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Mecanismos de inhibición de la heparanesa por
medio de heparán sulfato PG545 y tres estructuras
análogas
Presentado por:Carlos Alberto Coronado PinillaKarol Tatiana Moreno Moncada
Es una endo-β D-glucuronidasa también conocido
como HPSE, es una enzima que actúa tanto en la superficie de la célula y dentro de la matriz extracelular para degradar poliméricos heparán sulfato en moléculas más cortas de longitud de cadena de oligosacáridos .
Ayuda a: la angiogénesis la metástasis.
¿Qué es la Heparanasa (HPSE) ?
Enzima inhibida
La enzima inhibida fue la heparanasa, la cual tiene una participación importante en la propagación del cáncer.
La penetración exitosa de la capa de células endoteliales que reviste la superficie interior de los vasos sanguíneos es un proceso importante en la formación de tumores de transmisión hemática metástasis. Heparán sulfato proteoglicanos son los principales constituyentes de esta capa.
Heparanasa es importante en la
remodelación de tejidos y de señalización implicadas en la
generación de los nuevos vasos sanguíneos necesarios para el
crecimiento de tumores
Por ello se quiere inhibir esta enzima, teniendo 4 inhibidores con los cuales analizaremos su actividad inhibidora.
¿Cuál es el fin del artículo?
Estructuras de PG545 y los análogos
examinados
Compuesto 1 es el análogo trisacárido de PG545, mientras que los compuestos 2 y 3 son los tetra y trisacáridos sulfatados en el sitio ocupado por la aglicona colestanol.
Inhibidores
Estructuras
Se utilizaron dos técnicas diferentes:
Ensayo FondaparinuxSustrato: Fondaparinux
Ensayo de ultrafitraciónSustrato: Polisacárido [3H]-HS
Reacción que cataliza
Los ensayos se llevaron a cabo en microplacas de 96
pocillos (Costar 9018 EIA / RIA, Corning) pre-tratado con una solución de BSA al 4% en solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,05% de Tween 20 (PBST) durante 2 horas a 37 ° C.
Las placas se lavaron a continuación tres veces con PBST y se seca sacudido. Placas pretratadas fueron almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas antes de su uso.
Los ensayos (100 l) típicamente contenían 40 mM de tampón de acetato de sodio (pH 5,0), 0,25 nM heparanasa y concentraciones variables de compuestos de fondaparinux y de estudio.
Ensayos antiheparanasa fondaparinux
Los ensayos se prepararon fondaparinux menos y
se dejaron equilibrar durante 10 min antes de añadir el sustrato para iniciar la catálisis. La incubación a 37 ° C durante 18 h fue seguida por el desarrollo con 100 l de 1,69 mM WST-1 en solución 0,1 M de NaOH a 60 ° C durante 1 h después de lo cual se midió la absorbancia a 584 nm
. Para el análisis de CI50, los datos fueron convertidos en valores de% de inhibición mediante la comparación de los ensayos para controlar que no contienen compuesto de estudio.
Ensayos antiheparanasa fondaparinux
Las reacciones se establecieron en 1,5 ml microtubos
en un volumen de 200 l que contenía 40 mM de tampón de acetato de sodio (pH 5.0), 0.005% de Tween 20 (w / v), 4 nM heparanasa, 5 M [3H] -HS y diversas concentraciones de compuestos de estudio.
, todos los componentes excepto el [3H] -HS sustrato se dejaron equilibrar durante 10 min. Los ensayos se iniciaron entonces mediante la adición de [3H] -HS e inmediatamente fue tomada 40 l, se inactivó con 160 l de fosfato 10 mM (pH 7,0) y los 200 l transferidos a un Microcon YM-10 dispositivo de ultrafiltración (Millipore) que se centrifugó a 14.000 g durante 5 min.
Ensayos antiheparanasa ultrafiltración
La solución que pasa a través de la membrana (filtrado)
se retuvo. Esta muestra se consideró la muestra t0. Los ensayos se dividieron en alícuotas en 3 tubos de 40 l cada una y éstas se dejaron reaccionar a 37 ° C durante 18 h.
La etapa de filtración se repitió después del temple con 160 l de fosfato 10 mM (pH 7,0). El filtrado t0 y las tres muestras de filtrado tomadas después de 18 h (t18h) fueron contados para 3H usando Optiphase HiSafe 2 de centelleo
La diferencia entre el T0 y las muestras promediadas t18h dio la cantidad de actividad heparanasa.
Ensayos antiheparanasa ultrafiltración
Inhibidor Tipo de inhibición
Heparán sulfato PG545 Competitiva
Aglicón de colestanol de PG545 Competitiva
Tetrasacárido de PG545 Competitiva
Trisacárido de PG545 No competitiva
Tipo de inhibición
COMPETITIVO Km + Vmax= Análogo químico del
sustrato
NO COMPETITIVO Km = Vmax – No parecido
estructuralmente
Tipo de inhibición
Gráficas cinéticas
Para determinar los valores
de CI50, los datos de% de inhibición se ajustaron a la ecuación logística de cuatro parámetros.
Constantes cinéticas, Km aparente y aparente Vmax, se determinaron mediante el ajuste de V frente a [S] datos a la ecuación de Michaelis-Menten.
Determinación de velocidades de
reacción
La pendiente es KM/Vmax
La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax
Determinación de velocidades de
reacción
Y=m x+b
Los inhibidores competitivos parabólicos se unen a dos
sitios en la enzima y cada interacción es suficiente para evitar completamente la catálisis.
PG545 y sus tres análogos estructurales poseen tres modos distintos de la inhibición de heparanasa. Esta diversidad es inusual . en segundo lugar, se cree que la heparanasa su similitud de existir como un heterodímero con un sitio activo, impidiendo así la interacción entre los sitios activos.
Conclusiones
Una estructura de la heparanasa no ha sido publicado aunque la información acerca de la disposición tridimensional de partes importantes de la proteína ha sido obtenida de modelado comparativo de la secuencia basada en las estructuras de proteínas relacionadas.
La unión de la primera molécula de inhibidor competitivo parabólica aumenta la afinidad de la interacción de la molécula subsiguiente con la enzima. Esto podría resultar de un cambio conformacional en la heparanasa inducida por la unión del grupo colestanol que aumenta la afinidad entre el segundo sitio transitoriamente modificado y otra molécula de inhibidor.
Conclusiones
Hammond, E., Handly, P., Dredge, K., &
Bytheway, I. (2013). Mechanisms of heparanase inhibition by the heparan sulfate mimetic PG545 and three structural analogues. Disponible desde: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211546313000405
Juan Manuel González Mañas, (2012). Curso de Biomoléculas.Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#kv
Referencia bibliográfica
GRACIAS
