3/22/16

1

IMMUNOASSAY

Az immunassay-k jelentősége “Az analitikai biokémia hátaslova”

Alkalmazás

Részesedés

Analit típusa Koncentráció tartomány

Gyógyszerszint meghatározás

26% Kis molekulák 10 nM-mM

Fertőző betegségek 21% Baktériumok, vírusok, nagy molekulák, antitestek, metabolitok

low

Endokrinológia

33% Kis molekulák, nagy molekulák beleértve az antitesteket is (70% <5 kDa)

pM-nM

Immunológia allergia, autoimmunitás, egyéb

7% Antitestek pM-nM

Tumor 5% Nagy molekulák, antitestek pM-nM

Egyéb (specifikus proteinek stb.)

8% Nagy molekulák > nM

Immunoassay típusok

Homogén - Heterogén

Direkt - Indirekt

Kompetitív - Nem kompetitív

AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI

Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L Kompetitív (a reagens mennyisége limitált) szimultán: Ab + Ag + Ag-L több lépéses: 1. lépés: Ab + Ag Ab:Ag + Ab 2. lépés: Ab:Ag + Ab + Ag-L Nem kompetitív (a reagens feleslegben van)

Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L

HETEROGÉN: a komplexben kötött és szabadon lévő ligandummal jelzett reagenst a lekötődött jel detektálása előtt elválasztjuk

HOMOGÉN: a kötött és szabad jelzett reagens elválasztása nem szükséges

L=ligand: radioaktív izotóp, fluorofór, enzim, chemiluminescens, kofaktor, inhibitor, fém, partikulum, szubsztrát, polinukleotid

3/22/16

2

Csak abban az esetben használatos, ha egy specifikus és nagyon érzékeny módszerre van szükség. A RIA hátrányai: •  a nagy γ-sugárzó izotóp atomokkal történő jelölés, mint a

I125 gyakran nem megfelelő (a gyógyszerek kis molekulák, nem hatékony a jelölés vagy csökken az antigenitásuk)

•  a tríciummal való jelölés megfelelő, de ennek hátránya, hogy a H3 β-sugárzó és a β -scintillációs számlálás lassú és körülményes.

•  Csak heterogén módszer lehet.

Antigén helyett az antitest jelölése izotóppal: immunoradiometric assay (IRMA)

RADIOIMMUNOASSAY (RIA) FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) I.

A módszer elve:

•  egy fluoreszkáló anyaghoz (fluorofór) kémiai kötéssel antigént (gyógyszer, hormon, metabolit) kapcsolnak (konjugátum)

•  a fluorofórhoz kötött antigént megvilágítják polarizált fénnyel

•  Ha a konjugátumhoz nem kötődik antitest, szabadon rotál az oldatban és a beeső és az emittált fény síkja egymáshoz képest elmozdulhat.

•  Ha a konjugátumhoz antitest kötődik, az antitest molekula nagy mérete kb. 100x-ra csökkenti annak rotációs relaxációs idejét. Ez azt jelenti, hogy csak kis elmozdulás jöhet létre ugyanannyi idő alatt, ezért az elnyelt és kibocsátott fény ugyanabban a síkban polarizált.

•  Az emittált fény polarizációjának mértéke arányos a szabad konjugátum mennyiségével.

•  Ha a mintában lévő szabad antigén korlátozott mennyiségű antitest kötőhelyeiért versenyez a konjugátummal, a fény polarizációjának mértéke jelzi a minta antigén koncentrációját.

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) II.

A mintában nincs antigén

(az összes jelzett antigén antitesthez kötött – lassú rotáció)

At Ag At-Ag + antitest jelzett

antigén

minta

síkban polarizált beeső fény

ugyanabban a síkban kibocsátott fluoreszcencia

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) III.

A mintában jelen van az antigén (a mintában lévő antigén az antitesthez kötődik – a jelzett antigén szabadon rotál)

At-Ag + Ag + At antitest

Ag jelzett

antigén

minta

síkban polarizált beeső fény

Depolarizált fluoreszcencia A detektálás síkjában csökkent

fluoreszcencia intenzitás

+ Ag antigén a mintában

3/22/16

3

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) IV.

•  A készülékek a polarizált fény intenzitását mérik, ami fordított arányban áll a minta antigén koncentrációjával.

antigén koncentráció

pola

rizác

ió

Immunoassay típusok - nem kompetitív

első At Ag Ag

At

jel második At

jel

direkt at indirekt

direkt ag

At

jel Ag

szendvics

At 1

Ag

jel

At 2

Immunoassay formációk - kompetitív 1

Ag

jelzett At a reagensben

jelöletlen At a mintában

!!! Immunoassay formációk - kompetitív 2

jelzett Ag a reagensben jelöletlen At a

reagensben vagy a felszínen Ag a mintában

3/22/16

4

A szilárd felszín típusai • 96 lyukú mikrotitráló lemez felszíne (polystirol, PVC stb)

(ELISA) • Reakciócső felszíne (RIA) • Latex partikulumok felszíne (pl. MEIA) • Mágneses partikulumok felszíne (automatizált heterogén

immunoassay-k)

JELZÉSEK 1. Izotóp (125I: γ, T1/2= 60 nap

57Co: γ, T1/2= 270 nap 3H: β, T1/2= 12.26 év 14C: β, T1/2= 5760 év)

Enzim tormaperoxidáz HRPO (oxidoreduktáz) alkalikus foszfatáz AP (primer alkoholok, fenolok és aminok foszfát észtereinek hidrolízise) β-D- galaktozidáz glükóz oxidáz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz kataláz ureáz

JELZÉSEK 2. Fluorofór (megvilágítva fényt emittál)

1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU

Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) acridium észter acridium szulfonamid isoluminol

Biotin Protein A Kofaktor Inhibitor DNS

3/22/16

5

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Microwell Products

���

Enzyme-Linked ImmunoSorbent (ELISA) – leggyakrabban peptidek, proteinek, antitestek és hormonok kimutatására és meghatározására szolgál. Általában 96-well plate-t használunk (Corning’s/Nunc/Costar stb.), de lehet 384 well,

stb. Lépései: • A lemezt bevonjuk (capture) az antigénre specifikus elfogó antitesttel (1-10µg/

ml) leggyakrabban karbonát-bikarbonát pufferben (pH:9.5), inkubálás 2 h szobahőn vagy egy éjszakán át 4°C-on

•  mosás • A szabadon maradt felszín blokkolása (0,5-1% BSA), inkubálás 0,5-1 h szobahőn •  mosás • Standardok/minták bemérése (50-100 µl/well), inkubálás 1 h szobahőn •  mosás • Az antigénre specifikus, enzimmel (HRP/AP) konjugált jelző antitest bemérése,

inkubálás 1 h szobahőn •  mosás • Szubsztrát adása és detektálás Az inkubálási időket és hőmérsékleteket minden ELISA esetén optimalizálni kell.

ELISA (szendvics típus)

Ha az elfogó antitest biotinált és streptavidinnel bevont ELISA lemezt használunk, az elfogó, jelző antitesteket és a mintát egyszerre is bemérhetjük. Az inkubálási idő letelte után mossuk a lemezt majd bemérjük az enzim szubsztrátját és detektálunk (egylépéses ELISA).

ELISA (szendvics típus)

Streptavidinnel fedett felület

Reagensek Reakció

FXIII HRP-vel jelölt anti-FXIII-A jelzô antitest

A A B B

A A B B

Biotinilált anti-FXIII-B elfogó antitest

Az egy lépéses szendvics ELISA FXIII meghatározás elve

A lemez rázatása szükséges!

ELISA kalibrációs görbe

Szükség van istmert ag koncentrációjú standardra!

3/22/16

6

Indirekt ELISA módszer (adott antigénre specifikus antitest kimutatása)

MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay)

Anti-Troponin I monoklonális antitesttel fedett Latex szemcsék

Üvegszál mátrix

A Mikropartikuláris Enzim Immunoassay (MEIA) elméleti alapjai

A mérendő anyagra specifikus elfogóval fedett szubmikron nagyságú latex részecskéket alkalmaz a módszer. Következmény:

nagy, hatékony felületet az immunreakció számára. a kinetikus reakció felerősödik, csökken az inkubációs idő.

Mintavevő egységben:

A mérendő minta és a szükséges reagensek egy reakcióedénybe kerülnek Mérőegységben: 1.  A minta inkubálódik 2.  A reakcióelegy egy inert üvegszálas mátrix felületére kerül át. Az immunkomplex

fennmarad az üvegszálakon, a reakcióelegy többi összetevője átáramlik, kimosódik. 3.  Az üvegszálas mátrix felületére egy a mérendő anyagra specifikus, alkalikus foszfatázzal

jelzett konjugátum kerül. 4.  Az üvegszálas mátrix felületére 4-Methylumbelliferyl-foszfát (MUP) kerül, melyet az

enzim Methylumbelliferonná (MU) hidrolizál. 4.  A reakció során a mátrix felületén keletkező fluoreszcens MU képződési rátáját mérjük,

ami arányos a mintában lévő analit koncentrációjával.

A MEIA reakció lépései Kétlépéses

MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát

REAKCIÓ EGYSÉG A minta és a Mikropartikulumok keverednek

Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik

MOSÁS

Fluoreszcencia mérés

Alkalikus foszfatáz konjugát a mátrixra

MOSÁS

Egylépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát

REAKCIÓ EGYSÉG A minta a Mikropartikulumok és az Alkalikus foszfatáz konjugát keverednek

Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik

MOSÁS

Fluoreszcencia mérés

3/22/16

7

Tipikus standard görbe MEIA módszer esetén JELZÉSEK

Fluorofór (megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU

DELFIA: a TRF (Time Resolved Fluorometry) elvén működik

A DELFIA rendszerben a fluorometer 1000 excitációs fényfelvillanást szolgáltatmásodpercenként, melyek kevesebb, mint 1 mikrosecundumig tartanak. A fluoreszcenciamindegyik impulzus után 400 és 800 mikrosecundum között mérhető

JELZÉSEK Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) Enzim szubsztrátja kemiluminescens fényemisszióval stabilizálódik, pl: AP

szubsztrátja az adamantil 1,2-dioxetan arylfoszfát (AMPPD) isoluminol (A HRPO hatására, H2O2 jelenlétében bekövetkező luminol oxidáció fényemisszió

jelerősségét 1000-szeresre növelhetjük, ha a közegben szubsztituált fenolok, vagy naftolok vannak (pl. 4-jodofenol). Az enhanced kemilumineszcenciás jel 2-20 perc időtartamban jól leolvasható. Ezt a jelképzést sok automatizált módszer használja)

acridium észter, acridium szulfonamid (A jel keletkezésekor alkalikus közegben az észter kötés hasad s egy instabil N-metilakridon származék keletkezik, amely jellemző hullámhosszúságú fény felvillanások emissziójával stabilizálódik. A fényintenzitás mértéke a közeg lumineszcens anyag koncentrációjával arányos.)

Eltérően a fluoreszcencia méréstől, itt nincs besugárzási fény, és jel csak a lumineszcens molekulából származik, így a háttér teoretikusan nem ad jelet. Eltérően a radioaktív bomlástól, a kémiai reakcióból származó összes foton rövid idő alatt rendelkezésre áll, így növelve a potenciális specifikus aktivitást.

3/22/16

8

JELZÉSEK 4. Elektrokemiluminescens immunoassay (ECLIA)

A rutenium(II) tris (bipiridil) [Ru(bpi)33+], egy platina elektród felületén gerjesztődik, majd

alapállapotba kerül fény (elektrokemilumineszcens) emisszióval. A reakcióban elektron donorként tripropilamin (TPA) vesz részt. A Ru(bpi)3

3+ komplex redukciójával nyerjük a gerjesztett állapotú Ru(bpi)3

2+ komplexet, amely elektronleadás mellet fénykibocsátással tér vissza alapállapotába. Ezt a fénykibocsátást (620 nm) mérik egy átfolyó elektrokémiai cellában. Elektrondonor felesleg mellett a ruténium sokszorosan gerjeszthető, ami a jel erősödését eredményezi.