IDENTIFICACIÓN DE E. COLI VS. SHIGELLA LA FINALIDAD DEL TRABAJO A REALIZAR ES CONOCER EL FUNDAMENTO DE LOS MÉTODOS EXISTENTES PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

INTRODUCCIÓN

En el siguiente estudio se pretende identificar cuáles de estas especies bacterianas se encuentran en una muestra de procedencia por conocer.

GÉNERO SHIGELLA

Concepto

El Género Shigella se encuentra dentro de la Familia Enterobacteriaceae. Son bastones Gram negativos (solos, en cadenas o de a pares), inmóviles, no esporulados, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa como fuente de energía y otros azúcares sin producción de gas ni SH2, no utiliza citrato de Simmons.

Todas las especies producen afecciones graves y muy contagiosas sobre el tracto gastrointestinal (disentería bacilar), especialmente en ambientes de salubridad baja. Es aerobio, pero anaerobio facultativamente.

El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B); Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D).

Propiedades Bioquímicas de Shigella spp.

GÉNERO ESCHERICHIA

Concepto

El Género Escherichia se encuentra dentro de la Familia Enterobacteriaceae. Está constituido por bacterias con morfología bacilar, aunque las formas jóvenes son de tipo cocobacilar, fermentadoras de glucosa, móviles, Gram negativo, fermentadores de lactosa con producción de ácidos y gas, aguantan temperaturas altas (lo que permite diferenciarlo de otros coliformes), resiste muy bien los agentes externos y es fácil encontrarla en el agua, alimentos... Es saprófito de la flora aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo y, en general, la presencia de éste en aguas y alimentos es indicativo de contaminación fecal reciente. Suele crear trastornos gastrointestinales tipo diarreas debido a la acción de ciertos antígenos, infecciones urinarias, meningitis en neonatos y, en casos más excepcionales, y graves bacteriemias.

Nos encontramos con dos especies: E. coli y E. blattae.

Clasificación Escherichia coli

E. coli es el organismo predominante en casi todos los excrementos. Tiene una finalidad útil, al suprimir el crecimiento de ciertos organismos proteolíticos y al sintetizar grandes cantidades de vitaminas. Es aerobio, pero facultativamente anaerobio. Es la causa más frecuente de las infecciones del conducto urinario.

Puede ser móvil (flagelos períticos) o inmóvil. La mayoría de las variedades fermentan la lactosa. Ensayada en IMViC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato), produce indol a partir de triptófano, no produce H2S, no forma acetil-metil carbinol y no utiliza el citrato. Se encuentra en el suelo, agua, en las plantas, en el tracto intestinal de los animales y en varios alimentos, especialmente productos animales y aquellos manipulados por el hombre. Dada su termosensibilidad, su presencia en productos pasteurizados o cocinados delata recontaminación post-tratamiento.

Enrancia los alimentos, y algunas variedades son enteropatógenas o enterotóxicas por lo que son utilizadas como indicador de contaminación fecal. Su efecto nocivo obedece a su facultad de desarrollarse en sustratos varios, donde produce ácido y gas a partir de la mayoría de carbohidratos y sintetiza sus propias vitaminas. Además de la formación de gases, hace que los alimentos sepan y huelan a “fermentado”. Puede estar asociado con importantes síndromes patológicos.

Escherichia Coli Shigella

METODOLOGÍA

Para la identificación y clasificación de estas bacterias utilizaremos los siguientes métodos:

Reconocimiento Morfológico

Cultivo de Shigella y E.coli respectivamente

Cultivo de Shigella y E.coli respectivamente (Vista acercada)

Tinción Diferencial de Gram

La tinción de Gram será una buena primera prueba para la muestra identificando si encontramos bacteria Gram positiva o Gram negativa, siendo este último el caso de Shigella y Escherichia.

La tinción se deberá realizar de la siguiente manera lavando entre cada tincción exceptuando tras el alcohol y la sapranina:

Primero se añade cristal violeta.

Luego se añade una solución de lugol.

Luego se añade alcohol.

Finalmente se añade safranina.

Interpretación (microscopio)

Si la bacteria es Gram positiva aparecerá de color violeta Si la bacteria es Gram negativa aparecerá de color rosado.

Fundamento

Lo que la tinción de Gram realmente nos indica es si la bacteria tiene 2 membranas plasmáticas con una capa de peptidoglicano en medio o una membrana plasmática (bacterias Gram -) y una capa externa de peptidoglicano (bacterias Gram +).

Esto se debe a que en el proceso primero se ha teñido las células de violeta y se ha fijado con un mordiente en los 2 pasos iniciales. Pero luego el alcohol ha disuelto y arrastró los lípidos. Por tanto, las bacterias que en su parte más externa tengan lípidos, como la membrana plasmática externa de las bacterias Gram -, perderán el color fijado que será arrastrado junto con la membrana y se le fijará el tinte de safranina añadido al final.

En el caso de Shigella y Escherichia coli ambas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae las cuales son Gram negativas y por tanto tienen una membrana externa.

Si sometemos una muestra de un cultivo de estas especies a una tinción de Gram todas nos aparecerían rosadas.

Pruebas Bioquímicas

Para distinguir entre la multitud de especies enterobacterianas se realizan una serie de pruebas que sirven para identificar una característica particular de cada género. Entre éstas las que aparecen en la tabla van a ser utilizadas para diferenciar entre la E.coli y Shigella:

Diferenciación de Shigella spp. y E. coli.

PRUEBA DEL MUCATO

El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de utilizar el ácido múcico o el mucato como fuente de carbono.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con ácido múcico y NaOH para que formen mucato sódico. Luego se añade azul de bromotimol, que será nuestro indicador, y se busca el pH neutro mediante NaOH y HCl. Luego se coloca la muestra en este medio en un tubo de ensayo y se cultiva a 37ºC durante 48 horas comprobando cada 24 horas.

Viraje del Indicador

El azul de bromotimol es:

Azul: pH > 7,6 Verde: 7,6 > pH > 6 Amarillo: pH < 6

Interpretación

Si el bromotimol cambia a amarillo querrá decir que el microorganismo metaboliza el mucato acidificando el medio. En cambio si no utiliza el mucato el medio permanecerá azul-verdoso sin viraje del indicador.

Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso.

Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella: mucato (-)

E. coli: mucato (+)

PRUEBA DEL ACETATO

El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de utilizar acetato como única fuente de carbono y energía.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo en el cual el acetato sódico es la única fuente de carbono y sales inorgánicas de amonio son la única fuente de nitrógeno. Se añade azul de bromotimol, que será nuestro indicador, procurando un medio neutro. Luego se cultiva con una parte muestra a 37ºC durante 48 horas comprobando cada 24 horas.

Viraje del Indicador

El azul de bromotimol es:

Azul: pH > 7,6 Verde: 7,6 > pH > 6 Amarillo: pH < 6

Interpretación:

Si utilizan el acetato como fuente de carbono durante el proceso se descomponen las sales de amonio en amoníaco. Este aumento de la concentración de amoníaco incrementa el pH cambiando el color a azul. Si por el contrario no se está utilizando el acetato permanecer verde.

Ensayo positivo: viraje del color al azul.

Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece verde.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella: acetato (-)

E. coli: acetato (+)

PRUEBA DEL CITRATO DE CHRISTENSEN

El propósito de la prueba es indentificar si el microorganismo en cuestión es capaz de usar el citrato como fuente de carbono y energía en presencia de nitrógeno orgánico. Es muy similar al citrato de Simmons que es con nitrato inorgánico. También se conoce a esta prueba como la prueba de urea de Christensen.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con citrato amónico de hierro (III) como la única fuente de carbono y nitrógeno. Se añade el rojo de fenol como indicador. Se introduce la muestra a identificar y se incuba a 35ºC durante 48 horas comprobando cada 24 horas. Se debe dejar los tubos destapados para que se desprenda el anhídrido carbónico.

Viraje del Indicador

El rojo de fenol es:

Rojo: pH > 8,2 Amarillo: pH < 6,8

Interpretación

Si utilizan el citrato como fuente de carbono durante el proceso se forma también amoníaco. Este aumento de la concentración de amoníaco incrementa el pH cambiando el color a rojo. Si por el contrario no se está utilizando el acetato permanecer amarillo.

Ensayo positivo: viraje del color al rojo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece amarillo.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella: citrato de Christensen (-)

E. coli: citrato de Christensen (+)

PRUEBA DEL INDOL

El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de producir indol a partir del amino ácido triptófano.

Fundamento

El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol.

Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli. (Dr. Carlos G. Malbran, 2005)

Procedimiento (Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris, 2007):

Se prepara un medio de cultivo ácido al que se le añade p-dimetilaminobenzaldehído para que reaccione con el indol. El indol se extrae del cultivo en agua de peptona con un pequeño volumen de xilol, añadiéndose luego el reactivo. (Ramón Parés y Antonio Juárez, 1997).

Método de Kovacs

- En el tubo con agua de peptona, se siembra el microorganismo problema. El medio de cultivo es el agua de peptona, pues este medio tiene triptófano. El medio no debe tener glucosa, pues la fermentación de la glucosa eleva la acidez del medio y puede inhibirse la triptofanasa, ya que el enzima triptofanasa, actúa a un pH óptimo de 7.4-7.8

- Incubar a 37 ºC, durante 24-48 horas.

- Añadir al cultivo 5 gotas de reactivo indol de Kovacs. El reactivo indol de Kovacs debe ser fresco, pues con el tiempo cambia el color de amarillo a castaño y pierde sensibilidad. Puede conservarse en nevera a 4-10 ºC algunos días, debe conservarse en frasco color topacio con cierre hermético.

- Agitar suavemente el tubo y dejarlo unos minutos en reposo.

Método de Ehrlich

- En el tubo con agua de peptona, se siembra el microorganismo problema. El medio de cultivo es el agua de peptona, pues este medio tiene triptófano. El medio no debe tener glucosa, pues la fermentación de la glucosa eleva la acidez del medio y puede inhibirse la triptofanasa, ya que el enzima triptofanasa, actúa a un pH óptimo de 7.4-7.8

- Incubar a 37 ºC, durante 24-48 horas.- Añadir 1ml de éter etílico al cultivo y esperar a que suba a la superficie del tubo.- Añadir 5 gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por las paredes del tubo.

Interpretación de los resultados con el método de Kovacs

Indol positivo: aparece un anillo color rojo en la superficie del medio.

Indol negativo: el medio toma el color del reactivo añadido en su superficie.

Interpretación de los resultados con el método de Ehrlich

Indol positivo: aparece en la superficie de la capa acuosa un anillo rojo. Nunca se observa en la etérea.

Indol negativo: la capa acuosa toma el color del reactivo de Ehrlich amarillento.

PRUEBA DE LA ORNITINA DESCARBOXILASA

El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión utiliza el amino ornitina como fuente de energía. De ser así estará presente la enzima ornitina descarboxilasa. No todas la usan y por ello sirve de identificador.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con ornitina y una cantidad moderada de glucosa. El indicador bromocresol púrpura será también será el indicador. Se cultiva en este medio durante 48 horas a 35-37ºC comprobando cada 24 horas.

Viraje del Indicador

El bromocresol púrpura es:

Púrpura: pH > 6,8 Amarillo: pH < 5,2

Interpretación

Primero el organismo utilizará la glucosa y con ello el pH descenderá cambiando el bromocresol de púrpura a amarillo. En este medio ácido la enzima ornitina descarboxilasa actuará si presente. La enzima para aprovechar el carbono del amino ácido lo descarboxila en

este proceso se liberan las diaminas cadaverina y putrescina que incrementan el pH recuperando el color púrpura del bromocresol púrpura.

Ensayo positivo: viraje del de amarillo a púrpura.

Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece amarillo.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella: ornitina descarboxilasa (-). Aunque Shigella sonnei es ornitina descarboxilasa (+)

E. coli: ornitina descarboxilasa (+) pero también puede ser (-)

PRUEBA DE LA GLUCOSA (GAS)

El propósito de la prueba es ver si el microrganismo en cuestión es capaz de fermentar glucosa como fuente de carbono a base de ver si esta fermentación produce compuestos gaseosos.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con glucosa y el indicador rojo de fenol. Como la reacción de fermentación puede emitir algún gas que nos interesa usaremos unos tubos de durham para retener el gas. Se trata de unos tubos invertidos de menor tamaño que contienen el medio de cultivo y al producirse el gas retendrán las burbujas. Se añade la muestra y se cultiva a 37ºC durante 24 horas.

Viraje del Indicador

El rojo de fenol es:

Rosa/Magenta: pH > 8,2 Rojo: 8,2 > pH > 6,8

Amarillo: pH < 6,8

Interpretación

La fermentación de la glucosa produce hidrógeno y CO2. Estos gases reducen el pH del medio y viran el color rojo del rojo de fenol. De no producirse gas no virará. Además se verá el depósito de gas en el tubo de durham indicando su producción.

Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella no produce gas de la fermentación de la glucosa por tanto daría un resultado negativo.

E. coli produce gas de la fermentación de glucosa por tanto daría un resultado positivo.

PRUEBA DE LA SACAROSA

El propósito de la prueba es ver si el microorganismo en cuestión es capaz de fermentar el disacarido sacarosa (glucosa+fructosa).

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con sacarosa. Se le añade el indicador rojo de fenol. Se añade la muestra y se cultiva 24 horas a 37ºC.

Viraje del Indicador

El rojo de fenol es:

Rosa/Magenta: pH > 8,2 Rojo: 8,2 > pH > 6,8 Amarillo: pH < 6,8

Interpretación

La fermentación de la sacarosa descenderá el pH por lo que el indicador virará a amarillo. De no fermentarse permanecerá rojo.

Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.

Para el caso de Shigella y E. coli:

Shigella puede dar resultado tanto positivo como negativo.

E. coli puede dar resultado tanto positivo como negativo.

PRUEBA DE LA MOVILIDAD

El propósito de la prueba es medir la capacidad de propulsión del microorganismo en cuestión por medio de flagelos, pero la presencia de flagelos no implica movilidad.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo llamado agar de movilidad que es semisólido. Luego se pincha la muestra con la punta de un asa de pico y se pincha luego el medio con el agar de movilidad.

Interpretación

Si el microorganismo no es móvil tendrá lugar una franja lineal en la zona donde fue pinchado. Si el microorganismo es móvil se distribuirá por el medio.

En el caso de Shigella y Escherichia:

Shigela no es móvil por tanto daría un resultado negativo.

E. coli puede ser o no móvil por lo que puede dar un resultado tanto positivo como negativo.

En el caso de ser del género Shigella para identificar de que especie se trata utilizaríamos las siguientes pruebas bioquímicas:

Pruebas bioquímicas para identificar especies de Shigella

PRUEBA DEL D-Manitol

El propósito de la prueba es determinar si es microorganismo en cuestión es capaz de fermentar el manitol.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo con manitol. Se añade el indicador rojo de fenol y la muestra y se cultiva a 37ºC.

Viraje del Indicador

El rojo de fenol es:

Rosa/Magenta: pH > 8,2 Rojo: 8,2 > pH > 6,8 Amarillo: pH < 6,8

Interpretación

La fermentación del manitol acidifica el medio y disminuye el pH haciendo virar al indicador. Si no fermenta el manitol permanecerá el color rojo.

Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.

Permite identificar a la especie Shigella dysenteriae que es la única d-manitol negativa de las especies Shigella flexneri, Shigella sonnei y Shigella boydii que son positivas.

PRUEBA DEL ONPG

El propósito de la prueba es ver si el microorganismo en cuestión es capaz de fermentar la lactosa. En este proceso participa una enzima llamada beta-galactosidasa por ello se busca identificar la presencia de esa enzima que confirma la capacidad de fermentar la lactosa.

Procedimiento

Se prepara un medio de cultivo conlactosa y ONPG (ortonitrofenil-b-D-galactopiranosido). Se añade la muestra y se cultiva a 37ºC durante 24horas.

Interpretación

El ONPG se usa una molécula “señuelo” ya que también interacciona con la enzima pero en este caso cambia a color amarillo en presencia de la enzima debido a la producción de orto-nitrofenol.

Ensayo positivo: color amarillo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color permanece transparente.

Sirve de prueba identificadora de la especie Shigella sonnei ya que del resto de las Shigellas es la única capaz de fermentar lactosa.

Raquel Terragno, María Inés Caffer y Norma Binsztein (2007), indican que las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciación de los miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerogénicos, no móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E.coli.

RESULTADOS

Para identificar la especie que se encontraba en la muestra decidimos guiarnos por el siguiente flujo grama y realizar las pruebas más convenientes.

Se realizaron las pruebas que se creyeron más adecuadas para la identificación de Shigella o E. coli y los resultados fueron los siguientes:

DISCUSIÓN

A la vista de los resultados vimos que la muestra presentaba organismos Gram negativos. Por ello sabíamos que podía ser alguna de las enterobacterias buscadas.

Para discernir entre Escherichia coli y Shigella se uso la prueba del mucato, acetato y glucosa (gas). La del mucato dio negativo por lo que ya era muy probable que fuese Shigella, luego las siguientes 2 pruebas del acetato y glucosa (gas) dieron negativo por lo que confirmaban que se trataba de Shigella.

Tras confirmarlo se decidió determinar la especie con más pruebas bioquímicas en este caso las adecuadas son la del D-Manitol y la del ONPG. A partir de la prueba del D-manitol obtuvimos datos resultado positivo permitiendo descartar a la Shigella dysenteridae y la ONPG también dio positivo confirmando que se trataba de la especie Shigella sonnei.

BIBLIOGRAFÍA

Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris (2003), Microbiología (Tomo I), Editorial Paraninfo.

Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris (2007), Microbiología (Tomo II), Editorial Paraninfo.

Raquel Terragno, María Inés Caffer y Norma Binsztein (2007) Manual de procedimiento. Diagnóstico, aislamiento y procedimiento de Shigella spp., Departamento de bacteriología, Organización Panamericana de la Salud.

Adrian N. C. Delaat (1976), Microbiología, Nueva editorial interamericana.

Lansing M. Prescott, John P. Harley y Donald A. Klein (2000), Microbiología, McGrawHill.

Jorge J. Banwart (1982), Microbiología básica de los alimentos, Ediciones Bellaterra.

Ramón Parés y Antonio Juárez (1997), Bioquímica de los microoganismos, Editorial Reverté.

I. Poilane y A. Collignon (2006), Biodiagnóstico de las diarreas agudas bacterianas y virales, Acta bioquímica clínica latinoamericana.

Página oficial de Intuitive Systems Inc.

A raíz de los resultados se realizaron las últimas pruebas y se obtuvieron los siguientes resultados:

Tinción de Gram -Mucato -Acetato -

Glucosa (Gas) -

D-Manitol +ONPG +