NUKLEINSYRORNAS UPPBYGGNAD: Två olika nukleinsyror: • DNA deoxyribonukleinsyra • RNA ribonukleinsyra

Monomererna som bygger upp nuklein-syrorna kallas NUKLEOTIDER. En nukleotid består av tre delar: • en kvävebas • en sockerenhet • en fosfatgrupp

I DNA är sockret deoxyribos och i RNA ribos:

I respektive nukleinsyra är det nukleotidernas ordning som står för den genetiska inform-ationen som så småningom kan översättas till aminosyrasekvens. Det finns fem olika kvävebaser som delas in i två grupper efter deras struktur:

I DNA finns: C T A G I RNA finns: C U A G

Sockret och kvävebasen kopplas samman via en N-glykosidbindning – en nukleosid bildas:

När en fosfatgrupp förestrats till C5 erhålls en nukleotid.

Nukleinsyror bildas när nukleotider kopplas samman. Två nukleotider förbinds via fosfatgruppen i en FOSFODIESTER-BINDNING. Det är C3 i ett socker som förbinds med C5 i nästa.

En DNA- eller RNA-sekvens skrivs ALLTID 5’ 3’ så att inte missförstånd ska uppstå (precis som proteinsekvensen alltid skrivs N C).

DNA är dubbelsträngat medan RNA är enkelsträngat. I DNA-helixen basparar • adenin (A) med tymin (T) • cytosin (C) med guanin (G)

Notera; • En DNA-helix består av två

antiparallella nukleotidkedjor, den ena löper 5’ 3’ och basparar med en annan kedja som går 3’ 5’.

• Fosfatgrupperna och sockerenheterna sitter på utsidan och kvävebaserna inåt.

• En purin basparar alltid med en pyrimidin så helixens diameter blir hela tiden lika stor.

• Ett AT-baspar hålls samman av två vätebindningar och ett GC-baspar av tre.

DNA-strukturen publicerades av Watson & Crick 1953.

Dubbelhelixens geometri:

• Eftersom en större pyrimidinbas alltid basparar

med en mindre purinbas är innerdiametern på helixen hela tiden 11Å (1Å = 1·10-10 m) och ytterdiametern 20Å.

• Ett varv i dubbelhelixen är 34Å och innehåller 10 baspar.

• På ett varv finns en ”MAJOR GROOVE” och en ”MINOR GROOVE”. I dessa fördjupningar kan proteiner fästa.

• Utsidan av helixen är negativt laddad (fosfatgrupper) vilket gör att positivt laddade joner (katjoner) som Na+ och Mg2+ associeras till DNA:t in vitro. In vivo är DNA:t i cellkärnan uppvirat på positivt laddade proteiner, s k histoner, vilket ger effektiv tätpackning.

• Prokaryot DNA är cirkulärt medan eukaryot DNA är linjärt.

Denaturering av DNA: Eftersom dubbelhelixen bara hålls samman av nonkovalenta bindningar (vätebindningar) räcker det att värma ett DNA-prov för att de två kedjorna ska separera. När DNA-kedjorna separeras säger man att DNA:t denatureras eller smälter. Vilken temperatur som krävs beror på andelen GC-baspar relativt AT-baspar. Om temperaturen sänks återbildas dubbelhelixen spontant.

Man kan följa denatureringen spektrofoto-metriskt vid 260 nm. Denaturerat DNA absorberar mer ljus än den nativa formen eftersom kvävebaserna som svarar för absorptionen exponeras i denaturerat DNA.

Även enkelsträngat RNA bildar väldefinierade tredimensionella strukturer som stabiliseras av vätebindningar. Vätebindningarna binder ihop olika delar av en och samma RNA-kedja. Ett vanligt motiv är s k hårnålsloopar:

Molekylärbiologins centrala dogma:

Replikation: Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell ska delas måste DNA:t dupliceras – man måste få nytt DNA med exakt samma bassekvens som originalet.

Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg:

Transkription: Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mRNA. mRNA fungerar sedan som mall för proteinsyntesen. Translation: Bassekvens i mRNA översätts till aminosyrasekvens m h a tRNA. Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA KODEN och specificerar en viss aminosyra.

Replikationen: Först måste de två DNA-kedjorna separeras och sedan ska två nya kedjor bildas med originalen som mallar:

Eftersom det i varje ny DNA-molekyl kommer att finnas en ny och en gammal DNA-kedja säger man att DNA-replikationen är SEMIKONSERVATIV. (DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi Reaktionen katalyseras av DNA-polymeraser.

dNTP = dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Reaktionsmekanism för bildande av en ny fosfodiesterbindning: Hydroxylgruppen på C3 i ett socker gör en nukleofil attack på den innersta fosfor-atomen i nästa trifosfatnukleotid. Fosfaten är kopplad till C5 i nästa socker, alltså 3’,5’-fosfodiesterbindning.

Notera; • Ny nukleotid binder alltså först till

mallkedjan genom basparning och sedan sätts den nya kedjan ihop kovalent.

• Energikrävande process

DNA-polymeraser kräver en primer för att kunna starta syntes av en ny kedja. Primern utgörs av en kort RNA-sekvens och det viktigaste strukturmotivet är en fri 3’-OH-grupp:

Finns flera olika DNA-polymeraser men de viktigaste är: DNA-polymeras III: Främst ansvarig för polymerisationen av den nya kedjan. DNA-polymeras I: Kontrollerar att rätt nukleotid satts in. DNA-polymeras I har EXONUKLEAS-aktivitet vilket innebär att om ett fel upptäcks kan polymeraset klippa bort det och sätta in rätt nukleotid istället. Mycket viktigt eftersom fel vid replika-tionen kan få stora konsekvenser!

Problem: DNA-polymeras katalyserar bildande av ny DNA-kedja 5’ 3’ och rör sig längs den gamla kedjan 3’ 5’. Men en av kedjorna i helixen exponeras ju 5’ 3’…. Lösning: Den ena kedjan syntetiseras diskontinuerligt i s k Okazakifragment.

För varje Okazakifragment krävs en primer och för att sedan koppla ihop fragmenten krävs ytterligare ett enzym, DNA-ligas.

Andra proteiner som är viktiga vid replikationen:

Topoisomeras och helikas: Öppnar upp dubbelhelixen. ”Single strand binding proteins”: Binder till enkelsträngat DNA som temporärt bildas och skyddar det från nukleaser som annars attack-erar enkelsträngat DNA och bryter ner det. Primas: Katalyserar bildandet av RNA-primers som behövs för att DNA-polymeraset ska kunna syntetisera ny kedja. Ligas: Kopplar ihop fragment kovalent.

Ibland blir det dock fel vid replikationen: PUNKTMUTATIONER Tre typer: SUBSTITUTION: en kvävebas byts ut mot en annan DELETION: en bas tas bort INSERTION: en bas sätts till De två sista är allvarligast eftersom de förskjuter hela läsramen. Substitution är vanligast och finns i två varianter: *TRANSITION purin purin pyrimidin pyrimidin *TRANSVERSION purin pyrimidin pyrimidin purin Felfrekvens: 1/1010 nukleotider

Kemiska mutagener: • Ämnen som liknar de normala baserna

och därför kan inkorporeras i deras ställe. Ex. 5-bromouracil.

• Ämnen som modifierar befintliga baser vilket leder till mutationer vid nästa replikation. Ex. HNO2.

• Ämnen som interkalerar, binder in mellan baserna, i DNA-strukturen och kan uppfattas som en bas vid nästa replikation. Ex. etidiumbromid.

UV-ljus: UV-ljus kan leda till ihopkoppling av närliggande tyminer. Skydd: Reparationsmaskineri i tre steg: • Felet upptäcks och felaktig bas tas bort –

olika enzymer för olika fel. • Ny korrekt bas sätts in av DNA-

polymeras I. • Kedjan kopplas ihop av DNA-ligas.

Flera cancersjukdomar orsakas av defekt DNA-reparationsmaskineri: Exempel: I sjukdomen Xeroderma pigmentosum saknas enzymet som tar bort tymin-dimererna som bildas vid exponering för UV-ljus. Patienterna får hudcancer och dör ofta innan de fyllt 30 år.