UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

INTEGRANTES: CURSO: OCTAVO SEMESTRE ALVEAR SANDRA BASANTES FERNADA FIENCO ESTEFANIA GUEVARA DIANA HERAS DIANA

1. TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS SACHAROMYCCES CEREVISIAE

TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE AGUARDIENTE

2. OBJETIVO GENERAL:Aislar, seleccionar y caracterizar cepas termotolerantes y resistentes a altas concentraciones de alcohol de Saccharomyces cerevisiae para el mejoramiento de la producción de aguardientes, teniendo como materia prima melaza de caña de azúcar y residuos de la etapa de fermentación de caña de azúcar.

2.1 OBEJTIVOS ESPECIFICOS:

Obtener melaza de caña de azúcar mediante la preparación, extracción del jugo, clarificación, evaporación, cristalización y centrifugación

Aislar las cepas de Saccharomyces cerevisiae fermentadoras y de melaza de caña de azúcar.

Determinar los parámetros de selección de las mejores cepas de Saccharomyces cerevisiae.

Seleccionar las cepas de Saccharomyces cerevisiae termotolerantes y resistentes a etanol del cultivo aislado de melaza de caña.

Obtener cultivos axénicos de Saccharomyces cerevisiae Caracterizar morfológicamente las cepas aisladas de Saccharomyces cerevisiae. Preservar las mejores cepas de Saccharomyces cerevisiae.

3. INTRODUCCION:

Para realizar el presente trabajo nos hemos basado en publicaciones científicas sobre rendimientos de producción de etanol.

Los fenómenos relacionados con la tolerancia térmica y la tolerancia a etanol de los microorganismos han sido investigados exhaustivamente. La temperatura optima de crecimiento especialmente de saccharomyces cereviciae es de 30° a 35 °C (Hernández et al., 1986), la temperatura afecta el crecimiento de manera notable, principalmente porque los

microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperatura, según estudios realizados se ha reportado que la tolerancia a el etanol y altas temperaturas son interactivos, porque las concentraciones altas de alcohol disminuyen la temperatura optima de crecimiento y el aumento de la temperatura incrementa el efecto inhibitorio de etanol por lo tanto afecta directamente al rendimiento (Sa-Correia y van Uden, 1983; van Uden, 1989;Laluce, 1991;Banat et al., 1998).

Los efectos tóxicos de la temperatura y el etanol están relacionados con alteraciones de la permeabilidad de las membranas celulares, la desnaturalización de proteínas intracelulares, así como la inhibición del transporte de nutrientes (D´Amore et al., 1990; Banet et al., 1998).El mecanismo de respuesta celular al estrés por temperatura y por etanol es esencialmente similar (Piper, 1995) y consiste en cambios en la composición lipídica de las membranas y en síntesis transitoria de proteínas (Thomas y Rose, 1979; Benschoter e Ingram, 1986). Entre las estrategias para mejorar la tolerancia térmica se encuentran la selección de cepas, adaptación de cepas mediante incubación a temperaturas crecientes.

En Ecuador el uso de melaza como sustrato para la producción de saccharomyces cerevisiae es utilizado para la obtención de aguardiente, existe alrededor de 78 000 hectáreas cultivadas de caña destinadas a la producción de azúcar. Unas 30 000 hectáreas de caña de azúcar están  destinadas a la producción de aguardiente y otros productos artesanales.

El total de aguardiente producido en el Ecuador es de 22.000 L/año, el rendimiento de las cepas nativas de sacharomyces cereviciae es de 0.39 g de etanol por cada gramo de azúcares a 35°C, pero a 40°C (cepas termotolerantes) se obtiene 0.41g de etanol por cada gramo de azúcares, lo que incrementaría el rendimiento a 29.096 L/año.

Tomando en cuenta los datos citados anteriormente, se puede establecer que la elaboración de aguardiente como bebida alcoholica es rentable en nuestro país y aunque no se pretende competir con las grandes fábricas productoras, se sugiere la optimización del proceso, con la utilización de cepas de sacharomyces cerevisiae termotolerantes que produce mayor cantidad de etanol con menor consumo de azucares, se economiza la materia prima por lo tanto disminuyen costos de producción que generaran un incremento de ingresos de una fabrica productora de aguardiente.

4. MARCO TEÓRICO

CAÑA DE AZÚCARLa caña de azúcar es una gramínea tropical, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser extraído y cristalizado forma el azúcar.

MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

Las melazas Es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido, sales y otros compuestos solubles en álcali que normalmente están presentes en el jugo de la caña localizada, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar.

4.2.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) DE LA MELAZA DE LA CAÑA DE AZÚCAR

COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO (p/p)

COMPONENTES MAYORES

Materia seca 78%Proteínas 3%sacarosa 60-63%

Azúcares reductores 3-5%Sustancias disueltas

(azúcares diferentes)4-8%

Agua 16%grasas 0.40%

Cenizas 9%

CONTENIDO DE MINERALES

Calcio 0.74%magnesio 0.35%

fósforo 0.08%potasio 3.67%

SALES Orgánicas 3.0-3.4%inorgánicas 1.5-4.5%

COMPONENTES MENORESÁcidos orgánicos 1-3%

Aminoácidos 1.5-5.5%Almidones 0.001-0.050%

MICROORGANISMOS DE LA MELAZALas melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboración de la caña de azúcar.Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos termófilos dentro de la melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan bien durante la dilución de las melazas.

SACCHAROMYCES CEREVISIAEEs la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de azucares.

Enriquecimiento Es una técnica que consiste en incrementar en una población mixta el número de organismos de interés en relación al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros.

Esto se logra mediante el empleo de sustratos específicos en el caso de Saccharomyces cerevisiae, como es el extracto de malta reforzado que ayuda a mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado.

Selección Para el proceso de selección la cepa debe cumplir ciertos factores como:Un alto rendimiento, Una alta velocidad de transformación, Crecer en un medio con bajo costo, Debe ser fácil de manejarla y transportarla.

Aislamiento En el aislamiento simplemente lo que se busca es obtener colonias separadas con el fin de evaluar sus características macro y microscópicas y finalmente, si se considera de interés proceder a su purificación y crio conservación.

Preservación La crio conservación es una técnica utilizada para mantener los microorganismos de importancia en la industria o en un estudio en particular en condiciones de bajas temperaturas con el fin de reducir su metabolismo normal hasta llevarlo a basal (manteniendo el microorganismo viable por largo tiempo, preservando las estructuras celulares) con el fin de evitar el envejecimiento o evolución de un determinado microorganismo, es decir sin cambios en sus características (genéticamente estables); además mantener los cultivos puros, reduciendo las probabilidades de contaminación.

5. MARCO METODOLOGICO:

5.1 PROCESO DE OBTENCIÓN DE MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

5.2 AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TÉCNICAS DE MUESTREO

Tipo de muestreo: Simple según la Norma NTON 03 036 – 01 y Norma Oficial Mexicana

NOM-142-SSA1-1995 Bebidas Alcohólicas

La muestra seleccionada para el análisis debe ser representativa del lote entero del

alimento y lo suficientemente grande para poder llevar a cabo todas las

determinaciones.

Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración (2-8°C) o en

congelación si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda

contaminar el alimento.

Reducir el tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra.

Muestras líquidas deben encontrarse homogéneas, emplearse de 100 a 500 ml.

Obtención de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda

de bisturí y pinzas, uso de isopos inertes estériles humedecidos en solución diluyente

estéril.

Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmósfera

y usar líquidos de dilución con bajo potencial redox como el medio de Stuart (con

tioglicolato) o medio enriquecido para clostridios (con cisteína).

MATERIALES: Cajas petri, cooler, isopos esteriles para tomar las muestras

5.2.1 AISLAMIENTO

Segun Método:

ERTOLA, Rodolfo; YANTORNO, Osvaldo. Sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores Capitulo 7. Aspectos generales de los procesos de fermentación Capitulo 2. (Parte de Monografías Científicas). Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA. Fecha de visita: 20 de septiembre de 2006.http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap7_mi.pdf.

FASE DE ENRIQUECIMIENTO

1. Inocular alícuotas de 1 ml de crema de levadura en un erlenmeyer de 150 ml contenidas en 50 ml de caldo de mata reforzado

2. Incubar a 45°C con agitación (120rpm) durante 15 a 20 horas hasta que la turbidez indique evidencia de crecimiento celular

3. Tomar muestras de los matraces con resultados de crecimiento positivo y realizar diluciones seriadas hasta 10-5 con suero fisiológico (9 g/L de NaCl)

5.2.2 FASE DE SELECCION

1. A partir de los cultivos diluidos efectuar siembras por estriado sobre agar malta.2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas

5.2.3 FASE DE PURIFICACIÓN

1. Realizar una resiembra por estriado en agar malta enriquecido con ampicilina (300mg/L) para inhibir la flora competitiva que aun puede persistir.

2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas.

5.2.4 FASE DE CONSERVACIÓN

1. Del cultivo puro obtenido en la fase anterior seleccionar las mejores colonias y aplicar el método de perlas para conservación

2. Colocar en los crioviales de 10 a 20 perlas las cuales serán conservadas.3. La temperatura adecuada para la conservación de la cepa es de 4°C4. TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN

Principales técnicas de conservación de cepas : Fuente: http://www.biologia.edu.ar/microind/Seleccion,%20Mantenimiento%...

TÉCNICA DEFINICIÓN

Subcultivos

Consiste en el repique periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia varía con el microorganismo, debiendo considerarse el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 °C durante lapsos que oscilan entre 15 días y 2 meses, aunque presentan algunos inconvenientes.

Mantenimiento bajo capa de aceite

Consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrollo en medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura

ambiente o aún mejor en heladera por períodos de varios años.

Congelación

Es una técnica de elección, ya sea para cortos o largos períodos de tiempo.La técnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las células son más resistentes a los daños por congelación y descongelación.Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El más empleado es glicerol al 10%.

DIAGRAMA DE FLUJO DEL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Crema de levaduras residual

Incubación en caldo malta reforzado a 45°C de 15 a 20

horas

NOSI Crecimiento

Diluciones

Siembra en placa

Incubación a 35°C por 48 horas

Colonias aisladas

Colonias aisladas

5. RESULTADOS:

Calculo de ufc/ml por cada dilución:

Numero decolonias×diluci ónVolumen

=20×1000000100 μl

=200 UFCml

Numero decolonias×diluci ónVolumen

=270×1000000100 μl

=270 UFCml

Tabla N°1 Colonias y UFC/ml Saccharomyces Cerevisiae.:

DILUCION COLONIAS UFC/ml10-5 20 20010-3 >300 _

10-1 Incontable (Velo espeso) _

Resiembra en placas

Incubación a 35°C por 48 horas

Cultivo puro

Crioconservación a 4°C (T sugerida)

Selección de perlas y colocación en crioviales

Método de perlas

Tabla N°2 Descripción Morfológica de Saccharomyces Cerevisiae.

DILUCIONES Descripción De La Morfología Macroscópica De Las Colonias

10-5 Colonias cremosas de borde irregular, opacas, lisas, planas, color beige y con un pequeño borde color blanco.

10-3 Las colonias de esta cultivo se observan como un velo dispuesto sobre la caja de petri, se observan algunas colonias separadas muy pequeñas, su característica es de borde no muy definido, opacas, lisas y planas,

10-1 Las colonias de estos cultivos se observan como un velo dispuesto sobre la caja de petri muy espeso, que no permite observar ninguna morfología en las colonias

Tabla N°3 Descripción Microscópica de Saccharomyces Cerevisiae.(Tinción Gram)

OBSERVACION 10-5 Descripción MicroscópicaObservación a 10x

En este enfoque se observan un cúmulo de color morado, algunas un poco dispersas, por sus características alargadas podemos determinar que el microorganismo que se cultivo y creció corresponde a la Levadura Saccharomyces cerevisiae

Observación a 40x Con este lente podemos observar la morfología de las levaduras las colonias son redondas d color beige brillante se presentan en colonias unitarias aisladas

6. DISCUSIONES: Aunque existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más

efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona productora de aguardiente donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas en nuestro caso fueron obtenidas de los propios fermentadores donde se produce el aguardiente; ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son:

Específicas del área. Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar. Responsables, al menos parcialmente, de las características únicas de los productos

obtenidos.

La muestra observada al microscopio nos confirma la ausencia de contaminación en el cultivo de algún tipo de microorganismo que nos pudiesen haber alterado los medios ya que se observan solo levaduras.

Se estableció que la ampicilina es un buen agente de control en las fermentaciones ya que inhibió la flora acompañante en la melaza y la levadura no fue afectada en la producción de biomasa

Para evaluar la termotolerancia de los cultivos, la cepa fueron sometida a temperaturas superiores a las de crecimiento normal (35C) a los cuales la cepa creció optimizando su tolerancia a (45 C)

7. CONCLUSIONES: Con el objetivo de estudiar las condiciones para un adecuado crecimiento de la S.

cerevisiae, se diseñó un experimento de tipo bioreactor productor de biomasa usando como parámetro principal la influencia de la temperatura y sustrato a fermentar en el crecimiento microbianos

En nuestro proyecto se cumplió con el objetivo de producción de biomasa comprobando que esta es una vía factible para los procesos industriales y una alternativa para la reducción de las impurezas químicas que se pueden crear en procesos en los que se utilice la síntesis organica

Para comprobar la termoresistencia de las cepas aisladas se seleccionó, de la caja con mejor y mayor crecimiento, una colonia apropiada la cual fue sometida a una temperatura de 41°C (superior a la T de crecimiento), observándose crecimiento de esta lo cual afirma la hipótesis de termotolerancia

8. BIBLIOGRAFIA:1. http://www.biologia.edu.ar/microind/Seleccion,%20Mantenimiento%... 2. http://microbiologos.blogspot.com/2006_05_01_archive.html3. http://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/

1822/4369/1/2005_infowine_panorama_ecologico.pdf4. La caña de azúcar como materia prima para la producción de Alcohol Autor: Marco

Chaves Solera.5. MÉTODOS DE LA MICROBIOLOGÍA. Cap.2, Stayner.6. Amato, S. P. (1992). Procesos fermentativos.Curso Latinoamericano de síntesis de bio

productos y escalamiento de procesos biotecnológicos. San José, Universidad de Costa Rica y Universidad Nacional.

7. Degre, R. «Selection and commercial cultivation of wine yeast and bacteria» En Wine Microbiology and Biotechnology(Fleet, G.H., ed.) Harwood Academic Publishers, 421-447 (1993).

ANEXO:

CULTIVO INICIADOR

CREMA DE LEVADURA RESIDUAL:

CULTIVOS INICIADORES:

CULTIVOS AISLADOS: