Imunomodulação da encefalomielite autoimune experimental pelo ...

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    25-Jan-2017

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<ul><li><p>ANDERSON DANIEL RAMOS </p><p>Imunomodulao da encefalomielite autoimune </p><p>experimental pelo extrato da glndula salivar de </p><p>Aedes aegypti </p><p>Tese apresentada ao Programa de Ps-</p><p>Graduao em Imunologia do Instituto de </p><p>Cincias Biomdicas da Universidade de So </p><p>Paulo, para obteno do Ttulo de Doutor em </p><p>Cincias. </p><p>rea de concentrao: Imunologia </p><p>Orientador: Prof. Dr. Anderson de S Nunes </p><p>Verso corrigida. A verso original eletrnica </p><p>encontra-se disponvel tanto na Biblioteca do </p><p>ICB quanto na Biblioteca Digital de Teses e </p><p>Dissertaes da USP (BDTD). </p><p>So Paulo </p><p>2014 </p></li><li><p>RESUMO </p><p>Ramos AD. Imunomodulao da encefalomielite autoimune experimental pelo extrato da </p><p>glndula salivar de Aedes aegypti [Tese (Doutorado em Imunologia)]. So Paulo: Instituto de </p><p>Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo; 2014. </p><p>A saliva de insetos hematfagos uma fonte potencial de molculas biologicamente ativas. </p><p>Diversos trabalhos j demonstraram que a saliva destes animais possui molculas capazes de </p><p>modular o sistema imune do hospedeiro vertebrado com a finalidade de realizar o repasto </p><p>sanguneo e, consequentemente, em seu processo reprodutivo o qual dependente do sangue </p><p>ingerido. Baseando-nos na literatura cientfica a respeito das atividades presentes na saliva de </p><p>diversos artrpodes hematfagos, decidimos investigar no presente trabalho se o extrato da </p><p>glndula salivar (EGS) do mosquito vetor da dengue, Aedes aegypti, seria capaz de modular a </p><p>encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo animal para estudo da esclerose </p><p>mltipla. Para isso, imunizamos animais C57BL/6 com MOG35-55, um peptdeo </p><p>imunodominante da mielina de oligodendrcitos, e determinamos o regime de tratamento com </p><p>EGS de A. aegypti capaz de suprimir a doena. Demonstramos que a adio de EGS na </p><p>emulso de MOG35-55 seguido pela administrao intraperitoneal pelo perodo de 10 dias, foi </p><p>o protocolo mais eficiente para modulao dos sintomas da doena. Neste grupo, a incidncia </p><p>da doena foi menor do que no grupo que recebeu apenas veculo. Alm disso, mesmo os </p><p>animais que ficaram doentes, apresentaram atraso no aparecimento dos sinais clnicos e seus </p><p>sintomas foram mais brandos. Tambm observamos que a modulao pelo EGS no se deu na </p><p>fase efetora da resposta imune, pois quando realizamos o tratamento somente via </p><p>intraperitoneal no observamos diferena no quadro clnico. Adicionalmente, a anlise das </p><p>clulas do sistema nervoso central no mostrou efeito do EGS sobre as subpopulaes de </p><p>linfcitos T. Finalmente, nossos dados sugerem que a ao do EGS ocorre durante a induo </p><p>da resposta imune, uma vez que sua presena somente na emulso contendo MOG35-55 (sem o </p><p>tratamento intraperitoneal), suficiente para reproduzir grande parte dos efeitos observados, </p><p>sugerindo um papel nos mecanismos de processamento e/ou apresentao de antgeno. De </p><p>fato, nossos experimentos demonstraram que o EGS consegue suprimir a doena por quatro </p><p>vias principais: 1) atuando diretamente em clulas dendrticas e diminuindo a expresso de </p><p>MHC de classe II, CD80 e CD86, alm de diminuir a produo de citocinas responsveis pela </p><p>induo das respostas Th1 e Th17; 2) induo de clulas produtoras de IL-10 ex vivo; 3) </p><p>diminuio das respostas de linfcitos T nave, talvez como consequncia parcial da apoptose </p><p>induzida pelo EGS ou apresentao deficiente dos antgenos; 4) induo sistmica de clulas </p><p>com perfil Th2 com maior produo de IL-4 e IL-5, sugerindo um desvio do eixo Th1/Th17 </p><p>durante a resposta imune. Como concluso, temos que o EGS de A. aegypti capaz de atuar </p><p>tanto na supresso dos sintomas durante o curso da EAE, como tambm atuar </p><p>preventivamente inibindo o incio da resposta imune, sendo assim um candidato para a </p><p>descoberta de molculas bioativas que no futuro possam vir a ser usadas na teraputica da </p><p>esclerose mltipla e outras doenas autoimunes. </p><p>Palavras-chave: Aedes aegypti. Extrato da glndula salivar. Encefalomielite autoimune </p><p>experimental. Imunomodulao. Doenas autoimunes. </p></li><li><p>ABSTRACT </p><p>Ramos AD. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by salivary </p><p>gland extract of Aedes aegypti [Thesis (Ph.D. in Immunology)]. So Paulo: Instituto de </p><p>Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo; 2014. </p><p>Saliva of hematophagous insects is a potential source of biologically actives molecules. </p><p>Previous studies have indicated that the saliva of these animals can modulate the immune </p><p>system of the vertebrate host, in order to carry out the blood feeding and, consequently in his </p><p>reproductive process which depends on the ingested blood. Based on the activities described </p><p>in the saliva of several hematophagous arthropods, we decided to investigate in this work </p><p>whether the salivary gland extract (SGE) of the mosquito vector of dengue, Aedes aegypti, </p><p>could modulate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of </p><p>multiple sclerosis. For this, we have immunized C57BL/6 mice with MOG35-55, an </p><p>immunodominant peptide of myelin oligodendrocyte and determine the treatment with A. </p><p>aegypti capable of suppressing the disease. We have demonstrated that, the period of 10 days </p><p>was the most efficient protocol for the modulation of disease symptoms. In this group, the </p><p>disease incidence was lower than in the group that received only vehicle. Moreover, even the </p><p>animals that developed clinical symptoms showed a delayed onset of clinical signs, making </p><p>them less affected by the disease. We also observed that modulation by SGE did not occur in </p><p>the effector phase of immune response, because when the treatment is performed </p><p>intraperitoneally only, no difference was observed in the clinical signs. Additionally, analysis </p><p>of central nervous system cells showed no effect of the SGE on subpopulations of T </p><p>lymphocytes. Finally, our data suggest that the action of SGE occurs during the induction </p><p>phase of immune response, since its presence only in emulsion containing MOG35-55 (without </p><p>intraperitoneal treatment) is sufficient to reproduce most of the observed effects, suggesting a </p><p>role in processing mechanism and/or antigen presentation. Indeed, our experiments have </p><p>shown that SGE can suppress disease through four mainly routes: 1) acting directly on </p><p>dendritic cells and decreasing the expression of MHC class II, CD80 and CD86, besides </p><p>decreasing the production of cytokines responsible for Th1 and Th17 response induction; 2) </p><p>inducing IL-10 producing cells ex vivo; 3) decreasing the response of naive T lymphocytes, </p><p>perhaps as a partial consequence of apoptosis induced by SGE or poor antigen presentation; </p><p>4) systemic induction of Th2 cells with increased production of IL-4 and IL-5, suggesting a </p><p>shift of Th1/Th17 axis during immune response. In conclusion, we have shown that A. aegypti </p><p>SGE is able to relieve the symptoms during the course of EAE and also to act preventively, </p><p>inhibiting the initiation of immune response, becoming a candidate for the discovery of </p><p>bioactive molecules that can be used in the future for the treatment of multiple sclerosis and </p><p>other autoimmune diseases. </p><p>Keywords: Aedes aegypti. Salivary gland extract. Experimental autoimmune </p><p>encephalomyelitis. Immunomodulation. Autoimmune diseases. </p></li><li><p>1 INTRODUO </p></li><li><p>16 </p><p>1.1 Aedes aegypti </p><p>O filo Arthropoda possui aproximadamente 1.096.660 espcies descritas, constituindo </p><p>85% de todas as j catalogadas pelo homem (1), embora o nmero total de espcies estimado </p><p>fique entre 5 e 10 milhes (2). Dentro do grupo dos artrpodes, diversas espcies </p><p>desenvolveram de forma independente ao longo da evoluo o hbito hematofgico, que </p><p>consiste na ingesto de sangue de animais vertebrados. Estima-se que existam </p><p>aproximadamente 14.000 espcies de artrpodes que se alimentam de sangue (3). Dentre os </p><p>grupos de artrpodes hematfagos, os mosquitos recebem ateno especial, pois, segundo a </p><p>Organizao Mundial da Sade (OMS), so responsveis por mais de 1 milho de mortes/ano, </p><p>por serem os vetores de diversas doenas emergentes e reemergentes (4). </p><p>Os principais gneros de mosquitos que se alimentam de sangue so Anopheles, Culex, </p><p>Aedes, Psorophora, Ochlerotatus, Sabethes, Wyeomyia, Culiseta, e Haemagogus (5). No </p><p>Brasil, uma das espcies de mosquito mais importantes em termos de sade pblica o Aedes </p><p>aegypti. Esse inseto possui uma distribuio na regio tropical do globo, sendo o vetor </p><p>primrio de doenas como a febre amarela, febre Chikungunya e dengue (69). No caso </p><p>especfico da dengue, dados globais de 2010 mostram que foram registrados cerca de 96 </p><p>milhes de casos graves e aproximadamente 300 milhes de casos moderados ou </p><p>assintomticos. Setenta por cento dos casos graves de dengue ocorrem na sia, sendo que a </p><p>ndia responde sozinha por 34% desse total. Nas Amricas, o Brasil e o Mxico apresentam </p><p>cerca de 14% dos casos graves, praticamente a mesma porcentagem da frica, conforme </p><p>apresentado na Figura 1 (10). No Brasil, epidemias recorrentes tm ocorrido ao longo das </p><p>duas ltimas dcadas embora, segundo o Ministrio da Sade, no primeiro bimestre de 2014 </p><p>tenha ocorrido uma diminuio de 80% no nmero de casos em relao ao mesmo perodo de </p><p>2013 (427 mil em 2013 para 87 mil este ano). No Estado de So Paulo, porm, a situao </p><p>um pouco diferente e at junho de 2014 o nmero de casos registrados em todo o estado j </p><p>chegava marca de 98.468 (11), o que significa metade de todos os casos registrados no ano </p><p>de 2013 (12). Um levantamento recente divulgado pela Secretaria Municipal de Sade revela </p><p>que no municpio de So Paulo ocorreram mais de 6 mil casos da doena esse ano, o que </p><p>representa mais do que o dobro na comparao com o mesmo perodo de 2013 (13). </p></li><li><p>17 </p><p>Figura 1 Evidncia global e infeco da dengue em 2010. (a) Evidncias nacionais da total presena </p><p>(verde) ou total ausncia (vermelho) da dengue. (b) Cartograma do nmero anual de </p><p>infeces para todas as idades como proporo nacional da rea geogrfica (modificado de </p><p>Bhatt et al., 2013). </p><p>Para obter sucesso no repasto sanguneo, o mosquito A. aegypti fmea enfrenta dois </p><p>grandes obstculos: a hemostasia e o sistema imune do hospedeiro (14). Com relao </p><p>hemostasia, j foram descritas diversas molculas presentes na saliva de A. aegypti com </p><p>propriedades capazes de modular o sistema da coagulao. Entre as molculas presentes na </p><p>saliva temos a apirase, capaz de inibir agregao plaquetria, via hidrlise de ATP e ADP </p><p>liberados pelas clulas lesadas ou plaquetas ativadas (15). A aegyptina tambm exerce ao </p><p>Evidncia</p><p>Indeterminada</p><p>Pobre</p><p>Moderada</p><p>Boa</p><p>Completa presena</p><p>Pobre</p><p>Moderada</p><p>Boa</p><p>Completa ausncia</p><p>A.</p><p>Infeces Anuais</p><p>0,5-1 milho</p><p>7,5-32,5 milhes</p><p>275,000-500,000</p><p>150,000-275,000</p></li><li><p>18 </p><p>sobre a agregao de plaquetas, atravs de sua ligao ao colgeno, bloqueando a interao </p><p>com os componentes sanguneos (16,17). J a vasodilatao verificada durante o repasto do A. </p><p>aegypti basicamente desencadeada pela ao das sialocininas I e II (18). Adicionalmente, </p><p>tambm foi caracterizado um inibidor de serino-proteases (serpina) capaz de atuar sobre o </p><p>fator Xa da cascata de coagulao (19). Nosso grupo vem trabalhando com outra serpina </p><p>salivar que tambm apresenta atividade anticoagulante, embora menos potente, mas cujo </p><p>mecanismo ainda desconhecido (20). Deste modo, j foram descritas diversas molculas </p><p>presentes na saliva de A. aegypti capazes de modular a hemostasia, com o objetivo de garantir </p><p>o sucesso do animal no repasto sanguneo que ocorre no hospedeiro vertebrado. </p><p>Outro desafio enfrentado pelo mosquito durante sua alimentao o sistema imune do </p><p>hospedeiro. As atividades imunoduladoras da saliva de A. aegypti no hospedeiro vertebrado </p><p>esto comeando a ser entendidas. Por exemplo, j foi visto que o extrato da glndula salivar </p><p>(EGS) de A. aegypti capaz de inibir a secreo de TNF- em mastcitos de ratos, porm a </p><p>liberao de histamina por estas clulas no afetada (21). O EGS tambm capaz de </p><p>suprimir a expresso de transcritos de IL-12, IFN- e a enzima xido ntrico sintase induzvel </p><p>em clulas dendrticas e macrfagos de camundongos, inibindo assim o desenvolvimento de </p><p>uma resposta do padro Th1 (22). Wanasen e colaboradores (2004) demonstraram que a </p><p>resposta proliferativa de linfcitos de bao in vitro, tanto antgeno-dependente quanto </p><p>antgeno-independente, foi suprimida na presena do EGS de A. aegypti. Resultados </p><p>semelhantes foram apresentados no mesmo ano por Wasserman e colaboradores (2004), que </p><p>tambm mostraram uma diminuio significativa na produo de IL-2, IFN-, IL-12, GM-</p><p>CSF, TNF-, IL-4, IL-5 e IL-10 em linfcitos de camundongos DO11.10 estimulados com </p><p>ovalbumina (OVA). Essa reduo macia da produo de citocinas se correlacionou com um </p><p>aumento na morte de populaes linfocitrias, que foi induzida por uma frao de alto peso </p><p>molecular, presente na saliva de A. aegypti. Alm disso, os linfcitos sobreviventes </p><p>apresentaram menor capacidade proliferativa (23). </p><p>Sabendo que a saliva capaz de modular os elementos celulares e humorais da </p><p>resposta imune de seus hospedeiros, plausvel imaginar que essa regulao seja capaz de </p><p>proporcionar aumento da infectividade dos patgenos transmitidos. Essa hiptese foi </p><p>corroborada pela inoculao intradrmica do vrus do Nilo Ocidental em stios onde o </p><p>mosquito havia se alimentado, o que provocou alta viremia e acelerada neuroinvaso </p><p>comparado aos animais apenas infectados, mas sem prvia exposio s picadas (25). </p><p>Posteriormente, observou-se que quanto maior a exposio dos camundongos ao A. aegypti, </p></li><li><p>19 </p><p>maior a taxa de mortalidade dos animais infectados pelo mesmo vrus. Nestes animais pr-</p><p>sensibilizados pelas picadas houve uma maior expresso de IL-10 na pele e linfonodos, que </p><p>possivelmente criou um microambiente favorvel para a replicao viral (25). Na tentativa de </p><p>mimetizar a infeco natural, o mesmo grupo inoculou o vrus Sindbis simultaneamente com </p><p>a saliva de A. aegypti e encontrou uma potencializao na infeco viral, com maior </p><p>expresso de IL-4 e IL-10, concomitantemente com menor expresso de IFN-, quando </p><p>comparado aos animais que receberam apenas o vrus (26). Portanto, possvel assumir que a </p><p>presena da saliva de A. aegypti durante as infeces induz patologia exacerbada de alguns </p><p>agentes infecciosos por inibir a imunidade celular (Th1), elevar a resposta anti-</p><p>inflamatria/reguladora e, em alguns casos, tambm da populao de linfcitos Th2. </p><p>Em nosso laboratrio, demonstramos que a sensibilizao de camundongos com as </p><p>picadas do mosquito e posterior desafio intranasal com EGS induz inflamao pulmonar, com </p><p>aumento no nmero de eosinfilos, clulas T CD4+, CD19</p><p>+e citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 no </p><p>lavado broncoalveolar, anticorpos IgE total e IgG1 e IgG2a especficos no soro. Analisados </p><p>em conjunto, nossos dados demonstraram o desenvolvimento de uma resposta alrgica </p><p>diferente dos modelos clssicos, com a presena de elementos que sugerem uma resposta </p><p>mista, tanto de perfil Th1 quanto Th2 (27). Tambm observamos que o EGS de A. aegypti </p><p>afeta a ativao de macrfagos por LPS e IFN-, diminuindo a produo de xido ntrico e </p><p>das citocinas inflamatrias IL-6 e IL-12 (Barros, tese de Doutorado em andamento). </p><p>Adicionalmente, avaliando os efeitos dos componentes salivares de A. aegypti na biologia de </p><p>clulas d...</p></li></ul>

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