleitung über PtdIns3P gestoppt wird (2). Zur erneuten Aktivierung des Signalweges muss GSA1 über einen GEF reaktiviert oder durch GTP-GSA1 ersetzt werden. Die Funktion der Bindung von GSA1 und dem Transkriptionsfaktor STE12 wird aufgrund seiner Funktion in S. macrospora als mögliche Verbindung zur Ascosporogenese spekuliert (3).
An dem beschriebenen endosomalen Signalkomplex wird darüber hinaus in dieser Arbeit
die Beteiligung eines zweiten identifizierten GSA1-Effektors, der Phosphoinositol-
Phosphatase (PIPase), beschrieben, die durch Dephosphorylierung von PtdIns3P zu PtdIns,
die entgegengesetzte Funktion von VPS34 durchführt. In diesem Zusammenhang kann
eine GSA1-vermittelte Regulation über die vorherrschende Menge des sekundären
Botenstoffes PtdIns3P durch Bindung des jeweiligen Effektors (PIPase oder VPS34)
V Diskussion 84
vermutet werden, da eine steigende Konzentration von PtdIns3P die Rekrutierung von
ROG1 einleitet und den Signalweg beendet. Durch diese Rekrutierung des negativen
Regulators ROG1 könnte zudem ein möglicher Rückkopplungseffekt über PtdIns3P
bestehen, wodurch sich der Signalweg selbst steuert. Diese Selbstregulation kann aufgrund
einer Beschreibung aus Hefe dem eigenem Überleben dienen, da PtdIns3P in zu hoher
Konzentration toxisch auf den Organismus wirkt (Parrish et al. 2004, 2005).
Bei einer möglichen Funktion des in dieser Arbeit postulierten endosomalen Signalweges
innerhalb der Fruchtkörperentwicklung ist auch die Möglichkeit der Aktivierung eines
MAP-Kinase-Signalweges analog zu Beschreibungen in der Hefe zu bedenken. Dort wird
in der Pheromonantwort parallel zum an der Plasmamembran lokalisierten Gβγ-Signalweg
durch das produzierte PtdIns3P am Endosom ebenfalls die MAP-Kinase FUS3 aktiviert.
Anschließend wird durch Regulation des Zellzyklus über das Protein FAR1 und durch
Steuerung der Transkription über den Transkriptionsfaktor STE12 die Fusion der
Hefezellen eingeleitet (Dohlman und Thorner 2001; Slessareva et al. 2006).
(3) Eine weitere Regulation von GSA1 könnte durch die in dieser Arbeit identifizierte
Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor STE12 möglich sein, da für diesen in
S. macrospora eine Funktion bei der Ascosporogenese beschrieben werden konnte
(Nolting und Pöggeler 2006). Als Hypothese wäre in diesem Zusammenhang eine
zeitversetzte Regulation denkbar, in der GSA1 über den endosomalen Signalweg die
Fruchtkörperbildung einleitet, um nachfolgend für die Ascosporogenese mit STE12 zu
interagieren. Diese Hypothese wird durch den Phänotyp des im Vorfeld dieser Arbeit
generierten Doppelknockoutstammes ∆gsa1/∆ste12 unterstützt, bei der sowohl ein Defekt
in der Ascosporogenese als auch in der Bildung von Fruchtkörpern beobachtet werden
konnte. Entsprechende Einzelmutanten zeigten hingegen nur einen Phänotyp in der
Fruchtkörperentwicklung (∆gsa1) oder in der Ascosporogenese (∆ste12) (Kamerewerd et
al. 2008; Nolting und Pöggeler 2006). Für eine weitere Klärung dieser Interaktion, z.B. in
Bezug auf Ort und Zeit der Wechselwirkung bieten sich Lokalisationsstudien zu
verschiedenen Entwicklungsstadien des Pilzes an.
In der vorliegenden Arbeit wurde bei S. macrospora ein Signalkomplex identifiziert, der
möglicherweise analog zu Beschreibungen in Säugern und der Hefe am Endosom
lokalisiert ist. Durch weiterführende Analysen und die Lokalisation der einzelnen
Komponenten sowie die Untersuchung der möglichen negativen Regulation über das
identifizierte RGS-Protein ROG1, könnte diese Hypothese in folgenden Studien näher
untersucht werden. Für eine Bestätigung der Assoziation mit dem Endosom würden sich in
V Diskussion 85
diesem Zusammenhang Ko-Lokalisationsstudien durch Fluoreszenzmarkierung der
einzelnen involvierten Faktoren anbieten, die in Kombination mit einem für Endosomen
spezifischen Fluoreszenzprotein durchgeführt werden könnten. Zur Beschreibung
möglicher Querverbindungen und um mögliche Gerüstproteine innerhalb des
Signalkomplexes identifizieren zu können, bieten sich weiterführende Interaktionsstudien
der einzelnen Faktoren an. Zur zusätzlichen Aufklärung der Funktion der einzelnen
Komponenten und des gesamten Signalkomplexes könnten funktionelle Analysen mit
Deletionsmutanten durchgeführt werden, um die grundlegende Funktion des endosomalen
Signalkomplexes an der Fruchtkörperentwicklung zu bestätigen. Des Weiteren kann die
putative GAP-Aktivität des RGS-Proteins ROG1 in nachfolgenden Studien in
Kombination mit der in dieser Arbeit aufgereinigten aktiven Gα-Untereinheit GSA1
anhand von GTPase-Messungen ermittelt werden.
Es ist davon auszugehen, dass weiterführende Studien der in dieser Arbeit identifizierten
Interaktionspartner der Gα-Untereinheit GSA1 sowie des beschriebenen Signalkomplexes
zur weiteren Aufklärung von Entwicklungsprozessen in S. macrospora führen werden.
VI Zusammenfassung 86
VI Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der durch heterotrimere
G-Proteine vermittelten Signaltransduktion im Modellorganismus Sordaria macrospora
anhand einer Charakterisierung der Gα-Untereinheit GSA1 und deren Einfluss auf die
Fruchtkörperentwicklung. Durch direkte Mutagenese von gsa1 konnte eine konstitutiv
aktive und einer dominant negative Variante der Gα-Untereinheit GSA1 hergestellt
werden. Komplementationsstudien ergaben eine essentielle Rolle der aktivierten
GSA1-Form als positiven Regulator während der Fruchtkörperentwicklung des
Hyphenpilzes.
Die Verwendung der konstitutiven GSA1-Formen bei in vivo-Interaktionsstudien
ermöglichte darüber hinaus die Identifikation von Aktivitätsstatus-abhängigen
Interaktionspartnern der Gα-Untereinheit. Als möglicher negativer Regulator wurde mit
ROG1 in der vorliegenden Arbeit das erste Protein in S. macrospora identifiziert, das in
die Familie der Regulatoren des G-Protein-Signalweges (RGS-Proteine) eingeteilt werden
kann. Aufgrund homologer Proteine kann eine Funktion als GTPase aktivierendes Protein
(GAP) auf die Gα-Untereinheit GSA1 angenommen werden. Für nachfolgende Studien
dieser GAP-Aktivität bei ROG1 wurde durch Ko-Immunopräzipitationsanalysen die
Bindung an die aktive GSA1-Form bestätigt und bereits die intrinsische GTPase-Aktivität
der Gα-Untereinheit GSA1 ermittelt.
Als GSA1-Interaktionspartner wurde darüber hinaus die als Gα-Effektor aus der Hefe
bekannte endosomal lokalisierte Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 durch Hefe-2-Hybrid-
und Ko-Immunopräzipitationsanalysen bei S. macrospora charakterisiert. Mit der
Phosphoinositol-Phosphatase als GSA1-Effektor, interagiert GSA1 in diesem Kontext
ebenfalls mit dem direkten Gegenspieler von VPS34 bei der Synthese des sekundären
Botenstoffes Phosphoinositoltriphosphat, wodurch eine Phosphoinositol-vermittelte
Regulation bestimmter Prozesse der Fruchtkörperentwicklung über GSA1 denkbar ist.
Zusammenfassend kann in S. macrospora anhand des identifizierten Interaktionsnetzwerks
der Gα-Untereinheit GSA1 von einem möglichen endosomaler Signalkomplex
ausgegangen werden, dessen Existenz aufgrund von Literaturdaten über die
Pheromonantwort in der Hefe bekräftigt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das
Wissen über den Einfluss G-Protein-vermittelter Signalwege auf eukaryotische
Zelldifferenzierungsprozesse und können zum weiteren Verständnis komplexer
Regulationen auf andere Organismen übertragen werden.
VII Summary 87
VII Summary
The aim of this study was to analyse signal transduction mediated by heterotrimeric
G proteins in the model organism Sordaria macrospora by means of characterizing the Gα
subunit GSA1 and its influence on fruiting body morphogenesis. Direct mutagenesis of
gsa1 led to the successful construction of a constitutively active as well as a dominant
negative variant of the Gα subunit GSA1. Complementation studies show that the activated
GSA1 variant is a positive regulator of GSA1 and essential for fruiting body development
in S. macrospora. Constitutive GSA1 derivates were further used in in vivo interaction
studies. Hereby, interaction partners of the Gα subunit were identified that bind
specifically to the active or the negative form of GSA1. One of these, ROG1, is the first
characterised RGS-protein in S. macrospora, ROG1 and could serve as a negative
regulator. Orthologues of ROG1 have been described to function as GTPase activating
proteins (GAPs) and thus, this could be presumed for ROG1 also. To further characterise a
putative GAP-activity of ROG1 for GSA1, exclusive binding of ROG1 to the
constitutively active GSA1 form was confirmed by co-immunoprecipitation and the
intrinsic GTPase activity of GSA1 was measured.
In further analysis, the endosomal localised phosphoinositol-3-kinase VPS34, known as a
Gα effector from yeast, could be confirmed as a GSA1 interaction partner as well by
in vivo as in vitro interaction studies in S. macrospora. Interestingly, GSA1 further binds to
the phosphoinositide phosphatase, the direct antagonist of VPS34 during the synthesis of
the second messenger Phosphoinositol triphosphate, which indicates a phosphoinositide-
mediated regulation by GSA1.
In summary the identified interaction network of the Gα subunit GSA1hints to a putative
endosomal signaling complex in S. macrospora involved in signal transduction mediated
by G proteins during fruiting body development of filamentous fungi. Since fruiting body
morphogenesis is used as a model for eukaryotic cell differentiation in general, aspects of
this study can be applied to a further understanding of complex regulations of G protein
mediated signal transduction.
VIII Literatur 88
VIII Literatur
Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJ, Zuker CS (2000) A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100:693-702
Afshar K, Willard FS, Colombo K, Johnston CA, McCudden CR, Siderovski DP, Gonczy P
(2004) RIC-8 is required for GPR-1/2-dependent Galpha function during asymmetric division of C. elegans embryos. Cell 119:219-230
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment search
tool. J Mol Biol 215:403-410 Apanovitch DM, Iiri T, Karasawa T, Bourne HR, Dohlman HG (1998) Second site suppressor
mutations of a GTPase-deficient G-protein alpha-subunit. Selective inhibition of Gbeta gamma-mediated signaling. J Biol Chem 273:28597-28602
Arshavsky VY, Pugh EN, Jr. (1998) Lifetime regulation of G protein-effector complex: emerging
importance of RGS proteins. Neuron 20:11-14 Ausubel FM, Breut R, Koíngston RE, Moore DD, Seidmann JG, Smith JA, K S (1995) Current
protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, New York Ballesteros JA, Jensen AD, Liapakis G, Rasmussen SG, Shi L, Gether U, Javitch JA (2001)
Activation of the beta 2-adrenergic receptor involves disruption of an ionic lock between the cytoplasmic ends of transmembrane segments 3 and 6. J Biol Chem 276:29171-29177
Ballon DR, Flanary PL, Gladue DP, Konopka JB, Dohlman HG, Thorner J (2006) DEP-
domain-mediated regulation of GPCR signaling responses. Cell 126:1079-1093 Becker DM, Lundblad V (2001) Introduction of DNA into yeast cells. Curr Protoc Mol Biol
Chapter 13:Unit13 17 Berman DM, Wilkie TM, Gilman AG (1996) GAIP and RGS4 are GTPase-activating proteins
for the Gi subfamily of G protein alpha subunits. Cell 86:445-452 Berson EL, Rosner B, Weigel-DiFranco C, Dryja TP, Sandberg MA (2002) Disease
progression in patients with dominant retinitis pigmentosa and rhodopsin mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci 43:3027-3036
Birnbaumer L (1992) Receptor-to-effector signaling through G proteins: roles for beta gamma
dimers as well as alpha subunits. Cell 71:1069-1072 Bloemendal S, Lord KM, Rech C, Hoff B, Engh I, Read ND, Kück U (2010) A mutant
defective in sexual development produces aseptate ascogonia. Eukaryot Cell 9:1856-1866 Blumer KJ, Thorner J (1991) Receptor-G protein signaling in yeast. Annu Rev Physiol 53:37-57 Bölker M (1998) Sex and crime: heterotrimeric G proteins in fungal mating and pathogenesis.
Fungal Genet Biol 25:143-156 Bourne HR (1997) How receptors talk to trimeric G proteins. Curr Opin Cell Biol 9:134-142
VIII Literatur 89
Brandt DR, Ross EM (1985) GTPase activity of the stimulatory GTP-binding regulatory protein of adenylate cyclase, Gs. Accumulation and turnover of enzyme-nucleotide intermediates. J Biol Chem 260:266-272
Buck L, Axel R (1991) A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis
for odor recognition. Cell 65:175-187 Bullock WO, Fernandez M, Short JM (1987) XL-1 Blue: a high efficiency plasmid transforming
recA Escherichia coli strain with β-galactosidase selection. BioTechniques 5:376-379 Burack WR, Shaw AS (2000) Signal transduction: hanging on a scaffold. Curr Opin Cell Biol
12:211-216 Burda P, Padilla SM, Sarkar S, Emr SD (2002) Retromer function in endosome-to-Golgi
retrograde transport is regulated by the yeast Vps34 PtdIns 3-kinase. J Cell Sci 115:3889-3900
Carman CV, Parent JL, Day PW, Pronin AN, Sternweis PM, Wedegaertner PB, Gilman AG,
Benovic JL, Kozasa T (1999) Selective regulation of Galpha(q/11) by an RGS domain in the G protein-coupled receptor kinase, GRK2. J Biol Chem 274:34483-34492
Chan RK, Otte CA (1982a) Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants
supersensitive to G1 arrest by a factor and alpha factor pheromones. Mol Cell Biol 2:11-20 Chan RK, Otte CA (1982b) Physiological characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants
supersensitive to G1 arrest by a factor and alpha factor pheromones. Mol Cell Biol 2:21-29 Chasse SA, Flanary P, Parnell SC, Hao N, Cha JY, Siderovski DP, Dohlman HG (2006)
Genome-scale analysis reveals Sst2 as the principal regulator of mating pheromone signaling in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell 5:330-346
Chen CK, Burns ME, He W, Wensel TG, Baylor DA, Simon MI (2000) Slowed recovery of rod
photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1. Nature 403:557-560
Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD (2003)
Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res 31:3497-3500
Choi KY, Satterberg B, Lyons DM, Elion EA (1994) Ste5 tethers multiple protein kinases in the
MAP kinase cascade required for mating in S. cerevisiae. Cell 78:499-512 Cismowski MJ, Takesono A, Ma C, Lizano JS, Xie X, Fuernkranz H, Lanier SM, Duzic E
(1999) Genetic screens in yeast to identify mammalian nonreceptor modulators of G-protein signaling. Nat Biotechnol 17:878-883
Claing A, Chen W, Miller WE, Vitale N, Moss J, Premont RT, Lefkowitz RJ (2001) beta-
Arrestin-mediated ADP-ribosylation factor 6 activation and beta 2-adrenergic receptor endocytosis. J Biol Chem 276:42509-42513
Coca MA, Damsz B, Yun DJ, Hasegawa PM, Bressan RA, Narasimhan ML (2000)
Heterotrimeric G-proteins of a filamentous fungus regulate cell wall composition and susceptibility to a plant PR-5 protein. Plant J 22:61-69
VIII Literatur 90
Coleman DE, Berghuis AM, Lee E, Linder ME, Gilman AG, Sprang SR (1994) Structures of active conformations of Gi alpha 1 and the mechanism of GTP hydrolysis. Science 265:1405-1412
Colombo S, Ma P, Cauwenberg L, Winderickx J, Crauwels M, Teunissen A, Nauwelaers D,
de Winde JH, Gorwa MF, Colavizza D, Thevelein JM (1998) Involvement of distinct G-proteins, Gpa2 and Ras, in glucose- and intracellular acidification-induced cAMP signalling in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Embo J 17:3326-3341
Cook JG, Bardwell L, Kron SJ, Thorner J (1996) Two novel targets of the MAP kinase Kss1 are
negative regulators of invasive growth in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 10:2831-2848
Corvilain B, Van Sande J, Dumont JE, Vassart G (2001) Somatic and germline mutations of the
TSH receptor and thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf) 55:143-158 Cowan CW, Fariss RN, Sokal I, Palczewski K, Wensel TG (1998) High expression levels in
cones of RGS9, the predominant GTPase accelerating protein of rods. Proc Natl Acad Sci USA 95:5351-5356
Cullen PJ (2008) Endosomal sorting and signalling: an emerging role for sorting nexins. Nat Rev
Mol Cell Biol 9:574-582 Damilano F, Perino A, Hirsch E (2010) PI3K kinase and scaffold functions in heart. Ann N Y
Acad Sci 1188:39-45 Davis BJ (1964) Disc Electrophoresis. I. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann
N Y Acad Sci 121:404-427 de Alba E, De Vries L, Farquhar MG, Tjandra N (1999) Solution structure of human GAIP
(Galpha interacting protein): a regulator of G protein signaling. J Mol Biol 291:927-939 De Vries L, Elenko E, Hubler L, Jones TL, Farquhar MG (1996) GAIP is membrane-anchored
by palmitoylation and interacts with the activated (GTP-bound) form of G alpha i subunits. Proc Natl Acad Sci USA 93:15203-15208
De Vries L, Fischer T, Tronchere H, Brothers GM, Strockbine B, Siderovski DP, Farquhar
MG (2000) Activator of G protein signaling 3 is a guanine dissociation inhibitor for Galpha i subunits. Proc Natl Acad Sci USA 97:14364-14369
De Vries L, Mousli M, Wurmser A, Farquhar MG (1995) GAIP, a protein that specifically
interacts with the trimeric G protein G alpha i3, is a member of a protein family with a highly conserved core domain. Proc Natl Acad Sci USA 92:11916-11920
Dohlman HG (2002) G proteins and pheromone signaling. Annu Rev Physiol 64:129-152 Dohlman HG, Slessareva JE (2006) Pheromone signaling pathways in yeast. Sci STKE 2006:cm6 Dohlman HG, Song J, Ma D, Courchesne WE, Thorner J (1996) Sst2, a negative regulator of
pheromone signaling in the yeast Saccharomyces cerevisiae: expression, localization, and genetic interaction and physical association with Gpa1 (the G-protein alpha subunit). Mol Cell Biol 16:5194-5209
Dohlman HG, Thorner JW (2001) Regulation of G protein-initiated signal transduction in yeast:
paradigms and principles. Annu Rev Biochem 70:703-754
VIII Literatur 91
Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16:6127-6145
Downes GB, Gautam N (1999) The G protein subunit gene families. Genomics 62:544-552 Dreyer J, Eichhorn H, Friedlin E, Kürnsteiner H, Kück U (2007) A homologue of the
Aspergillus velvet gene regulates both cephalosporin C biosynthesis and hyphal fragmentation in Acremonium chrysogenum. Appl Environ Microbiol 73:3412-3422
Drucker DJ (2003) Glucagon-like peptides: regulators of cell proliferation, differentiation, and
apoptosis. Mol Endocrinol 17:161-171 Druey KM, Ugur O, Caron JM, Chen CK, Backlund PS, Jones TL (1999) Amino-terminal
cysteine residues of RGS16 are required for palmitoylation and modulation of Gi- and Gq-mediated signaling. J Biol Chem 274:18836-18842
Elion EA (1998) Routing MAP kinase cascades. Science 281:1625-1626 Ellis RW, Defeo D, Shih TY, Gonda MA, Young HA, Tsuchida N, Lowy DR, Scolnick EM
(1981) The p21 src genes of Harvey and Kirsten sarcoma viruses originate from divergent members of a family of normal vertebrate genes. Nature 292:506-511
Engelman JA, Luo J, Cantley LC (2006) The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as
regulators of growth and metabolism. Nat Rev Genet 7:606-619 Engh I, Nowrousian M, Kück U (2010) Sordaria macrospora, a model organism to study fungal
cellular development. Eur J Cell Biol 89:864-872 Engh I, Würtz C, Witzel-Schlomp K, Zhang HY, Hoff B, Nowrousian M, Rottensteiner H,
Kück U (2007) The WW domain protein PRO40 is required for fungal fertility and associates with Woronin bodies. Eukaryot Cell 6:831-843
Esser K, Straub J (1958) Genetische Untersuchungen an Sordaria macrospora Auersw.,
Kompensation und Induktion bei genbedingten Entwicklungsdefekten. Z Vererbungsl 89:729-746
Fabrizio P, Pozza F, Pletcher SD, Gendron CM, Longo VD (2001) Regulation of longevity and
stress resistance by Sch9 in yeast. Science 292:288-290 Fang EG, Dean RA (2000) Site-directed mutagenesis of the magB gene affects growth and
development in Magnaporthe grisea. Mol Plant Microbe Interact 13:1214-1227 Farahbakhsh ZT, Ridge KD, Khorana HG, Hubbell WL (1995) Mapping light-dependent
structural changes in the cytoplasmic loop connecting helices C and D in rhodopsin: a site-directed spin labeling study. Biochemistry 34:8812-8819
Farrens DL, Altenbach C, Yang K, Hubbell WL, Khorana HG (1996) Requirement of rigid-
body motion of transmembrane helices for light activation of rhodopsin. Science 274:768-770
Feng Y, Davis NG (2000a) Akr1p and the type I casein kinases act prior to the ubiquitination step
of yeast endocytosis: Akr1p is required for kinase localization to the plasma membrane. Mol Cell Biol 20:5350-5359
VIII Literatur 92
Feng Y, Davis NG (2000b) Feedback phosphorylation of the yeast a-factor receptor requires activation of the downstream signaling pathway from G protein through mitogen-activated protein kinase. Mol Cell Biol 20:563-574
Feng Y, Song LY, Kincaid E, Mahanty SK, Elion EA (1998) Functional binding between Gbeta
and the LIM domain of Ste5 is required to activate the MEKK Ste11. Curr Biol 8:267-278 Figueroa M, Hinrichs MV, Bunster M, Babbitt P, Martinez-Oyanedel J, Olate J (2009)
Biophysical studies support a predicted superhelical structure with armadillo repeats for Ric-8. Protein Sci 18:1139-1145
Fisk HA, Yaffe MP (1997) Mutational analysis of Mdm1p function in nuclear and mitochondrial
inheritance. J Cell Biol 138:485-494 Fredriksson R, Lagerstrom MC, Lundin LG, Schioth HB (2003) The G-protein-coupled
receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol 63:1256-1272
Freissmuth M, Gilman AG (1989) Mutations of GS alpha designed to alter the reactivity of the
protein with bacterial toxins. Substitutions at ARG187 result in loss of GTPase activity. J Biol Chem 264:21907-21914
Funderburk SF, Wang QJ, Yue Z (2010) The Beclin 1-VPS34 complex--at the crossroads of
autophagy and beyond. Trends Cell Biol 20:355-362 Gales C, Van Durm JJ, Schaak S, Pontier S, Percherancier Y, Audet M, Paris H, Bouvier M
(2006) Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol 13:778-786
Garcia-Regalado A, Guzman-Hernandez ML, Ramirez-Rangel I, Robles-Molina E, Balla T,
Vazquez-Prado J, Reyes-Cruz G (2008) G Protein-coupled Receptor-promoted Trafficking of G beta(1)gamma(2) Leads to AKT Activation at Endosomes via a Mechanism Mediated by G beta(1)gamma(2)-Rab11a Interaction. Molecular Biology of the Cell 19:4188-4200
Garcia-Rico RO, Fierro F, Mauriz E, Gomez A, Fernandez-Bodega MA, Martin JF (2008)
The heterotrimeric Galpha protein pga1 regulates biosynthesis of penicillin, chrysogenin and roquefortine in Penicillium chrysogenum. Microbiology 154:3567-3578
Garrenton LS, Stefan CJ, McMurray MA, Emr SD, Thorner J (2010) Pheromone-induced
anisotropy in yeast plasma membrane phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate distribution is required for MAPK signaling. Proc Natl Acad Sci USA 107:11805-11810
Garrison TR, Zhang Y, Pausch M, Apanovitch D, Aebersold R, Dohlman HG (1999)
Feedback phosphorylation of an RGS protein by MAP kinase in yeast. J Biol Chem 274:36387-36391
Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A (2003) ExPASy: The
proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788
Gilman AG (1984) G proteins and dual control of adenylate cyclase. Cell 36:577-579 Gilman AG (1987) G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu Rev Biochem
56:615-649
VIII Literatur 93
Gonczy P, Echeverri C, Oegema K, Coulson A, Jones SJ, Copley RR, Duperon J, Oegema J, Brehm M, Cassin E, Hannak E, Kirkham M, Pichler S, Flohrs K, Goessen A, Leidel S, Alleaume AM, Martin C, Ozlu N, Bork P, Hyman AA (2000) Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature 408:331-336
Graziano MP, Freissmuth M, Gilman AG (1989) Expression of Gs alpha in Escherichia coli.
Purification and properties of two forms of the protein. J Biol Chem 264:409-418 Guo M, Aston C, Burchett SA, Dyke C, Fields S, Rajarao SJR, Uetz P, Wang Y, Young K,
Dohlman HG (2003) The Yeast G Protein [alpha] Subunit Gpa1 Transmits a Signal through an RNA Binding Effector Protein Scp160. Molecular Cell 12:517-524
Hall A (1990) The cellular functions of small GTP-binding proteins. Science 249:635-640 Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol
166:557-580 Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ (1993) The p21 Cdk-interacting
protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816 Hart MJ, Jiang X, Kozasa T, Roscoe W, Singer WD, Gilman AG, Sternweis PC, Bollag G
(1998) Direct stimulation of the guanine nucleotide exchange activity of p115 RhoGEF by Galpha13. Science 280:2112-2114
He C, Klionsky DJ (2009) Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu
Rev Genet 43:67-93 Heenan EJ, Vanhooke JL, Temple BR, Betts L, Sondek JE, Dohlman HG (2009) Structure and
function of Vps15 in the endosomal G protein signaling pathway. Biochemistry 48:6390-6401
Hepler JR (1999) Emerging roles for RGS proteins in cell signalling. Trends Pharmacol Sci
20:376-382 Herman PK, Stack JH, DeModena JA, Emr SD (1991) A novel protein kinase homolog
essential for protein sorting to the yeast lysosome-like vacuole. Cell 64:425-437 Hicke L, Zanolari B, Riezman H (1998) Cytoplasmic tail phosphorylation of the alpha-factor
receptor is required for its ubiquitination and internalization. J Cell Biol 141:349-358 Hicks JK, Yu JH, Keller NP, Adams TH (1997) Aspergillus sporulation and mycotoxin
production both require inactivation of the FadA G alpha protein-dependent signaling pathway. Embo J 16:4916-4923
Higashijima T, Ferguson KM, Sternweis PC, Smigel MD, Gilman AG (1987) Effects of Mg2+
and the beta gamma-subunit complex on the interactions of guanine nucleotides with G proteins. J Biol Chem 262:762-766
Hildebrandt JD, Sekura RD, Codina J, Iyengar R, Manclark CR, Birnbaumer L (1983)
Stimulation and inhibition of adenylyl cyclases mediated by distinct regulatory proteins. Nature 302:706-709
Holmes DS, Quigley M (1981) A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids.
Anal Biochem 114:193-197
VIII Literatur 94
Hopkins AL, Groom CR (2002) The druggable genome. Nat Rev Drug Discov 1:727-730 Hsueh YP, Xue C, Heitman J (2007) G protein signaling governing cell fate decisions involves
opposing Galpha subunits in Cryptococcus neoformans. Mol Biol Cell 18:3237-3249 Hu G, Hacham M, Waterman SR, Panepinto J, Shin S, Liu X, Gibbons J, Valyi-Nagy T,
Obara K, Jaffe HA, Ohsumi Y, Williamson PR (2008a) PI3K signaling of autophagy is required for starvation tolerance and virulenceof Cryptococcus neoformans. J Clin Invest 118:1186-1197
Hu G, Wensel TG (2002) R9AP, a membrane anchor for the photoreceptor GTPase accelerating
protein, RGS9-1. Proc Natl Acad Sci USA 99:9755-9760 Hu Y, Xing J, Chen L, Guo X, Du Y, Zhao C, Zhu Y, Lin M, Zhou Z, Sha J (2008b) RGS22, a
novel testis-specific regulator of G-protein signaling involved in human and mouse spermiogenesis along with GNA12/13 subunits. Biol Reprod 79:1021-1029
Huang X, Miller W (1991) A time-efficient, linear-space local similarity algorithm. Adv. Appl.
Math 12:337-357 Huh WK, Falvo JV, Gerke LC, Carroll AS, Howson RW, Weissman JS, O'Shea EK (2003)
Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature 425:686-691 Hunter S, Apweiler R, Attwood TK, Bairoch A, Bateman A, Binns D, Bork P, Das U,
Daugherty L, Duquenne L, Finn RD, Gough J, Haft D, Hulo N, Kahn D, Kelly E, Laugraud A, Letunic I, Lonsdale D, Lopez R, Madera M, Maslen J, McAnulla C, McDowall J, Mistry J, Mitchell A, Mulder N, Natale D, Orengo C, Quinn AF, Selengut JD, Sigrist CJ, Thimma M, Thomas PD, Valentin F, Wilson D, Wu CH, Yeats C (2009) InterPro: the integrative protein signature database. Nucleic Acids Res 37:D211-215
Ivey FD, Taglia FX, Yang F, Lander MM, Kelly DA, Hoffman CS (2010) Activated alleles of
the Schizosaccharomyces pombe gpa2+ Galpha gene identify residues involved in GDP-GTP exchange. Eukaryot Cell 9:626-633
Jacoby E, Bouhelal R, Gerspacher M, Seuwen K (2006) The 7 TM G-protein-coupled receptor
target family. ChemMedChem 1:761-782 James P, Halladay J, Craig EA (1996) Genomic libraries and a host strain designed for highly
efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics 144:1425-1436 Jenness DD, Spatrick P (1986) Down regulation of the alpha-factor pheromone receptor in S.
cerevisiae. Cell 46:345-353 Jennings MD, Pavitt GD (2010) eIF5 has GDI activity necessary for translational control by eIF2
phosphorylation. Nature 465:378-381 Johnston CA, Willard MD, Kimple AJ, Siderovski DP, Willard FS (2008) A sweet cycle for
Arabidopsis G-proteins: Recent discoveries and controversies in plant G-protein signal transduction. Plant Signal Behav 3:1067-1076
Jones MB, Siderovski DP, Hooks SB (2004) The G betagamma dimer as a novel source of
selectivity in G-protein signaling: GGL-ing at convention. Mol Interv 4:200-214
VIII Literatur 95
Juhasz G, Hill JH, Yan Y, Sass M, Baehrecke EH, Backer JM, Neufeld TP (2008) The class III PI(3)K Vps34 promotes autophagy and endocytosis but not TOR signaling in Drosophila. J Cell Biol 181:655-666
Kamerewerd J, Jansson M, Nowrousian M, Pöggeler S, Kück U (2008) Three alpha-subunits of
heterotrimeric G proteins and an adenylyl cyclase have distinct roles in fruiting body development in the homothallic fungus Sordaria macrospora. Genetics 180:191-206
Kenakin T (2003) Ligand-selective receptor conformations revisited: the promise and the problem.
Trends Pharmacol Sci 24:346-354 Khwaja A, Rodriguez-Viciana P, Wennstrom S, Warne PH, Downward J (1997) Matrix
adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway. Embo J 16:2783-2793
Kihara A, Noda T, Ishihara N, Ohsumi Y (2001) Two Distinct Vps34 Phosphatidylinositol 3-
Kinase Complexes Function in Autophagy and Carboxypeptidase Y Sorting in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 152:519-530
Kimple RJ, De Vries L, Tronchere H, Behe CI, Morris RA, Gist Farquhar M, Siderovski DP
(2001) RGS12 and RGS14 GoLoco motifs are G alpha(i) interaction sites with guanine nucleotide dissociation inhibitor Activity. J Biol Chem 276:29275-29281
Kimple RJ, Kimple ME, Betts L, Sondek J, Siderovski DP (2002) Structural determinants for
GoLoco-induced inhibition of nucleotide release by Galpha subunits. Nature 416:878-881 Koelle MR, Horvitz HR (1996) EGL-10 regulates G protein signaling in the C. elegans nervous
system and shares a conserved domain with many mammalian proteins. Cell 84:115-125 Kolakowski LF, Jr. (1994) GCRDb: a G-protein-coupled receptor database. Receptors Channels
2:1-7 Kozasa T, Jiang X, Hart MJ, Sternweis PM, Singer WD, Gilman AG, Bollag G, Sternweis PC
(1998) p115 RhoGEF, a GTPase activating protein for Galpha12 and Galpha13. Science 280:2109-2111
Kraakman L, Lemaire K, Ma P, Teunissen AW, Donaton MC, Van Dijck P, Winderickx J, de
Winde JH, Thevelein JM (1999) A Saccharomyces cerevisiae G-protein coupled receptor, Gpr1, is specifically required for glucose activation of the cAMP pathway during the transition to growth on glucose. Mol Microbiol 32:1002-1012
Kristiansen K (2004) Molecular mechanisms of ligand binding, signaling, and regulation within
the superfamily of G-protein-coupled receptors: molecular modeling and mutagenesis approaches to receptor structure and function. Pharmacol Ther 103:21-80
Krystofova S, Borkovich KA (2005) The heterotrimeric G-protein subunits GNG-1 and GNB-1
form a Gbetagamma dimer required for normal female fertility, asexual development, and galpha protein levels in Neurospora crassa. Eukaryot Cell 4:365-378
Kubler E, Mosch HU, Rupp S, Lisanti MP (1997) Gpa2p, a G-protein alpha-subunit, regulates
growth and pseudohyphal development in Saccharomyces cerevisiae via a cAMP-dependent mechanism. J Biol Chem 272:20321-20323
Kück U (2005) Praktikum der Molekulargenetik. Springer Verlag, Berlin
VIII Literatur 96
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685
Lecellier G, Silar P (1994) Rapid methods for nucleic acids extraction from Petri dish-grown
mycelia. Curr Genet 25:122-123 Lee MJ, Dohlman HG (2008) Coactivation of G protein signaling by cell-surface receptors and an
intracellular exchange factor. Curr Biol 18:211-215 Leevers SJ, Weinkove D, MacDougall LK, Hafen E, Waterfield MD (1996) The Drosophila
phosphoinositide 3-kinase Dp110 promotes cell growth. Embo J 15:6584-6594 Lefkowitz RJ (1998) G protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-
arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem 273:18677-18680 Leopoldt D, Hanck T, Exner T, Maier U, Wetzker R, Nurnberg B (1998) Gbetagamma
stimulates phosphoinositide 3-kinase-gamma by direct interaction with two domains of the catalytic p110 subunit. J Biol Chem 273:7024-7029
Li D, Bobrowicz P, Wilkinson HH, Ebbole DJ (2005) A mitogen-activated protein kinase
pathway essential for mating and contributing to vegetative growth in Neurospora crassa. Genetics 170:1091-1104
Li L, Wright SJ, Krystofova S, Park G, Borkovich KA (2007) Heterotrimeric G protein
signaling in filamentous fungi. Annu Rev Microbiol 61:423-452 Liang C, Feng P, Ku B, Dotan I, Canaani D, Oh BH, Jung JU (2006) Autophagic and tumour
suppressor activity of a novel Beclin1-binding protein UVRAG. Nat Cell Biol 8:688-699 Macara IG, Lounsbury KM, Richards SA, McKiernan C, Bar-Sagi D (1996) The Ras
superfamily of GTPases. FASEB J 10:625-630 Marcus S, Polverino A, Barr M, Wigler M (1994) Complexes between STE5 and components of
the pheromone-responsive mitogen-activated protein kinase module. Proc Natl Acad Sci USA 91:7762-7766
Masloff S, Pöggeler S, Kück U (1999) The pro1(+) gene from Sordaria macrospora encodes a C6
zinc finger transcription factor required for fruiting body development. Genetics 152:191-199
Mayrhofer S, Pöggeler S (2005) Functional characterization of an alpha-factor-like Sordaria
macrospora peptide pheromone and analysis of its interaction with its cognate receptor in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell 4:661-672
Mayrhofer S, Weber JM, Pöggeler S (2006) Pheromones and pheromone receptors are required
for proper sexual development in the homothallic ascomycete Sordaria macrospora. Genetics 172:1521-1533
McConnell SJ, Yaffe MP (1993) Intermediate filament formation by a yeast protein essential for
organelle inheritance. Science 260:687-689 Miller KG, Alfonso A, Nguyen M, Crowell JA, Johnson CD, Rand JB (1996) A genetic
selection for Caenorhabditis elegans synaptic transmission mutants. Proc Natl Acad Sci USA 93:12593-12598
VIII Literatur 97
Milligan G, Kostenis E (2006) Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol 147 Suppl 1:S46-55
Moore CA, Milano SK, Benovic JL (2007) Regulation of receptor trafficking by GRKs and
arrestins. Annu Rev Physiol 69:451-482 Nakafuku M, Itoh H, Nakamura S, Kaziro Y (1987) Occurrence in Saccharomyces cerevisiae of
a gene homologous to the cDNA coding for the alpha subunit of mammalian G proteins. Proc Natl Acad Sci USA 84:2140-2144
Nakafuku M, Obara T, Kaibuchi K, Miyajima I, Miyajima A, Itoh H, Nakamura S, Arai K,
Matsumoto K, Kaziro Y (1988) Isolation of a second yeast Saccharomyces cerevisiae gene (GPA2) coding for guanine nucleotide-binding regulatory protein: studies on its structure and possible functions. Proc Natl Acad Sci USA 85:1374-1378
Nakayama N, Miyajima A, Arai K (1985) Nucleotide sequences of STE2 and STE3, cell type-
specific sterile genes from Saccharomyces cerevisiae. Embo J 4:2643-2648 Neubig RR, Siderovski DP (2002) Regulators of G-protein signalling as new central nervous
system drug targets. Nat Rev Drug Discov 1:187-197 Nicholas KB, Nicholas HBJ, Deerfield DWI (1997) GeneDoc: Analysis and Visualization of
Genetic Variation. EMBNEW.NEWS 4:14 Nobukuni T, Joaquin M, Roccio M, Dann SG, Kim SY, Gulati P, Byfield MP, Backer JM,
Natt F, Bos JL, Zwartkruis FJ, Thomas G (2005) Amino acids mediate mTOR/raptor signaling through activation of class 3 phosphatidylinositol 3OH-kinase. Proc Natl Acad Sci USA 102:14238-14243
Nolting N, Bernhards Y, Pöggeler S (2009) SmATG7 is required for viability in the homothallic
ascomycete Sordaria macrospora. Fungal Genet Biol 46:531-542 Nolting N, Pöggeler S (2006) A STE12 homologue of the homothallic ascomycete Sordaria
macrospora interacts with the MADS box protein MCM1 and is required for ascosporogenesis. Mol Microbiol 62:853-868
Nowrousian M, Cebula P (2005) The gene for a lectin-like protein is transcriptionally activated
during sexual development, but is not essential for fruiting body formation in the filamentous fungus Sordaria macrospora. BMC Microbiol 5:64
Nowrousian M, Frank S, Koers S, Strauch P, Weitner T, Ringelberg C, Dunlap JC, Loros JJ,
Kück U (2007) The novel ER membrane protein PRO41 is essential for sexual development in the filamentous fungus Sordaria macrospora. Mol Microbiol 64:923-937
Nowrousian M, Masloff S, Pöggeler S, Kück U (1999) Cell differentiation during sexual
development of the fungus Sordaria macrospora requires ATP citrate lyase activity. Mol Cell Biol 19:450-460
Nowrousian M, Stajich JE, Chu M, Engh I, Espagne E, Halliday K, Kamerewerd J,
Kempken F, Knab B, Kuo HC, Osiewacz HD, Pöggeler S, Read ND, Seiler S, Smith KM, Zickler D, Kück U, Freitag M (2010) De novo assembly of a 40 Mb eukaryotic genome from short sequence reads: Sordaria macrospora, a model organism for fungal morphogenesis. PLoS Genet 6:e1000891
Oka Y, Saraiva LR, Kwan YY, Korsching SI (2009) The fifth class of Galpha proteins. Proc
Natl Acad Sci USA 106:1484-1489
VIII Literatur 98
Oldham WM, Hamm HE (2006) Structural basis of function in heterotrimeric G proteins. Q Rev
Biophys 39:117-166 Oldham WM, Hamm HE (2008) Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled
receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 9:60-71 Ornstein L (1964) Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci 121:321-
349 Palczewski K (2006) G protein-coupled receptor rhodopsin. Annu Rev Biochem 75:743-767 Palczewski K, Benovic JL (1991) G-protein-coupled receptor kinases. Trends Biochem Sci
16:387-391 Panek HR, Stepp JD, Engle HM, Marks KM, Tan PK, Lemmon SK, Robinson LC (1997)
Suppressors of YCK-encoded yeast casein kinase 1 deficiency define the four subunits of a novel clathrin AP-like complex. Embo J 16:4194-4204
Parrish WR, Stefan CJ, Emr SD (2004) Essential role for the myotubularin-related phosphatase
Ymr1p and the synaptojanin-like phosphatases Sjl2p and Sjl3p in regulation of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast. Mol Biol Cell 15:3567-3579
Parrish WR, Stefan CJ, Emr SD (2005) PtdIns(3)P accumulation in triple lipid-phosphatase-
deletion mutants triggers lethal hyperactivation of the Rho1p/Pkc1p cell-integrity MAP kinase pathway. J Cell Sci 118:5589-5601
Pearson WR (2000) Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package.
Methods Mol Biol 132:185-219 Penela P, Rivas V, Salcedo A, Mayor F, Jr. (2010) G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2)
modulation and cell cycle progression. Proc Natl Acad Sci USA 107:1118-1123 Perez DM, Karnik SS (2005) Multiple signaling states of G-protein-coupled receptors. Pharmacol
Rev 57:147-161 Peter M, Gartner A, Horecka J, Ammerer G, Herskowitz I (1993) FAR1 links the signal
transduction pathway to the cell cycle machinery in yeast. Cell 73:747-760 Peterson YK, Bernard ML, Ma H, Hazard S, 3rd, Graber SG, Lanier SM (2000) Stabilization
of the GDP-bound conformation of Gialpha by a peptide derived from the G-protein regulatory motif of AGS3. J Biol Chem 275:33193-33196
Pöggeler S (2000) Two pheromone precursor genes are transcriptionally expressed in the
homothallic ascomycete Sordaria macrospora. Curr Genet 37:403-411 Pöggeler S, Kück U (2001) Identification of transcriptionally expressed pheromone receptor genes
in filamentous ascomycetes. Gene 280:9-17 Pöggeler S, Kück U (2004) A WD40 repeat protein regulates fungal cell differentiation and can be
replaced functionally by the mammalian homologue striatin. Eukaryot Cell 3:232-240 Pöggeler S, Kück U (2006) Highly efficient generation of signal transduction knockout mutants
using a fungal strain deficient in the mammalian ku70 ortholog. Gene 378:1-10
VIII Literatur 99
Pöggeler S, Nowrousian M, Kück U (2006) Fruiting-body development in ascomycetes. In: Kües U, Fischer R (eds) The Mycota I. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, pp 325-355
Ponting CP (1996) Novel domains in NADPH oxidase subunits, sorting nexins, and PtdIns 3-
kinases: binding partners of SH3 domains? Protein Sci 5:2353-2357 Popov S, Yu K, Kozasa T, Wilkie TM (1997) The regulators of G protein signaling (RGS)
domains of RGS4, RGS10, and GAIP retain GTPase activating protein activity in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 94:7216-7220
Posner BA, Gilman AG, Harris BA (1999) Regulators of G protein signaling 6 and 7.
Purification of complexes with gbeta5 and assessment of their effects on g protein-mediated signaling pathways. J Biol Chem 274:31087-31093
Pryciak PM, Huntress FA (1998) Membrane recruitment of the kinase cascade scaffold protein
Ste5 by the Gbetagamma complex underlies activation of the yeast pheromone response pathway. Genes Dev 12:2684-2697
Rapoport I, Miyazaki M, Boll W, Duckworth B, Cantley LC, Shoelson S, Kirchhausen T
(1997) Regulatory interactions in the recognition of endocytic sorting signals by AP-2 complexes. Embo J 16:2240-2250
Regenfelder E, Spellig T, Hartmann A, Lauenstein S, Bolker M, Kahmann R (1997) G
proteins in Ustilago maydis: transmission of multiple signals? Embo J 16:1934-1942 Reiter E, Lefkowitz RJ (2006) GRKs and beta-arrestins: roles in receptor silencing, trafficking
and signaling. Trends Endocrinol Metab 17:159-165 Renart J, Reiser J, Stark GR (1979) Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-
paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci USA 76:3116-3120
Rhee SG (2001) Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C. Annu Rev Biochem
70:281-312 Rodbell M, Birnbaumer L, Pohl SL (1971) Characteristics of glucagon action on the hepatic
adenylate cyclase system. Biochem J 125:58P-59P Rose M, Botstein D (1983) Construction and use of gene fusions to lacZ (beta-galactosidase) that
are expressed in yeast. Methods Enzymol 101:167-180 Ross EM, Gilman AG (1977) Reconstitution of catecholamine-sensitive adenylate cyclase
activity: interactions of solubilized components with receptor-replete membranes. Proc Natl Acad Sci USA 74:3715-3719
Ross EM, Maguire ME, Sturgill TW, Biltonen RL, Gilman AG (1977) Relationship between
the beta-adrenergic receptor and adenylate cyclase. J Biol Chem 252:5761-5775 Ross EM, Wilkie TM (2000) GTPase-activating proteins for heterotrimeric G proteins: regulators
of G protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. Annu Rev Biochem 69:795-827 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 edn.
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, NY Satagopam VP, Theodoropoulou MC, Stampolakis CK, Pavlopoulos GA, Papandreou NC,
Bagos PG, Schneider R, Hamodrakas SJ (2010) GPCRs, G-proteins, effectors and their
VIII Literatur 100
interactions: human-gpDB, a database employing visualization tools and data integration techniques. Database (Oxford) 2010:baq019
Schaefer M, Shevchenko A, Knoblich JA (2000) A protein complex containing Inscuteable and
the Galpha-binding protein Pins orients asymmetric cell divisions in Drosophila. Curr Biol 10:353-362
Scheffzek K, Ahmadian MR (2005) GTPase activating proteins: structural and functional insights
18 years after discovery. Cell Mol Life Sci 62:3014-3038 Schmidt TG, Skerra A (2007) The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity
detection or capturing of proteins. Nat Protoc 2:1528-1535 Schu PV, Takegawa K, Fry MJ, Stack JH, Waterfield MD, Emr SD (1993)
Phosphatidylinositol 3-kinase encoded by yeast VPS34 gene essential for protein sorting. Science 260:88-91
Segall JE (1993) Polarization of yeast cells in spatial gradients of alpha mating factor. Proc Natl
Acad Sci USA 90:8332-8336 Segers GC, Nuss DL (2003) Constitutively activated Galpha negatively regulates virulence,
reproduction and hydrophobin gene expression in the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica. Fungal Genet Biol 38:198-208
Selbie LA, Hill SJ (1998) G protein-coupled-receptor cross-talk: the fine-tuning of multiple
receptor-signalling pathways. Trends Pharmacol Sci 19:87-93 Sheikh SP, Zvyaga TA, Lichtarge O, Sakmar TP, Bourne HR (1996) Rhodopsin activation
blocked by metal-ion-binding sites linking transmembrane helices C and F. Nature 383:347-350
Shenoy SK, Lefkowitz RJ (2003) Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-
membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J 375:503-515 Siderovski DP, Diverse-Pierluissi M, De Vries L (1999) The GoLoco motif: a Galphai/o binding
motif and potential guanine-nucleotide exchange factor. Trends Biochem Sci 24:340-341 Siderovski DP, Willard FS (2005) The GAPs, GEFs, and GDIs of heterotrimeric G-protein alpha
subunits. Int J Biol Sci 1:51-66 Simon MI, Strathmann MP, Gautam N (1991) Diversity of G proteins in signal transduction.
Science 252:802-808 Simon MN, De Virgilio C, Souza B, Pringle JR, Abo A, Reed SI (1995) Role for the Rho-family
GTPase Cdc42 in yeast mating-pheromone signal pathway. Nature 376:702-705 Skatrud PL, Queener SW, Carr LG, Fisher DL (1987) Efficient integrative transformation of
Cephalosporium acremonium. Curr Genet 12:337-348 Slessareva JE, Dohlman HG (2006) G protein signaling in yeast: new components, new
connections, new compartments. Science 314:1412-1413 Slessareva JE, Routt SM, Temple B, Bankaitis VA, Dohlman HG (2006) Activation of the
Phosphatidylinositol 3-Kinase Vps34 by a G Protein [alpha] Subunit at the Endosome. Cell 126:191-203
VIII Literatur 101
Smith B, Hill C, Godfrey EL, Rand D, van den Berg H, Thornton S, Hodgkin M, Davey J, Ladds G (2009) Dual positive and negative regulation of GPCR signaling by GTP hydrolysis. Cell Signal 21:1151-1160
Snow BE, Krumins AM, Brothers GM, Lee SF, Wall MA, Chung S, Mangion J, Arya S,
Gilman AG, Siderovski DP (1998) A G protein gamma subunit-like domain shared between RGS11 and other RGS proteins specifies binding to Gbeta5 subunits. Proc Natl Acad Sci USA 95:13307-13312
Sondek J, Bohm A, Lambright DG, Hamm HE, Sigler PB (1996) Crystal structure of a G-
protein beta gamma dimer at 2.1A resolution. Nature 379:369-374 Sondek J, Siderovski DP (2001) Ggamma-like (GGL) domains: new frontiers in G-protein
signaling and beta-propeller scaffolding. Biochem Pharmacol 61:1329-1337 Song D, Dolan JW, Yuan YL, Fields S (1991) Pheromone-dependent phosphorylation of the
yeast STE12 protein correlates with transcriptional activation. Genes Dev 5:741-750 Sorkin A, von Zastrow M (2009) Endocytosis and signalling: intertwining molecular networks.
Nat Rev Mol Cell Biol 10:609-622 Southern EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. J Mol Biol 98:503-517 Spiegel AM (1987) Signal transduction by guanine nucleotide binding proteins. Mol Cell
Endocrinol 49:1-16 Spiegel AM, Weinstein LS (2004) Inherited diseases involving G proteins and G protein-coupled
receptors. Annual Review of Medicine 55:27-39 Sprang SR (1997) G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu Rev Biochem
66:639-678 Sprang SR, Chen Z, Du XL (2007) Structural basis of effector regulation and signal termination
in heterotrimeric G alpha proteins. Mechanisms and Pathways of Heterotrimeric G Protein Signaling 74:1-65
Stoyanov B, Volinia S, Hanck T, Rubio I, Loubtchenkov M, Malek D, Stoyanova S,
Vanhaesebroeck B, Dhand R, Nurnberg B, et al. (1995) Cloning and characterization of a G protein-activated human phosphoinositide-3 kinase. Science 269:690-693
Strahl T, Thorner J (2007) Synthesis and function of membrane phosphoinositides in budding
yeast, Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1771:353-404 Takesono A, Cismowski MJ, Ribas C, Bernard M, Chung P, Hazard S, 3rd, Duzic E, Lanier
SM (1999) Receptor-independent activators of heterotrimeric G-protein signaling pathways. J Biol Chem 274:33202-33205
Tall GG, Krumins AM, Gilman AG (2003) Mammalian Ric-8A (synembryn) is a heterotrimeric
Galpha protein guanine nucleotide exchange factor. J Biol Chem 278:8356-8362 Terrell J, Shih S, Dunn R, Hicke L (1998) A function for monoubiquitination in the
internalization of a G protein-coupled receptor. Mol Cell 1:193-202
VIII Literatur 102
Tesmer JJ, Berman DM, Gilman AG, Sprang SR (1997) Structure of RGS4 bound to AlF4--activated G(i alpha1): stabilization of the transition state for GTP hydrolysis. Cell 89:251-261
Tolkovsky AM, Levitzki A (1978) Mode of coupling between the beta-adrenergic receptor and
adenylate cyclase in turkey erythrocytes. Biochemistry 17:3795 Torres MP, Lee MJ, Ding F, Purbeck C, Kuhlman B, Dokholyan NV, Dohlman HG (2009) G
Protein Mono-ubiquitination by the Rsp5 Ubiquitin Ligase. J Biol Chem 284:8940-8950 Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354
Turner GE, Borkovich KA (1993) Identification of a G protein alpha subunit from Neurospora
crassa that is a member of the Gi family. J Biol Chem 268:14805-14811 Ullmann A, Jacob F, Monod J (1967) Characterization by in vitro complementation of a peptide
corresponding to an operator-proximal segment of the beta-galactosidase structural gene of Escherichia coli. J Mol Biol 24:339-343
Valencia A, Chardin P, Wittinghofer A, Sander C (1991) The ras protein family: evolutionary
tree and role of conserved amino acids. Biochemistry 30:4637-4648 Valtz N, Peter M, Herskowitz I (1995) FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in
response to mating pheromones. J Cell Biol 131:863-873 Vanhaesebroeck B, Leevers SJ, Ahmadi K, Timms J, Katso R, Driscoll PC, Woscholski R,
Parker PJ, Waterfield MD (2001) Synthesis and function of 3-phosphorylated inositol lipids. Annu Rev Biochem 70:535-602
Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M,
Evans CA, Holt RA, Gocayne JD, Amanatides P, Ballew RM, Huson DH, Wortman JR, Zhang Q, Kodira CD, Zheng XH, Chen L, Skupski M, Subramanian G, Thomas PD, Zhang J, Gabor Miklos GL, Nelson C, Broder S, Clark AG, Nadeau J, McKusick VA, Zinder N, Levine AJ, Roberts RJ, Simon M, Slayman C, Hunkapiller M, Bolanos R, Delcher A, Dew I, Fasulo D, Flanigan M, Florea L, Halpern A, Hannenhalli S, Kravitz S, Levy S, Mobarry C, Reinert K, Remington K, Abu-Threideh J, Beasley E, Biddick K, Bonazzi V, Brandon R, Cargill M, Chandramouliswaran I, Charlab R, Chaturvedi K, Deng Z, Di Francesco V, Dunn P, Eilbeck K, Evangelista C, Gabrielian AE, Gan W, Ge W, Gong F, Gu Z, Guan P, Heiman TJ, Higgins ME, Ji RR, Ke Z, Ketchum KA, Lai Z, Lei Y, Li Z, Li J, Liang Y, Lin X, Lu F, Merkulov GV, Milshina N, Moore HM, Naik AK, Narayan VA, Neelam B, Nusskern D, Rusch DB, Salzberg S, Shao W, Shue B, Sun J, Wang Z, Wang A, Wang X, Wang J, Wei M, Wides R, Xiao C, Yan C, Yao A, Ye J, Zhan M, Zhang W, Zhang H, Zhao Q, Zheng L, Zhong F, Zhong W, Zhu S, Zhao S, Gilbert D, Baumhueter S, Spier G, Carter C, Cravchik A, Woodage T, Ali F, An H, Awe A, Baldwin D, Baden H, Barnstead M, Barrow I, Beeson K, Busam D, Carver A, Center A, Cheng ML, Curry L, Danaher S, Davenport L, Desilets R, Dietz S, Dodson K, Doup L, Ferriera S, Garg N, Gluecksmann A, Hart B, Haynes J, Haynes C, Heiner C, Hladun S, Hostin D, Houck J, Howland T, Ibegwam C, Johnson J, Kalush F, Kline L, Koduru S, Love A, Mann F, May D, McCawley S, McIntosh T, McMullen I, Moy M, Moy L, Murphy B, Nelson K, Pfannkoch C, Pratts E, Puri V, Qureshi H, Reardon M, Rodriguez R, Rogers YH, Romblad D, Ruhfel B, Scott R, Sitter C, Smallwood M, Stewart E, Strong R, Suh E, Thomas R, Tint NN, Tse S, Vech C, Wang G, Wetter J, Williams S, Williams M, Windsor S, Winn-Deen E, Wolfe K, Zaveri J, Zaveri K, Abril JF, Guigo R, Campbell
VIII Literatur 103
MJ, Sjolander KV, Karlak B, Kejariwal A, Mi H, Lazareva B, Hatton T, Narechania A, Diemer K, Muruganujan A, Guo N, Sato S, Bafna V, Istrail S, Lippert R, Schwartz R, Walenz B, Yooseph S, Allen D, Basu A, Baxendale J, Blick L, Caminha M, Carnes-Stine J, Caulk P, Chiang YH, Coyne M, Dahlke C, Mays A, Dombroski M, Donnelly M, Ely D, Esparham S, Fosler C, Gire H, Glanowski S, Glasser K, Glodek A, Gorokhov M, Graham K, Gropman B, Harris M, Heil J, Henderson S, Hoover J, Jennings D, Jordan C, Jordan J, Kasha J, Kagan L, Kraft C, Levitsky A, Lewis M, Liu X, Lopez J, Ma D, Majoros W, McDaniel J, Murphy S, Newman M, Nguyen T, Nguyen N, Nodell M, Pan S, Peck J, Peterson M, Rowe W, Sanders R, Scott J, Simpson M, Smith T, Sprague A, Stockwell T, Turner R, Venter E, Wang M, Wen M, Wu D, Wu M, Xia A, Zandieh A, Zhu X (2001) The sequence of the human genome. In: Science, vol. 291, 2001/02/22 edn, pp 1304-1351
Verghese MW, Charles L, Jakoi L, Dillon SB, Snyderman R (1987) Role of a guanine
nucleotide regulatory protein in the activation of phospholipase C by different chemoattractants. J Immunol 138:4374-4380
Versele M, de Winde JH, Thevelein JM (1999) A novel regulator of G protein signalling in
yeast, Rgs2, downregulates glucose-activation of the cAMP pathway through direct inhibition of Gpa2. Embo J 18:5577-5591
Versele M, Lemaire K, Thevelein JM (2001) Sex and sugar in yeast: two distinct GPCR systems.
EMBO Rep 2:574-579 von Zastrow M, Mostov K (2001) Signal transduction. A new thread in an intricate web. Science
294:1845-1847 Wall MA, Coleman DE, Lee E, Iniguez-Lluhi JA, Posner BA, Gilman AG, Sprang SR (1995)
The structure of the G protein heterotrimer Gi alpha 1 beta 1 gamma 2. Cell 83:1047-1058 Wang H, Ng KH, Qian H, Siderovski DP, Chia W, Yu F (2005) Ric-8 controls Drosophila
neural progenitor asymmetric division by regulating heterotrimeric G proteins. Nat Cell Biol 7:1091-1098
Watson N, Linder ME, Druey KM, Kehrl JH, Blumer KJ (1996) RGS family members:
GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein alpha-subunits. Nature 383:172-175
Weiner MP, Anderson C, Jerpseth B, Wells S, Johnson-Browne B, Vaillancourt P (1994)
Studier pET System, vectors and hosts. Strategies 7: 41-43. Wheeler GL, Matuto Y, Bitensky MW (1977) Light-activated GTPase in vertebrate
photoreceptors. Nature 269:822-824 Whiteway M, Hougan L, Dignard D, Thomas DY, Bell L, Saari GC, Grant FJ, O'Hara P,
MacKay VL (1989) The STE4 and STE18 genes of yeast encode potential beta and gamma subunits of the mating factor receptor-coupled G protein. Cell 56:467-477
Wieser J, Yu JH, Adams TH (1997) Dominant mutations affecting both sporulation and
sterigmatocystin biosynthesis in Aspergillus nidulans. Curr Genet 32:218-224 Willars GB (2006) Mammalian RGS proteins: multifunctional regulators of cellular signalling.
Semin Cell Dev Biol 17:363-376
VIII Literatur 104
Woodard GE, Huang NN, Cho H, Miki T, Tall GG, Kehrl JH (2010) Ric-8A and Gi alpha recruit LGN, NuMA, and dynein to the cell cortex to help orient the mitotic spindle. Mol Cell Biol 30:3519-3530
Worby CA, Dixon JE (2002) Sorting out the cellular functions of sorting nexins. Nat Rev Mol
Cell Biol 3:919-931 Worthylake DK, Rossman KL, Sondek J (2000) Crystal structure of Rac1 in complex with the
guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature 408:682-688 Wurmser AE, Emr SD (1998) Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of
membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. Embo J 17:4930-4942
Xu Y, Seet LF, Hanson B, Hong W (2001) The Phox homology (PX) domain, a new player in
phosphoinositide signalling. Biochem J 360:513-530 Xue C, Hsueh YP, Chen L, Heitman J (2008) The RGS protein Crg2 regulates both pheromone
and cAMP signalling in Cryptococcus neoformans. Mol Microbiol 70:379-395 Yang Q, Borkovich KA (1999) Mutational activation of a Galphai causes uncontrolled
proliferation of aerial hyphae and increased sensitivity to heat and oxidative stress in Neurospora crassa. Genetics 151:107-117
Yang Q, Poole SI, Borkovich KA (2002) A G-protein beta subunit required for sexual and
vegetative development and maintenance of normal G alpha protein levels in Neurospora crassa. Eukaryot Cell 1:378-390
Yeung WW, Wong YH (2010) Galpha16 interacts with Class IA phosphatidylinositol 3-kinases
and inhibits Akt signaling. Cell Signal 22:1379-1387 Yu JH, Wieser J, Adams TH (1996) The Aspergillus FlbA RGS domain protein antagonizes G
protein signaling to block proliferation and allow development. Embo J 15:5184-5190 Yu JW, Lemmon MA (2001) All phox homology (PX) domains from Saccharomyces cerevisiae
specifically recognize phosphatidylinositol 3-phosphate. J Biol Chem 276:44179-44184 Yun CW, Tamaki H, Nakayama R, Yamamoto K, Kumagai H (1997) G-protein coupled
receptor from yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 240:287-292
Zerangue N, Jan LY (1998) G-protein signaling: fine-tuning signaling kinetics. Curr Biol 8:R313-
316 Zhao ZS, Leung T, Manser E, Lim L (1995) Pheromone signalling in Saccharomyces cerevisiae
requires the small GTP-binding protein Cdc42p and its activator CDC24. Mol Cell Biol 15:5246-5257
Zheng B, Lavoie C, Tang TD, Ma P, Meerloo T, Beas A, Farquhar MG (2004) Regulation of
epidermal growth factor receptor degradation by heterotrimeric Galphas protein. Mol Biol Cell 15:5538-5550
Zheng B, Ma YC, Ostrom RS, Lavoie C, Gill GN, Insel PA, Huang XY, Farquhar MG (2001)
RGS-PX1, a GAP for GalphaS and sorting nexin in vesicular trafficking. Science 294:1939-1942
VIII Literatur 105
Zheng B, Tang T, Tang N, Kudlicka K, Ohtsubo K, Ma P, Marth JD, Farquhar MG, Lehtonen E (2006) Essential role of RGS-PX1/sorting nexin 13 in mouse development and regulation of endocytosis dynamics. Proc Natl Acad Sci USA 103:16776-16781
Zhong H, Wade SM, Woolf PJ, Linderman JJ, Traynor JR, Neubig RR (2003) A spatial
focusing model for G protein signals. Regulator of G protein signaling (RGS) protien-mediated kinetic scaffolding. J Biol Chem 278:7278-7284
Zhong Y, Wang QJ, Yue Z (2009) Atg14L and Rubicon: yin and yang of Beclin 1-mediated
autophagy control. Autophagy 5:890-891 Zhou J, Moroi K, Nishiyama M, Usui H, Seki N, Ishida J, Fukamizu A, Kimura S (2001)
Characterization of RGS5 in regulation of G protein-coupled receptor signaling. Life Sci 68:1457-1469
Zhou X, Wang F (2010) Effects of neuronal PIK3C3/Vps34 deletion on autophagy and beyond.
Autophagy 6:798-799
Curriculum vitae
Christian Schäfers,
Geboren am 20.03.1978 in Witten
1985-1988 Breddeschule (Grundschule), Witten
1988-1992 Ruhr-Gymnasium, Witten
1992-1996 Otto-Schott-Realschule, Witten
1996-1999 Gymnasiale Oberstufe des Cuno II Berufskollegs, Hagen
2001-2002 Biologie (Lehramt, Sek. II) / Universität Essen
2002-2007 Diplom-Studiengang Biologie, Diplomarbeit am Lehrstuhl für
Allgemeine und Molekulare Botanik, Ruhr-Universität Bochum
Diplomarbeit mit dem Thema: „Funktionelle Analyse von Interaktionspartnern des Transkriptionsfaktors Ste12 aus Sordaria macrospora“
Seit Dez. 2007 Promotions-Studiengang Biologie, Anfertigung der Dissertation am
Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik, Ruhr-Universität
Bochum
Dissertation mit dem Thema: „Heterotrimere G-Proteine in Pilzen: Die Funktion der Gα-Untereinheit GSA1 in der Entwicklung des Modellorganismus Sordaria macrospora“
Publikationen: Elleuche S, Bernhards Y, Schäfers C, Varghese JM, Nolting N, Pöggeler S (2010) The small
serine-threonine protein SIP2 interacts with STE12 and is involved in ascospore germination in Sordaria macrospora. Eur J Cell Biol 89:873-887
Kongressbeiträge:
Vorträge:
Schäfers C, Kück U (2009) Heterotrimeric G protein in Sordaria macrospora: Interaction partners
of the G protein alpha subunit GSA1. In: 9th VAAM Symposium "Molecular Biology of Fungi", Münster, Germany
Poster:
Schäfers C, Kück U (2009) G-Protein mediated signal transduction in a filamentous fungus: Use of the yeast-two-hybrid-system to identify interaction partners of the alpha subunit GSA1. In: VAAM Annual Meeting, Bochum, Germany
Kamerewerd J, Schäfers C, Jansson M, Nowrousian M, Pöggeler S, Kück U (2009) Distinct
roles of three G protein a-subunits and an adenylyl cyclase in fruiting body development of the homothallic fungus Sordaria macrospora. In: 25th Fungal Genetics Conference, Asilomar, Pacific Grove, USA
Schäfers C, Kück U (2010) Activation state-dependent interaction partners of the G protein alpha
subunit GSA1 in Sordaria macrospora. In: 9th International Mycological Congress, Edinburgh, UK
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät
eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet
habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort
und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in
keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 01.02.2011
(Christian Schäfers)