IASLC Atlas of ALK Testing in Lung Cancer - Japanese Translation

international association for the study of lung cancer

編集者Ming sound tsao, Md, frcPcfred r. hirsch, Md, Phdyasushi yatabe, Md, Phd

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス


International Association for the Study of Lung Cancer, Aurora, Colorado, USA

編集者： Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD

IASLC Press によって出版された IASLC 出版物邦訳にあたって次の方々の協力をいただきました。マークベントン (Intermed English Services)、木村花代子、近藤千晶、柴田典子、尾関順子、太田裕子。表紙および本のレイアウトは Biographics によるオリジナルデザイン

IASLC Press オフィス: IASLC, 13100 East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, USA

www.iaslc.org

2013年10月初版

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

ISBN: 978-1-940488-05-9

著作権 c2013 International Association for the Study of Lung Cancer

禁無断転載

著作権法上の例外を除き、書面による事前の承諾無しで出版物の部分的利用、検索システムへの保存あるいは導入、あるいは全ての転載を禁止します。

出版時点における本文の情報は真実かつ正確であると確信していますが、いかなる間違いや不作為についてIASLC、編集者、および出版者は法的責任を負いません。出版者は内容に関して明示的にも黙示的にも保証を負いません。

編集者 Ming Sound Tsao, MD, FRCPC

Fred R. Hirsch, MD, PhDYasushi Yatabe, MD, PhD

international association for the study of lung cancer


謝辞

IASLC はこのALKアトラスのプロジェクトに対する Pfizer Oncology が提供した寛大な資金とサポートに深く感謝します。また共編者およびすべての担当者は Lori Alexander, MTPW, ELS, の編集援助、Deborah A. Whippen, Editorial Rx, Inc., および Rania Gaspo, PhD, Pfizer Oncology のサポートに対し感謝致します。

目次

執筆者リスト. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

略語 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

製造業者 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

前書き . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

第1章 ALKテストの対象 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

第2章検体採取、処理、および診断の手順 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

第3章蛍光インシチューハイブリダイゼーション法（FISH) . . . . . . . . . . . 17

第4章免疫組織化学法（IHC） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

第5章逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR)およびマルチプレックス遺伝子解析法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

第6章 ALKテストのための解析プラットホームの比較 . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

第7章細胞診におけるALKテスト . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

第8章 ALKテストの報告書 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

第9章ガイドラインおよびテスト標準化の研究 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

第10章概要および展望. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

付記1 肺癌におけるALK遺伝子再構成についての報告された研究の概要再構成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

付記2 EGFR およびALKチロシンキナーゼ阻害剤で治療を受ける肺がん患者を選択するためのCAP/IASLC/AMP の遺伝子検査のガイドライン. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

6肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

Ming Sound Tsao, MD, FRCPCPathologist and Senior Scientist, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network Professor, Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto Toronto, Canada

Fred R. Hirsch, MD, PhD Professor, Department of MedicineDepartment of PathologyUniversity of Colorado at DenverDenver, Colorado, USA

Yasushi Yatabe, MD, PhD Chief, Department of Pathology and Molecular Diagnostics,Aichi Cancer CenterNagoya, Japan担当者リスト

List of Contributors

Elisabeth Brambilla, MD, PhDProfessor, Département d’Anatomie et Cytologie PathologiquesINSERM U823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Université Joseph FourierGrenoble, France

Lukas Bubendorf, MDProfessor and Head, Division of CytopathologyInstitute for Pathology, University Hospital BaselBasel, Switzerland

Jin-Haeng Chung, MD, PhDProfessor, Department of PathologySeoul National University Bundang HospitalSeoul, South Korea

Keith M. Kerr, FRCPathProfessor, Department of PathologyAberdeen University Medical SchoolAberdeen Royal InfirmaryAberdeen, Scotland, United Kingdom

Sylvie Lantuéjoul, MD, PhDProfessor and Chair, Départementd’Anatomie et Cytologie PathologiquesINSERM U 823 Institut Albert BonniotCentre Hospitalier Universitair A Michallon, Université Joseph Fourier Grenoble, France

Kengo Takeuchi, MD, PhDPathology Project for Molecular Targets of the Cancer InstituteDivision of Pathology of the Cancer Institute HospitalJapanese Foundation for Cancer Research Tokyo, Japan

Erik Thunnissen, MD, PhDConsultant Pathologist, VU University Medical CenterAmsterdam, The Netherlands

Marileila Varella-Garcia, PhDProfessor, Department of Medicine/Medical OncologyDepartment of Pathology University of Colorado at DenverDenver, Colorado, USA

Ignacio Wistuba, MDProfessor and Chair, Jay and Lori Eisenberg Endowed ProfessorDepartment of Translational Molecular PathologyThe University of Texas MD Anderson Cancer CenterHouston, Texas, USA

Akihiko Yoshida, MD, PhDAttending Pathologist, Department of PathologyNational Cancer Center HospitalTokyo, Japan

分担執筆者

編集者

2013年イタリアのソレントで開催された IASLCALKテストワークショップ参加者。前例左からY. Yatabe, M. Varella-Garcia, E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo （Pfizer Oncology）, J-H Chung; 後列左からA. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M. S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr。

7略語

AEC: 3-アミノ-9-エチルカルバゾールALK: 未分化リンパ腫キナーゼAMP: Association for Molecular Pathology ATS: American Thoracic SocietyCAP: College of American PathologistsCISH:クロモゲンインシチューハイブリダイゼーションDAB: 3, 3’ ジアミノベンジジンEBUS: 超音波気管支鏡EDTA: エチレンジアミン四酢酸EGFR: 上皮成長因子受容体（Epidermal growth factor receptor）EML4: echinoderm microtubule-associated protein-like 4ERS: European Respiratory SocietyETOP: European Thoracic Oncology PlatformEUS: 経食道超音波法FDA: 米国食品医薬品局FFPE: ホルマリン固定パラフィン包埋FISH: 蛍光インシチューハイブリダイゼーションFNA: 細針吸引細胞診H&E: ヘマトキシリン-エオジンHER2: ヒト上皮成長因子受容体-2iAEP: intercalated antibody-enhanced polymerIASLC: International Association for the Study of Lung CancerIHC: 免疫組織化学的検査ISH: インシチューハイブリダイゼーションKIF5B: kinesin family member 5BNOS: Not otherwise specifiedNSCLC: 非小細胞肺癌NGS: 次世代シークエンシングRET: retがん遺伝子ROS1: c-ros がん遺伝子 1RT-PCR: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応SCLC: 小細胞肺癌TKI: チロシンキナーゼ阻害剤v: 変形体（variant)

略語本文で使用されている略語。


製造業者以下の製造業者および製品が本アトラスに記載されています。各製造業者について記載された場所は

唯一のものでは有りません。多くの製造業者が世界各地にオフィスを持っています。

Abbott MolecularAbbott Park, Illinois, USAVysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Spectrum Orange Probe, and Spectrum Green Probe

AbcamCambridge, UKAnti-ALK antibody（5A4）

BD（Becton, Dickinson and Company）DiagnosticsFranklin Lakes, New Jersey, USASurePath

Cell Signaling TechnologyDanvers, Massachusetts, USAD5F3 antibody（ALK [D5F3] XP Rabbit mAb）

DakoGlostrup, DenmarkCarpinteria, California, USAADVANCE, ALK1 antibody, EnVision, EnVision+, EnVision FLEX, and EnVision FLEX+, PT Link, and Target Retrieval Solution Hologic, Inc.Bedford, Massachusetts, USAThinPrep

Invitrogen, Life Technologies CorporationCarlsbad, California, USAAnti-ALK antibody

Leica BiosystemsBuffalo Grove, Illinois, USAWetzlar, GermanyBond-Max, Novolink Polymer Detection System

Nichirei Biosciences, Inc.Tokyo, Japan5A4 antibody（Histofine ALK Detection Kit）

NovocastraNewcastle, UK5A4 antibody

NanoString TechnologiesSeattle, Washington, USANanoString assay

Pfizer OncologyNew York, New York, USAXalkoriTM

Ventana Medical Systems, Inc. （member of the Roche group）Tucson, Arizona, USA BenchMark XT, iVIEW DAB Detection Kit, OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView Amplification Kit, and ultraView Universal DAB Kit, and Rabbit Monoclonal Primary Antibody assay

ZytoVision GmbHBremerhaven, GermanyZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probe

過去数年間にわたって、進行肺癌に罹患する患者の診断および治療はめざましい変化をとげた。現在は、新規標的療法に対する治療戦略は特定のがん関連遺伝子異常の有無に基づいて決定されている。最初に肺癌で発見されたそのような遺伝子異常は上皮成長因子受容体（EGFR）キナーゼ領域の突然変異で、この変異のある腫瘍は EGFR チロシンキナーゼ阻害剤（TKIs）に感受性の高い事が明らかとなった。それ以来、未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）遺伝子が肺癌における2番めのドライバー変異である事が明らかになり、それに対する非常に効果的な療法が新たに開発された。新しいALK融合遺伝子は 2 番染色体の短腕における再構成再構成によって形成されるもので、ALK（2p23.2）および echinoderm microtubule-associated protein-like 4（EML4）（2p21）をコードする遺伝子または、まれに、他の染色体上の遺伝子と関連している。この新しい融合遺伝子による蛋白質には、EML4 遺伝子の酸性領域が新しいキメラ蛋白質の二量体形成を促すことによって、ALKキナーゼの恒常的な活性化をもたらす。再構成遺伝子再構成によるEML4-ALK融合遺伝子として、複数のバリアントが同定されている。融合体はEML4 遺伝子の N 末端部分そしてALK遺伝子の C 末端キナーゼ領域から成り立っている。この遺伝子の再構成は大きい染色体の逆位および転座を含むため、FISH（蛍光インシチューハイブリダイゼーション法）によってすべてのALK遺伝子再構成を検出する事ができる。またこの方法がALK阻害剤である crizotinib（Xalkori®、Pfizer Oncology）の最初の臨床試験において本遺伝子の異常検出に使用され（Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012）、 ALKブレイクアパート再構成プローブを使用した FISHがALK再構成のある肺癌診断の標準的評価法となるとともに、米国食品医薬品局（FDA）は Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit（Abbott Molecular）を承認した。この解析方法は明確な陽性及び陰性結果の判定基準をもち、再構成進行非小細胞性肺癌（NSCLC）に罹患するALK再構成陽性の患者を選別するために使用された。第I／II相試験では、crizotinib は奏功率 61% と無増悪生存期間の中央値が9.7か月であることが示された（Camidge 2012年）。無作為化第III相試験（PROFILE 1007）では従来の化学療法に抵抗性の患者に対して crizotinib治療と標準的化学療法が比較され、crizotinib による治療は 65% の奏功率（化学療法では 20%）および 7.7か月の無増悪生存期間の中央値（化学療法では 3.0か月）（Shaw 2013年）が示された。

執筆担当：Ming Sound Tsao, Fred R. Hirsch, および Yasushi Yatabe

前書き


新世代のALK阻害剤が開発され、これらの阻害剤の臨床試験が現在行われている。さまざまな遺伝子の再構成のパターンが明らかになり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の塩基配列決定を用いた融合遺伝子の検出方法が開発された。さらに、多数の施設での研究により、シグナル増強法を用いた免疫組織化学的検査（IHC）を使用して、 FISHでALK陽性であったほとんどすべての腫瘍にALK蛋白質が検出できたことが明らかとなった。また複数の症例報告で、非定型FISHパターンでALK陰性とされた NSCLC の腫瘍（ALK FISH 陰性）が IHC　検査でALK陽性となりALK阻害剤が奏功することもあることが報告されている（Peled 2012）。そのため、IHC キットが現在開発および評価中である。これらの複数の診断プラットホームの開発によってALK遺伝子再構成あるいは融合蛋白の検出が、検査施設での専門技術や装置の利用可能状況に応じて選択する事が可能になっている。臨床診断テストは優れた再現性と信頼性が要求されるため、これらの解析方法の標準化は必須である。この問題を扱うために、IASLCの病理部会（the Pathology Committee of the International Association for the Study of Lung Cancer）は専門委員を招集し、進行 NSCLC に罹患する患者に対するALKテスト法の背景、プロトコール、そして結果の解釈についての病理医、検査医、および臨床医の一助となるよう、この指針を出版することにした。

ALK遺伝子再構成を検出することは進行 NSCLC の患者に対する有効な治療法を選択する上で重要であることは広く認識されている。しかし、臨床病理学的な特徴によってALKの検査を受けるべき患者を決定できるのかどうかは明白ではない。ALK遺伝子再構成は非喫煙者、前軽度喫煙者、若い患者、及び肺腺癌として分類される腫瘍により高頻度に認められる。だからといって年齢が高い喫煙者の扁平上皮細胞の組織をALKテストから除外すべきだろうか？発表された研究からは、ALK陽性の NSCLC 患者の約 70～80% は非喫煙者（前喫煙者あるいは現在喫煙者は 20% から30%）で、また NSCLC 罹患者全体（60から70歳）あるいはEGFR 突然変異を伴う NSCLC 罹患者（60から65歳）よりずっと若い（40から50歳）と報告されている（Rodig 2009、Shaw 2009、Bang 2010、 Kwak 2010、Shaw 2011）。しかし、研究全体を見ると、ALK再構成をもつ腫瘍は70歳以上、あるいは40歳未満の患者にも認められている。これらのデータから、喫煙の経験および年齢によって患者のALKテストをすべきか否かは明確でない。組織学的診断がより重要な選択基準だと考えられる。文献で報告された12,000以上の肺癌標本の内、ALK再構成は主として非扁平上皮および非神経内分泌の肺癌（図1、付記1）に見られている。これらのデータに基づいて、the College of American Pathologists（CAP）/International Association for the Study of Lung

ALKテストの対象執筆担当：Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla, および Ming Sound Tsao

第1章

図1。NSCLC におけるALK遺伝子再構成に関する研究の概要。A. 2013年5月までに報告されたALK異常の研究結果。ここでは「NSCLC」は腫瘍のタイプを特定せず、「NSCLC 以外」は腺扁平上皮癌(ADSC)および大細胞／肉腫様癌を含んでいる。B. 腫瘍の組織学的ALK陽性例の推定比率。腺癌 (ADC)の結果は、臨床選択基準(例えば喫煙経歴、EGFR 陰性または KRAS 突然変異)の有無による有病率を提示している。数値は付記1で示されるデータに基づく。SCC = 扁平上皮細胞癌。

5.2 5.7

11.1

1.3

NSCLC ADC(unselected)

ADC(selected)

SCC ADSC NSCLC-Others

9

4.8

A

B

NSCLC-Others (n=376)ADSC (n=78)

NSCLC(n=4025)

ADC(n=6775)

SCC(n=1411)


Cancer（IASLC）/Association for Molecular Pathology（AMP）によって発表された最新のガイドラインを含むいくつかの公表されたガイドラインでは、進行 NSCLC 患者にはルーチンに扁平上皮組織によるALKテストを行わない事を推奨している（Lindeman 2013）。（ALKテスト指針の詳細な議論については付記2 および第9章を参照.）【訳注: 生検組織や細胞診検体での検討であれば組織型によらずすべての患者で検査すべきとされている】しかしながら、ALK再構成は1,400 以上の扁平上皮細胞の肺癌の約 1.3%に検出される（付録1）とともに、症例によっては IHC でも確認されたALK再構成が報告されている（Alrifai 2013、An 2013、Ochi 2013）。扁平上皮細胞の報告間での違いは、NSCLC の組織学的サブタイプの診断が難しいことによる可能性がある。肺癌の診断はしばしば生検標本または細胞診検体によって行われるが、生検標本による病理組織学的な診断は常に腫瘍全体の組織像を代表するものではない。EGFR やKRAS 突然変異を有する扁平上皮細胞癌を再検査した結果 16 の腫瘍中 15 に腺癌の成分が確認された（Rekhtman 2012）。そのため、CAP/IASLC/AMP のガイドラインはALKテストを、完全に切除できた肺癌標本が採取できる場合にのみ腺癌患者および腺癌の成分をもつ混合型肺癌の症例のみに実施することを提案している。ALKテストはまた、腺癌成分の存在が完全に否定できない生検および細胞診検体のような限られた標本について実施するよう推奨されている。 ALKテストのためのIHCによるスクリーニングは、扁平上皮細胞性肺癌に対するALKテストの問題を払拭する理想的な解決策となる可能性がある。低コストと高い再現性、感受性、および特異性を考慮すると IHC 検査は扁平上皮細胞性肺癌患者に、より高価なFISHによる確認をするのに悪くない選択といえる。限局性または限局−局所性 NSCLCを有する患者については現在のところALK再構成検査と治療介入との関連性は示されていない。しかし、多くの患者は再発するため、ALKテストは有益と考えられ、結果があれば再発後に実施される治療までの時間と労力を節約することができる。

ALK遺伝子再構成検査は、肺癌組織検体を使用して行われる診断方法の1つである。多くの患者では、一回に採取できる組織検体は少量であり、診断に十分な情報を得るには最も効率のよい方法で検体を使用する必要がある。組織検体について記憶に留めるべき2つの重要なポイントがある、すなわち検体が腫瘍細胞を有しない可能性があることと、組織を固定して処理するのは一回限りだということである。全ての診断が同一検体を使用して行われるため、検体採取と処理は品質管理の重要な工程である。

診断のための組織採取多くの場合、ALKテストは進行期患者から採取される生検よって得られる小組織標本または細胞診用の検体で行われる。頻度は少ないものの、早期の段階で外科的切除が行われ、その後再発した患者では、その切除腫瘍が利用できる可能性もある。診断のための組織採取は最も安全で、侵襲性の少なくかつ最大の腫瘍組織が獲得できる方法で施行すべきである（Thunnissen 2012d）。検体採取は原発腫瘍、胸腔内転移巣、または胸腔外への転移性腫瘍についても施行されることがある。原発性と転移性腫瘍の間のALKテスト結果に相違が報告されたが（Kim 2013年）、それは組織採取方法が原因であるとするにはデータが不十分である。原発腫瘍は内視鏡検査法（内部気管支あるいは経気管支鉗子による生検、低温生検、または穿刺吸引 [FNA] による）で、または経皮、経胸アプローチ（針生検あるいは FNA による）で検体採取を行うことがある。現在では胸腔内転移は EBUS （気管支内超音波検査）または EUS（経食道超音波検査）のガイダンスに基づいた検体採取が一般に行われているし、胸膜病変（の胸膜生検あるいは体腔液細胞診）はしばしば良い診断材料となる。胸腔外への遠隔転移症は場所に応じた適切な検体採取が可能である。いずれの場合も、複数の画像技術を使用して目標を定めて検体採取を行うことがよりよい腫瘍採取につながる（Rivera 2007年）。多くの医療施設では、画像ガイド下で十分な材料が採取されない場合、またはその方法が好ましく無い場合は外科手術が行われる。

ALKテスト用組織ALKテストには組織生検と細胞診検体のいずれも用いることができる。重要な点は材料が適切に処理されて取り扱われるべきこと、および検体が十分な腫瘍細胞を有することである（Thunnissen 2012b）。ALK蛋白質を IHC で検出するのに必要な腫瘍細胞の数は決め

検体採取、処理、および診断の手順執筆担当：Keith M。Kerr、Ignacio Wistuba、および　Yasushi Yatabe

第2章


られていないが、ALK遺伝子再構成を FISH で検出するには最低 50個の確認できる腫瘍細胞が必要である。細胞診塗抹標本に代わるいくつかの作成方法があるが、細胞診検体での最適な方法はセルブロックの作成であり、組織生検検体と同様に切片を作成し処理することができる。組織や細胞材料の全ては通常病理検査施設で受付され、処理されるべきものである。概して直径 3 cm以下の腫瘍検体は生検と同様に処理されるべきであるが、その他の外科切除検体いの処理は異なる。多量の胸水もまた一部のみ処理される場合がある。全ての診断作業が完了するまで胸水は保存しておくことが望まれる。

組織の処理10% の中性緩衝ホルマリン液による浸漬固定、または必要に応じて膨張固定が推奨される。ある種のアルコールベースの固定液による前処理は組織の抗原性あるいは DNA 断片化状態を変える可能性がある。骨の生検検体に使用される酸性脱灰液は IHC を阻害する可能性がありばかりでなく、FISHテストを損ない、 DNA を劣化させ、突然変異検査結果の信頼性を低下させる。酸性の固定液（例えばブアン液）また重金属塩類をベースとした固定液は避けるべきである。総じて、特にバイオマーカーを検査する際（DNAの断片化防ぐことが重要である）には固定時間は6時間以上、48時間以下が推奨される（Wolff 2007年、Hunt 2007年）。固定不足あるいは固定過剰は DNA および蛋白質の抗原エピトープに悪い影響をもたらす場合がある（Werner 2000年、Atkins 2004年、Oyama 2007年、Bussolati 2008年、Eberhard 2008年）。組織処理における重要点の1つは、患者から検体が切除された直後から保存液の中に移されるまでの時間である。多くの実験室は組織切除から固定液に浸漬するまでの時間と検査施設へ到着するまでの時間を記録する事ができず、またそのデータもないのが実情である。さらに、多くの自動組織処理装置は固定の工程があるため、固定時間が増加する。実際には、多くの検査施設はそれぞれの平均的な固定時間に見合うように IHC および ISH（in situ hybridization）に関連する染色工程を調節している。多くの外部機関から広範囲の異なる固定方法で処理された検体を受け取る大きい検査施設では、固定の性質と時間を見極めることが大きな問題となっている。

バイオマーカー検査用組織の取り扱い多くのバイオマーカー検査（IHC、ISH、または RNA/DNA の検査）は初回診断過程に行われる。この場合、バイオマーカー検査には新たに作成した切片を使用すべきである。ガラス上に保存された組織切片は数日あるいは数週間内に劣化してしまい、数ヶ月内には完全に劣化して使用することができなくなる。劣化の程度は貯蔵条件とバイオマーカーの種類によって左右される（Atkins 2004年）。未染切片上のALK蛋白質の安定性についてはまだ系統的な研究が行われていない。従って、乳癌の HER2 検査にならって、 6週間以上保存された組織切片スライドはALKの IHC 検査に使用すべきではない。貯蔵が必要な場合は、切片をワックスあるいは同等の素材で被覆して空気酸化を防ぎ、涼しく、乾燥した、暗い条件で保存すべきである。FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）ブロックは劣化し難いので、多くの場合必要に応じて再度切片を作成することができる。さまざまな試みにより、初回の形態検査、IHC 染色、およびその後の分子解析用にブロックから切片を作成する必要回数を減らすことができる。例えば、一回目の標本作製時に余分な切片を切って置く場合がある。そ

15第2章: 検体採取、処理、および診断の手順

のような方法は再度標本を作成するときにつきものの無駄を省くことができるが、一方で、不必要な標本作成が行われることや作成された切片の保存に関する問題もある。（図1）。

検体評価の第一歩は悪性腫瘍の有無を識別することである。患者、検体採取方法、および診断者の技量によるが、およそ腫瘍陽性の検出率は60～90% 以上に及ぶ（Schreiber 2003年）。検体に腫瘍が存在しても、それぞれの組織片全体に存在せず、提出された組織のごく一部分のみに存在する場合があることは広く知られている（Coghlin 2010年）。悪性腫瘍が確認されれば、次のステップは非上皮細胞悪性腫瘍（リンパ腫あるいは肉腫等）の可能性および/または癌、特に腺癌の場合、別の臓器からの肺転移であるという可能性を

図1。診断までの過程で行われる組織切片の調整法。現在、通常の方法では組織学的診断のため、切片作成とH&E （ヘマトキシリン-エオジン）染色を行う。IHC 検査および/または分子検査が必要の際には再度切片作成を行っている。何回も切片作成を行うことにより、切片作成毎に腫瘍の量が減る可能性がある。分子標的療法の時代では、予想される IHC の解析や分子検査のために追加未染切片を作成することで組織検体の無駄を減少させるとともに、所用時間を短縮することができる。

Common procedure to date

The procedure in era of molecularly targeted drugs

h & e staining for histologic diagnosis

for ihc

for molecular testing

h & e staining for histologic diagnosis

for ihc

for molecular testing

repeat sectioning

repeat sectioning


鑑別することである（Kerr 2013b）。このステップは多くの場合検体とともに提供される十分な臨床及びレントゲン画像情報と基本的なH&Eによる形態学的評価に基づいて容易に行う事ができる。しかし臨床情報が不足していると、胸腔外の腫瘍を鑑別するために不必要なIHC を施行し、その結果残りの検体が遺伝子検査にまわらなくなる可能性がある。腫瘍が原発肺癌だと仮定すると、次のステップは SCLC（小細胞肺癌）と他の組織型を区別することである。それは進行 SCLC と NSCLC が異なる方法で治療されるためである。この区別は通常形態学上の特徴に基づいて正しく診断することができる（Burnett 1994年）が、IHC が必要となる場合もある。SCLC 以外の多くの症例は扁平上皮細胞癌腫、腺癌または、まれに、他の NSCLC タイプとして形態学的に正確に、再現性をもって分類することができる。しかし 25～40% の症例では、検体のタイプと混合型の症例により、形態学上の特徴だけで正確な、再現性のある NSCLC のサブタイプに分類できない場合があるのも知っておかなければならない。そのような症例の初回診断は NSCLC-NOS（not otherwise specified）とすべきである（Chuang 1984年）。NSCLC のサブタイプを推測するために診断用の IHC を行うことが多い（Loo 2010年、Travis 2011年、Travis 2013年）。このアプローチは、限られた IHC パネルを使用して NSCLC-NOS の割合を 10% 以下に減らし、多くの NOS の NSCLC サブタイプを 80% 以上の精度で推定できる（Loo 2010年）。IHC 検査で腺癌と推定され、形態学的に分別できない症例は、IHC 検査方法を使用していることとともに、推奨されている診断用語（例えば、NSCLC、推定腺癌 [favor adenocarcinoma]）を用いて報告すべきである（Travis 2011年、Kerr 2013a）。

まとめ分子標的治療が可能な腫瘍をもつ患者の選択は、現在では標準的な手法となっている。初回の形態学的診断と必要に応じた IHC による腫瘍亜型の決定に加えて、遺伝子テストを施行するには、診断用腫瘍組織の採取、取り扱い、処理、およびよく考えた組織の使用が非常に重要となる。引き続いて行われる診断過程に利用可能な十分量の腫瘍組織が確保される様に最善を尽さねばならない。しかし、時として組織量が十分確保できない事態は避けられず、腫瘍の診断に続く遺伝子テストに大きな影響を及ぼしかねない。組織量が不十分なことにより、生検が繰り返し行われる例が増加している。

第 3 章

ブレークアパートプローブセットを用いた FISH は染色体間の転座によって形成された融合遺伝子を検出するために開発された方法である。ブレークアパート FISH は融合パートナーが不明であっても、FFPE 標本を用いて容易に検討できるため、外科病理での信頼できる診断方法ということができる。ALKテストのためのブレークアパートプローブを用いた FISH はリンパ腫および肉腫の診断に広く用いられており、NSCLC の一群にALK再構成が報告されてからは本法の適用が広がっている（Soda 2007）。しかし、肺癌の場合 FISH はこれまでとは異なった課題に直面している。それは主として、ALK（2p23.2）と近接している EML4（2p21）遺伝子の間に形成される染色体逆位による融合遺伝子が多く、他の遺伝子との染色体転座によって起る融合は非常にまれだからである。従って、ALK再構成を有する肺癌の診断に施行するブレークアパート FISH はその技術の詳細や結果の解釈に特別な注意が要求される。

FISH プローブのデザインALKブレークアパートプローブは通常 3ʼ（telomeric）側の融合切断ポイントを一種の蛍光色素で標識し、そして 5ʼ（centromeric）側を別な蛍光色素で標識して作成される。特定の遺伝子領域に対するプローブおよび標識用蛍光試薬には、市販およびカスタムプローブとしていくつかの種類がある。Abbott Molecular 社が開発したキット(図1、Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit）では、3ʼ 側 (約 300 kb）はオレンジ色のシグナル(Spectrum Orange,赤の波長の干渉フィルターを用いて検出されるため、文献ではしばしば赤と表現されている）で、そして5ʼ側（約 442 kb）は緑色のシグナル（Spectrum Green）で表現される。このプローブセットはALK阻害剤使用ためのコンパニオン診断法として米国のFDAによって承認され、世界的に広く使用されている。

FISH: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション担当著者：Akihiko Yoshida および Marileila Varella-Garcia

図1。肺癌におけるEML4-ALK融合遺伝子（ALK再構成）を検査するための Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular）。

2p23.2

300 kb 442 kb5'3'

ALK EML4

ALK:EML4

ALK:EML4

~12.5 Mb inversionEML4-ALK fusion

Normal


解析前の必要事項DNA 解析法として、FISH には代えがたい優れた利点がある。しかし、本解析法は多くの要因、特に標本を固定するタイミング、固定時間、固定液のタイプ、によって影響を受け、これらの全てが DNA の分解に繋がる可能性がある（表1）（Hunt 2007, Babic 2010）。例えば長時間低温下で乏血条件に置かれたり、組織の固定が組織の切除から１時間以上経て行われたりすることは DNA の断片化により、FISHテストの結果が得られない場合がある（Khoury 2012）。理想的な固定時間は 6 から 48時間の間と考えられている（Hunt 2007、 Babic 2010）。固定時間が短過ぎたり、長過ぎたりすると検査の性能に影響を及ぼすことが知られている。

最適な固定液は 10% の中性緩衝ホルマリン液であり、ブアン液はハイブリダイゼーションを妨げる。強酸性溶液で脱灰された組織はほとんど確実にハイブリダイゼーションを妨げる。 EDTA または蟻酸による軽度脱灰は通常検査性能に大きな問題を起こさない。脱灰操作は、骨に転移した病巣が分子解析に利用可能な唯一の検体である場合は特に注意せねばならない。そのような場合、骨の脱灰程度を H&E 染色組織の状態から推測できる。この状態を見ることで標本を FISHテストに堤出する否かを決定できることが多い。解析がうまくいくためのもう一つの要因は未染スライドの新しさと保存条件である。室温で長時間保存された未染スライド上の組織は、標準的な FISH 解析で満足できる結果を得る事はまれで、特別なプロトコールが必要である。従って、組織をブロック内に包埋しておくことは理想的な保存方法である。パラフィンブロックの許容保存時間は保存条件（例えば、温度、光への露出度、熱、湿気）によって左右され、DNA の分断化を起こす条件に置かれた材料はハイブリダイゼーションに失敗する可能性がある。ハイブリダイゼーション前後の多くの要素が検査に影響を与える可能性もある。ハイブリダイゼーション前処理はプローブの腫瘍細胞核への浸透を促進する一連の工程からなっている。この透過処理は大きい蛋白質を消化することによってなされるが、全ての標本が特定のプロトコールに同様に反応するとは限らない。ハイブリダイゼーション前処理に対し分化の悪い腫瘍はより影響を受けやすく、一方線維性および粘液性腫瘍はより影響を受

パラメータ推奨

固定までの時間 1 時間を超えないようにできるだけ短く

固定液 10% の中性緩衝ホルマリン液

固定時間 6-48 時間

切片パラフィン包埋セクション、5 ±1 μmの厚さに薄切する

標本の保存組織ブロック（理想としては)

ブロックのための保存時間適切条件下では考慮する必要がない

ブロックの保存条件光、熱および湿気を避ける

切片の保存時間 4-6週(理想としては）; 古いスライドには特別なプロトコールが必要

脱灰 EDTA、必要な場合のみ

表1。FISH 成功のための解析前の推奨事項

19第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

けにくい。ハイブリダイゼーション後の洗浄はシグナル強度を減少すること無く、非結合プローブを十分に除去するために行われる。多くの代替プロトコールが優れた結果を生む場合がある。従って、検査ラボは条件が標本の特性に合うように別のプロトコールを選ぶ事も考えられる。

ハイブリダイズした標本の品質評価と結果の判定可能な細胞の選択解析を進める上で組織の形態およびシグナル強度の質を厳格に査定することが必要である。形態がよく保たれ、バックグラウンドノイズが非常に低い、十分なシグナル強度を有する場合が解析に適切であると言える（図 2および 3）。クロマチンの過剰消化またはプローブの浸透性の低い標本は評価すべきでなく、トラブルシューティングをした後で再検査すべきである。例えば、組織の前処理が不十分または過剰な場合（図 4）、または切片作成技術が原因で細胞核上に紐状のシグナルが重複して赤と緑の分離測定が不可能な時は標本を評価すべきではない（図 5）。 ALK再構成が腫瘍内に均一に分布して見えることは、それが腫瘍化に重要な役割を担っていることを示す（Camidge 2010）。従って、形態または免疫染色結果に基づいて、腫瘍の一部を選択する必要は無く、複数の異なった腫瘍区域でのスコアリングが推奨される。スコアリングは 5'側と 3'側の各々のシグナルの図 2。ALK陰性の肺腫瘍のFISH像。

図 3。主に 3'-5' スプリットパターン（3A-3C）および隔離 3’パターン（3D、3E）を示すALK陽性の肺腫瘍のFISH像。

A B C

D

E

A

B C


コピーが少なくとも1つ存在し、適切に保存されたオーバーラップしていない腫瘍細胞についてのみ施行すべきである。肺癌はいろいろな増殖パターンを有する場合があり、また癌細胞が非癌組織成分（例えば肺胞マクロファージやリンパ球）と混在する場合が多いため、暗視野での癌細胞の正確な同定は難しい場合がある。適切な形態修正のためには、連続組織切片の H&E 染色スライドを常に参考にすることが勧められる。

細胞の分類: シグナルパターン概念的には 5'と 3'プローブに相同な遺伝子領域は分子が非常に近接しており、これらのシグナルは正常細胞に融合、接触、あるいは隣接して認められる。対照的に、EML4-ALK融合遺伝子が存在する場合、5' ALK緑信号は 3'ALK赤信号（約12.5 Mb）から分断され、

両シグナルが分離して検出される。実際には、3'と5'のシグナルはさまざまな程度の凝縮および染色体の三次元構造により、正常細胞においても分離して検出される場合と非常に近接してブレイクが検出される場合がある。同様に、EML4 とALKは近接しているため、シグナルの分離は非常に狭く、両シグナルがALK再構成内に融合して検出される場合もある（図6）。さらに、このゲノム領域は非常に不安定で、１つのプローブ領域が損失して、相応するシグナルが検出不能な場合がある。その結果、各腫瘍細胞は正常5'-3'ALK　シグナルおよび単一の5'または 3'ALKシグナルの種々な組み合わせを表示する可能性がある。これらシグナル特性には多様性が知られているが、それぞれの細胞は各シグナルの数および位置に基づいて次の4つのパターンの1つに分類される。

融合（正常）パターン（図 7A）。１つの細胞に 5'そして 3'のシグナルが融合して存在する場合、正常パターン（ALK陰性）と判定される（図2）。5'そして 3'のシグナルが分離していても、分離が 2 つのシグナルの直径以下の場合では融合シグナル（正常シグナル）と分

図 4。組織の消化過剰（4A）または消化不十分（4B）により解析が不適当な標本。

図 5。高いバックグラウンドノイズ（5A）および紐状シグナル（5B）により解析が不適当な標本。

A B

A B


類しなければならない。腫瘍細胞核当たりの 5'-3' の融合シグナル数はパターン分類において気にしなくてもよい。

スプリット（陽性）パターン（図 7B）。１つの細胞において、5'と 3'のシグナルが分離して存在しているとき、隔離シグナルの数にかかわらず、スプリットパターン（ALK陽性）と解釈される（図3）。5'と 3'のシグナルの分離の距離は、最も大きいグナルの直径の 2 倍以上でなければならない（Camidge 2010）。5'と 3'の分離シグナルの数が等しい必要はない。例えば、5'側のシグナルのコピー数が 2つで、そして 3'側のシグナルのコピー数が 3つの細胞はスプリットとして分類される。１細胞当たりの 5'-3'融合シグナル数はパターン分類に関与しない。

単一 3’（陽性）パターン（図 7C）。単一3'シグナルが、単一5'シグナル無しで検出された場合、細胞は単一3'パターンを有すると解釈される。１つの細胞で単一3'シグナルと単一5'シグナルの両方を有し、3'シグナルが 5’シグナルより多い場合、正しい分類はスプリットパターンで、単一3'ではない。シグナル融合数はパターン分類に関与しない。

隔離 5’（陰性）パターン（図7D）。単一5'シグナルが、単一3'シグナル無しで検出された場合、細胞は単一5'パターンを有すると解釈される（ALK陰性）。細胞が単一3'と単一5’シグナルの両方を有し、5'シグナルが 3'シグナルより多い場合、正しい分類はスプリットパターンで、単一 5’ではない。シグナル融合数はパターン分類に関係ない。

図 6。ブレークアパート FISH によるALK融合肺腫瘍細胞核のシグナルパターン。

Nonrearranged tumors:Rearrangement-positive cell rate<15% of cells

Rearranged tumors:Rearrangement-positive cell rate≥15% of cells

SIGNAL CLASSIFICATION

SPECIMEN CLASSIFICATION

Red and green separated by <2 signal diameters

Red and green separated by ≥2 signal diameters

Patterns observed in native ALK Patterns observed in split 3'-5' ALK

Classi�ed as positive

Classi�ed as negative

Red and green separated by ≥2 signal diametersClassi�ed as positive

Red and green separated by <2 signal diametersClassi�ed as negative

Patterns Examples

A.fused

B.split

C.isolated

3' ALK

D.isolated

5' ALK

図 7。FISH におけるALKシグナルパターンに基づく腫瘍細胞の分類。


注: スプリットパターンの判定規準は Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit を用いた FFPE 腫瘍切片のテストに基づいたもので、異なる解析試薬あるいは生体標本が使用される場合にはその評価規準の妥当性を確認する必要がある。プローブのサイズはプローブのデザインによって異なる場合があり、シグナルサイズの大きいプローブを使用する場合、より小さい分離距離がスプリットの定義に必要となる。

スコアリングスコア者が一人の場合は最低 50腫瘍細胞が、スコア者が二人の場合は最低 100 の腫瘍細胞が必要とされている（詳細については「カットオフ値」の項を参照）。評価可能な細胞数が少ない標本は FISH 解析に適さない（Camidge 2010）。各腫瘍細胞についてのシグナルパターンをスコアリングのワークシートに記録すべきである（図 8）。スコアリングは単一（赤と緑）および二重干渉フィルタを用いて組織を評価すると、より正確である。画像に基づいたスコアリングには限度があり、分離シグナルの誤った解釈を避けるためには、画像はすべての切片深度を代表するものでなければならない（図9）。正常ALK遺伝子のコピー数増加は NSCLC（図 10）ではよく認められ、蛋白質の過剰発現との関連性は示されていない。現時点では、ALKのコピー数をルーチンにスコアリングすることは推奨されていない。

注: 撮影画像のシグナルサイズは実際の蛍光顕微鏡検査で検出されるよりもわずかに大きい傾向がある。撮影画像に基づくスコアリングは、シグナル間の距離が過小評価され、解析結果を損なう場合がある。画像に基づくスコアリングのもう一つの落とし穴は、撮影画像はしばしば一平面上に複数の焦点レベルを統合することにより、組織平面の z 軸に沿う縦分裂シグナルが融合シグナルと見誤られる可能性がある。

図 8。細胞スコアリング用ワークシートの例。

Summary of Scoring:total # of cells scored: 50total # of cells with fused pattern: 19total # of cells with split pattern: 22total # of cells with isolated 3' pattern: 5total # of cells with isolated 5' pattern: 4total # of cells with rearrangement-positive patterns: 22+5=27rearrangement-positive cell rate: 27÷50 x100=54%

Cell Fusedsignal

5'signal

3’signal Pattern

cell 1 2 0 0 fused

cell 2 2 1 1 split

cell 3 2 0 1 isolated 3'

cell 4 1 1 0 isolated 5'

cell 5 0 1 2 split

cell 6 1 0 0 fused

cell 50 2 0 0 fused

図 9。画像に基づいた解析は z 軸に沿う重層（一平面上への複数焦点レベルの統合）が切片の全深度を代表しない場合は困難である。

A Bno z-stacking16 planes at 0.4 µm= 6.4 µm z-stacking


標本の分類: 再構成陽性の細胞の比率ALK再構成陽性の細胞の比率は以下の様に定義される:再構成陽性細胞率（%）= [（スプリットパターンを有する細胞数 + 単一3'パターンを有する細胞数）/評価細胞総数] × 100

注:ALKチロシンキナーゼのキナーゼドーメインは遺伝子の 3'側にコードされているため、腫瘍病理学上妥当な融合遺伝子は単一3'シグナルであり、単一5'シグナルは非機能的な相互融合産物を代表する可能性が高い。従って、単一3'パターンを有する細胞は,スプリットパターンの認められる細胞と共に再構成陽性細胞として分類される。単一 5'パターンを有する細胞は再構成陽性細胞として解釈してはいけない。単一3'パターンを無視して再構成の定義をスプリットパターンのみに限ると、ALK FISH の感受性が 60～70% に減少する（Yoshida 2011a, Paik 2011）。

カットオフ値EML4-ALK融合遺伝子は近接する二つの遺伝子の小さな染色体内逆位によって形成されるため、ブレークアパート FISH で解析するとALK再構成を示す分離したシグナル間の距離は、（他の転座シグナルに比べて）通常は狭くなる。細胞内の染色体凝縮とその分布の度合いにより、狭い分離は時に融合シグナルとの識別が技術的に難しく（図 6）、そのためALK-再構成 NSCLC に置ける再構成陽性細胞の比率低下（40～70%）を引き起こす（Perner 2008, Camidge 2010, Camidge 2012b）。さらに、ALK再構成をもたない NSCLC の一部の細胞に再構成陽性パターン（すなわち、スプリットパターンあるいは単一3'パターン）が認められることがある（Perner 2008, Camidge 2010, Yoshida 2011a）。これはおそらく切片化の際のアーティファクトあるいは確率的に起こるゲノム変化によるもので特定の融合遺伝子を示唆するものではない（図 6）。その結果、NSCLC における再構成陽性細胞率の分布は連続的であり、ALK再構成陽性とALK野生型 NSCLC の相違は統計的な問題となっている。従って、注意深い定量的な評価が、最適な検査を施工するためには必須となる。15% というカットオフ値はALK再構成（ALK陽性）とALK野生型（ALK陰性）NSCLC を最もよく分別するために設定されたものである（Camidge 2010, Kwak 2010, Yoshida 2011a）。

図 10。正常ALK遺伝子のコピー数は肺癌標本ではしばしば増加し、低（10A）から高（10C）までのレベルにおよぶことがある。クラスター状のコピー数増加は遺伝子増幅（10D、10E）を示唆する。コピー数の増加を陽性と解釈すべきではない。

A B C

D

E


技術的な偏りを最小にするため、二人の独立したスコア者による二段階評価が推奨されている（図11）。最初のスコア者は 50個の腫瘍細胞をスコアする。再構成陽性細胞の比率が 10% 未満（すなわち、再構成を有する細胞数が 50個の細胞中 5 未満）の場合は陰性と判定される。50% を超える（すなわち 50個の細胞中 25 より多い）場合は陽性と判定される。そして10～50%（すなわち、50細胞中 5 から 25）の場合は不確定で、追加スコアリングの実施を考慮すべきである。その場合、第二番目の異なるスコア者が別に50個の腫瘍細胞をスコアし、再構成陽性細胞の最終的な比率は第一及び第二スコアの合計を基に計算する。最終的な陽性率が 15% あるいはそれを超える場合、標本はALK遺伝子再構成陽性として解釈される。比率が 15% より低い場合は、標本はALK遺伝子再構成陰性として解釈される。

注: 15% のカットオフ値は主に Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit（Abbott Molecular）を用いて行う検査に基づいているため、異なる試薬を用いる場合は有効性確認試験が必要である。

検査施設の有効性確認試験ALK FISH 解析を臨床的な目的で使用する前に、検査施設で適切な有効性確認試験を施行する必要がある（Halling 2012、Saxe 2012）。検査精度[正常（ALKの陰性）と異常（ALKの陽性）の判別率]を、他の検査施設で適切に実施された検査の精度と比較するか、同一検査施設で以前に確認された検査精度と比較すべきである。検査の正確さあるいは再現性は、同一標本について異なる技術者や異なる時点で施行された解析間の一致の度合いに基づいて決定されるべきである。また解析方法全体についての確認も必要である。精度および正確さの確認は定期的に繰り返して実施されるべきである。さらに、解析の感受性と特異性はすでにわかっている遺伝子型の標本を用いて確認されるべきである。ALK野生型 NSCLC および良性組織は、真の陽性スプリットシグナルの間隔（シグナル直径の少なくとも 2倍の間隔）との違いを知るのに用いられるべきである。これらの作業は、市販されている試薬を用いる場合は簡単であるが、研究室で開発された試薬を用いる場合は、高いレベルの詳細なデータが必要である。

課題ALKブレークアパート FISH は 4 つの主たる課題を抱えている: 偽陰性と偽陽性、非定型FISHシグナル、ボーダーラインの再構成陽性細胞比、そして反復テストの必要性である。

図 11。ALK FISH スコアリングの推奨アルゴリズム。

1st reader-50 tumor cells

10%-50% Positive

Equivocal

2nd reader-50 tumor cells

1st + 2nd readers-100 tumor cells

<10% Positive>50% Positive

<15% Positive≥15% Positive

Specimen is positive for ALK rearrangement

Specimen is negative for ALK rearrangement


偽陰性と偽陽性ブレークアパート FISH はALK陽性肺癌を診断する標準法として使用されて来たが、テストの真の感受性および特異性の評価については決着がついていない。FISH と他の手段との不一致の多くは技術的な理由によるものである。しかし、 FISHにおいても、真の偽陽性または偽陰性の結果を生じる可能性があるため、疾病管理に重大な影響を及ぼしかねない。偽陽性の結果は, RT-PCR および IHC 検査に感受性の限界が認められているため、とくに証明が難しい。にもかかわらず、ALK阻害剤による治療効果予測において、単独のFISH検査結果は、FISH、IHC、および RT-PCRを組み合わせた結果よりも劣るという報告もある。また臨床的な不一致症例にはFISHによる真の偽陽性結果はまれにしか含まれていない可能性がある（Chihara 2011）。ゲノム全体の次世代シークエンス解析のような新技術が FISHの偽陽性結果の存在を証明する可能性がある。これに対して、いくつかの FISH の偽陰性結果は文献で十分に裏付けられている（Yoshida 2011a, Murakami 2012, Peled 2012）. このような場合、非定型の FISH シグナルパターンが認められる場合と認められない場合とがある。FISH の偽陰性結果を引き起こすゲノムメカニズムは明らかでないものの、複雑な遺伝子再構成および未知の遺伝子挿入（cryptic insertions）が要因と成っていることも考えられる。

非定型シグナルの特徴FISHテストは、まれに（およそ 6%、[Camidge 2013]）、再現性がありかつ十分認識可能なシグナルを示す非定型シグナルパターンを示すことがある。このようなパターンの少なくともいくつかは偽陰性とされている。その 1例は、腫瘍細胞の多くが優勢な単一5'パターンを有し、少数の細胞のみが分離あるいは単一3'パターンを示す場合である（「5'優勢パターン」、図12）。従来の分類規則では、単一5'パターンはALK陰性として分類されるべきで、これらの症例はALK再構成陰性として見落とされがちである。それにもかかわらず、このシグナルパターンを有する症例は EML4-ALK融合転写産物を保有することが RT-PCR によって確認されている（Yoshida 2011a）。もう一つの非定型 FISH シグナルはいわゆる赤のダブレット（red doublet）パターンで、2つの 3'シグナルと 5'シグナルが融合したものである（図 13A）（Peled 2012）。赤のダブレットパターンを有するALK陽性 NSCLC は,そのような集合シグナルが従来の融合シグナルに類似するためにALK再構成陰性として誤って評価されることがある。時々、3つ以上の 3'シグナルが集合し、一つの 5' シグナ

図 12。ブレークアパート FISH で単一 5' 優勢を示す肺癌の非定型パターン。矢印は単一の緑信号（5'ALK）を示す。

A B


ルと融合する場合もある（コピー数に従って、赤のトリプレットパターンなどと呼ばれる; 図 13B、13C）。他のまれな例としては、ALK陽性 NSCLC の腫瘍細胞の多くが正常なシグナルを示さず、単一3'シグナルのみを有する場合がある（図 13D）。そのようなパターンを示す細胞は従来のスコアリング規則により 5' プローブのハイブリダイズ失敗の可能性があるため評価不能とみなされ、そのようなパターンを示すALK陽性の癌は見落される可能性がある。このような非定型シグナルパターンが常に融合状態を示唆しているかは明確ではないが、これらのパターンは少なくとも疑問視する必要があり、他の診断方法（例えば、RT-PCR、IHC）による速やかな検査を施行すべきである。将来の研究が FISH 偽陰性となる他の非定型シグナルを見出す可能性もある。

再構成陽性細胞の比率のボーダーラインNSCLC 症例のおよそ 8% は、再構成陽性細胞の割合が 10～20% の範囲にある（Camidge 2013）。現在受け入れられている 15% のカットオフは、ALK再構成の陽性と陰性を機械的に分類するものの、FISHテストでボーダーラインにある再構成シグナルが正確に融合遺伝子の存在を示しているか否かについて、我々の経験は限られている。そのような標本では、腫瘍と非腫瘍細胞間の形態学上の区別に特別な注意を払った上で、再度数え直すことを推奨する。非腫瘍細胞を含んで細胞数を数えることは再構成陽性細胞の比率を減少させる。推奨されている二段階アルゴリズムはこれらの技術的な間違いを最小限に留めるようにしたものである。組織の平面で z 軸上の縦に分裂したシグナルは、融合シグナルとして誤解される可能性があるため、同様に注意を払う必要がある。特に評価がデジタル撮影画像上で行われる検査施設では、一つの画像に複数の焦点レベルを統合するため（z軸への重層）、注意が必要である。これらのボーダーライン症例は、前述したように、非定型シグナルによる場合もある。特に、赤のダブレットパターンは再構成陽性細胞の比率がボーダーラインにある症例で頻度が高い傾向にある。単一色フィルターを使用した解析は、二色（赤および緑）または三色（青、赤、および緑）フィルターの使用で見落されることもある重なったシグナルの識別を可能にする場合がある。注意深い再検査の後でも再構成陽性細胞の比率がボーダーラインにある場合は、最終的な解釈は 15% のカットオフに基づいた陽性あるいは陰性であるが、他の診断方法、例えば IHCまたは RT-PCR、による更なる検討を考慮するようにとの注記を付すべきである。

図 13。ブレークアパート FISHテストによる肺腫瘍に認められる非定型パターン。13A: 3'-5-3'（赤のダブレットパターン）、 13B および 13C: 3'-3'-5'-3' （赤のトリプレットパターン）。 13D: 単一 3' シグナル（正常ALKシグナルが多く認められない）。矢印はALK再構成を示す。

A

B

C D


最検査の必要性少数の研究結果報告によれば、臨床経過に伴うALKのコピー数増加が見られる。特にALK阻害剤による治療の後で変化することが示唆されている（Doebele 2012）。その頻度やメカニズムはまだ明確ではないが、腫瘍がALK阻害剤による治療に抵抗性を獲得し、新規治療方法を選ぶ際には、最検査が考慮されるべきである。しかし、データは確定的ではなく、さらなる検討および確認が必要である。

色素インシチューハイブリダイゼーション（CISH）FISH には次の様な限界がある。特別な装置を必要とし、保存期間にしたがってシグナルが減衰し、また暗視野検査のために組織の構造と細胞形態学的特徴を捉えにくい。肺癌は非腫瘍細胞と複雑に混在し、複雑な増殖パターンを示すので、後者の要因は特に問題となる。細胞構造あるいは細胞質などの情報なしで非腫瘍細胞成分から腫瘍細胞を区別することは困難な場合がある。CISH はこれらの FISH の不利な点を克服するために開発された。CISH では、各ハイブリダイゼーションプローブを螢光色素よりもむしろ発色色素によって視覚化する（図 14）。CISH では腫瘍の構造および細胞形態学を維持しながら、ルーチンの明視野顕微鏡の下で特定の遺伝子の変化を検出できる。ALKブレークアパート CISH の肺癌診断における実用性についてはすでに報告があり、すべての研究は FISH および／あるいは RT-PCR の結果と優れた一致を実証している（Kim 2011, Yoshida 2011a, Nitta 2013, Schildhaus 2013）。異なったカットオフ（15% および 20%）およびスコアリング規準（1 直径間隔および 2 直径間隔）が少数の研究で発表されているが、CISH を肺癌のALK再構成検出に使用するには検証が必要である。

まとめブレークアパート FISH はALK再構成 NSCLC 診断のために信頼にたる技術であり、ALK阻害剤による治療に適切な患者を選択する標準的指標として受け入れられている。しかし、FISH

target dna

Probe

secondaryantibodyPrimary

antibody

enzyme

substratechromogenicreaction

図 14。CISH の原理。左。個々のプローブは異なるハプテンを用いて標識され IHC に類似した抗体反応によって視覚化される。ALK陽性腫瘍に適用されたALKブレークアパート CISH を示す（右）。黒い点は正常なALK遺伝子を示し、そして再構成したALK遺伝子は分離した単一の赤あるいは青シグナルとして可視化される。


テストはガイドラインに厳密に従った注意深い操作と解釈に大きく依存している。さらに、 FISH はまれに不確実かつ誤った結果を生む可能性がある。他の臨床検査と同様に、ALKブレークアパート FISH は独特な特徴と限度を有するため、適切な診断条件の下で使用されるべきである。この方法がルーチン検査として導入される前に各検査施設が既知のコントロール材料を使用して内部確認試験を行うことが強く推奨される。さらに、検査施設は他の公認された臨床検査施設との定期的なスライド交換プログラム、または販売会社が提供する熟達度調査に参加するべきである。

第 4 章

スクリーニングツールとしてのALK IHC分子標的療法を実施するにあたり、標的となる遺伝子変化の検出は、検証された検査方法に大きく依存している。特に遺伝子変化が患者の一部にのみ認められる場合は特にその傾向が強い。ALK IHC は明視野検査を用いる方法で、迅速でかつ比較的安価なスクリーニング方法として期待されている。組織の構造および腫瘍細胞の組織評価が可能であるという理由で、多くの病理医に好まれる方法である。IHC は FISH に必要とされるより少数の悪性細胞を用いて結果を判定できることもある。IHC はさまざまな腫瘍標本を用いて良い結果を得る事ができる。少数の腫瘍細胞の集塊が標本に存在しさえすれば FFPE　組織ブロック、液状検体、および FNA の細胞診セルブロック、あるいは塗抹標本による検査が可能である。ALK再構成を有するNSCLC のような頻度の低い腫瘍には、経済的なスクリーニング法に対する期待が高まっている（Soda 2007, Koivunen 2008, Perner 2008, Takeuchi 2008, Palmer 2009）。

ALK IHC の課題ALK IHC をスクリーニング法として標準化し、評価規準を確立することは重要である。ALK陽性肺癌の腫瘍細胞は通常ALKキメラ遺伝子の産物である蛋白質を発現する（図 1 および 2）。細胞内のALKチロシンキナーゼ領域と、N末端がさまざまに短縮したパートナー遺伝子との融合により産生される蛋白質がALKキナーゼを恒常的に活性化する（Morris 1994, Allouche 2007）。しかし、NSCLC におけるALK融

IHC: 免疫組織化学執筆担当者：Erik Thunnissen, Sylvie Lantuéjoul, Jin-Haeng Chung, Keith Kerr,

Fred R. Hirsch, Ming Sound Tsao, および Yasushi Yatabe

図 1。ALK強陽性の腺癌。A および B: H&E 染色したスライド、概観（A）および x10 拡大のスライド（B）。B の挿入図は x40 拡大。印環細胞は見られない。C および D: 5A4 抗体を用いたALK IHC でALK遺伝子産物は細胞質に強陽性を示している（拡大率、C: x20、D: x40）。

A B

C D


合蛋白の発現量は低いため , 未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）の診断に用いられているALK1 抗体でこの蛋白質の検出をするのは難しい（Mino-Kenudson 2010）。この問題を克服するために、抗原賦活化、高親和性一次抗体の高濃度での使用、シグナル増強法（たとえばチラミドカスケードや抗体-強化ポリマーによる増幅を使用）、および新抗体の開発を含む数々の技術的な試みがなされてきた（表 1）。

肺癌標本のALK IHC 検査のもう一つの重要点は、免疫染色での内部陽性コントロールを欠いていることである。そのため IHC 陰性結果はALKの融合蛋白質の表現が真に陰性であるか否かの判断が困難である。しかしながら、正常な肺組織ではALK発現は見られないので、肺癌細胞でのびまん性ALK蛋白質発現は、異常なALK融合蛋白質の表現と常に関連している（Takamochi 2013, Takeuchi 2013）。ALK再構成を有する細胞株（H3122 バリアント 1 および H2228 バリアント 3）を包埋した FFPE セルブロックは、最適な染色条件を得るコントロールとなり得るが、組織切片と細胞株ブロックの違いは、特にALK IHC のエピトープ濃度が低い場合は、注意しなければならない（図 3）。

固定および切片作成ALK IHC のための解析前工程は他の IHC 方法と同じである。由来にかかわらず、診断生検組織あるいは外科標本は十分量（標本の容積の 10倍以上）の 10% の中性緩衝ホルマリン液

表 1。IHC でALK蛋白質の表現を検出するための市販抗体

クローンクローンのタイプアイソタイプ免疫原

ALK1 マウスモノクローナル

IgG3, kappa 全長ヒトALK蛋白質のアミノ酸番号 1359-1460、キメラ NPM-ALKタンパク質のアミノ酸番号 419-520 に相当

5A4 マウスモノクローナル IgG1 NPM-ALK転写物(アミノ酸番号 419-520)の C 末端

D5F3 ウサギモノクローナル入手不可能ヒトALKの C 末端

抗-ALK ウサギモノクローナル

IgG ヒトALKのアミノ酸番号 426-528 のリコンビナント蛋白質

図 2。ALK強陽性の腺癌。A: H&E 染色したスライド。B: D5F3 抗体とチラミド増幅を用いたALK IHCはALK遺伝子産物が細胞質に強陽性を示している（拡大率、x40）。

A B

31 第 4 章: 免疫組織化学

ですぐに固定し、パラフィンで包埋すべきである（FFPE）。血流を遮断したあとの虚血の影響（cold ischemia effects）を避けるために、固定はできるだけ早く行うべきである。6 時間以下の固定時間は、IHC および通常の染色に悪影響を及ぼす可能性があるため推奨されない。IHCのための抗原の保存性に関してはエピトープ依存性があり、あるエピトープは 120 時間に及ぶ固定時間でも妨害を受けないこともある。具体的には、6 から 48 時間の固定時間がすべての標本に推奨される。パラフィン包埋の後では腫瘍組織は酸化や他の変性効果に対しても安定している。しかし、FFPEブロックから3 から4-μmの厚さのスライドとしていったん薄切されると、顕微鏡用ガラススライド上に載せられた切片の室温における保存期間は最大 6週に限られる。低温で保存すれば、スライドはより長時間保たれる。しかし、6 週以上前に調整された組織切片のスライドは、偽陰性の結果を示すこともあるので注意深く解釈すべきである。

免疫染色解析方法、例えば実際のALK IHC の検査、には、エピトープ賦活化法、抗体のタイプおよび濃度、インキュベーション時間、インキュベーション温度、および増幅などをよく管理・最適化する必要がある。対象となるような標準IHC検査法は NSCLC におけるALK IHCでは、確立されていない。代りに、抗体のクローンあるいは免疫源、抗原賦活化法と抗体検出法および増幅技術は多くの知見が蓄積されている（表 2）。異なった抗体を直接比較すると、ADVANCE system（DAKO、日本ではEnvision FLEX+）を使った D5F3（Cell Signaling Technology）と 5A4（Novocastra）は、感受性と特異性においてALK1 抗体（Dako）より優れていた（図4）（Conklin 2013）。（さまざまなプラットホームについての議論は第 6 章を参照。）市販ALK IHC キットが現在開発および評価中である。種々のシグナル増幅法の使用により、ALK融合蛋白質を検出するための感受性は高くなってきている（図 5）（Rodig 2009, Sakairi 2010, McLeer-Florin 2012）。市販 IHC キットを使用した IHC の自動化に伴い、標準化が行われる可能性がある。自動染色装置を用

図 3。IHC における低（青い円）および高（赤い三角形）シグナル増幅システムの効果。低エピトープ濃度が高シグナル増幅システムを用いると陽性になるが（細い矢印）、低シグナル増幅システムでは陰性になる場合があることに留意すべきである。さらに、高強度ではプラトーに達した場合、一旦陽性となれば、より高濃度のエピトープはそれ以上濃く染色されない。リンパ腫（太い矢印）のエピトープ濃度は、NSCLC （細い矢印）より高く、IHCは低シグナル増幅システムで十分である。NSCLC（細い矢印）では、高濃度の高親和性の抗体と高増幅が必要である。エピトープ濃度は対数目盛で、そしてシグナル強度は線形目盛で示されている（A.U.= 任意単位）。出典: Prinsen CF, Klaassen CH, Thunnissen FB. Microarray as a model for quantita-tive visualization chemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003; 11: 168-173。

801010

20

10

inte

nsity

(a.u

.)

epitope concentration


表 2。いくつかの発表された研究に記載されている市販ALK抗体を使用した免疫染色の条件（市販キットは使用せず）

研究抗体抗原賦活化法希釈インキュベーシ

ョン検出システム

Yi et al., 2011 ALK1 EDTA、pH 8.0、PT Link 内に30分

1:100 室温 30分 ADVANCE

Mino-Kenudson et al., 2010

ALK1 EDTA、pH 8.0、圧力鍋

1:2 オーバーナ

イト EnVision+ D5F3 1:100

Minca et al., 2013a

D5F3 熱調整BenchMark XT

1:100 特定無し OptiView

Martinez et al., 2013

D5F3 標準BenchMark XT

1:50 37°C 16分 ultraView

Paik et al., 2011 5A4 CC1 溶液、100°C、20分

1:30 42°C 2 時間 iVIEW

Hofman et al., 2011

5A4 標的レトリーバル溶液、pH 9.0、97°C、40分

1:50 室温 30分 EnVision FLEX

McLeer-Florin et al., 2012

5a4 EDTA 含有 CC1 溶液、pH 8.4、1 時間

1:50 37°C 2 時間増幅キット

Kim et al., 2011 5A4 CC1 溶液、100°C、20分

1:30 42°C 2 時間 iVIEW

Sholl et al., 2013 5A4 クエン酸緩衝液、pH 6.0、

圧力鍋中、122°C、30-45分

1:50 室温 40分 EnVision FLEX+

Wong et al., 2009 Anti-ALK クエン酸緩衝液、pH 6.0、

電子レンジ中、95°C、30分

1:1000 4°C オーバーナイト

ストレプトアビジン-ビオチニル化

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

複合体Chen et al., 2012 Anti-ALK CC1 溶液、95°C、30分 1:500 室温オーバー

ナイトultraView

Clone ALK1 Clone D5F3図 4。ALK1 と D5F3 抗体を用いたALK IHCは同一組織の切片上できわめて異なる陽性強度を示す。

抗体:ALK1 は Dako の製品; D5F3 は Cell Signaling Technology の製品; 5A4 は Paik et al., Kim et al., および Sholl et al. による研究では Novocastra の製品が使用され、Hofman et al. および McLeer-Florin et al による研究では Abcam の製品が使用された。 ; 抗-ALKは Invitrogen、Life Technologies Corporation の製品。抗原賦活化: PT Link および Target Retrieval Solution は Dako の製品であり、BenchMark XT は Ventana Medical Systems、Inc.の製品である。検出システム: ADVANCE, EnVision+, および EnVision FLEX+ は Dako の製品; OptiView （DAB Kit）, ultraView （DAB Kit）, iVIEW （DAB Kit）は Ventana Medical Systems、Inc.の製品。


いた標準化は、時には高濃度の一次抗体を必要とするが、安定した染色結果をもたらす。最近、新しいハプテン（3-ヒドロキシ-2-キノキサリン; HQ）とチラミド増幅を組み合わせた高感度の検出方法が開発された（Nitta 2013）。この HQ-チラミド IHC の検出システムによって、強度の変化に関わらず、すべての腫瘍細胞が陽性となったことで、別の方法での不均一な染色パターンは検出限界が原因であることを示唆している。さらに、この仮説は、明視野ブレークアパート ISH と高感度 IHC を組み合わせた遺伝子-蛋白質アッセイによって確認された。

染色の評価解析工程は染色スライドの顕微鏡検査から始まる。NSCLC ではALK染色は細胞質内に認められる。顆粒状の陽性像を示し、時には膜の強調像として認められる場合がある。染色強度の評価は主観的なものであるが、最初に HER2 検査に用いられた様に、固有の空間的分解能をもつ顕微鏡の対物レンズを使用することで、染色強度を評価する一助となる（Ruschoff 2012）。このアプローチにより発現強度のスコアリングに再現性をもたらすことができる。強い染色（3+）は x2 または x4 の顕微鏡の対物レンズを使用して明瞭に観察できる程度、中等度の染色（2+）を明瞭に認識するには x10 または x20 対物レンズが必要となる。そして弱い染色（1+）は x40 対物レンズによってのみ観察することができる。昔から使われているH-スコアは染色陽性を示す腫瘍の比率に、強度（0、 1、2、あるいは 3）を乗じた値であり、結果は 0 から 300 の範囲にわたる。このアプローチは染色の不均一性を示すのに優れている。 IHC のALK陽性およびALK陰性の判定にそれぞれの研究で異なる基準が適用されている。ある著者は 1+ か 2+ かの閾値が曖昧なままで、強度を 1+ から 3+ のスコアで記録している（図6）。このようなスコアリングのアプローチは使用された増幅システ

図 5。通常のポリマー法、およびリンカーポリマー方法の模式図。

Regular Polymer Method Linker-Polymer Method

!"#$%"&'%()*+,&'

Primary antibody

antigens

Polymer with secondary antibodies

linker

01+

2+3+

図 6。ALK IHC のスコア 0 から 3+ までの例。


ムおよび, ある種の抗体に認められたバックグラウンドに関連があると思われる（Mino-Kenudson 2010、Conklin 2013）。別の著者はALK陽性を、強度を問わず、腫瘍細胞の 10% 以上が陽性である場合と定義する簡単な評価法を採用している（Rodig 2009、Mino-Kenudson 2010、McLeerFlorin 2012、Martinez 2013、Sholl 2013）。最近 Takeuchi は、5A4 抗体および抗体増強ポリマーの挿入（iAEP）方法を用いた IHC で検査された 300 以上のALK-再構成肺癌で、ほとんどすべての癌細胞が染色されたことを報告した（Takeuchi 2013）。この染色の均一性はALK遺伝子再構成肺癌では、全ての腫瘍細胞がALK-遺伝子再構成を有することを示唆している。IHC 結果の偽陽性に関するより多くのデータが利用可能になるまで、ALK IHC の高処理スクリーニングに関しては、病理医は標準となっているFISH を用いた陽性シグナルで確認すべきである。しかしながら、IHC で陽性で、かつ FISH に陰性（厳しく定義された規準に従って）を示す腫瘍をもつ患者で crizotinib 療法に良い反応を示す例が次々と報告されている（Peled 2012）。もう一つ考慮すべき点は、異なる検査施設および病理医間のALK IHC の結果の再現性である。本項執筆時に、2 つの IHC プロトコールが検証されていた。ひとつは、VentanaALK IHC kit（Ventana Medical Systems、Inc.）を使用して、7人の国際的な病理医間の再現性が検討された。Ventana で定義された標準方法での陽性・陰性の区分で、観察者間の再現性は陽性および陰性結果に対し、それぞれ 95% および 97% であった（Hirsch 2013）。もう一方では、5A4 抗体（Novocastra）を使用した European Thoracic Oncology Platform（ETOP）プロトコールで、12 の検査施設が手動あるいは自動化された方法を用いて、一定の方法で同じ腫瘍を染色した（Thunnissen 2012c）。（標準化の詳細情報については第 9 章を参照。）

ALK IHC の実用的な施行病理医はさまざまなアーティファクトが偽陽性の染色をもたらす可能性があることを熟知する必要がある: 肺胞マクロファージの軽度の胞体内ドット状反応（図 7）、神経起源の細胞（神経および神経節の細胞）、腺上皮の染色、細胞外の粘液、および壊死性腫瘍領域。バックグラウンド染色は正常な肺実質内ではほとんど観察されないが、いくつかの染色における注意点が知られている（表 3）。

A B

C D

図 7。D5F3 抗体を用いた IHC の非特異染色。A:ALK陰性腫瘍の境界部にみられる肺胞マクロファージ。B: NSCLC を示す肺結節から穿刺吸引で採取された細胞診セルブロック。肺胞マクロファージの軽度の胞体内ドット状反応はアーティファクトで、偽陽性と解釈される可能性がある。ドット状陽性像のある腺癌のセルブロック（C）および生検組織（D）。 FISHテストでALK再構成が陰性であった。


状況によってALK再構成なしにALK蛋白質の発現が上昇する場合があり、その場合 IHC の結果は陽性で、ALK FISH は陰性（あるいは非定型の）パターンを示すことがある（図 8）（第 3 章を参照）。また、遺伝子が増幅しているにもかかわらずALK蛋白質発現が認められないことも報告されている（Pelosi 2012、Salido 2011）。例えば、Pelosi et al. は肉腫様がんのサブセットにALK遺伝子の増幅を認めたものの、ALK蛋白質の発現は 2 つの異なる抗体を使用しても検出されなかったことを報告している。蛋白発現を伴うALK遺伝子のコピー数増加の臨床的意義はさらに明確にされる必要がある（Salido 2011, Kim 2013）。組織学的に、印環細胞のような粘液含有細胞のALKの免疫反応性には注意深い解釈が要求される。ALK IHCの薄い膜様の陽性パターンは胞体内粘液空胞（図 9）によって覆われ、印環細胞内の陽性パターンが検出しにくい場合がある（Rodig 2009, Yoshida 2011b, Popat 2012）。ある研究者は FISH陰性癌で、細胞膜が染色されることに注目した（Murakami 2012、 Mino-Kenudson [個人通信]）。この知見は癌細胞に特有ではなく、ある種の非腫瘍細胞、例えば反応性の II 型肺上皮でも認められている。さらに、ある種の神経内分泌の癌腫もまた陽性反応と関連している（Murakami 2012、 Nakamura 2013）。

図 8。 FISHテストで認められる非定型パターン（拡散単一緑シグナル：右）をもつALK蛋白質陽性例（左）。

表 3。IHC の結果解釈で注意すべき点

粘液産生細胞細胞質は、ALK蛋白質が存在しない細胞内の粘液で覆い隠され、染色陰性の結果をもたらすか、またはわずかに膜様に染色され、偽陰性と解釈される。

膜様染色特に管腔に面した先端部分で顕著な、非特異的な染色が時折見られる。この知見は腫瘍細胞に特定ではなく、正常な肺細胞でも認められる。

神経内分泌細胞

ある種の扁平上皮細胞癌、大細胞神経内分泌癌、および正常な神経節細胞は陽性反応を示す

非特異的な粘液染色

使用される増幅システムによっては、ある種のバックグラウンドが細胞外の粘液や肺胞マクロファージおよび気管支上皮細胞の胞体で認められる。

A B

図 9。形態および染色の多様性を有する腫瘍。H&E 染色は（A）印環細胞が多くある領域、および（B）少数の印環細胞を伴う充実性領域を示している。ALK 5A4免疫染色で小さな胞体辺縁に弱い発現（+1、 C）、強陽性（+2/+3、D）を示す（拡大率、x40）。

A B

C D


ある種の腫瘍、特に外科標本では、陽性像が不均一に認められる場合がある（図 10）。しかし、解析前の条件が十分に管理されていれば、大部分の腫瘍細胞は、FISH 解析に認められるALK遺伝子再構成の均一な分布と同様に均一に染色される。不均一性は固定の不均一性と関連があり、組織学的パターンの違いとは関連していないことが多い。生検標本では固定の遅れに対するALK蛋白質の感受性は問題ではないが、保存標本でALKのスクリーニングのために組織マイクロアレイを使用する場合は、これが問題となることもある。核周囲のドット状パターンは KIF5B-ALK再構成には典型的なものとして報告されているが、さらなる確認が必要である（図 11）（Takeuchi 2009）。

図 11。 KIF5B-ALK- 陽性腺癌の IHC における異常な陽性反応。ゴルジ野を強調したような強染色パターンを示す（A: H&E 染色, B:ALK染色）、および核周囲のハローパターン（C: H&E 染色, D:ALK染色）。バー = 100 μm。Takeuchi K, et al. Clin Cancer Res. 2009;15: 3143-3149. から転載。

図 10。ALK陽性腫瘍の不均一な陽性染色の例。左パネルのボックスは右の画像に対応している。印環細胞成分は陰性染色の潜在的なピットフォールである。

A B

C D


まとめALK IHC 解析は、現在検証および標準化が行われており、NSCLC における費用対効果の高いALK再構成スクリーニングのための有望な臨床ツールとして期待がもたれている。この方法によるスクリーニングは既にヨーロッパ、日本およびアジアの研究機構によって推奨されている。米国では、NSCLC のALK阻害剤による治療は現在ALK FISH の陽性結果に依存している。ALK IHC の陽性結果を基にALK阻害剤療法を行うためにはALK FISH による証明が必要である。しかし、近い将来に、IHC 検査が米国 FDA によって承認される可能性があり、ALK IHC 陽性結果を示す患者もまたALK阻害剤療法に適合することになるであろう。ヨーロッパでは、ALK陽性肺癌はALK FISHテストに制限されていない。

第 5 章

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) および複数の遺伝子解析

執当担当者：Yasushi Yatabe, Kengo Takeuchi, and Ignacio Wistuba

PCR は NSCLC における EGFR 突然変異の検出に、多くの検査施設で使用されているため臨床的に施行可能である。しかし、RT-PCRでは実地診療で得にくい高品質の RNA が必要とされるため、主に血液系腫瘍に使用されている。CAP/IASLC/AMP のガイドラインでは、RT-PCR はALK阻害剤治療のための肺癌患者を選ぶ検査として推奨されていない。それは偽陰性の結果を生じる危険があることや、FFPE のサンプルの RNA ベースの解析はうまくいくとは限らないためである。しかしながら、RT-PCR はALK融合パターンについて最も確実でかつ詳細な情報を提供する。さらに、いくつかの最近開発された技術は高い成功率で臨床サンプルに適用することができる。

RT-PCREML4-ALKは多くの融合バリアントを示す。ALKの切断点は常にエクソン 20 （ENST00000389048）の 5'-末端の前に存在する。そこはキナーゼ領域が始まる位置で、この一貫性はリンパ腫および肉腫のような他のALK転座を有する腫瘍でも認められる。それに対して、EML4 の切断点はさまざまなエクソンに分布している。最初の 2 つの融合バリアントの発見（Soda 2007）に続いて、13 以上のバリアントおよび 3 つの融合パートナーが知られている（図 1）。最も高頻度に見られる 6 つの EML4-ALKバリアントでは、EML4とALKのエクソンが挿入あるいは削除なしで直接インフレームに融合している。3 つの主要なバリアント（v1: E13; A20、v2: E20; A20 および v3: E6; A20）は EML4-ALKに関連した肺癌の 90% 以上に認められる。マイナーなバリアントのうち、E2; A20（v5）および E18; A20（v5'）は EML4-ALK肺癌の 1～2% に認められる（Takeuchi 2008、Wong 2009）。E21; A20 は直腸結腸癌で認められているが（Lin 2009）、肺癌ではまだ認められていない。新鮮あるいは新鮮凍結した腫瘍サンプルを用いた RT-PCR は必要な癌細胞の数の点では他の方法より感受性が高いことがある。しかし、高い感受性は融合パターンがプライマーで検出可能な範囲内にある場合にのみ達成される。全ての知られているEML4-ALKバリアントを検出するため、プライマーセットは包括的な方法（表 1）で設計されるべきである。プライマーのアニーリングサイトの欠失により、包括的なデザインのプライマーを用いても不規則なバリアントが検出できない可能性もある。さらに、EML4-ALK検出のためにデザインされた RT-PCR システムはALKと他のパートナーとの融合、例えば kinesin family member

39第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

ALK

EML4-ALK (E13;A20), v1



EML4-ALK (E14;del49A20), v4


EML4-ALK (E13;ins69A20), v6


EML4-ALK (E15del19;del20A20), v4'

EML4-ALK (E18;A20), v5'

KIF5B-ALK (K24;A20)

KIF5B-ALK (K15;A20)

KIF5B-ALK (K17;A20)

KLC1-ALK (K9;A20)

e20

e20

e13

e20

e20e6

e20e14

e20

e2 del49e20

e13

ins69e20e14

del14e20

e18

e15del19

del20e20

e20

e20

e20

e20

e20

e9

e17

e15

e24

図 1。野生型ALKおよび肺癌におけるさまざまなタイプのALK融合: 5 つの通常認められるバリアント(v1、v2、 v3、v5 および v5')と 4 つの変則的なEML4-ALKのバリアント(v4、v6、v7、および v4')、3 つのKIF5B-ALKバリアント、および KLC1-ALK。融合パートナー遺伝子 (EML4, KIF5B, and KLC1) の濃い部分はコイルドコイルドメインを表し、ALK内ではそれらは膜貫通ドメイン（オレンジ色）とキナーゼドメイン（赤）を表す。

5B（KIF5B) および kinesin light chain 1（KLC1）、は検出できない（Takeuchi 2009、 Togashi 2012）。この限界を克服するために、他の融合パートナーのためのプライマーが設計され、EML4-ALK、KIF5B-ALK（図 2）、および ret 癌遺伝子（RET）融合の同一試験管内RT-PCR による検出を可能にしている（Takeuchi 2012）。これらの努力にもかかわらず、未知パートナーとの融合は検出不可能である。従って、RT-PCR はALK阻害剤による治療のための患者スクリーニングには推奨されない。しかしながら、L858R 点突然変異とEGFRエクソン 19 の欠損の細胞株での形質変換能が異なることや、EGFR TKI による臨床治療効果が異なることが示唆されているように、ALK融合パートナーおよび／または融合バリアントによってALK阻害剤による治療効果が異なる可能性がある。そのような場合は、RT-PCR が臨床的に有利な可能性もある。 RT-PCR は気管支洗浄液、痰、血液、体腔液、および他の体液のような組織ブロックを必要としない標本で検査することができ、それらの検体では最適な方法といえる（Soda 2012）。ALK再構成陽性が確認された患者では、液状標本中のセルフリー RNA または循環血中の腫瘍細胞を用いた RT-PCR は、侵襲性を最小限に止め、病状進行の経過を調べる強力なツールである。しかし、液状サンプル中の腫瘍細胞（または腫瘍由来の RNA）の検出はしばしば確認が難しく、腫瘍細胞が含まれていない標本はALK再構成陰性として誤診さ


研究頻繁に認められるEML4-ALKバリアントへの適用可

能性標本

タイププライマーの数主要なバリアント* マイナーなバリアント*

e13;a20 e20;a20 e6;a20 e2;a20 e18;a20 e21;a20

Soda et al., 2007 Yes Yes No No Yes Yes 凍結 2

Inamura et al., 2008 Yes Yes No No Yes Yes 凍結 2

Shinmura et al., 2008 Yes Yes No No Yes Yes 凍結 3

Takeuchi et al., 2008 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結 3

Martelli et al., 2009 Yes Yes Yes No Yes Yes 凍結 3

Takeuchi et al., 2009 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結

5 (KIF5B-ALKのための

2つのプライマーを含む)

Wong et al., 2009 Yes Yes Yes No Yes Yes 凍結 4

Takahashi et al., 2010 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結 3

Sun Y et al., 2010 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結 4

Sanders et al., 2011 Yes Yes Yes Yes Yes Yes FFPE 23

Takeuchi et al., 2012 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結

6 (KIF5B-ALKと RET 融合物のための 3 つのプライマー

を含む)Shaozhang et al., 2012 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結 4

Soda et al., 2012 Yes Yes Yes Yes Yes Yes 凍結

9 (KIF5B-ALKのための

4つのプライマーを含む)

*主要なバリアントは EML4-ALKをもつ肺癌の 90% 以上に認められる。マイナーバリアントはEML4-ALKをもつ肺癌の 1～2% に認められる。

表 1。 EML4-ALKスクリーニングのための RT-PCR の設定

れる危険がある。原則的には、液状サンプルが第一次スクリーニングに使用される場合、癌細胞陽性を確認されたサンプルだけが検査されるべきであり、それではRT-PCRの高感度性が特に優位であるということはできない。比較定量RT-PCRALKは正常な肺組織には発現しないためALK再構成の検出に IHC を使用することができる。IHCによるALK陽性反応は、通常、肺癌における再構成によって最も高頻度に引き起こされるALK発現異常を意味している。この原則はALK転写物の発現にも適用することができる。ALKの切断点は、キメラ転写が一貫して保持されている発がん性キナーゼ領域（エクソン 20）の前に起こる。従って、ALKと EML4または他のパートナーと融合する場

41第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

合、3' そして 5' 領域のALK転写産物の発現量は異なる（図 3）。この原則に基づいて、共通の融合パターンに加えてEML4-ALKの新しいバリアントの同定を伴う融合遺伝子の検出に、エクソンアレイを使用した報告がある（Lin 2009）。また、リアルタイムPCR も使用した報告がある（Wang R 2012a、Wang R 2012b）。NanoString 解析（NanoString Techno-logies）は、ROS1 そして RET（Suehara 2012）と同様、ALK融合遺伝子を検出する方法として近年報告されている（Lira 2013）。これらの 3'および 5' -比較 mRNA をベースとしたアレイの最大利点は、同時にかつ独自にさまざまなALK融合パートナーが検出できることである。ブレークアパート FISH は同

図 2。多重 RT-PCRのプライマーサイトおよび予想産物の長さ。ALKキナーゼ領域はさまざまな EML4 のエクソン、例えば KIF5B、および他のパートナー遺伝子と融合するため、うまくALK融合を検出するためには複数のプライマーセットが必要である。






EML4-ALK (E13;ins69A20), v6


EML4-ALK (E15del19;del20A20), v4'

EML4-ALK (E18;A20), v5'

KIF5B-ALK (K24;A20)

KIF5B-ALK (K15;A20)

KIF5B-ALK (K17;A20)

(1,735bp)

(2,488bp)

913bp*, 946bp*

(1,849bp)

454bp

(1,804bp)

(1,873bp)

(3,732bp)

(2,302bp)

546bp

432bp

1,185bp

546bp

501bp

570bp

579bp

999bp

(3,603bp)

1,176bp

1,483bp

EML4 72F; 5'-GTCAGCTCTTGAGTCACGAGTT-3' (EML4 exon 2, forward)Fusion-RT-S; 5'-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3' (EML4 exon 13, forward), ALK 3078RR, 5'-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3' (ALK exon 20, reverse)

KIF5B867F 5'-ATTAGGTGGCAACTGTAGAACC-3' (exon 10)KIF5B2533F 5'-GTGCACAAACAGTTGGTACGTG-3' (Exon 23-24 boundary)

EML4 72F/ALK 3078RR

Fusion RT-S/ALK 3078RR

KIF5B867F/ALK 3078RR

KIF5B2533F/ALK 3078RR

!"#$%&#'()!*+,&-./0(1* ()*02+345/ (($+-45(

!"#$%&#'()!-.,&-./0(1- ()-0$6645/ (*0*6345(

!"#$%&#'()!7,&-./0(1+ (8*+4590(8$7459(

!"#$%&#'()!*$,:;<$8&-./0(1$ ()*06$845/ (3$745(

!"#$%&#'()!-,&-./0(13 ($3$45(

!"#$%&#'()!*+,=>?78&-./0(17 ()*06.$45/ (3.*45(

!"#$%&#'()!*$,:;<*$&-./0(12 ()*062+45/ (32.45(

!"#$%&#'()!*3:;<*8,:;<-.&-./0(1$@( ()+02+-45/ (32845(

!"#$%&#'()!*6,&-./0(13@ ()-0+.-45/ (88845(

&#'(+.26AA0(3 %&BCC&DBBCDBCCBDBBC&D&DC%+ ()&#'(;EF>(-.0(G;1;G?;/(HI?=F>%AB%J,(3 %DBDC&DBDBBB&DC&BBCBBDDDD%+ ()!"#$(;EF>(*+0(KFGLMG:/0((!"#$(2-H,(3 %DBC&DCBCBBD&DBC&CD&DBB%+ ()!"#$(;EF>(-0(KFGLMG:/(

!"#$(2-HN(&#'(+.26AA(

HI?=F>(AB%JN(&#'(+.26AA(

'OH3P%&#'()'-$,&-./ (3$745 ()+07.+45/((

'OH3P%&#'()'*3,&-./ ( (*0*2745((

'OH3P%&#'()'*2,&-./ ( (*0$6+45(

'OH3P672H(3@%&BB&DDBDDC&&CBDB&D&&CC%+@(();EF>(*./('OH3P-3++H((3@%DBDC&C&&&C&DBBDDB&CDBD%+@()!EF>(-+%-$(4FI>:MGQ/(

'OH3P672HN(&#'(+.26AA(

'OH3P-3++HN(&#'(+.26AA(

9(BR;(M?S;G=?T(:;>FS;?((5GF:IUS?(FK(1MG=M>S(+M(M>:(40(G;?5;UV1;<Q(

!"#$%&#'()!*+,&-./0(1* ()*02+345/ (($+-45(

!"#$%&#'()!-.,&-./0(1- ()-0$6645/ (*0*6345(

!"#$%&#'()!7,&-./0(1+ (8*+4590(8$7459(

!"#$%&#'()!*$,:;<$8&-./0(1$ ()*06$845/ (3$745(

!"#$%&#'()!-,&-./0(13 ($3$45(

!"#$%&#'()!*+,=>?78&-./0(17 ()*06.$45/ (3.*45(

!"#$%&#'()!*$,:;<*$&-./0(12 ()*062+45/ (32.45(

!"#$%&#'()!*3:;<*8,:;<-.&-./0(1$@( ()+02+-45/ (32845(

!"#$%&#'()!*6,&-./0(13@ ()-0+.-45/ (88845(

&#'(+.26AA0(3 %&BCC&DBBCDBCCBDBBC&D&DC%+ ()&#'(;EF>(-.0(G;1;G?;/(HI?=F>%AB%J,(3 %DBDC&DBDBBB&DC&BBCBBDDDD%+ ()!"#$(;EF>(*+0(KFGLMG:/0((!"#$(2-H,(3 %DBC&DCBCBBD&DBC&CD&DBB%+ ()!"#$(;EF>(-0(KFGLMG:/(

!"#$(2-HN(&#'(+.26AA(

HI?=F>(AB%JN(&#'(+.26AA(

'OH3P%&#'()'-$,&-./ (3$745 ()+07.+45/((

'OH3P%&#'()'*3,&-./ ( (*0*2745((

'OH3P%&#'()'*2,&-./ ( (*0$6+45(

'OH3P672H(3@%&BB&DDBDDC&&CBDB&D&&CC%+@(();EF>(*./('OH3P-3++H((3@%DBDC&C&&&C&DBBDDB&CDBD%+@()!EF>(-+%-$(4FI>:MGQ/(

'OH3P672HN(&#'(+.26AA(

'OH3P-3++HN(&#'(+.26AA(

9(BR;(M?S;G=?T(:;>FS;?((5GF:IUS?(FK(1MG=M>S(+M(M>:(40(G;?5;UV1;<Q(* The asterisk denotes products of variant 3a and b, respectively

図 3。正常な肺細胞では、ALK mRNA の発現は非常に低いか検出不可能なレベルであるが、ALK陽性の腫瘍細胞は多くのキメラALK転写物を産生する。3'そして5'領域のALKを別々に解析すると、ALK陽性細胞ではALK5' 領域の転写物のみが検出される。この方法を用いれば混合された正常細胞に影響されず、融合パートナーに依存しない。

Normal cells ALK+ cells

Kinase domain

EML4 Coiled coil domain

ALK Kinase domain

ALK DNA

mRNA

mRNA

Kinase domain

ALK

5’ region 3’ region

!"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20*&,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*

9*

:*

;*

<*

=*

>9*

5' region 3' region

9*

:*

;*

<*

=*

>9*

5' region 3' region

ALK+ cellsNormal cells

ALK DNA

mRNAmRNA

Comparison between 5' and 3'regions of ALK transcript

5' region 3' region

ALK

1086420

5' region 3' region

1086420

5' region 3' region

ALK+ cellsNormal cellsALK DNA

mRNAmRNA


5' region 3' region

ALK

1086420

5' region 3' region

1086420

5' region 3' region

Kinasedomain

ALK Kinasedomain

EML4 Coiledcoil domain

Kinasedomain


図 4。FFPE 標本に RNA の比較リアルタイム PCR を応用し、ALK陽性を検出した肺腺癌の例（A）。 RNA は FFPE から抽出され、3' そして 5' 領域のALK発現レベルが解析された（B）。この腫瘍では、2 つの領域間のmRNA発現の相違は明白で、ALK再構成を示唆している。融合産物は RT-PCR の直接シークエンシング（C）と、ブレークアパート FISH により確認された（D）。

Normal cells ALK+ cells

Kinase domain

EML4 Coiled coil domain

ALK Kinase domain

ALK DNA

mRNA

mRNA

Kinase domain

ALK

5’ region 3’ region

!"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20*&,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*

9*

:*

;*

<*

=*

>9*

5' region 3' region

9*

:*

;*

<*

=*

>9*

5' region 3' region

ALK+ cellsNormal cells

ALK DNA

mRNAmRNA


5' region 3' region

ALK

1086420

5' region 3' region

1086420

5' region 3' region

ALK+ cellsNormal cellsALK DNA

mRNAmRNA


5' region 3' region

ALK

1086420

5' region 3' region

1086420

5' region 3' region

Kinasedomain

ALK Kinasedomain

EML4 Coiledcoil domain

Kinasedomain

800

600

400

200

0

-20010 20 30 40 50 60

cycles

fluo

resc

ence

34.83

50.0

5'-3' product comparative rt-Pcr

3' products

5' products

ALK exon 20 EML4 exon 13

A B

C D

様な利点を持つが、3' -および 5' -領域の転写物比較解析も効率のよい解析が可能である。これにより一つのRNA サンプルを解析することで、ALK, ROS1、および RETを含む全ての融合タイプの変化が探索可能である。さらに、FFPE のサンプルから RNA を抽出する技術が進歩し、実地診療への応用が可能になっている。定量的RT-PCR は通常短い産物（およそ 150 bp）が必要とされるため、FFPE サンプルにおいても十分施行可能である（図 4）。

マルチプレックス遺伝子解析肺癌領域のALKを含む多くの遺伝子の突然変異、再構成、および発現状態を同時に検出でき、また臨床に応用可能な解析方法について開発への要望が高まっている。少量の肺腫瘍の組織および細胞診標本を最大限に使用するために、これらのマルチプレックス解析法は重要である。ALK融合を DNA および RNA のレベルで決定するためには、複数の多重遺伝子解析が適用できるが、報告論文は限られている（Li T 2013）。大規模なシークエンシング技術の急速な発展（次世代のシークエンシング [NGS]）は従来のシークエンシングに勝るさまざまな利点を提供してきた。単一検査による多数の遺伝子の全シークエンシング、そして全ての既知の癌関連遺伝子における欠失、挿入、コピー数変化、再構成、およびエクソーム全体の塩基置換（既知のホットスポット突然変異を含む）の検出がそれらで可能である（Ross 2011）。

43

現在、全ゲノム、全エクソーム、および標的遺伝子のシークエンシングを含む NGS プラットホームは、発癌遺伝子の融合、そして FFPE を含む腫瘍組織標本における突然変異を検出するための新規診断方法を代表するものである（Lipson 2012, Takeuchi 2012）。ある研究は、少なくとも 5 つの異なる遺伝子座で切断する遺伝子 DNA を解析したNGSは、ブレークアパート FISH でALK陰性だったサンプルで、複合的なALK再構成が検出できたことを立証している。肺腫瘍組織標本のALK突然変異や遺伝子のコピー数変化の検出報告は限られているが、肺腫瘍組織の FFPE サンプルから抽出された DNA を使用して、肺癌患者13 人のうち 3 例で、crizotinib 治療に対する耐性ALK遺伝子突然変異を多重型 NGS 解析で検出することができた（Huang 2013）。まとめEML4-ALK検出のための RT-PCR は、EML4-ALK肺癌の 90% 以上を占める 3 つの主要なバリアントに標的を絞って、できるだけ包括的に設計されるべきである. RT-PCR は、組織サンプルの量が十分である場合は特に、 IHC および FISH の解析結果を確認するためには十分な方法であるが、ALK再構成の第一次スクリーニングには適していない。新規多重遺伝子解析、特にNGSは、突然変異、コピー数の増加、および遺伝子発現を含む他の遺伝子の異常とALK融合検出のために臨床応用が期待されている。しかし、これらの解析方法に関する報告データは限られている。

第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

第 6 章

前述したように、 FISH はALK再構成を同定する参照標準として一般に受け入れられており、ALK阻害剤（crizotinib）による治療の患者選択のための検査として臨床的に確認され、認可されている。FISH は遺伝子パートナーおよびバリアントの種類にかかわらず、また保存されているFFPE の標本を用いてALK再構成を検出できる。しかし、 FISH は最低 50 の腫瘍細胞を必要とし、この理由で肺癌生検組織の 20% ものサンプルが FISH 使用不可能となっている（Camidge 2010, McLeer-Florin 2012）。FISH には他にも多くの限界がある。時間がかかり、検査費用が高く、蛍光顕微鏡を必要とし、そして結果の解釈に専門的な技術を要する。その限界により、FISH はすべての病理検査施設で施行することができない。 NSCLC におけるALK検出のために、他の解析プラットホームの実用性が評価されてきている。さまざまな抗体を用いた IHC、マルチプレックスおよび定量的RT-PCR、および CISHなどと、FISH を比較することに焦点を合わせた研究が行われてきた。理論的には IHC は、すべてのALKの融合蛋白質を検出する可能性があるが、いくつかのバリアントおよび融合パートナーは蛋白発現レベルが低く検出が難しい場合がある。従って、多くの IHC 解析には蛋白質シグナルを高めるよう増幅工程が含まれている。IHC は最も普及した、最も費用対効果が高いプラットホームである• 病理検査施設で世界的に使用されている • ルーチンに利用されたFFPE の標本で使用することができる • 比較的安価 • 必要機器が少ない • 訓練および最適化が迅速• 融合蛋白質の存在を検出するのに多くは少量の腫瘍細胞ですむ ALK IHC およびALK FISH の結果には優れた相関関係があるが、ALK阻害剤治療への反応を予測するマーカーとしての IHC の価値は複数の患者グループで確認されていない。IHC はまたALK再構成を直接立証する物ではなく、ある種の偽陰性および偽陽性結果（FISH の結果と比較して）が報告されている。また、IHC でALK陽性、 FISH でALK陰性となった標本のいくつかは crizotinib への良い反応を示している（Peled 2012）。 ALKテストのための IHC 解析の標準化は現在進行中である。しかし、多くのガイドライン、たとえばヨーロッパおよび日本で作成されたものは、crizotinib 療法の患者選択につい

ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較執筆担当：Sylvie Lantuéjoul, Marileila Varella-Garcia, Erik Thunnissen, and Yasushi Yatabe

45第 6 章: ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較

て、 FISH で陽性の確認を行うためにALK IHC をスクリーニング検査として既に推奨している。また、米国のガイドラインは、注意深い検証を実施すればALK IHCを肺腺癌を持つ患者のスクリーニングとして考慮してもよいことを記している。 RT-PCR は 5' パートナーおよび切断バリアントの精密な同定が可能な、特異性の高い信頼できる技術である。しかし非定型ALKバリアントあるいは融合パートナー（挿入または欠失を伴う変則的なバリアント）は検出されない場合がある。EML4-ALKの RT-PCR プライマーは正常細胞の産物を増幅しないため非常に感度が高いが、既存のFFPE 標本では、mRNAが保たれた状態にない。RT-PCRにかかる費用はまだ評価の途中であり、検査施設および使用される検査によって異なる。 CISHは、FISH の不利な点のいくつかを克服することを目的に開発されたALK再構成検出の新しい方法である（Kim 2011）。CISH は完全に自動化した ISH 解析で、安定した染色を提供し、通常の明視野光学顕微鏡を使用してALK遺伝子再構成を検出する事ができる。

IHC 対 FISHいくつかの研究で FISH と IHC が比較された。2 つのマウスモノクローナル抗体のクローン、ALK1（Dako）および 5A4（Novocastra）、を含めた種々の抗体、ウサギのモノクローナル抗体のクローン D5F3（Cell Signaling Technology）、およびウサギのポリクローナル抗体（Invitrogen, Life Technologies）がIHC に用いられてきた。多くの研究では、FISH はALKブレークアパート再構成プローブキット（Abbott Molecular）を用いて施行された。これは crizotinib 治療の患者選択のためにALKテストのコンパニオン診断キットとして米国の FDA によって承認されている。

ALK1 IHC 対 FISH未分化大細胞型リンパ腫を診断するために使用されたALK1 抗体が、はじめにNSCLC のALK再構成検出のために評価された。ALK1 IHC および FISH は肺腺癌または NSCLC 患者を用いた 3 つの研究で比較検討された（表 1）（Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010, Yi 2011）。 FISH と比較して、ALK1 IHC は未分化大細胞型リンパ腫よりもALK-再構成肺癌検出の感受性が低く、これはおそらく NSCLC ではALKの融合蛋白質の発現レベルが低いことによる思われる。ALK1 は特異性は高いものの、感受性は 67～100% の範囲にとどまっていた。

表 1。ALK1 抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究標本の

数ALK1希釈抗原賦活化法

検出と増幅スコアリング

IHC陽性

IHC感受性

IHC特異性

Rodig et al., 2009

358 1:2 EDTA (pH 8.0)圧力鍋

チラミド増幅および EnVision

0 対 + >10% 陽性

腫瘍細胞

増幅有りで80%

(無し 40%)

100%

Mino- Kenudson et al., 2010

153 1:2 EDTA (pH 8.0) 圧力鍋

EnVision 0、1+、2+、または 3+腫瘍細胞

染色陽性％

>10% 陽性

腫瘍細胞

67% 97%

Yi et al., 2011

101 1:100 EDTA (pH 8.0)PT link

ADVANCE 0、1+、 2+、

または 3+

>0 90% 97.8%

PT Link, EnVision, および ADVANCE は Dako の製品。


ある標本は FISH でALK陽性で、IHCでALK陰性であったが、IHCでALK陽性、FISHでALK陰性となった標本は無かった（Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010）。その報告の一つでは、ALK IHC スコア1+ を陰性、 3+ の IHC スコアを陽性とし、そして 2+ を判定不明と判定した（Yi 2011）。この分類は乳癌のHER2 検査の評価法に類似している。チラミド増幅の使用は検出の感受性を高めるために推奨されたが、腫瘍および非腫瘍細胞の非特異染色が高濃度ALK1 抗体で報告されている（Mino-Kenudson 2010）。

D5F3 IHC 対 FISH3 つの研究で D5F3 クローンを用いた IHC と FISH が比較された（表 2）（Mino-Kenudson 2010, Martinez 2013, Minca 2013）。感受性は 83～100% であり、特異性は 99% および 100% であった。その中の研究の1つでは、FISHでALK陽性であった 6 標本のうち、1 検体は IHC によってALK陰性であったが、FISH によってALK陰性であった標本で IHC でALK陽性のものは無かった（Martinez 2013）。これらの研究に加えて、国際的な病理医パネルは、既知のALK遺伝子型による一連の肺腺癌を D5F3 IHC を用いて評価した。全体的にみて、 FISH と比較した IHC の感受性は 90% で、特異性は 95% であり、観察者間のスコアリングの一致率は高かった（Hirsch 2013）。

5A4 IHC 対 FISH少なくとも 6 つの大きなシリーズの研究で 5A4 クローンを用いた IHC と FISH が比較された（表 3）（Jokoji 2010, Kim 2011, Paik 2011, Lopes 2012, McLeer-Florin 2012, Sholl 2013）。すべての研究を通して、感受性および特異性はそれぞれ 93～100% まで,および 96～100% に及んだ。しかし、その中の研究で、偽陽性あるいは偽陰性の結果が報告されている。1 例は、悪性腫瘍細胞が FISH で検出されず、結果は IHC ALK陽性であっ

表 2。D5F3 抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究標本の

数標本の

数抗原

賦活化法

検出と増幅

システムスコアリング

IHC陽性閾値

IHC感受性

(対 FISH)

IHC特異性

(対 FISH)Mino- Kenudson et al., 2010

153 1:100 EDTA (pH 8.0)圧力鍋

EnVision+ 0、1+、2+、または

3+ および腫瘍細胞 %

>10%陽性

腫瘍細胞

100% 99%

Martinez et al., 2013

79 1:50 標準BenchMark

XT

ultraView 0 対 + ≥10%陽性

腫瘍細胞

83% 100%

Minca et al., 2013a

231 1:100 温度調整BenchMark

XT

OptiView 0 対 + 陽性 94%** 100%

Hirsch et al., 2013b*

98 前希釈標準BenchMark

XT

OptiView とOptiView

増幅

0 対 + 強い細胞質染色

90% 95%

aFFPE 標本を用いた IHC 検査の 2 つの偽陰性結果は ThinPrep プロセッサー(陽性の結果)を用いた検討で修正された。 b研究に選ばれた症例のうち、43 検体は FISHテストによってALK陽性で、55 検体は FISH によってALK陰性であった。BenchMark XT, ultraView（Universal DAB Detection Kit）, OptiView（DAB IHC Detection Kit）, および OptiView Amplification Kit は Ventana Medical Systems、Inc.の製品。 EnVision+ は Dako の製品。


た。別の例では、弱い緑のプローブシグナルをもつ非対称的なスプリットシグナルが FISH ALK陽性と誤って解釈されていた（Sholl 2013）。全体的にみて、その研究では、FISH と比較した IHC の特異性は 98.5% であった。

ウサギポリクローナル抗体 IHC 対 RT-PCR少なくとも 2 つの研究では、ウサギのポリクローナル抗体を用いた IHC が行われている（表 4）（Wong 2009, Chen 2012）。その内の１つの研究では、結果は EML4-ALK RT-PCR で得られた結果と比較され、一致率は高かった（Chen 2012）。他の研究では、RT-PCR でALK陽性の 11 の腺癌と 1 つの腺扁平上皮癌が IHC でも陽性と判定された（Wong et al 2009）。

表 3。5A4 抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究標本数

5A4希釈倍

率抗原

賦活化法

検出と増幅

システムスコアリング

IHC陽性閾値

IHC感受性

(対 FISH)

IHC 特異性

(対 FISH)Jokoji et al., 2010

254 1:100 標的賦活化法溶液、高いPH

EnVisionFLEX+ および IAEP

0 対 + スコア無し 100%(FISH は IHC+ 標本でのみ行

われた）

100%

Paik et al. 2011

640 1:30 CC1 溶液 i-VIEW 0、1+、2+、または 3+

0、または 1+: 陰性

2+: 陰陽不明3+: 陽性

100% 96%

Kim et al., 2011

465 1:30 CC1 溶液 i-VIEW 0、1+、2+、または 3+

0、または 1+: 陰性

2+: 陰陽不明3+: 陽性

100%スコアが 2+の場合,陽性と

判定

98%

McLeer-Florin et al., 2012

441 1:50 CC1 溶液 ultraView 0、1+、2+、または 3+ およ

び腫瘍細胞陽性％

>10%腫瘍細胞

陽性

95% 100%

Lopes et al., 2012

62 1:200 電子レンジ Novolink

スコア無し >10%腫瘍細胞陽性

100% 100%

Sholl et al., 2013

186 1:50 クエン酸緩衝液、(pH 6)圧力鍋中

EnVision FLEX+

0、1+、または 2+

1+, 2+ 93% 100%

aMcLeer-Florin et al., Jokoji et al., および Lopes et al.の研究に使用された 5A4 抗体は Abcam の製品; 他の研究で使用された抗体は Novocastra の製品。iView (DAB Detection Kit) および OptiView (DAB IHC Detection Kit) は Ventana Medical Systems の製品。Novolink (Polymer Detection System) は Leica Biosystems の製品。

表 4。ALKウサギポリクローナル抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究

標本の数(ALK+ の %)

ALK1希釈倍率

抗原賦活化法

検出と増幅

システムスコアリ

ング

IHC陽性閾値

IHC感受性

(対 RT-PCR)

IHC特異性

(対 RT-PCR)Wong et al., 2009

266 (4.9%)

1:1000 クエン酸緩衝液(pH 6.0)

電子レンジ

HRPコンプレックス

無し特定無し 100% 特定無し

Chen et al., 2012

64 (4.7%)

1:500 CC1 溶液 ultraView 0、1+、 2+、

または 3+

≥2+ 100% 90%

CC1 (TTris/borate/ EDTA) は Roche (バーゼル、スイス連邦共和国)の製品で。ultraView (Universal DAB Detection Kit) は Ventana Medical Systems, Inc. , そして HRP (horseradish peroxidase) complex は Dako の製品。


表 5。IHC で使用される抗体クローンの比較

研究

標本の数(ALK+ の %)

抗体クローン

抗原賦活化法

検出と増幅

システムスコアリング標準

IHC感受性

(対標準)

IHC特異性

(対標準)Takeuchi et al., 2009

21 (52%) 5A4 標的賦活化溶液（pH 9.0)

（全て)

iAEP

0 対 +(全て)

RT-PCR 100% 100%

5A4 EnVision+ 27% 100%ALK1 iAEP 100% 100%ALK1 EnVision+ 9% 100%SP8 iAEP 20% 100%SP8 EnVision+ 100% 18%

Rodig et al., 2009

239 (4%) ALK1 EDTA　圧力鍋中（両

方）

EnVision+ 0対 + (両方)

FISH 40% 100%

ALK1 チラミド増幅

80% 100%

Mino- Kenudson et al., 2010

37 (59%) ALK1 EDTA圧力鍋中（両方

EnVision+(両方)

スコア >2.7画像上解析は陽性

FISH 67% 97%

D5F3 100% 99%

Murakami et al., 2011

361a (5%)

ALK1 標的賦活化法溶液（pH 9.0)

(全て)

ABC (増幅無し)

0 対 +(全て)

RT-PCR/FISH

81% 100%

5A4 EnVision FLEX+

100% 100%

EnVision FLEX+

100% 99.7%

Conklin et al., 2013

377 (3%) 5A4 製造元の使用説明に

準拠（全て）

iAEP 0、1+、2+、または 3+

(全て)

FISH 100% 62.5%

ALK1 EnVision FLEX 66% 100%

ALK1 ADVANCE 66% 87.5%

5A4 ADVANCE 100% 87.5%

D5F3 ADVANCE 100% 75%

Selinger et al., 2013

594 (11%)

ALK1 緩衝液（pH 9.0)圧力鍋中

EnVision FLEX+

0、1+、2+、または 3+

(全て)

FISH 100% 99%

5A4 製造元の使用説明書に

準拠

ultraView とultraView

増幅

100% 98%

D5F3 製造元の使用説明書に

準拠

OptiView とOptiView

増幅

100% 99%

aD5F3 抗体検査のための標本数は 356 であった。SP8 は Abcam の製品。Target Retrieval Solution, buffer, EnVision, EnVision FLEX+, および ADVANCE は Dako の製品。である。ultraView (Universal DAB Detection Kit) , OptiView（DAB IHC Detection Kit), および ultraView and OptiView Amplification kits は Ventana Medical Systems、Inc.の製品である。 ABC=avidin biotin complex.


抗体クローンの比較同じサンプルセットを使用して抗体クローン間の一致率を検討した研究もある。一致率は抗体によって異なっていた（表 5）（Rodig 2009, Takeuchi 2009, Mino-Kenudson 2010, Murakami 2011, Conklin 2013, Selinger 2013）。Takeuchi et al.はシグナル増幅のために抗体増強ポリマーの挿入（iAEP）方法を用いてALK1 および 5A4 抗体の結果の同等性を報告した（Takeuchi 2009）。しかし、不一致が認められた検討もある。例えば、Murakami et al. はALK再構成をもつ 12 の標本間で 1 つの不一致例を報告した。その結果は 5A4 IHC で陰性で, D5F3 IHC で陽性であった（Murakami 2012）。Conklin et al. は抗体クローンと検出システムの 5 つの組合せを比較した。ADVANCE system（Dako）を用いた場合 5A4 と D5F3 が最も高い一致率を示したが、 FISHでALK陰性だった標本では不均一な陽性反応が検出された（Conklin 2013）。

マルチプレックスあるいは定量的な RT-PCR 対 FISH（IHC の有無を問わず）ある研究では、EML4-ALK転写物が 9 人の NSCLC　患者から採取した腫瘍細胞で認められたうえ、正常な肺でも認められた（Martelli 2008）。正常な肺組織にそのような転写物が認められたことは他の研究者によって追認されていないため、データに疑いが持たれた（Mano 2010, Sasaki 2010）。RT-PCR は高い特異性と感受性をもつ方法で、偽陽性は認められない。しかし、FFPE 標本から良質の RNA を取得することが難しいため,偽陰性をもたらす危険がある。RT-PCR の偽陰性率について詳しい報告は無いが、前向き研究でのALK転写物の検出成功が報告されている（Soda 2012）。その研究では、916 の検体中 108（12%）は RNAが分解しており解析から除外された。EML4-ALK転写物は 36 検体で検出され、そのうち 15 に IHC を施行でき、 15例すべてがALK IHC陽性であった。一般に、ALK転写物検出のための RT-PCR の感受性と特異性はIHC および FISH と比較して満足できるものであり、94～100% におよんでいる（表 6）（Takeuchi 2008, Inamura 2008, Takeuchi 2009, Soda 2013）。

表 6。他のALKテスト方法の結果と RT-PCR 結果の比較

研究タイプ

RT-PCRIHC抗体 FISH

RT-PCR の感受性(対 FISH および/ま

たは IHC)

RT-PCR の特異性(対 FISH および/

または IHC)Inamura et al., 2008

マルチプレックスRT- PCR

ALK1 無し 100% (対 IHC) 100% (対 IHC)

Takeuchi et al., 2008

マルチプレックス RT- PCR

– FISH-ベースの融合解析 100% (対 FISH) 100% (対 FISH)

Takeuchi et al., 2009

インバースおよび


5A4 ALK1

EML4 そして KIF5B融合解析

100% (対 IHC) 100% (対 IHC)

Soda et al., 2012


5A4 ALKブレークアパートプローブキット

100% (対 IHC)94% (対 FISH)

100% (対 FISH)100% (対 FISH)

Inamura et al. および Takeuchi et al.(2009) による研究に用いられたALK1 抗体は Dako 製品である。Takeuchi et al.(2009) の研究で使用された5A4 抗体は Abcam の製品で、 Soda et al.の研究で使用された物は Nichirei Biosciences, Inc. の製品である。Soda et al.の研究で使用されたブレークアパートプローブキットは Abbott Molecular の製品である。


CISH 対他の方法CISH には FISH に勝る利点があり、ALK再構成検出における CISH の結果が他の方法のそれらと同等であることが示されている（表 7）（Kim 2011, Yoshida 2011a, Schildhaus 2013）。 CISH のためのALK陽性の規準は FISH の基準と同じ報告もあれば、 CISH のために別のカットオフ値を用いる事により、ALK陽性とALK陰性の腫瘍をより良く分けることができたとする報告もある（Schildhaus 2013, Yoshida 2011a）。新しい技術が開発され、ALKコピー数およびALK蛋白質表現が同一細胞で評価される技術もある（Ventana Medical Systems、Inc.）（Ventana Medical Systems、Inc.）。この方法はより正確なALK状態を示し、従来の IHC よりも優れた感受性を証明している。しかし、この解析は技術的に難しく、この技術の検証作業が進行している。

ALKテストのための診断アルゴリズムの例ALK検出のための個々の方法の利点と特徴に基づいて、いくつかの研究グループはALKテストの診断アルゴリズムを提案している（図 1-6）（Japanese Lung Cancer Society 2011, Kim 2011, Paik 2011, Thunnissen 2012b, Conklin 2013, Marchetti 2013）。

表 7。ALKテストの他の方法と CISH の比較CISH FISH IHC RT-PCR

研究解析キット標本の数

(ALK+ の %)陽性の基準感受性特異性感受性特異性感受性特異性

Kim et al., 2011

ALK二色ブレークアパート

CISH

431 (4%) 記述無し 94% 100% 66.7% 100% NA NA

Yoshida et al., 2011a

ALK二色ブレークアパート

CISH

45 (31%) ≥20%スプリット

シグナル伴う

100% 100% 93% 100% 93% 100%

Schildhaus et al., 2013

ZytoDot 2C SPECALKブレークアパ

ートプローブ

100 (16%) ≥15% の細胞スプリット

シグナル伴う

100% 100% NA NA NA NA

Kim et al. および Yoshida et al.の研究に使用した解析キットは Ventana Medical Systems、Inc.の製品。 Schildhaus et al. が研究で使用したキットは Gmbh ZytoVision の製品。 NA =利用できない。

図 1。IHC によるスクリーニングと FISH による確認からなる、日本肺癌協会が提案するアルゴリズム; RT-PCR は細胞診の標本に使用される。点線は臨床病理学的特徴に従って施行可能な検査を表す。 Biomarker Committee, Japanese Lung Cancer Societyによる肺癌患者のALK遺伝子検査のためのガイダンス。第1.0 版 2011年8月1日。http://www haigan.gr.jp/uploads/photos/641.pdf で参照可能。

FISH

negative

(rare)Positive

ALK inhibitor

Positivenegative

negative Positive

cytology samples, frozen

RT-PCR

IHC

Lung CancerSamples


negative0/1+

reported as alK negative

IHC

equivocal2+

FISH

Positive3+

reported as alK positive

図 3。NSCLC のALK IHC および FISH を使用した診断アルゴリズム。Paik J, Choe G, Kim H, et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2011;6(3):466-472.

negative0/1+

reported as alK negative

IHC

equivocal2+

CISH/FISH

Positive3+

reported as alK positive

図 2。IHC および CISH または FISH を用いたALK遺伝子再構成を予測するアルゴリズム。Kim H, Yoo S-B, Choe J-Y, et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2011; 6 (8): 1359-1366。

NSCLC

ALK testing

IHC

ALK rearrangementNo ALK rearrangement

negative Positive1+, 2+, 3+

FISH

negative Positive

図 4。ALK IHC が十分に確認された場合での NSCLCALKテストのためのアルゴリズム。Thunnissen E, Bubendorf L, Dietel M, et al の許可を得て修正。 Virchows Arch. 2012;461(3):245-257.


ALK IHC(5a4 by novocastra or dsf3 by cell signaling with adVance detection)

FISH

negative(no alK expression)

alK negative

Positive(any alK expression)

alK positive

図 5。IHC によるALKテストと FISH による確認からなる診断スクリーニングのアルゴリズム。Conklin C, Craddock KJ, Have C, et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2013;8(1):45-51.

ALK rearrangementNo ALK rearrangement

FISH test

negative Positive

2-3 working days

Positivenegative

ALK IHC 1-2 working days

NSCLC(adenocarcinoma, large cell carcinoma, mixed

tumors with adenocarcinoma, nos)

図 6。the Italian Association of Medical Oncology and the Italian Society of Pathology and Cytopathology による NSCLCALKテストのアルゴリズム。点線で書かれたボックスおよび点線は、IHC によるスクリーニングの後で FISH に回す仮説的な方法を示している。IHC および FISHテストと結果の解釈に必要な時間も記載されている。NOS=not other-wise specified. Marchetti A, Ardizzoni A, Papotti M et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2013;8(3):352-358.

まとめIHC を用いたALKスクリーニングが多くの地域で推奨されている。それはスクリーニングの費用対効果が高いこと、および FISH によってALK陽性結果が確認されることによる。IHCのみの結果ではALKチロシンキナーゼ阻害剤の臨床的効果反応性との関連を示す検証が必要とされる。さらに、非定型あるいはボーダーライン例の臨床的意義を知るため、 FISH による評価を続ける必要がある。ALKテストのための複数の診断アルゴリズムが提案されている。

NSCLC における細胞学の役割NSCLC における予測マーカーとしてのALK再構成検出のFISH検査法は、当初、生検材料で承認された（Kwak 2010）。パラフィンブロックは病理検査施設でルーチンに処理され、これらのブロックから多数の切片をさまざまな解析に利用できるため、生検材料はトランスレーショナル研究でしばしば用いられている。しかし、40% におよぶ進行非小細胞癌は、生検材料による組織検査無しで、細胞診単独で診断されている。従って、組織診がALKテストの唯一の検体であるということにとらわれ過ぎると、多くの患者で生検が繰り返し行われる事にもつながるため、細胞診検体でのALKテストの重要性が強調されてきている。細胞診標本による FISH 解析には長い伝統があり、組織切片に適用できる以前には、細胞株あるいは腫瘍組織標本から単離した核を用いた FISH 解析が行われていた。 FISH はまた細胞診の分野で確立された方法でもある。技術的な面からは、細胞診標本にALK FISH を施行することを非とする理論的根拠はない。実際は、細胞診標本には複数の利点がある。例えば、組織切片と対照的に、細胞スメアの細胞核は断片化されず、真の細胞核の FISH シグナル数検出を可能にする。再発あるいは転移症例において、バイオマーカー解析を繰り返して行うために腫瘍材料を採取するには、細胞診は侵襲性の少ない、好ましい方法と言える。NSCLC の細胞診は通常 EBUS-FNA、経胸 FNA、気管支分泌物または擦過、気管肺胞洗浄液、および胸膜の FNA あるいは他の転移場所のFNA をもとに施行される。セルブロックは組織標本と同様に扱うことができ、またバイオマーカー解析と同じプロトコールを適用できることもあるため、そのような標本で FFPE セルブロックを作成することは多くの検査施設で好まれるようになっている。（図1）（Alici 2013, Kalhor 2013）。セルブロックは、繰り返し切片をカットして多くの材料が得られる上に蛋白質や DNA の質を長期間保持できる利点がある。市販製品に加えて、セルブロック作

細胞診におけるALKテスト執筆担当：Lukas Bubendorf

第 7 章

図 1。肺腺癌の胸水。1A: 通常スメアのパパニコロウ染色。1B: セルブロック切片の H&E 染色（x 400）。

50 µm 50 µmA B


成のためのプロトコールが報告されている。一般的に使用されるプロトコールは、いわゆる細胞ボタン法、アルギン酸ナトリウム法、および血漿トロンビン法である（ボックス 1）（Orell 2011, Kalhor 2013, Noda 2010, Jing 2013）。

肺細胞診におけるALK FISH の解析FISH はほとんどあらゆるタイプ、構成成分の細胞診標本に適用可能な手堅い技術である。ALK FISH 解析のためのプロトコールや規準は組織検査と同一である。しかし、少なからずのセルブロックは分子解析に不十分か、または全く癌細胞を含んでいない（Knoepp 2013）。また、特に FISH 解析では、通常の細胞診に比べて、隣接した反応細胞から腫瘍細胞を区別することが難しい。従って、いくつかの検査施設では、細胞診標本によるALK解析は有効ではあるがオプションの一つとされている（図 2）（Betz 2013、 Savic 2013）。細胞診の重要な利点は、追加未染色スライドを必要とせず、 FISH 解析用にすでに染色されたスライドの中から最適な細胞診スライドを選択できることである。核分断およびそれに関連したアーティファクトがないことに加え、空気乾燥またはアルコール固定した細胞診標本の DNAは、ヌクレオチドの架橋および化学修正をもたらすホルムアルデヒドによる固定標本に比べて、品質的に勝っている。この事実は、従来の細胞診のALK FISH 解析の成功率は 100% で、組織標本での失敗率は 19% におよぶ理由を説明している（McLeerFlorin 2011、Savic 2013）。 FISH は、従来のスメア、サイトスピン、あるいは液状化細胞診（ThinPrep[Hologic] または SurePath [BD Diagnostics]）を含むほとんどすべての細胞診標本に、固定方法（空気乾燥およびアルコールベースの固定液）に関わらず適用することができる。肺細胞診に、粘着剤塗布あるいは正荷電のスライドを使用することは、これらのスライドが細胞の脱落を防ぎ、 FISH の技術的な操作の間に剥がれ落ちるのを防ぐのに有用である。FISH は、

方法

3方

法 2

細胞ボタン方法（Orell 2011, Kalhor 2013） a. 吸引サンプルまたはサイトスピン検体を、拡散したり塗り付けたりしない様に、スライドグラス上に静かに1滴滴下する。 b. 数秒間付着させた後に、スライドを注意深くエタノールに浸漬して固定する。 c. c. 固定が終わったボタン様の滴下物を静かにメスの刃で剥がし、生検標本と同様に処理する。

アルギン酸ナトリウム法（Noda 2010） a. 液状検体の遠心沈澱物を、10% 緩衝ホルマリン液内で溶解、浮遊させ 2-3 時間固定する。 b. 遠心分離機によって固定細胞のペレットを集め、ホルマリン上清を注ぎ落とし、蒸留水で洗浄する。 c. 遠心分離機にかけ、ペレットを 0.5mLの 1% アルギン酸ナトリウムで再浮遊させる。 d. ナトリウムカルシウム（1M）を溶液に加え、ゲル化させる。 e. ゲル化した材料を鉗子で採取し、生検の小標本と同様に処理する。

血漿トロンビン法（the University Hospitals of Basel and Zurich, Switzerland で使用されるプロトコール） a. 細胞診材料を 2,500rpm で 10 分間遠心分離機にかける。 b. 上清を取除く。 c. 2滴の沈殿物をピペットで先細の小チューブ（エッペンドルフチューブなど）へ移す。 d. 200 μl の血漿を加えて、標本を短時間ミキサーで混和する。 e. 50 μl のトロンビンを加えて、標本を短時間ミキサーで混和する。 f . 標本を 5 分間インキュベートする。 g. ゲル化した細胞塊を埋め込みカセット（2 つのフィルターパッドの間）に入れ、カセットを閉じる。 h. 10% 緩衝ホルマリン液中で材料を固定する。 i . 固定標本を取り出し、生検の小標本と同様に処理する。

ボックス 1。細胞診セルブロック作成プロトコール

方法

1

55第 7 章: 細胞診におけるALKテスト

パパニコロウ、ヘマトキシリン、または変法ギムザ染色と同様に、未染色の標本でも十分に機能し、追加処理は通常必要としない。変法ギムザ染色は例外で、FISH 解析の前に、酸アルコール技術による脱染色が推奨される（Betz 2013）。3-アミノ-9-エチルカルバゾル（AEC）がクロモゲンとして使用される場合、 FISH は免疫組織化学染色標本にも応用できる。3, 3' ジアミノベンチジン（DAB）は自己蛍光のために FISH シグナルと干渉する。染色済み細胞診標本の FISH のプロトコールが発表されている（Thunnissen 2012b）。細胞診検査施設では診断で用いたスライドを数年間保存する法的義務があると同時に、診断後数年経ってまれな症例を見直すこともある。そのため、診断で用いた細胞診標本をFISH解析に使うことに抵抗があるかもしれないが、代表的な画像を保存し、または解析前に全てのスライドをスキャンすることでそのような懸念は対処できる。 FISH 解析後のスライドを再染色することもまた可能である（Betz 2013）。

図 2。通常の細胞診スライド、あるいは以前にパパニコロウ染色された組織を用いたALK FISH の代表的な所見（ z 軸に沿う圧縮重層画像は全細胞核の FISH 全シグナルの投影図を示す）。2A および 2B: 3つの正常（融合）ALKシグナル（2A）、および腫瘍細胞核当たり多数の正常ALKシグナル（2B）を伴うALK陰性の癌。2C および 2D: 1 つあるいは 2 つのブレークアパートシグナルを伴うALK陽性な癌（緑と赤のシグナルの間隔が少なくともシグナルの２倍）（2C）、あるいは腫瘍細胞核当たりいくつかの正常シグナルに加えて、対応する緑シグナルを欠く単一の赤シグナル（2D）。

A B

C D


ALK FISH 陽性評価の閾値は組織標本の解析をもとに確立された（癌細胞の少なくとも15%にALK再構成の典型的なシグナルパターンが存在する）。しかしながら、推奨コンセンサスが利用可能になるまでは、個々の検査施設でALK陰性細胞診標本について独自の閾値を定める必要がある（カットオフ値の詳細については蛍光インシチューハイブリダイゼーションの項を参照）。オーバーラップしていない腫瘍細胞がALK FISHの検査に選ばれるべきである。しかし、再構成シグナルの検出は三次元構造によって阻害されないため、多くの三次元クラスターはALK解析に用いる事ができる。腫瘍細胞比率の低い標本には、癌細胞の位置を記憶する適切なソフトウェアによる自動化ステージを使用することにより解析の精度を高め、迅速にFISH の結果を得ることができる。

細胞診断におけるALK IHC 検査ALK蛋白質の過剰発現を検出する免疫組織化学は最近開発された有用性の高い解析方法であり、FISH 解析のための NSCLC のスクリーニングおよび FISH判定不能例を評価するために用いられる（詳細は免疫組織化学の項に記載)。組織標本と同様に、ALK IHC は、セルブロックおよび通常あるいは液状細胞検体を含む細胞診標本に施行可能である（Moreira 2012、Martinez 2013、Savic 2013、Tanaka 2013）。パパニコロウ染色された細胞診スライドのALK IHC の精度は非常に高く、ALK FISH と比較した感受性および特異性はほぼ 100% である（Savic 2013, Tanaka 2013）。この精度は 5A4 抗体（Novocastra、ALKテストのための解析プラットホームの項を参照）を用いた自動免疫染色装置を用いて得られた（Bond-Max、Leica Biosystems）（図 3および 4）。この抗体の他のプラットフ

図 3。肺腺癌の悪性胸水に対する通常細胞診スライドを用いた IHC（x 200）における、ALK陰性（3A）、そしてALK陽性（3B、3C）の腫瘍を示す。ALK-再構成を有する H2228 株化細胞を陽性コントロールとして使用（3D）した。5A4 抗体（Novocastra）そして自動免疫染色装置（Bond-Max、Leica Biosystems）を用い、すべての結果は FISH によって確認した。

A B

C D

57第 7 章: 細胞診におけるALKテスト

ォームでの結果や、D5F3 抗体（Ventana Medical Systems、Inc.）を用いて新しく標準化されたALK IHC 細胞診解析の検証には追加研究が必要である。 IHC は広く施行可能であることから、ALKテストの最初の手段として IHC を使用する病理検査施設の数が増加し、IHC の結果が評価困難あるいは陽性の時に限ってFISHが施行されている。ただし、組織および細胞診標本のための標準化した方法を用い、適切な外部品質管理プログラムが行われる必要がある。 RT-PCRRT-PCR が細胞診標本の解析に使用される場合がある（Betz 2013, Mitiushkina 2013）。ALKテストのための解析プラットホームに記述されているように、RT-PCR はALK IHC あるいは FISH の結果を確認するためには適切かもしれないが、ALK再構成検出の一次スクリーニングには適切とはいえない。

まとめ通常の細胞診スライドおよびセルブロック標本は、予測ALK解析のための生検標本を十分代替する方法といえる。

図 4。ALK陽性の肺腺癌（x 200）。パパニコロウ染色が施されたスライド上で 5A4 抗体（Novocastra）を用いたALK IHC（4A）、それに対応するセルブロック切片での 5A4 抗体（4B）、および D5F3 抗体（Ventana Medical Systems、Inc.）での染色（4D）。

A

B

C

腫瘍の分子病理診断の標準的な報告と同様に、ALKテスト報告書は、解析前（preanalytic）、解析（analytic）、結果（results）、および解釈／結論（interpretation/conclusion）の４つの成分から成り立っており、これはFISH, IHC, あるいは RT-PCR の診断方法を問わない。

解析前セクション同時に提出される病理レポートに分子診断が含まれていない場合、このセクションの標準的なレポートは、患者情報に加えて、標本の種類および診断の概要を含むべきである。報告されるべきは次の情報である。

標本の特徴• 標本のサイズおよび種類: 外科切除（肺葉切除、肺切除、区域切除、楔状切除）、生検（気管支／経気管支生検、針生検）、FNA細胞診、液体検体（胸膜、脊髄液) • 組織の保存方法: 急速凍結（保存温度も）または FFPE • 組織の固定法: 固定のタイミングおよび固定時間および使用した固定液（FFPE には緩衝ホルマリンが推奨される）。組織が脱灰溶液で処理された場合は、使用された脱灰試薬と共に記録すべきである

腫瘍の組織学的診断腺癌のタイプおよびサブタイプの分類については the 2011 IASLC/American Thoracic Society/ European Respiratory Society lung adenocarcinoma classification に従うべきである（Travis 2011）。1つ以上の腫瘍型が含まれる場合、次の様に記述すべきである: 腺扁平上皮癌、小細胞肺癌と腺癌の混合、および神経内分泌大細胞癌（単独あるいは腺癌と混在）。1 つ以上の増殖パターンあるいは組織学的サブタイプが同一の腫瘍に認められた場合、検体での優勢な組織学的サブタイプが記載されるべきであり、採取された成分がわかれば、検査された組織型的サブタイプが記録されるべきである。

腫瘍細胞の評価• IHC、FISH、および/または RT-PCR のためにサンプルに十分量の腫瘍細胞があるか否かを評価するための、切片内での推定される腫瘍の細胞密度（切片内のすべての核と比

ALKテストの報告執筆担当：Elisabeth Brambilla、Erik Thunnissen、Marileila Varella-Garcia、および Yasushi Yatabe

第 8 章

59第 8 章: ALKテストの報告

較した腫瘍細胞の核のパーセント） • そのままの切片もしくはブロックにおける腫瘍細胞比（％）および、マイクロダイセクションなどの腫瘍細胞に富んだ領域を選択した場合はその後のDNA/RNAが抽出される組織での腫瘍細胞比 • 壊死の範囲、炎症性細胞浸潤、炭肺、および組織のアーティファクト • 情報があれば、追加診断用免疫組織化学マーカー、例えばTTF-1、p63/p40、および粘液染色による検査結果（Thunnissen 2012a）

総合的な標本の適切性• 「検査に最適（関連する所見およびALKテストの所見をここに記載する）あるいは「不適（suboptimal）」（理由を記述）として記録

他の情報• 情報があれば、薬剤治療歴（オプション）

解析セクションこのセクションには使用されたそれぞれの解析方法の感受性および診断基準と共に、基本的な操作手順が含まれるべきである。再検査や検査施設間の結果の相違に備えて、別の検査施設が何を行ったのか理解できるように十分な情報を提供すべきである。• ALK FISH: プローブセット（製造元、タイプ）および陽性結果判定に使用される診断基準 • ALK IHC: 抗体のクローン（由来）、抗体の濃度、インキュベーション時間および温度、および二次シグナルの増強システム • ALKRT-PCR: 方法、プライマー、プローブおよびその陽性コントロール、解析法の感受性

結果セクションこのセクションでは検査結果について報告すべきで、偶然見つかった所見やその意義がわからないバリアントなども含まれる。結果が不確定である場合は、それを明確に記載すべきである。結果は、腫瘍医および専門外の病理医が容易に結果を理解できるようにALK再構成陽性または陰性として報告されるべきである。加えて、使用された解析方法に関する特別な情報が報告されるべきである。

ALK FISH: 解析された細胞の数および陽性パターンを示した細胞の数とパーセント。非定型パターンが見られたら、注記すべきである（例えば、「ALK再構成は陰性、解釈の項を参照」）; International Systems for Human Cytogenetic Nomenclature（ISCN）をもちいれば、容易に理解しやすい明確な結果を示すことができる。

ALK IHC: 結果は陽性、陰性または評価不能として報告されるべきである。結果が評価不能の場合、その理由を説明をすべきである（例えば、腫瘍組織がなくなってしまっ


た、腫瘍細胞数が足りないなど）。他の任意に付け加える結果としては修正 H スコア（染色した核のパーセント、染色強度、および染色パターン [細胞質/細胞膜]）および染色の均一性などがある。技術の妥当性を保つために、外部の陽性コントロールはすべての検査で必要である。この陽性コントロールとしてはALK再構成のある細胞株あるいはALK陽性の腫瘍標本のセルブロックが使用可能である。

ALK RT-PCR: 認められた臨床的に意味のある遺伝子変異の名称が報告されるべきである。融合パターン、例えば「バリアント 1」など。ただし、現在はバリアント 1の代わりに「EML4-ALK（E13; A20）」およびバリアント 4の代わりに「EML4-ALK（E14; A20 E14; ins11del49A20）」と記述する事が推奨されている（Soda 2012）。（詳細な命名法は http://atlasgeneticsoncology.org/Tumors/ inv2p21p23NSCCLungID5667.html で入手可能。）

解釈／結論セクション本セクションでは以下の項目が含まれるべきである。• 標本の種類および診断（未治療またはALKの阻害剤療法後） • 容易で理解しやすい臨床的解釈。これは遺伝子検査結果や腫瘍が、ALK阻害剤治療に反応するかもしくは抵抗するかの可能性（臨床的エビデンスを考慮しながら）も含まれる。 • 評価不能であった説明や複数の検査間の相違についての説明（分かる範囲での）。解析の失敗、不十分な標本、または他の理由（例えば、非定型の FISH パターン）に起因するのかなど。また、より良い結果をもたらす可能性のある他の標本での再検査の検査の必要性なども含まれる。

まとめALKテストの結果報告は検査医および臨床医の両方が、検体の由来と特徴、検査の性質および精度、そして結果の臨床的意義を理解するために十分な情報が含まれるべきである。

第 9 章

NSCLCに対するALK標的療法の発展に伴い、世界中で多くの腫瘍および病理検査機関が、単独の文書もしくは広い分野にわたる遺伝子検査ガイドラインの一部としてALKテストの推奨事項を発表した。さらに検査機関間のALKテストプロトコールを標準化するために、地域あるいは国際的な多施設共同研究が行なわれている。

ガイドライン肺癌標本における遺伝子検査ガイドラインは臨床および方法論についての推奨を含んでいる。2011年、the European Society for Medical Oncology（ESMO）はルーチンでのALKテストはその当時推奨できなかったと記載しているが、新たに発表されるデータがこの検査における臨床的意義を指し示す可能性を認めていた（Felip 2011）。それ以来、いくつかの専門家グループはALK遺伝子再構成を含む肺癌の遺伝子検査のためのコンセンサスと推奨を出版してきた（表 1）。最も総合的なガイドラインは CAP･ IASLC, および AMP を代表する専門家の協力と努力の成果の賜物である。この成果は 2012年2月以前に出版された研究の総括的な評価に基づいたものである。（このガイドラインの推奨概要については付記2を参照）。このガイドラインは、もし腫瘍が腺癌もしくは腺癌成分を有する場合は、進行 NSCLC のすべての患者がALK遺伝子再構成の検査を受けることを推奨している。ALK遺伝子再構成の検査はまた、標本が小さく、腺癌成分が存在する疑いが否定できない場合にも施行されるべきである。（Lindeman 2013）。EGFR 突然変異の検査と同様に、標本の適切さを決定するために病理医が組織検体の選択に関わることが必要である。現在の推奨検査方法はALK FISH ブレークアパート解析（Vysis LSI Break Apart FISH Probe Kit, Abbott Molecular）で、これは現在、米国 FDA で承認されたALK阻害剤療法の適格性を決定する唯一の方法である。しかし、ガイドラインは、もし検証された IHC 解析が使用されれば、ALK IHC をALKのスクリーニングに使用することができると記述している。標準化の研究米国では、crizotinib の使用には米国の FDAで認可された解析方法によるALKテストが必要と注記している。現在、ALK FISH break-apart assay（Abbott Molecular）が唯一の公認ALK FISH 解析である。他の国では、それぞれの保険統制機関は特定方法の使用を強制しないが、検証された解析方法の使用を要求している。これらの国では、ALK遺伝子再構成検出

ガイドラインおよび標準化の研究執筆担当：Yasushi Yatabe、Sylvie Lantuéjoul、Erik Thunnissen、Keith Kerr、

および Ming Sound Tsao


に、標準化されている限り、他の解析方法の使用が可能である。 CAP/IASLC/AMPのガイドラインの専門家の一致した意見は、ALKテストの確認は他の分子診断検査と同じガイドラインそして同様の品質管理／保証方針に従うべきだということにある。検査施設間の標準化を実行するために、他施設共同研究が世界各国および各地で実施された（表2）。

ヨーロッパETOP Lungscape プロジェクトは肺癌のバイオマーカーに関する研究のために計画されたものである。最初のプロトコールはALK遺伝子再構成をしらべる後向きコホート研究であった。この研究は IHC とそれに続いた FISH による確認試験を用いて、ヨーロッパにおける切除されたステージ I-IIIの肺腺癌のALK陽性率を調査するためのものであった（Blackhall

表 1。肺癌におけるALKテストに関するさまざまな専門家グループが出版したガイドラインあるいは推奨

著者、年機関

言及された方法

診断アルゴリズム

細胞診検体の検査

免疫組織化学(IHC)

Mitsudomi et al., 2011

JLCS FISH, IHC, およびRT-PCR

IHC によるスクリーニング FISH による確認を伴う

適切、FISH および IHC のためのセルプロック構築を推奨

検体を、認可された商業検査施設で適切なクローンと検出システムが使用されている場所に送ることを推奨

Garrido et al., 2012

SEOM およびSEAP

FISH 患者のための FISHテスト EGFR-陰性腫瘍を使用

論議されず論議されず

Thunnissen et al., 2012b

ヨーロッパの

Europe

FISH, IHC, およびRT-PCR


組織学および細胞診標本はともに使用できる可能性がある

スクリーニングのツールとして考慮される可能性あり

Yi et al., 2012

専門家 FISH およびIHC


論議されず実用的で信頼性のあるスクリーニングツール

Marchetti et al., 2013

AIOM および

SIAPEC-IAP

FISH, IHC, および RT-PCR

(凍結組織)

FISH for selection of patients with stage IIIB and IV NSCLC

FISH が利用可能。スメアを含む

スクリーニングに使用の可能性、決定的結論にはデータ不十分

Lindeman et al., 2013

CAP-IASLC- AMP

FISH FISH による診断進行肺腺癌患者（あるいは腺癌の成分を有するNSCLS)；ステージ I-IIIの患者の検査 NSCLC が推奨されるが地域の多分野専門チームの決定を仰ぐべきである

適切。セルブロックがスメア調整よりも好ましい

適切に確認された方法スクリーニングツールALK FISHテスト用の標本選択：もし最適化された IHC 結果が陰性の場合 FISHは必要し、

Ettinger et al., 2013

NCCN FISH FISH が標準; IHC　でスクリーニングし陽性結果をFISH で確認； PCR の評価済み

論議されずスクリーニングツールとして使用の可能性； IHC 解析はリンパ腫の大部分のALK-再構成 NSCLC検出には不十分

ESMO=European Society for Medical Oncology, SEOM=Spanish Society of Medical Oncology, SEAP=Spanish Society of Pathology, AIOM=Italian Association of Medical Oncology, SIAPEC-IAP=Italian Society of Anatomic Pathology and Diagnostic Cytopathology-International Academy of Pathology, NCCN=National Comprehensive Cancer Network, ALCL=anaplastic large cell lymphoma.

63第 9 章: ガイドラインおよび標準化の研究

表 2。ALKテスト方法標準化のための他施設共同研究

国方法

評価済み参加者標本の数研究のタイプEurope (ETOP)

IHC および FISH

15 検査施設 1,099 (ALK-陽性 69) ラウンドロビンテスト; 回顧解析

カナダ IHC および FISH

12 のカナダの病理検査施設

28 (ALK陽性 22) 個々の検査施設のプロトコールを用いて検査、コンセンサス会議の後でプロトコール調整を行いさらに繰り返し検査で確認

日本 IHC, FISH, および定量的 RT-PCR

全国的な３ヶ月にわたるスクリーニング

2,884 (ALK陽性 213) 予想スクリーニング

フランス IHC, FISH, および RT-PCR

15 のフランス胸部病理部門

459 (ALK陽性 85) 中央検査施設で検査方法間の一致を確認

ドイツ IHC および FISH

ドイツの 8 つの病理機関の専門家

10 (ALK陽性 5) 既知のALK状態のラウンドロビンテスト

ヨーロッパ(EuropeanSociety ofPathology)

IHC, FISH, および FISH のデジタル画像

一次および二次ラウンドのそれぞれに、80 および 150検査施設が参加

6 再カット標本 (ALK陽性 2）,6 細胞株 (ALK陽性 2)および 4 つのデジタル画像（ALK陽性 2)

既知のALK状態のラウンドロビンテスト

2012）。ALK IHC プロトコールは 15 の検査施設においてラウンドロビンテストで確認された。Novolink detection system（Leica Biosystems）と共に抗体クローン 5A4 が使用されたが、ある検査施設では Bond-Max autostainer platform（Leica Biosystems）が使用され、他は手動染色を行った。中間解析では、ALK IHC で腺癌の 1,099標本中 69 が陽性（6.3%）であったスコアは 23 標本（33.3%）が 3+、8 標本（11%）が2+、および 38 標本（55%）が 1+ であった。一致した条件となるようALK IHC 陽性/陰性比率が 1:2 のコホート（n = 207）を作り、FISH で確認を行った。FISH の結果は 60 のALK IHC 陽性腫瘍の 22（37%）および 138 のALK IHC 陰性腫瘍の 137（99%）で一致が認められた（図 1）。この研究では IHC 陽性の定義と、どのレベルの IHC 陽性がALK遺伝子再構成を予測するかを明確にすることの重要性を示している。これらの解析条件を 5A4 抗体に適用すると、1+ または 2+ のスコアをもつ標本はALK再構成を示す確率は低く、IHC 検査陰性の標本は非常に高い確率でALK再構成を示さない。

カナダCanadian Anaplastic Lymphoma Kinase（CALK）の研究は、FISH で確認された腫瘍（22 のALK-陽性腫瘍と６つのALK-陰性腫瘍）を用いて、カナダ国内の他施設研究としてALK IHC と FISHテストの最適化と標準化を行った（Tsao 2013）。まず、約 2,000 の肺腺癌からなる組織マイクロアレイについて IHC と FISH の両方でスクリーニングしALK陽性検体を抽出した。それをもとにした匿名化切片を参加検査施設に送付し、ALK FISH break-apart assay（Abbott Molecular）を用いた FISH　解析および IHC と FISHテストが施行された。抗体としてはALK1（Dako; one center）, clone 5A4（Novocastra; 12 centers）, およ


び clone D5F3（Cell Signaling Technology; one center）が使用され、またその施設に既存の自動染色装置（Dako、Leica Biosystems、or Ventana Medical Systems、Inc.）が用いられた。5A4 抗体を評価した 12 施設からIHC のスコアと 11 施設から FISH スコアが集められ解析された。IHC の施設間のクラス内相関係数（ICC）は 0.84 であった。IHC 結果の初期解析および参加病理医のスライド評価の会合の後、個々の施設でプロトコールの調整が行われた。第二ラウンドの研究は同じ検体セットを用いて行われ、ICC はかなり上昇した（0.94）。FISH の ICC は 0.68 であり、医療センター全体の FISH 結果の感受性および特異性はそれぞれ、88～100% および 100% であった。この結果から、多くの施設で、ALKテストのための IHC および FISHを標準化することは可能であると結論付けられた。異常および臨床解釈が不明の非定型 FISH 像を示した不一致例を除いて、IHC は FISH　によってALK陽性のすべての腫瘍を検出した。しかし、本結果は、また FISH で偽陰性をもたらす場合があることも示唆している。

日本Crizotinib は2012年3月30日に日本の医薬品医療機器総合機構によって承認されたが、国民健康保険の薬価基準に収載されるまで薬剤は実臨床に使用できなかった。薬価が収載されるまでの 3 か月間に、倫理的な理由から日本 Pfizer は、腫瘍がALK陽性であると判定されたは場合には登録した医療機関に crizotinib を提供するという償還前プログラムを施行した。このプログラムでは、FFPE 検体は FISH（Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit, Abbott Molecular）と IHC（5A4 抗体のクローンを EnVision FLEX+ system [Dako] および iAEP detection kit [Nichirei Biosystems]と共に使用）を用いて同時に検査された。また、胸水のような細胞診検体に対してはRT-PCRが用いられた。合計 5,514 の検査が行

図 1。ETOP Lungscape プロジェクトの結果。1,099 の肺腺癌のうち、69 は IHC でALK陽性と同定された。IHC と FISH 間の一致については対応するコホートで解析された（右）。

adenocarcinoma patients with available alK ihc dataN=1099

alK ihc+ N=69

alK ihc– N=1030

ALK IHC 1:2 Matched CohortN=207

Matching factors in order of importance: stage, gender/smoking status, center/ year of surgery/age

alK ihc+ N=69*

38FISH–

22FISH+

*9, FISH not done

alK ihc– N=138

1FISH+

137FISH–

fish Positivefish negativefish alK

100

80

60

40

20

0

Perc

ent

ihc result 0+ ihc result 1+ ihc result 3+ihc result 2+

9.5%

90.5%

87.5%99.3% 93.5%

6.5% 12.5%

65第 9 章: ガイドラインおよび標準化の研究

われ、その内訳は 2,630 が FISH法で、2,631 は IHC法、および 253 は RT-PCR法であった。検査成功率はそれぞれ 93%、96%、および 94%、であった。FISH と IHC 間の一致は 98% であったが、ALK IHC の感受性は 86% に留まった。結果は 213 の標本でFISH および IHC の両方で陽性であったが、36 標本は FISH 陽性でIHC 陰性、12 の標本は FISH 陰性で IHC 陽性であった。2,076 の標本で FISH および IHC の両方で陰性であった。これらの結果に基づいて、日本肺癌学会は2011年にALKテストのガイダンスに次の様な注記を加えた。「たとえ、患者が IHC および FISH 両方の結果に基づいてALK阻害剤療法に適切な候補者であっても、2 つの検査結果に矛盾が存在する可能性があるため、治療実施にあたっては効果とリスクのプロフィールについて注意深い考慮が必要とされる」（Mitsudomi 2011）。

フランス2007年に開始した French National Cancer Institute（INCa）プログラムは、28 施設での悪性腫瘍を対象とした遺伝子解析を基にした、肺癌、結腸直腸癌、およびメラノーマの新規バイオマーカーの検出を目的としたものである。このプログラムの一部として、500 のFFPE 外科標本シリーズを用いた 5A4 および D5F3 抗体（それぞれ　Novocastra, および Cell Signaling Technology の製品）による IHC と FISH そして定量的 RT-PCR を比較するALK検証研究が、フランスの多施設研究として行なわれた（Lantuéjoul 2013）。これまで検査された 459 の標本の内、340 は FISH と IHC の両方でALK陰性であり、85 はFISH と IHC の両方でALK陽性であった。不一致の検査結果のうち、15 は FISH 陰性で IHC 陽性（しかし染色スコアは低い）、12 は FISH 陽性で IHC 陰性であった。7 サンプルは FISH による解釈が行われず、それらのうち 5 つは IHC でALK陽性を示した。全体的にみて、 FISH と比較した IHC の感受性は 87% であり、特異性は 96% であった。定量的 RT-PCR による検査では、ALK陽性標本のほぼ 50% にバリアント 1、30% にバリアント 3a/b、5% 以下にバリアント 2 または 7 が検出された。 20% は陰性または解釈不能であった。この研究から、5A4 を用いた IHC はルーチンのALK 異常を診断するのに信頼でき、容易な技術であると結論付けられた。しかし FISH および定量的 RT-PCR は未だに解析前の条件および、技術的専門知識に左右されるとも指摘している。いずれの方法も完璧ではなく、臨床像としてALK陽性が疑われる場合、検査結果が陰性であっても、別な方法で検査を繰り返し、ALK陽性腫瘍を有する患者を見逃さないようにすべきである。

ドイツThe German Society of Pathology（Deutsche Gesellschaft für Pathologie; DGP）および the Professional Association of German Pathologists（Berufsverband Deutscher Pathologie; BDP）はそれぞれの医療機関の技術を認定するためにALK融合検出のラウンドロビン検査を行なっている。検査前段階に付いての研究では、肺癌症例から採取された 10 標本が FISH および IHC 検査を用いて8つの病理検査施設の専門家によってALK変異状況が評価された（V Laffert 2013）。確認された肺癌検体を組織のマイクロアレイ切片として配付し、参加医療機関は異なった FISH プローブ（Abbott Molecular あるいは Zytovision GmbH の製品）、抗体クローン（ALK1、5A4 および D5F3）、希釈（1:20 から 1:200


）、および検出システム（手動あるいは Ventana Medical Systems, Leica Biosystems, あるいは Dako の自動染色装置を使用）を用いて検討した。ALK陰性腫瘍はいずれの方法（FISH およびIHC）でも正しく診断されたが、ALK陽性腫瘍では異なる結果が、特に IHC を用いた検査で認められた。研究はALK融合遺伝子を検出するには、標準化されたプロトコールを確立することが重要であることを明らかにした。

ヨーロッパ分子病理医のための外部品質評価プログラムに関するガイドラインが近年報告された（van Krieken 2013）。The European Society of Pathology は、バイオマーカー検査の精度と熟練度を保証するために、NSCLC のバイオマーカー変異の検査についてヨーロッパの外部品質評価プログラムを実施している。プログラムはALKテストについて 2 つの外部品質評価が、80 および 150 の検査施設が参加して実施された。FFPE の組織コアとして採取された組織のマイクロアレイのスライドおよび FISH のデジタル画像が提供された。両方のラウンドからのデータは 2013年の年末に公開予定となっている。

VentanaALK IHC キットの国際的な再現性の研究D5F3 抗体を用いた VentanaALK IHC（Ventana Medical Systems、Inc.）の再現性および、IHCと FISH 間の相関性を評価するために、7 人の国際評価者が 100例について検討した。ALK IHC と FISH の相関をみると、 FISH と比較した感受性は 90%、特異性は 93%、一致率は 95% であった。IHC の解釈に関しては、7 人すべての評価者が一致した症例は 95% 、7 人の内 6 人の IHC 解釈が一致した症例は97% であった（Hirsch 2013）。 Ventana IHC のキットを用いて、優れた観察者内および観察者間の一致とともに、ALK FISHとの優れた相関性があると結論づけている。

まとめブレークアパートALK FISH プローブを使用したALK遺伝子再構成の検査は、ALK TKI 療法のための標準的な診断規準として一般に認められているが、ALK陽性肺癌検出のためのスクリーニングのアルゴリズムは未だに開発中である。世界全体のグループが世界的あるいは地域的なガイドラインを確立するための研究を行っている。これらの多くは、スクリーニングツールとしての IHC の感受性そして特異性の評価とともに、 IHC および FISH 両方による検査の標準化に焦点をおいた研究となっている。これらの研究結果が報告され、数年以内にALKスクリーニングのアルゴリズムに関するグローバルなコンセンサスが得られるものと期待される。　　　　　　　　　　　

ALK遺伝子再構成を有する進行 NSCLC 患者の治療成績は引き続いて期待がもたれるが、ALK再構成の診断としては課題を抱えている。ALK遺伝子再構成の遺伝子検査が、進行 NSCLC の患者、特に腺癌または腺癌成分を有する腫瘍のための最適療法を選択する上で非常に重要であることはすでに確立している。しかし、いくつかの疑問には未だに明確な回答が得られていない。1. どの患者のためにALK遺伝子再構成スクリーニングを行うべきか？ 2. 費用対効果が最も高いスクリーニング法は何か？ 3. ALK阻害剤治療に適した患者を選び、この治療により恩恵を受ける可能性のある患者を選択できる最適なスクリーニング診断法は何か？ 4. 現在の臨床的根拠に基づく最適な治療方法は何か？最後の質問はこのアトラスの範疇を超えるが、最初の 3 つの問題については既に言及した。

どの患者のためにALK遺伝子再構成スクリーニングを行うべきか？ALK遺伝子再構成のスクリーニングは腺癌または腺癌成分を有する NSCLC の患者のすべてに施行すべきであるというのが少なくともコンセンサスとなっている。サンプルの大きさや学術的興味もよるが、相対的に年齢の低い患者や、EGFR および KRAS 突然変異検査結果が陰性の場合は、他の組織学的特徴を有する進行 NSCLCであっても、患者のスクリーニングが考慮されるべきである。時折、ALK遺伝子再構成が非腺癌組織型に認められるが、これはまれである。診断標本が小さく、腺癌成分の可能性が否定できない場合、ALKテストが推奨される。 ALK阻害剤による治療は現在早期のNSCLC（I-IIIA）を有する患者には推奨されていないが、腫瘍の再発あるいは進行に備えて、外科標本を用いたALKテストを含む遺伝子テストが推奨されている。

最も費用効果が大きいスクリーニング法は何か？米国では、crizotinib 治療には、米国の FDA によって承認されたALK遺伝子再構成解析を用いたALK診断が必要とされている。現在、唯一の診断法、ALK FISH break-apart assay （Abbott Molecular）、が認可を得ている。しかし、ALKスクリーニングには特定の検査

概要および展望執筆担当：Fred R. Hirsch, Yasushi Yatabe, および Ming Sound Tsao

第 10 章


方法は指定されていない。多くの研究で、ALK FISHと比較したALK IHC の高い診断特異性および感受性が確認されており、すでに多くのガイドラインは NSCLC を有する多くの人に対してALKスクリーニングとしてALK IHC を使用した後、治療承認を得るためにALK FISH で確認することを推奨している。RT-PCR によるALKのスクリーニングは現在推奨されていない。

ALK阻害剤による治療のための最適なスクリーニング-診断方法は何か？ALK IHC によるスクリーニングは多くの国で採用されているが、どの検査結果がALK FISH で確認されるべきかは未だに明白でない。いくつかの指針ではALK IHC で陽性の腫瘍の全てがALK FISH で検査されるべきであると推奨し、一方他のガイドラインは IHC の結果が 1+ および 2+ の場合のみに,確認のために FISH を使用することを勧めている。最適のスクリーニング診断方法を決定するためには、ALK阻害剤治療への反応性や治療結果との関連を示す詳細なデータが必要である。そのような詳しい関連性についての解析結果が得られるまでは、すべての IHC 陽性腫瘍をALK FISH で確認することが推奨される。しかしながら、ALK FISH で陰性であるが IHC が陽性で、crizotinib 治療で良好な効果を示す患者の報告も増えている。このような症例では、FISH陰性結果が、本当に陰性であるか、ボーダーラインあるいは非定型 FISH パターンのために偽陰性を示している可能性が否定できない。これらの症例についての詳細な解析が進行中であり、その結果がこの問題を解く助けとなるであろう。

将来の展望は何か？治療上の視点からは、現在、複数の第二世代ALK阻害剤がALK/EGFR の同時阻害剤とともに臨床開発中であり、有望な結果が得られている。将来的な研究こそが、どの診断法が最もよい臨床結果と関連性があるかを証明する事ができる。ALK FISH 解析は今日の crizotinib による治療の基準となっており、また次世代ALK阻害剤の臨床試験で使用されている。しかし、IHC および PCR のような他の解析と治療の関連は、研究中であり、スクリーニングー診断法が将来的に変わる可能性がある。また、新しいマルチプレックス解析、特に NGS 技術の導入については、NSCLC の患者に対するALK標的療法のスクリーニングおよび治療認可の両方に対してその有用性を確認する必要がある。

まとめこのアトラスで解説されたごとく、ALK遺伝子再構成の診断法はまだ開発途中である。2、3 年以内に診断スキーマは変わり、新しい標的薬剤の出現によってその移行が促される可能性がある。しかし、我々は少数のこの遺伝子異常を有する NSCLC 患者を適切に治療できることを確信している。この分野のすべての関係者はALK標的治療の恩恵を受ける可能性のあるすべての患者が、最適な治療を受けられるようにしなければならない。

69参考文献

alici i, demirci ny, yilmaz a, et al. the combination of cytological smears and cell blocks on endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspirates allows a higher diagnostic yield. Virchows Arch. 2013;462(3):323-327.

allouche M. alK is a novel dependence receptor: potential implications in development and cancer. Cell Cycle. 2007;6:1533-1538.

alrifai d, Popat s, ahmed M, et al. a rare case of squamous cell carcinoma of the lung harbouring alK and Braf activating mutations. Lung Cancer. 2013;80(3):339-340.

an s, chen Zh, su J, et al. identification of enriched driver gene alterations in subgroups of non-small cell lung cancer patients based on histology and smoking status. PLoS One. 2012;7(6):e40109.

atkins d, reiffen K-a, tegtmeier cl, et al. immunohistochemical detection of egfr in paraffin-embedded tumor tissues: variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem. 2004;52(7):893-901.

Babic a, loftin ir, stanislaw s, et al. the impact of pre-analytical processing on staining quality for h&e, dual hapten, dual color in situ hybridization and fluorescent in situ hybridization assays. Methods. 2010;52(4):287-300.

Bang y, Kwak el, shaw at, et al. clinical activity of the oral alK inhibitor Pf-02341066 in alK-positive patients with non-small cell lung cancer (nsclc) J Clin Oncol. 2010;28(18s):(suppl; abstr 3).

Betz B, dixon ca, Weigelin hc, et al. the use of stained cytologic direct smears for alK gene rearrangement analysis of lung adenocarcinoma. Cancer Cytopathol. 2013 Mar 27 [epub ahead of print].

Biomarker committee, Japanese lung cancer society. Guidance for ALK Gene Testing in Lung Cancer Patients. Version 1.0 august 1, 2011. available at http://www.haigan.gr.jp/uploads/photos/641.pdf.

Blackhall f, Peters s, Kerr KM, et al. Prevalence and clinical outcomes for patients with alK gene rearrangement in europe: preliminary results from the european thoracic oncology Platform lungscape project. Ann Oncol. 2013;23(suppl 9):ix73.

Boland J, erdogan s, Vasmatzis g, et al. anaplastic lymphoma kinase immunoreactivity correlates with alK gene rearrangement and transcriptional up-regulation in non-small cell lung carcinomas. Hum Pathol. 2009;40(8):1152-1158.

Burnett r, swanson Beck J, howatson sr, et al. observer variability in histopathological reporting of malignant bronchial biopsy specimens. J Clin Pathol. 1994;47(8):711-713.

Bussolati g, leonardo e. technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry. J Clin Pathol. 2008;61(11):1184-1192.

camidge d, Bang yJ, Kwak el, et al. activity and safety of crizotinib in patients with alK-positive non-small-cell lung

cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol. 2012;13(10):1011-1019. (a)

camidge d, Kono sa, flacco a, et al. optimizing the detection of lung cancer patients harboring anaplastic lymphoma kinase (alK) gene rearrangements potentially suitable for alK inhibitor treatment. Clin Cancer Res. 2010;16(22):5581-5590.

camidge dr, skokan M, Kiatsimkul P, et al. native and rearranged alK copy number and rearranged cell count in non-small cell lung cancer. implications for alK inhibitor therapy. Cancer. 2013 sept 10 [epub ahead of print].

camidge d, theodoro M, Maxson da, et al. correlations between the percentage of tumor cells showing an anaplastic lymphoma kinase (alK) gene rearrangement, alK signal copy number, and response to crizotinib therapy in alK fluorescence in situ hybridization-positive nonsmall cell lung cancer. Cancer. 2012;118(18):4486-4494. (b)

chen t, chang ic, liu hP, et al. correlation of anaplastic lymphoma kinase overexpression and the eMl4-alK fusion gene in non-small cell lung cancer by immunohistochemical study. Chang Gung Med J. 2012;35(4):309-317.

chihara d, suzuki r. More on crizotinib [letter]. N Engl J Med. 2011;364(8):776-778.

chuang M, Marchevsky a, teirstein as, et al. diagnosis of lung cancer by fibreoptic bronchoscopy: problems in the histological classification of non-small cell carcinomas. Thorax. 1984;39(3):175-178.

coghlin c, smith lJ, Bakar s, et al. Quantitative analysis of tumour in bronchial biopsy specimens. J Thorac Oncol. 2010;5(4):448-452.

conklin c, craddock KJ, have c, et al. immunohistochemistry is a reliable screening tool for identification of alK rearrange-ment in non-small-cell lung carcinoma and is antibody dependent. J Thorac Oncol. 2013;8(1):45-51.

dai Z, Kelly Jc, Meloni-ehrig a, et al. incidence and patterns of alK fish abnormalities seen in a large unselected series of lung carcinomas. Molec Cytogenetics. 2012;5(1):44.

diVito K, charette la, rimm dl, camp rl. long-term preservation of antigenicity in tissue microarrays. Lab Invest. 2004;84(8):1071-1078.

doebele r, Pilling aB, aisner dl, et al. Mechanisms of resistance to crizotinib in patients with alK gene rearranged non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012;18(5):1472-1482.

eberhard d, giaccone g, Johnson Be; non-small-cell lung cancer Working group. Biomarkers of response to epidermal growth factor receptor inhibitors in non-small-cell lung cancer Working group: standardization for use in the clinical trial setting. J Clin Oncol. 2008;26(6):983-994.

edwards s, roberts c, McKean Me, et al. Preoperative histological classification of primary lung cancer: accuracy of diagnosis and use of the non-small cell category. J Clin Pathol. 2000;53(7):537-540.

参考文献


felip e, gridelli c, Baas P, et al. Metastatic non-small-cell lung cancer: consensus on pathology and molecular tests, first-line, second-line, and third-line therapy: 1st esMo consensus conference in lung cancer; lugano 2010. Ann Oncol. 2011;22:1507-1519.

gainor J, Varghese aM, ou sh, et al. alK rearrangements are mutually exclusive with mutations in egfr or Kras: an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013;19(15):4273-4281.

garrido P, de castro J, concha Á et al. guidelines for biomarker testing in advanced non-small-cell lung cancer. a national consensus of the spanish society of Medical oncology (seoM) and the spanish society of Pathology (seaP). Clin Transl Oncol. 2012;14(5):338-339.

halling K, schrijver i, Persons dl. test verification and validation for molecular diagnostic assays. Arch Pathol Lab Med. 2012;136(1):11-13.

hirsch f, yatabe y, dietel M, et al. alK-immunohistochemistry (ihc) standardization with d5f3 antibody in non-small cell lung carcinoma (nsclc): an international consensus study. J Clin Oncol. 2013;31(May 20 supplement):e22042.

huang d Kd, Kotsakis a, et al. Multiplexed deep sequencing analysis of alK kinase domain identifies resistance mutations in relapsed patients following crizotinib treatment. Genomics. 2013 feb 20 [epub ahead of print].

hunt J. Molecular pathology in anatomic pathology practice: a review of basic principles. Arch Pathol Lab Med. 2007; 132(2):248-260.

inamura K, takeuchi K, togashi y, et al. eMl4-alK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers. J Thorac Oncol. 2008;3:13-17.

Jin g, Jeon hs, lee eB, et al. eMl4-alK fusion gene in Korean non-small cell lung cancer. J Korean Med Sci. 2012; 27(2):228-230.

Jing X, li QK, Bedrossian u, Michael cW. Morphologic and immunocytochemical performances of effusion cell blocks prepared using 3 different methods Am J Clin Pathol. 2013; 139(2):177-182.

Jokoji r, yamasaki t, Minami s, et al. combination of morpho-logical feature analysis and immunohistochemistry is useful for screening of eMl4-alK-positive lung adenocarcinoma. J Clin Pathol. 2010;63(12):1066-1070.

Kalhor n, Wistuba, ii. Perfecting the fine-needle aspirate cell block. Cancer Cytopathol. 2013;121(3):109-110.

Kerr K. clinical relevance of the new iaslc/ers/ats adenocarcinoma classification. J Clin Pathol. 2013 apr 6 [epub ahead of print]. (a)

Kerr K, loo Ps, nicolson Mc. Pathology and personalized medicine in lung cancer. Lung Cancer Mange. 2013;2(1):35-46. (b)

Khoury t. delay to formalin fixation alters morphology and immunohistochemistry for breast carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2012;20(6):531-542.

Kim h, Xu X, yoo sB, et al. discordance between anaplastic lymphoma kinase status in primary non-small-cell lung cancers and their corresponding metastases. Histopathology. 2013;62(2):305-314.

Kim h, yoo s-B, choe J-y, et al. detection of alK gene rearrangement in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6(8):1359-1366.

Knoepp s, roh Mh. ancillary techniques on direct-smear aspirate slides: a significant evolution for cytopathology techniques. Cancer Cytopathol. 2013;121(3):120-128.

Koivunen J, Mermel c, Zejnullahu K, et al. eMl4-alK fusion gene and efficacy of an alK kinase inhibitor in lung cancer. Clin Cancer Res. 2008;14(13):4275-4283.

Kwak e, Bang yJ, camidge dr, et al. anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010;363(18):1693-1703.

lantuéjoul s, rouquette i, Begueret h, et al. a french multi-centric and prospective validation study for alK translocation diagnosis in lung adenocarcinomas J Clin Oncol. 2013;31 (May 20 supplement):8100.

li t, Kung hJ, Mack Pc, gandara dr. genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer: implications for current and future therapies. J Clin Oncol. 2013;31:1039-1049.

li y, li y, yang t, et al. clinical significance of eMl4-alK fusion gene and association with egfr and Kras gene mutations in 208 chinese patients with non-small cell lung cancer. PLoS One. 2013;8(1):e52093.

lin e, li l, guan y, et al. exon array profiling detects eMl4-alK fusion in breast, colorectal, and non-small cell lung cancers. Mol Cancer Res. 2009;7:1466-1476.

lindeman n, cagle Pt, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for egfr and alK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the college of american Pathologists, international association for the study of lung cancer, and association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol. 2013;8(7):823-859.

lipson d, capelletti M, yelensky r, et al. identification of new alK and ret gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature Med. 2012;18:382-384.

lira M, Kim tM, huang d, et al. Multiplexed gene expression and fusion transcript analysis to detect alK fusions in lung cancer. J Molec Diag. 2013;15:51-61.

loo P, thomas sc, nicolson Mc, et al. subtyping of undif-ferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. J Thorac Oncol. 2010;5(4):442-447.

lopes l, Bacchi ce. anaplastic lymphoma kinase gene rearrangement in non-small-cell lung cancer in a Brazilian population. Clinics (Sao Paulo). 2012;67:845-847.

Mano h, takeuchi K. eMl4-alK fusion in lung [letter]. Am J Pathol. 2010;176(3):1552-1553.

Marchetti a, ardizzoni a, Papotti M, et al. recommendations for the analysis of alK gene rearrangements in non-small-cell lung cancer: a consensus of the italian association of Medical oncology and the italian society of Pathology and cytopathology. J Thorac Oncol. 2013;8(3):352-358.

Martelli M, sozzi g, hernandez l, et al. eMl4-alK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol. 2009;174(2):661-670.

71参考文献

Martinez P, hernandez-losa J, Montero Ma, et al. fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry as diagnostic methods for alK positive non-small cell lung cancer patients. PLoS One. 2013;8(2):e52261.

Mcleer-florin a, Moro-sibilot d, Melis a, et al. dual ihc and fish testing for alK gene rearrangement in lung adenocarcinomas in a routine practice: a french study. J Thorac Oncol. 2012;7(2):348-354.

Minca e, Portier BP, Wang Z, et al. alK status testing in non-small cell lung carcinoma: correlation between ultrasensitive ihc and fish. J Mol Diagn. 2013;15(3):341-346.

Mino-Kenudson M, chirieac lr, law K, et al. a novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of alK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immu-nohistochemistry. Clin Cancer Res. 2010;16(5):1561-1571.

Mitiushkina n, iyevleva ag, Poltoratskiy an, et al. detection of egfr mutations and eMl4-alK rearrangements in lung adenocarcinomas using archived cytological slides. Cancer Cytopathol. 2013;121(7):370-376.

Moreira a, hasanovic a. Molecular characterization by immunocytochemistry of lung adenocarcinoma on cytol-ogy specimens. Acta Cytol. 2012;56(6):603-610.

Morris s, Kirstein Mn, Valentine MB, et al. fusion of a kinase gene, alK, to a nucleolar protein gene, nPM, in non-hodgkin’s lymphoma. Science. 1994;263:1281-1284.

Murakami y, Mitsudomi t, yatabe y. a screening method for the alK fusion gene in nsclc. Front Oncol. 2012;2:24.

nakamura h, tsuta K, yoshida a, et al. aberrant anaplastic lymphoma kinase expression in high-grade pulmonary neuroendocrine carcinoma. J Clin Pathol. 2013;66:705-707.

national comprehensive cancer network. non-small cell lung cancer. Version 2.2013. available at www.nccn.org.

nitta h, tsuta K, yoshida a, et al. new methods for alK status diagnosis in non-small-cell lung cancer: an improved alK immunohistochemical assay and a new, brightfield, dual alK ihc-in situ hybridization assay. J Thorac Oncol. 2013; 8(8):1019-1031.

noda y, fujita n, Kobayashi g, et al. diagnostic efficacy of the cell block method in comparison with smear cytology of tissue samples obtained by endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration. J Gastroenterol. 2010;45(8):868-875.

ochi n, yamane h, yamagishi t, et al. can we eliminate squamous cell carcinoma of the lung from testing of eMl4-alK fusion gene? Lung Cancer. 2013;79(1):94-95.

orell s, sterrett gf (eds). Orell and Sterrett’s Fine Needle Aspiration Cytology, 5th ed. new york: churchill livingstone; 2011.

oyama t, ishikawa y, hayashi y, et al. the effects of fixation, processing and evaluation criteria of immunohistochemical detection of hormone receptors in breast cancer. Breast Cancer. 2007;12(2):182-188.

Paik J, choe g, Kim h, et al. screening of anaplastic lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in non-small cell lung cancer: correlation with fluorescence in situ hybridization. J Thorac Oncol. 2011;6(3):466-472.

Paik J, choi cM, Kim h, et al. clinicopathologic implication of alK rearrangement in surgically resected lung cancer: a proposal of diagnostic algorithm for alK-rearranged adenocarcinoma. Lung Cancer. 2012;76:403-409.

Palmer r, Vernersson e, grabbe c, hallberg B. anaplastic lymphoma kinase: signalling in development and disease. Biochem J. 2009;420:345-361.

Park h, lee JK, Kim dW, et al. immunohistochemical screening for anaplastic lymphoma kinase (alK) rearrangement in advanced non-small cell lung cancer patients. Lung Cancer. 2012;77:288-292.

Peled n, Palmer g, hirsch fr, et al. next-generation sequenc-ing identifies and immunohistochemistry confirms a novel crizotinib-sensitive alK rearrangement in a patient with metastatic non-small-cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2012;7(9):e14-16.

Pelosi g, gasparini P, cavazza a, et al. Multiparametric molecular characterization of pulmonary sarcomatoid carcinoma reveals a nonrandom amplification of anaplastic lymphoma kinase (alK) gene. Lung Cancer. 2012;77:507-514.

Perner s, Wagner Pl, demichelis f, et al. eMl4-alK fusion lung cancer: a rare acquired event. Neoplasia. 2008;10(3):298-302.

Popat s, gonzalez d, Min t, et al. alK translocation is associated with alK immunoreactivity and extensive signet-ring morphology in primary lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2012;75:300-305.

Prinsen c, Klaassen ch, thunnissen fB. Microarray as a model for quantitative visualization chemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003;11:168-173.

rekhtman n, Paik PK, arcila Me, et al. clarifying the spectrum of driver oncogene mutations in biomarker-verified squamous carcinoma of lung: lack of egfr/Kras and presence of PiK3ca/aKt1 mutations. Clin Cancer Res. 2012; 18(4):1167-1176.

rikova K, guo a, Zeng Q, et al. global survey of phosphoty-rosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 2007;131:1190-1203.

rivera M, Mehta ac, american college of chest Physicians. initial diagnosis of lung cancer: accP evidence-based clinical practice guidelines (2nd edition). Chest. 2007;132(3 supple):131s-148s.

rodig s, Mino-Kenudson M, dacic s, et al. unique clini-copathologic features characterize alK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population. Clin Cancer Res. 2009;15(16):5216-5223.

ross J, cronin M. Whole cancer genome sequencing by next-generation methods. Am J Clin Pathol. 2011;136:527-539.

rothschild s, Zippelius a, Betticher dc, et al. neue therapiekonzepte beim Bronchuskarzinom. Schweiz Med Forum. 2011;11:7.

ruschoff J, Kerr KM, grote hJ, et al. reproducibility of immunohistochemical scoring for epidermal growth factor receptor expression in non-small cell lung cancer. Arch Pathol Lab Med. 2012 dec 27 [epub ahead of print].


sakairi y, nakajima t, yasufuku K, et al. eMl4-alK fusion gene assessment using metastatic lymph node samples obtained by endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration. Clin Cancer Res. 2010;16(20):4938-4945.

salido M, Pijuan l, Martinez-aviles l, et al. increased alK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6(1):21-27.

sanders h, li hr, Bruey JM, et al. exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel eMl4-alK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genet. 2011;204:45-52.

sasaki t, rodig sJ, chirieac lr, et al. the biology and treatment of eMl4-alK non-small cell lung cancer. Eur J Cancer. 2010;46:1773-1780.

savic s, Bode B, diebold J, et al. detection of alK-positive non-small-cell lung cancers on cytological specimens: high accuracy of immunocytochemistry with the 5a4 clone. J Thorac Oncol. 2013;8(8):1004-1011.

saxe d, Persons dl, Wolff dJ, et al. Validation of fluorescence in situ hybridization using an analyte-specific reagent for detection of abnormalities involving the mixed lineage leukemia gene. Arch Pathol Lab Med. 2012;136(1):47-52.

schildhaus h, deml Kf, schmitz K, et al. chromogenic in situ hybridization is a reliable assay for detection of alK rearrangements in adenocarcinomas of the lung. Mod Pathol. 2013 Jun 7 [epub ahead of print].

schreiber g, Mccrory dc. Performance characteristics of different modalities for diagnosis of suspected lung cancer: summary of published evidence. Chest. 2003;123(1 suppl):115s-128s.

selinger c, rogers tM, russell Pa, et al. testing for alK rearrangement in lung adenocarcinoma: a multicenter comparison of immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization. Mol Pathol. 2013 Jun 7 [epub ahead of print].

shaozhang Z, Xiaomei l, aiping Z, et al. detection of eMl4-alK fusion genes in non-small cell lung cancer patients with clinical features associated with egfr mutations. Genes Chromsomes Cancer. 2012;51(10):925-932.

shaw a, Kim dW, nakagawa K, et al. crizotinib versus chemo-therapy in advanced alK-positive lung cancer. N Engl J Med. 2013;368(25):2385-2394.

shaw a, yeap By, Mino-Kenudson M, et al. clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor eMl4-alK. J Clin Oncol. 2009;27(26):4247-4253.

shaw a, yeap By, solomon BJ, et al. effect of crizotinib on overall survival in patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring alK gene rearrangement: a retrospective analysis. Lancet Oncol. 2011;12(11):1004-1012.

shinmura K, Kageyama s, tao h, et al. eMl4-alK fusion tran-scripts, but no nPM-, tPM3-, cltc-, atic-, or tfg-alK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas. Lung Cancer. 2008;61(2):163-169.

sholl l, Weremowicz s, gray sW, et al. combined use of alK immunohistochemistry and fish for optimal detection of alK-rearranged lung adenocarcinomas. J Thorac Oncol. 2013;8(3):322-328.

soda M, choi yl, enomoto M, et al. identification of the transforming eMl4-alK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007;448(7153):561-566.

soda M, isobe K, inoue a, et al. a prospective Pcr-based screening for the eMl4-alK oncogene in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012;18(20):5682-5689.

sun J, choi yl, Won JK, et al. a dramatic response to crizotinib in a non-small-cell lung cancer patient with ihc-positive and fish-negative alK. J Thorac Oncol. 2012;7:e36-e38.

sun y, ren y, fang Z, et al. lung adenocarcinoma from east asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases. J Clin Oncol. 2010;28(30):4616-4620.

takahashi t, sonobe M, Kobayashi M, et al. clinicopathologic features of non-small-cell lung cancer with eMl4-alK fusion gene. Ann Surg Oncol. 2010;17(3):889-897.

takamochi K, takeuchi K, hayashi t, et al. a rational diagnostic algorithm for the identification of alK rearrangement in lung cancer: a comprehensive study of surgically treated Japanese patients. PLoS One. 2013;8(8):e69794.

takeuchi K. interpretation of anti-alK immunohistochemistry results [letter]. J Thorac Oncol. 2013;8(7):e67-e68.

takeuchi K, choi yl, soda M, et al. Multiplex reverse transcription-Pcr screening for eMl4-alK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14(20):6618-6624.

takeuchi K, choi yl, togashi y, et al. Kif5B-alK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for alK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009;15(9):3143-3149.

takeuchi K, soda M, togashi y, et al. ret, ros1 and alK fusions in lung cancer. Nature Med. 2012;18:378-381.

tanaka h, tone K, hayashi a, et al. clinical application of immunocytochemical detection of alK rearrangement on cytology slides for detection or screening of lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2013;80(3):289-292.

thomas J, lamb d, ashcroft t, et al. how reliable is the diagnosis of lung cancer using small biopsy specimens? report of a uKcccr lung cancer Working Party. Thorax. 1993; 48(11):1135-1139.

thunnissen e, Boers e, heideman da, et al. correlation of immunohistochemical staining p63 and ttf-1 with egfr and K-ras mutational spectrum and diagnostic reproducibility in non small cell lung carcinoma. Virchows Arch. 2012;461(6):629-638. (a)

thunnissen e, Bubendorf l, dietel M, et al. eMl4-alK testing in non-small cell carcinomas of the lung: a review with recommendations. Virchows Arch 2012;461(3):245-257. (b)

thunnissen e, Kerr KM, Bubendorf l, et al. external quality assessment for alK immunohistochemistry testing in lung adenocarcinoma within the european thoracic oncology Platform lungscape Project. Ann Oncol. 2012;23(suppl 9):2932. (c)

thunnissen e, Kerr KM, herth fJ, et al. the challenge of nsclc diagnosis and predictive analysis on small samples. Practical approach of a working group. Lung Cancer. 2012;76(1):1-18. (d)

73参考文献

to Kf, tong Jh, yeung Ks, et al. detection of alK rearrangement by immunohistochemistry in lung adenocarcinoma and the identification of a novel eMl4-alK variant. J Thorac Oncol. 2013;8(7):883-891.

togashi y, soda M, sakata s, et al. Klc1-alK: a novel fusion in lung cancer identified using a formalin-fixed paraffin-embedded tissue only. PLoS One. 2012;7:e31323.

travis W, Brambilla e, noguchi M, et al. international association for the study of lung cancer/american thoracic society/european respiratory society international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol. 2011; 6(2):244-285.

travis W, Brambilla e, noguchi M, et al. diagnosis of lung cancer in small biopsies and cytology: implications of the 2011 international association for the study of lung cancer/american thoracic society/european respiratory society classification. Arch Pathol Lab Med. 2013;137(5):668-684.

tsao M, craddock K, Brandao g, et al. canadian alK (calK): a pan-canadian multicenter study to optimize and standardize alK immunohistochemistry (ihc) and fluorescence in situ hybridization (fish) for alK gene rearrangements. J Clin Oncol. 2013;31(May 20 supplement):8096.

V laffert M, Warth a, Penzel r, et al. anaplastic lymphoma kinase (alK) gene rearrangement in non-small cell lung cancer (nsclc): results of a multi-centre alK-testing. Lung Cancer. 2013;81:200-206.

van Krieken J, normanno n, Blackhall f, et al. guideline on the requirements of external quality assessment programs in molecular pathology. Virchows Arch. 2013;462:27-37.

Wang r, hu h, Pan y, et al. ret fusions define a unique molecular and clinicopathologic subtype of non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2012;30:4352-4359. (a)

Wang r, Pan y, li c, et al. the use of quantitative real-time reverse transcriptase Pcr for 5’ and 3’ portions of alK transcripts to detect alK rearrangements in lung cancers. Clin Cancer Res. 2012;18(4725-4732. (b)

Wang Z, Zhang X, Bai h, et al. eMl4-alK rearrangement and its clinical significance in chinese patients with advanced non-small cell lung cancer. Oncology. 2012;83(5):248-256.

Werner M, chott a, fabiano a, Battifora h. effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. am J Surg Pathol. 2000;24(7):1016-1019.

Wolff a, hammond Me, schwartz Jn, et al. american society of clinical oncology/college of american Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2007;131(1):18-43.

Wong d, leung el, so KK, et al. the eMl4-alK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type egfr and Kras. Cancer. 2009;115(8):1723-1733.

Wu s, Kuo yy, chang yl, et al. eMl4-alK translocation predicts better outcome in lung adenocarcinoma patients with wild-type egfr. J Thorac Oncol. 2012;7(1):98-104.

yang P, Kulig K, Boland JM, et al. Worse disease-free survival in never-smokers with alK+ lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol. 2012;7(1):90-97.

yi e, Boland JM, Maleszewski JJ, et al. correlation of ihc and fish for alK gene rearrangement in non-small cell lung carcinoma: ihc score algorithm for fish. J Thorac Oncol 2011;6:459-465.

yi e, chung Jh, Kulig K, Kerr KM. detection of anaplastic lymphoma kinase (alK) gene rearrangement in non-small cell lung cancer and related issues in alK inhibitor therapy: a literature review. Mol Diagn Ther. 2012;16:143-150.

yoshida a, tsuta K, nitta h, et al. Bright-field dual-color chromogenic in situ hybridization for diagnosing echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase-positive lung adenocarcinomas. J Thorac Oncol. 2011;6(10):1677-1686. (a)

yoshida a, tsuta K, Watanabe s, et al. frequent alK rearrange-ment and ttf-1/p63 co-expression in lung adenocarcinoma with signet-ring cell component. Lung Cancer. 2011;72:309-315. (b)

Zhang X, Zhang s, yang X, et al. fusion of eMl4 and alK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking egfr and Kras mutations and is correlated with alK expression. Mol Cancer. 2010;9:188.

Zhang y-g, Jin M-l, li l, et al. evaluation of alK rearrangement in chinese non-small cell lung cancer using fish, immunohistochemistry, and real-time quantitative rt-Pcr on paraffin-embedded tissues. PLOS One. 2013;8(5):e64821.

Zhang y, sun y, Pan y, et al. frequency of driver mutations in lung adenocarcinoma from female never-smokers varies with histologic subtypes and age at diagnosis. Clin Cancer Res. 2012;18(7):1947-1953.

Zhou J, yang h, deng Q, et al. oncogenic driver mutations in patients with non-small-cell lung cancer at various clinical stages. Ann Oncol. 2013;24(5):1319-1325.


付記

1報

告さ

れた

肺癌

にお

ける

ALK

遺伝

子再

構成

検査

に関

する

研究

の概

要

研究

国検

査方

法N

SCLC

*数

ALK

+数

(%

) A

DC

数A

LK+

数 (

%)

SCC

数A

LK+

数 (

%)

AD

SC 数

ALK

+数

(%

)N

SCLC

、他

数A

LK+

数 (

%)

NEC

a数

A

LK+

数 (

%)

患者

の選

択

Riko

va e

t al.,

200

7中

国RT

-PCR

103

4 (4

%)

--

--

--

--

-

Soda

et a

l., 2

007

日本

RT-P

CR75

5 (6

.7%

)20

2 (1

0.0%

)11

1 (9

.1%

)2

042

00

0

Koiv

unen

et a

l.,

2008

米国

/韓国

RT-P

CR30

58

(2.6

%)

208

8 (3

.8%

)88

09

00

00

0

Pern

er e

t al.,

200

8米

国/ス

イス

FISH

/RT-

PCR

603

16 (

2.7%

)-

--

--

--

--

-Sh

inm

ura

et a

l.,

2008

日本

RT-P

CR/G

en S

eq77

2 (2

.6%

)50

2 (4

.0%

)20

03

04

00

0

Take

uchi

et a

l.,

2008

日本

RT-P

CR/F

ISH

/ Ge

n Se

q34

011

(3.

2%)

253

11 (

4.3%

)71

07

09

024

0SC

LC L

CNEC

など

の神

経内

分泌

癌を

含む

Bola

nd e

t al.,

200

9米

国IH

C/FI

SH/R

TPCR

335

6 (1

.8%

)18

55

(2.7

%)

150

1 (0

.7%

)0

00

00

0

Mar

telli

et a

l., 2

009

イタ

リア

／ス

ペイ

ンRT

-PCR

/FIS

H/I

HC

120

9 (7

.5%

)63

3 (4

.8%

)48

4 (8

.3%

)2

2 (1

00%

)7

00

0

Rodi

g e

t al.,

200

9米

国IH

C/FI

SH35

820

(5.

6%)

358

20 (

5.6%

)0

00

00

00

0

Shaw

et a

l., 2

009

米国

FISH

141

19

(13.

5%)

130

18 (

12.8

%)

20

41

(2

5%)

50

00

非／

軽度

喫煙

者、

アジ

ア人

、女

性Ta

keuc

hi e

t al.,

20

09日

本IH

C/RT

-PCR

&

FISH

130

4 (3

.1%

)13

04

(3.1

%)

00

00

00

00

Won

g et

al.,

200

9中

国(H

K)RT

-PCR

266

13 (

4.9%

)20

911

(5.

3%)

340

00

232

(8.7

%)

00

Joko

ji et

al.,

201

0日

本IH

C25

48

(3.1

%)

254

8 (3

.1%

)0

00

00

00

0

Saka

iri e

t al.,

201

0日

本IH

C/FI

SH &

RT-

PCR

109

7 (6

.4%

)82

7 (8

.5%

)18

00

09

00

0

Salid

o et

al.,

201

0ス

ペイ

ンFI

SH/I

HC

107

3 (2

.8%

)69

3 (4

.3%

)30

00

08

00

0

Sun

Y et

al.,

201

0中

国RT

-PCR

523

(5.8

%)

523

(5.8

%)

00

00

00

00

非喫

煙者

Taka

hash

i et a

l.,

2010

日本

RT-P

CR/D

irect

Seq

313

5 (1

.6%

)21

15

(2.4

%)

750

00

270

00

Zhan

g X

et a

l., 2

010

中国

RACE

/ RT

-PCR

103

12

(11.

7%)

6210

(16

.1%

)29

2 (6

.9%

)0

012

00

0

Paik

et a

l., 2

011

韓国

IHC/

FISH

735

28 (

3.8%

)39

527

(6.8

%)

292

00

048

1 (2

.1%

)0

0

Yi e

t al.,

201

1米

国FI

SH/I

HC

101

10 (

9.9%

)10

110

(9.

9%)

00

00

00

00

非喫

煙者

腺癌

75付記 1

An e

t al.,

201

2中

国RA

CE-P

CR23

915

(6.

3%)

130

10 (

7.7%

)97

4 (4

.1%

)-

-12

1 (8

.3%

)0

0

Dai

et a

l., 2

012

米国

FISH

1387

49 (

3.7%

)-

--

--

--

--

-

Jin e

t al.,

201

2韓

国RT

-PCR

167

10 (

6.0%

)12

19

(7.4

%)

461

(0.2

%)

00

00

00

McL

eer-

Flor

in e

t al.,

20

12フ

ラン

スIH

C/FI

SH44

129

(6.

6%)

441

29 (

6.6%

)0

00

00

00

0

Mur

akam

i et a

l.,

2012

日本

RT-P

CR/I

HC/

FISH

811

31 (

3.8%

)71

330

(4.

2%)

521

(1.9

%)

80

380

00

Park

et a

l., 2

012

韓国

IHC/

FISH

258

25 (

9.7%

)18

217

(9.

3%)

00

00

768

(10.

5%)

40

EGFR

野生

型ま

たは

以前

のEG

FR T

KI 治

療が

無効

Shao

zhan

g et

al.,

20

12中

国RT

-PCR

102

8(7.

8%)

735

(6.2

%)

141

(7.1

%)

142

(14.

3%)

10

00

女性

、非

～軽

度喫

煙者

腺癌

Wan

g Z

et a

l., 2

012

中国

FISH

/IH

C11

311

(9.

7%)

9510

(10

.5%

)18

1 (5

.6%

)0

00

00

0

Wu

et a

l., 2

012

台湾

RT-P

CR/F

ISH

116

39 (

34%

)11

639

(34

%)

00

00

00

00

EGFR

野生

型胸

水

Yang

et a

l., 2

012

米国

IHC/

FISH

300

34 (1

1.3%

)30

034

(11

.3%

)0

00

00

00

0非

喫煙

者

Zhan

g Y

et a

l., 2

012

中国

RACE

-PCR

349

15 (

4.3%

)34

915

(4.

3%)

00

00

00

00

女性

非喫

煙者

Gain

or e

t al.,

201

3U米

国FI

SH16

8375

(4.

4%)

--

--

--

--

--

Li Y

et a

l., 2

013

中国

RT-P

CR/I

HC

208

7 (3

.4%

)95

6 (6

.3%

)96

07

1 (1

4.3%

)10

00

0

Mar

tinez

et a

l.,

2013

スペ

イン

FISH

/IH

C99

7 (7

.1%

)79

5 (6

.3%

)7

00

013

2 (1

5.4%

)0

0

Min

ca e

t al.,

201

3米

国IH

C/FI

SH24

932

(12.

8%)

--

--

--

--

--

Shol

l et a

l., 2

013

米国

IHC/

FISH

186

12 (

6.5%

)18

612

(6.

5%)

To e

t al.,

201

3中

国(H

K)IH

C/FI

SH/R

T-PC

R37

322

(5.

9%)

373

22 (

5.9%

)0

00

00

00

0

Zhan

g Y-

G et

al.,

20

13中

国RT

-PCR

/IH

C/FI

SH46

920

(4.

2%)

341

19 (

2.6%

)11

20

40

121

(8.3

%)

00

Zhou

et a

l., 2

013

中国

ARM

S RT

-PCR

488

28 (

5.7%

)34

925

(7.

2%)

101

2 (2

.0%

)18

1(5.

6%)

200

00

Tota

l12

665

662

(5.2

%)

6775

444

(6.6

%)

1411

18

(1.3

%)

787

(9.0

%)

376

17

(4.5

%)

280

*神経

内分

泌癌

を除

く (

NE

Ca）

; N

SCLC

=非

小細

胞肺

癌, A

DC=

腺癌

, SCC

=扁

平上

皮, A

DSC

=腺

扁平

上皮

癌, S

CLC=

小細

胞肺

癌 L

CNEC

=神

経内

分泌

大細

胞癌

, EGF

R=上

皮成

長因

子受

容体

, TKI

s=チ

ロシ

ンキ

ナー

ゼ阻

害剤

, RT-

PCR

= 逆

転写

酵素

ポリ

メラ

ーゼ

連鎖

反応

, FIS

H=

蛍光

イン

シチ

ュー

ハイ

ブリ

ダイ

ゼー

ショ

ン, G

en s

eq=

遺伝

子シ

ーク

エン

シン

グ, I

HC

= 免

疫組

織化

学, R

ACE=

rapi

d am

plifi

catio

n of

cD

NA

ends

, およ

び A

RMS

ampl

ifica

tion-

refr

acto

ry m

utat

ion

syst

em.


付記 2CAP/IASLC/AMPによる EGFRおよびALK阻害剤治療に対する患者選択のための遺

伝子テストガイドライン推奨概要

Section I .肺癌遺伝子検査をいつ行うべきか？論点1 EGFR、ALK変異検査をどのような患者に行うべきか？ 1.1.a推奨： EGFR-TKI治療を行うための患者選択にはEGFR変異検査を用いるべきである。癌患者は臨床的因子で遺伝子検査を省くべきではない。 1.1.b推奨： ALK-TKI治療を行うための患者選択にはALKテストを用いるべきである。腺癌患者は臨床的因子で遺伝子検査を省くべきではない。 1.2推奨：切除検体では、組織学的な悪性度によらず、腺癌もしくは腺癌の成分を含む混合型肺癌に対してEGFR･ALKテストが行われるべきである。完全に切除され、腺癌の成分をまったく含まない場合（すべて扁平上皮癌、小細胞癌、免疫染色で腺癌のマーカーが完全に陰性の大細胞癌の成分のみ）はEGFR･ALKテストは推奨されない。 1.3推奨：腺癌の可能性を完全に否定できない生検や細胞診などの部分的な検体の場合は、扁平上皮癌や小細胞癌の診断であっても、EGFR･ALKテストは施行してもよいが、その際には臨床情報（例えば、若めの年齢、非喫煙者）が役立つことがある。 1.4推奨：初回治療でEGFR･ALK変異の有無を決定する際に、原発巣でも転移巣でも同等に遺伝子検査に適している。 1.5専門家統一見解：多発性で明らかに別々の肺腺癌に対しては、それぞれの腫瘍について検討してもよいが、1つの腫瘤の異なった領域を検討する必要はない。

論点2いつ患者検体をEGFR･ALKテストすべきか？ 2.1a推奨：患者が進行癌（第7版TNMで、stage IV）で発症し、治療が適切と考えられる場合で診断された時や、低いステージで以前にテストしていない腫瘍でも再発や病状の進行をきたした際には、EGFR変異検査をオーダーすべきである。 2.1a推奨：患者が進行癌（第7版TNMで、stage IV）で発症し、治療が適切と考えられる場合で診断された時や、低いステージで以前にテストしていない腫瘍でも再発や病状の進行をきたした際には、ALK融合遺伝子検査をオーダーすべきである。2.2a専門家統一見解: Stage I, II, IIIで発症した患者が診断された際にはEGFR変異検査が勧められるが、その決定は、それぞれの施設でオンコロジーチームで協議して決めるべきである。 2.2b専門家統一見解: Stage I, II, IIIで発症した患者が診断された際にはALK融合遺伝子検査が勧められるが、その決定は、それぞれの施設でオンコロジーチームで協議して決めるべきである。 2.3推奨：組織はEGFR･ALKテストに優先的に持ちられるべきである。

論点3：どの程度でテスト結果が得られるべきか？ 3.1専門家統一見解： EGFR･ALKの結果は、テストを行う検査部が標本を受け取ってから2週間（10労働日数）以内に結果が閲覧できるようになるべきである。 3.2専門家統一見解：返却時間が平均で2週間を超える検査部は、臨床的な緊急性に応じて、院内でもしくは提携検査所で、より迅速なテストができるようにすべきである。 3.3専門家統一見解：検査部は、依頼を受けてから3実労働日以内に外部の遺伝子検査所に、院内の場合では24時間以内に最終病理診断がなされた検体が届くプロセスを構築すべきである。

77付記 2

Section II. どのようにEGFRテストを行うべきか？論点4 EGFRテストをいかに進めていくべきか？ 4.1専門家統一見解：病理医は、ホルマリン固定パラフィン包埋標本、新鮮凍結標本もしくはアルコール固定標本を、PCRベースのEGFR変異テストに用いるべきである。他の固定（酸性もしくは重金属製の固定液もしくは脱灰標本）はEGFR変異テスト用には避けるべきである。 4.2専門家統一見解：細胞診検体はEGFRおよびALKテストに適している。セルブロック標本がスメア標本よりも望ましい。

論点5 EGFR変異検査の検体必要条件とは？ 5.1専門家統一見解：病理医は、EGFRテストのための検体の適正を、癌細胞の割合、DNAの質および量にもとづいて決定すべきである。 5.2専門家統一見解：それぞれの検査ラボでは、変位検出の際の最低含有量および細胞数を検証実験の際に決定する必要がある。 5.3専門家統一見解：病理医は、それぞれの検体における腫瘍成分を取り出せるようにすべきで、必要に応じて病理医自ら、もしくはよく指導された技師によって腫瘍に富んだ部分をマイクロダイセクトすべきである。

論点6 どのようにEGFRテストは行われるべきか？ 6.1推奨：検査ラボは、十分な性能特性を持ったと確認されたEGFRテストを用いることができる。 6.2専門家統一見解：検査施設は、少なくとも50%の腫瘍細胞を有する検体で変異を検出可能な方法を用いるべきであり、10%程度の腫瘍細胞でも検出可能なより感度の高い方法（もしくはそれが可能なレフェレンスラボを持つこと）を用いることが推奨される。 6.3専門家統一見解：臨床的なEGFRテストは、少なくともEGFR変異肺腺癌で1%以上の頻度と報告されているすべての変異を検出可能である必要がある。 6.5推奨：通常のEGFRの免疫染色はEGFR阻害剤治療の患者選択に用いるべきではない。 6.6推奨： EGFRコピー数解析（FISHもしくはCISHいずれも）は、EGFR阻害剤治療の患者選択に用いるべきではない。

論点7 EGFR阻害剤の患者選択におけるKRAS遺伝子変異の役割とは？ 7.1推奨： KRAS変異テストは、EGFR阻害剤を決定づける唯一の因子であると推奨されない。

論点8 二次性もしくは獲得耐性の場合に、どんな追加的な検査を考慮するのが重要か？ 8.1推奨： EGFR阻害剤に対する獲得耐性を有する患者からの検体でテストを行う場合、5%足らずの細胞で二次性EGFRT790M変異が検出できる必要がある。


Section III: どのようにALKテストを行うべきか？論点9 どのような方法をALKテストでは用いるべきか？ 9.1推奨：検査施設は、ALK阻害剤治療の患者選択のためには、2色でラベルされた分離プローブ式のALK FISHアッセイを用いるべきである。注意深く検証された場合には、免疫染色もALK FISHのスクリーニング方法として考慮してもよいと思われる。 9.2推奨： ALK阻害剤の患者選択に、FISHに変わるものとしてRT-PCRは推奨されない。9.3専門家コンセンサス：病理医は、腫瘍構築、細胞像、標本品質を評価することで、ALK FISHテストのための標本選択に関与すべきである。 9.4専門家コンセンサス：病理医は、直接解析を行ったり、固形がんのFISH解析の特別トレーニングを受けた遺伝子検査士もしくは技術者の評価をレビューすることで、ALK FISHスライドの解釈に参加すべきである。 9.5専門家コンセンサス： ALK阻害剤に対する獲得耐性に関連した二次性遺伝子変異に対する検査は、臨床的なマネージメントに現在は必要ではない。

Section IV：他の遺伝子変異も肺腺癌でルーチンにテストすべきであるか？論点10 他の分子マーカーは肺癌でテストするのに適しているか？ 10.1a推奨：肺腺癌においては、EGFRテストは他の分子マーカーよりも優先的に扱われるべきである。 10.1b提言： EGFRテストの次に、ALKテストは肺腺癌では優先的に扱われねばならないが、現状では十分なエビデンスは発表されていない。

Section V: 肺腺癌の遺伝子テストはいかに実施され、運用されるべきか？論点11 すべての腺癌が、EGFRとALKの両方のテストをされるべきであるか？ 11.1専門家統一見解: 検査施設は、全体の結果レポート返却時間要件を満たしつつ、腺癌の遺伝子テストの効率を最大化する検査アルゴリズムを実施すると思われる。

論点12 EGFRとALKの結果はいかに報告されるべきか？ 12.1専門家統一見解： EGFR変異テストとALK FISHの報告書には、腫瘍内科医や非専門家病理医にも容易に理解できる結果と解釈の項目が含まれている必要がある。

論点13 EGFRとALK検出法はいかに有効性が確認されるべきか？ 13.1専門家統一見解: EGFRとALKテストの有効性の実証については、他の遺伝子診断やFISHテストと同様のガイドラインを用いるべきである。

論点14 いかにして精度管理を行うべきであるか？ 14.1専門家統一見解: 検査施設は、肺癌のEGFR、ALKテストも他の臨床検査で用いられる精度管理ポリシーに従うべきである。特に、治療のためのEGFR,ALKテストを行う検査所は、技能調査に参加すべきである。

Abbreviations: CISH, chromogenic in situ hybridization; EGFR, epidermal growth factor receptor; FISH, fluorescence in situ hybridization; PCR, polymerase chain reaction; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; TKI, tyrosine kinase inhibitor; TNM, tumor node metastasis.

次の論文から許可をえて転載: Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: Guideline from the College of American Pathologists (CAP), International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC), Association for Molecular Pathology (AMP). J Thorac Oncol 2013;8:823-859.

IASLC はこのALKアトラスのプロジェクトに対する Pfizer Oncology が提供した寛大な資金とサポートに深く感謝します

www.iaslc.org

Documents

IASLC Atlas of ALK Testing in Lung Cancer - Japanese Translation