8/16/2019 HSPCR
1/3
Ketika pengaturan reaksi amplifkasi dilakukan pada suhu kamar,
primer dapat
mengikat nonspesifk satu sama lain, membentuk primer-dimer.
Selama siklus
amplifkasi, primer-dimer dapat diperpanjang untuk menghasilkan
produk spesifk,
yang mengurangi hasil produk tertentu. Untuk aplikasi PCR yang
lebih menantang,
penggunaan hot-start PCR sangat penting untuk hasil tertentu
sukses. Untuk
menghasilkan panas-start polimerase D!, akti"itas polimerase #a$
D! dapatdihambat pada suhu yang lebih rendah dengan antibodi atau,
lebih e%ekti%, dengan
pengubah kimia yang membentuk ikatan ko"alen dengan asam amino
di
polimerase. &odifkasi kimia mengarah untuk menyelesaikan
inakti"asi polimerase
sampai ikatan ko"alen yang rusak selama a'al langkah akti"asi
panas. Sebaliknya,
dalam prosedur hot-start antibodi-mediated, antibodi berikatan
dengan polymerase
oleh pasukan non-ko"alen yang relati% lemah, yang meninggalkan
beberapa molekul
polimerase dalam keadaan akti% mereka. (al ini terkadang
menyebabkan produk
ekstensi primer spesifk yang dapat lebih diperkuat selama PCR.
Produk ini mun)ul
sebagai bedak atau salah %ragmen berukuran ketika dijalankan
pada gel agarosa
*hen amplif)ation rea)tion setup is per%ormed at room
temperature, primers )an
bind nonspe)if)ally to ea)h other, %orming primer+dimers. During
amplif)ation
)y)les, primer+dimers )an be etended to produ)e nonspe)if)
produ)ts, 'hi)h
redu)es spe)if) produ)t yield. or more )hallenging PCR
appli)ations, the use o%
hot-start PCR is )ru)ial %or su))ess%ul spe)if) results. #o
produ)e hot-start D!
polymerases, #a$ D! polymerase a)ti"ity )an be inhibited at
lo'er temperatures
'ith antibodies or, more ee)ti"ely, 'ith )hemi)al modifers that
%orm )o"alent
bonds 'ith amino a)ids in the polymerase. #he )hemi)al
modif)ation leads to
)omplete ina)ti"ation o% the polymerase until the )o"alent bonds
are broken during
the initial heat a)ti"ation step. /n )ontrast, in
antibody-mediated hot-start
pro)edures, antibodies bind to the polymerase by relati"ely 'eak
non-)o"alent
%or)es, 'hi)h lea"es some polymerase mole)ules in their a)ti"e
state. #his
sometimes leads to nonspe)if) primer etension produ)ts that )an
be %urther
amplifed during PCR. #hese produ)ts appear as smearing or
in)orre)tly si0ed
%ragments 'hen run on an agarose gel.
(igh-fdelity D! polymerase
Unlike standard D! polymerases 1su)h as #a$ D! polymerase2,
high-fdelity PCRen0ymes generally pro"ide a 34 to 54 eonu)lease
a)ti"ity %or remo"ing in)orre)tly
in)orporated bases. (igh-fdelity PCR en0ymes are ideally suited
to appli)ations
re$uiring a lo' error rate, su)h as )loning, se$uen)ing, and
site-dire)ted
mutagenesis. (o'e"er, i% the en0yme is not pro"ided in a
hot-start "ersion, the 34 to
54 eonu)lease a)ti"ity )an degrade primers during PCR setup and
the early stages
o% PCR. onspe)if) priming )aused by shortened primers )an result
in smearing on
8/16/2019 HSPCR
2/3
a gel or amplif)ation %ailure 6 espe)ially 'hen using lo'
amounts o% template. /t
should be noted that the proo%reading %un)tion o%ten )auses
high-fdelity en0ymes
to 'ork more slo'ly than other D! polymerases. /n addition, the
!-addition
%un)tion re$uired %or dire)t U!- or #!-)loning is strongly
redu)ed, resulting in the
need %or blunt-end )loning 'ith lo'er ligation and
trans%ormation e7)ien)y.
PCR )y)ling
/n theory, ea)h PCR )y)le doubles the amount o% ampli)on in the
rea)tion.
#here%ore, 89 )y)les multiply the ampli)on by a %a)tor o%
:8999 and so on.
;a)h PCR )y)le )onsists o% template denaturation, primer
annealing and primer
etension. /% the temperatures %or annealing and etension are
similar, these t'o
pro)esses )an be )ombined. ;a)h stage o% the )y)le must be
optimi0ed in terms o%
time and temperature %or ea)h template and primer pair
)ombination.
#inggi kesetiaan D! polymerase
#idak seperti D! polimerase standar 1seperti #a$ D!
polymerase2, en0im PCR-
kesetiaan yang tinggi umumnya memberikan akti"itas 3 4ke 54
eonu)lease untuk
menghapus basis tidak benar dimasukkan. en0im PCR tinggi
kesetiaan ideal untuk
aplikasi yang memerlukan tingkat kesalahan rendah, seperti
kloning, sekuensing,
dan mutagenesis situs-diarahkan. amun, jika en0im tidak
disediakan dalam "ersi
hot-start, akti"itas 3 4ke 54 eonu)lease dapat menurunkan primer
selama setup
PCR dan tahap a'al PCR. priming nonspesifk yang disebabkan oleh
primer
dipersingkat dapat mengakibatkan mengolesi pada kegagalan gel
atau amplifkasi -
terutama ketika menggunakan jumlah rendah template. Perlu
di)atat bah'a %ungsi
proo%reading sering menyebabkan en0im tinggi kesetiaan untuk
bekerja lebih
lambat dari D! polimerase lainnya. Selain itu, %ungsi !-Selain
diperlukan untuk U!-
langsung atau #!-kloning sangat berkurang, sehingga kebutuhan
untuk tumpul-end
kloning dengan ligasi lebih rendah dan efsiensi
trans%ormasi.
PCR bersepeda
Dalam teori, setiap siklus PCR menggandakan jumlah amplikon
dalam reaksi.
