Inovatyvi alo/auto DNR minorinių kiekių analitika

E. Gineikienė

Minorinė alo/auto DNR = cirkuliuojanti

• Surasta 1948 metais.

• Biomarkeris.

• Standartizacija: mėginio paėmimas, DNR išskyrimas, tyrimas, gauto rezultato patikimumas (reikalingos prospektyvinės studijos).

Cirkuliuojanti DNR

• Neląstelinė (cell-free) ir su ląstelės paviršine membrana asocijuota DNR yra natūraliai susidarantys baltymų/membranos darinių junginiai.

• Vidutinis cirkuliuojančios DNR kiekis plazmoje normos atveju svyruoja nuo 10 ng/ml iki 1500 ng/ml ir daugiau. Sveikuose individuose cirkuliuojančios DNR kiekis yra labai nedidelis, kadangi negyvos ląstelės iš kraujotakos efektyviai šalinamos fagocitozės keliu.

• Apoptozė yra pagrindinis laisvos DNR šaltinis serume ar plazmoje. Šiek tiek dar prideda nekrozuojančių ląstelių lizė, spontaninis susintetintos DNR išleidimas, kraujo ląstelių degradacija, patogenų (bakterijų, virusų) degradacija, su ląstelės membrana asocijuota DNR.

• Cirkuliuojančios DNR molekulinė masė (ilgis bp) gali rodyti tos DNR kilmę: apoptozėprodukuoja ~180-300 bp fragmentus, nekrozė – iki 10000 bp ilgio.

• Cirkuliuojančios DNR pusamžis trumpas – 10-15 min.

• Koduojanti/nekoduojančioje 1,5% (tyrimo jautrumas?)

• Reikia žinoti:

• (1) Ruošiant serumą periferinio kraujo limfocitų lizė gali padidinti cirkuliuojančios DNR kiekį.

• (2) Laisvos DNR kiekiai padidėja po kraujo paėmimo į mėgintuvėlį, bet praėjus 8 valandoms vėl atsistato; todėl rekomenduojama mėginį ruošti tyrimui po ~6 val. po kraujo paėmimo.

Alu pasikartojančios sekos

• Cirkuliuojanti DNR ≠ nereprezentuoja genominės DNR.

• Plazmoje randama laisva DNR priklauso Alu pasikartojančių sekų tipui.

• Alu sekos yra apie 300 bp ilgio

• Žmogaus genome yra virš milijono Alu elementų; ~10,7% viso genomo.

Chromosomos, dažytos Alu zondais (žalios Alu sritys).

Cirkuliuojančios DNR išskyrimas

• Kadangi cirkuliuojančios DNR kiekis plazmoje/serume yra mažas, reikia pasirinkti tinkamą metodiką, ypač tais atvejais, jei norima pagal ilgį nustatyti cirkuliuojančios DNR kilmę (apoptotinė ar nekrotinė).

• (1) QIAamp Method and Modified QAIamp Protocol Triton/Heat/Phenol Protocol (THP) for CFDNA Purification

• (2) Blunt-End Ligation-Mediated Whole Genome Amplification (BL-WGA)

• (3) The NucleoSpin Method

• (4) Mes panaudojome virusinės DNR išskyrimo iš kraujo rinkinį (automatizuotas).

Cirkuliuojančios DNR tyrimo metodai

• (1) Modified semi-nested or nested methylation-specific PCR (MSP).

• (2) Quantitative, multiplex PCR for circulating nuclear or mitochondrial DNA.

• (3) Quantification of circulating DNA by real-time quantitative PCR or immunological methods such as ELISA

• (4) DNA Methylation specific PCR (MSP) (qMS-PCR)

• (5) Direct SYBR (R) Gold assay

• (6) Utilization of LOH of microsatellite biomarkers followed by post-PCR product analysis using capillary array electrophoresis

• (7) Cloning and sequencing of free circulating DNA

• (8) Quantitative methylation analysis of minute DNA amounts after whole Bisulfitome

• Amplification (qMAMBA)

• (9) Single tube extraction and processing technique dubbed “methylation on beads” that allows for DNA extraction and bisulfite conversion

• (10) Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-ToF)

• (11) Digital PCR using microfluidic devices

• (12) NGS

Auto-DNR - neoplazmos

• Neuroblastoma

• Gliomas

• Breast Cancer

• Endometrial Tumors

• Cervical Tumors

• Ovarian Tumors

• Hepatocellular Carcinoma (HCC)

• Pancreatic Carcinoma

• Esophageal Tumors

• Stomach Tumors

• Colorectal Cancer (CRC)

• Nasopharyngeal Carcinoma

• Thyroid Tumors

• None Small Cell Lung Carcinoma(NSCLC)

• Small Cell Lung Carcinoma (SCLC)

• Testicular Tumors

• Kidney Tumors

• Prostate Carcinoma (PCa)

• Malignant Melanoma

• Squamous Cell Carcinoma (SCC)

• Leukemia, lymphoma

Vidutinė cirkuliuojančios DNR koncentracija su solidiniais navikais 17 ng/mL (ribos: 0.5–1600)—3X didesnė nei sveikuose.

Leukemija, limfoma

• Ligos atsinaujinimo tyrimui galima naudoti cirkuliuojančios DNR kiekio matavimą. Hodžkino limfomos/DDBLL, mantijos limfomos atvejų cirkuliuojančios DNR kiekiai yra žymiai didesni, lyginant su sveikais.

• Didesni laisvos DNR kiekiai rodo pažengusią ligos stadiją, B simptomus, padidėjusius LDH kiekius, amžių >60 metų.

• DDBLL atveju galima vertinti MGMT geno promotoriaus metilinimo būklę ir p53 mutacijas (geros prognozės faktoriai). Ne-Hodžkino limfomoje ir ūminėje B leukemijoje randama pertvarkytos Ig sunkiosios grandinės variantų.

Aberantinis metilinimas• Tam tikrų genų promotorių metilinimas yra ankstyviausias ir dažniausias navikų genomo

sutrikdymas (pvz., dažniausiai išjungiantis naviko supresorius). Turint naviko epigenetiniųžymenų profilį, galima rasti naviko cirkuliuojančią DNR (relapsas arba ankstyva diagnostika?).

• Žinomi ląstelės ciklo, augimo, diferenciacijos ir vystymosi genai, kurie būna hipermetilintinavikuose:

• MLH1: Colon, endometrial and gastric cancers;

• ER-beta (Estrogen receptor beta) and RAR-beta2: Breast cancer;

• P16: esophageal, lung, colon, liver and pancreas cancer;

• GSTP1 (Glutathione S-transferase P): hepatocellular carcinoma;

• 14-3-3 sigma/stratifin: breast cancers;

• BRCA1: breast and ovarian cancers;

• VHL: kidney tumors;

• RB: retinoblastoma;

• TMEFF2: Lung and various tumor types;

• DNA methyl transferase and MGMT: various tumor types.

• Todėl gali būti potencialiais naviko žymenimis cirkuliuojančios DNR pavidalu.

LOH, MSI

• Specifinių alelių LOH tyrimas galėtų prisidėti prie pirminių navikų diagnostikos ir prognostikos . Nustatytas LOH gali rodyti naviko atsinaujinimą. Reikia žinoti, kad pvz., krūties vėžio atveju LOH skirtinguose lokusuose yra nustatomas mažo molekulinio svorio cirkuliuojančios DNR frakcijoje, todėl prieš tai reikalingas cirkuliuojančios DNR frakcionavimas.

• Cirkuliuojanti DNR LOH nustatymui yra naudojama melanomos, GIST, prostatos karcinomos, krūties vėžio tyrimuose.

• Mikrosatelitinės DNR galima priskirti ~30 paveldimų ir neurologinių sutrikimų.

• Gali prisidėti prie navikų diagnostikos ir progresijos nustatytmo.

NGS auto-DNR tyrimams

• NSCLC plaučių vėžio NGS panelis, padengiantis >95% plaučių navikų somatinių mutacijų.

• II-IV stadijos NSCLC cirkuliuojanti navikų DNR aptinkama visuose (100%)pacientuose, I stadijos – pusėje pacientų; specifiškumas 96%; jautrumas (mutuotosalelės ~0.02%).

• Cirkuliuojančios kiekis koreliavo su naviko mase, pagal kiekį buvo galima atskirti liktinę ligą ir matyti naviko redukcijos tendencijas (pagal radiologinius vaizdus). Cirkuliuojančios DNR kiekio įvertinimas leido anksčiau įvertinti atsaką į gydymą, nei radiologiniai tyrimai.

Alo-DNR (vaisiaus DNR motinos plazmoje)

• 1997 nustatyta, kad vaisiaus DNR galima rasti motinos plazmoje.

• 1. Dydis. Iki 300 bp (dažniausiai 145 bp; tai rodo, kad vaisiaus ląstelės apoptuoja, o ne nekrozuoja), motinos – virš 500 bp (gal būtų įmanomas selektyvus izoliavimas). Skirtingi plazmos paruošimo metodai – kol kas toks pat rezultatas.

• 2. Vaisiaus laisva DNR, manoma, asocijuota su nukleosomomis (gal būtų įmanomas selektyvus izoliavimas).

• 3. Kiekis. 3,4% (3-6%) (25 genomai/1 ml plazmos). Frakcijos praturtinimas.• A problem in all tests on fetal DNA in maternal plasma arises from the large

quantity of maternal DNA present in the DNA preparation, so that satisfactory internal controls, to test for successful amplification of fetal DNA, are difficult to include.

• Neinvaziniam vaisiaus genetinių anomalijų tyrimui – aneuploidijai nustatyti.

• Dažniausiai tiriamos trisomijos:

• 21 (Dauno sindromas)

• 18 (Edward sindromas)

• 13 (Patau sindromas)

1. WGS vaisiaus aneuploidijai

• NGS pasirodė tinkamas metodas genomo masės įvertinimui ir suradimui tų chromosomų, kurių yra virš normos.

• Naudojant cirkuliuojančią DNR, išskirtą iš motinos kraujo, NGS metodas leidžia tiksliai nustatyti tas moteris, kurios turi aneuploidinius vaisius.

• Skaičiuojamos sekos, nuskaitytos ant kiekvienos (tiriamosios) chromosomos ir įvertinamas sekų kiekis (t.y. norma - neviršija CI; ar virš normos – viršija viršutinę CI ribą). Naudojamasi statistiniais metodais ir įvairiais algoritmais, kurie patikimai palygina duoto atvejo duotos chromosomos skaitalų skaičių su normos atvejo duotos chromosomos skaitalų skaičiumi.

Vaisiaus DNR (žalia) cirkuliuoja motininėje plazmoje ir sudaro mažumą dideliame motininės DNR fone (mėlyna). Toks vaisiaus ir motinos cirkuliuojančių DNR mišinys yra išskiriamas iš motinos kraujo ir sekvenuojamas NGS metodu. Tada skaičiuojami kiekvienos tirtos chromosomos skaitiniai.

21 chromosomos padengimas su 21 chr trisomija yra ~11% didesnis už disominiusatvejus. Minimali vaisiaus DNR frakcija, kurią galima aptikti NGS-u 2%.

2. Taikininis (targeted) NGS vaisiaus aneuploidijai

• Skaičiuojami (kiekybiškai vertinami) ne visi genomo lokusai. Ribojant skaičiuojamų DNR regionų , ženkliai sumažėja taškų, leidžiančių pilnai įvertinti chromosomos dozę.

• Be to, pasirinkus kiekybiniam įvertinimui tik specifinius regionus, gali sumažėti to regiono vertinimui imamų skaitinių skaičius, nes algoritmas ims tik skaitinius iš panašių savybių turinčių lokusų (kad būtų galima patikimai palyginti).

• Be to, selekcijos (targeted) žingsnis turi minimizuoti paklaidas (variacijas), t.y. fragmento skaitymo išeiga turi priklausyti tik nuo fragmento indėlio, o ne nuo fragmento savybių, pvz., sekos).

Polimorfizmai

• b-talasemijos tyrimas, targeted sequencing• Paveldima autosominiu recesyviniu keliu, t.y. abu tėvai turi po vieną mutuotą HBB

(hemoglobino beta) alelį, o vaikas gauna iš abiejų tėvų abu mutuotus alelius.• NGS tiriami polimorfizmai beta-globino lokuse, pagal heterozigotiškumą nustatoma

galimai perduotos tėvinės alelės su delecija. • 8/10 šeimų nustato teisingai

• Chromosomų aneuploidijos targeted sequencing• Pagal polimorfizmų heterozigotiškumą. • Tiriamas mišinys vaisiaus/motinos cirkuliuojanti DNR + motinos DNR tik iš WBC +

galima dar pridėti tėvo DNR (patentas US20110288780A1). 21, 18, 13 trisomijos, lytinių chromosomų aneuploidijai (X0, XXY, XXX, XYY)

RhD tyrimas

• Laikas, per kurį reikia atlikti tyrimus, yra ribotas, nes vaisius auga. • Viso genomo sekvenavimas:1. Surinkti mėginius (4-8)2. Paruošti3. Ilgas procesas (vien 11 dienų Illumina HiSeq2000)4. Brangus5. Tikslus ir specifinis trisomijų įvertinimui

• Taikininis sekvenavimas1. Surinkti mėginius (12-24)2. Paruošti 3. Trumpesnis procesas, didesnės padengimo variacijos4. Gal pigesnis5. Tikslus? ir specifinis? trisomijų įvertinimui

Precizinė medicina: TKI taikinių (kinazių) aberacijų paieška

pažangiomis technologijomis bei gydymo kinazių inhibitoriais

galimybės

E. Gineikienė

Tirozinkinazės

Trys sritys palaiko receptoriaus neaktyvumą nesant ligando: (1) priemembraninis domenas, (2)kinazės domeno aktyvacijos kilpa ir (3) konservatyvus baltymo C-galas (PDGFR).Jak2 kinazė – ne receptorinė, jos neaktyvumą palaiko pseudokinazėsdomenas; struktūra receptorius+ligandas+Jak2 yra labai panaši į receptorinių kinazių+ligandas.

1

2

3

Receptoriaus aktyvacija

• Ligandas → receptoriaus dimerizacija → du kinazės domenai suartėja ir transfosforilinaaktyvacijos kilpos amino rūgštis (aktyvuoja) ir priemembraniniodomeno a.r. (nuima neaktyvumo blokavimą)

• Tos fosforilintos a.r. tada naudojamos sąveikai su tolesniais signalo perdavimo baltymais –tolesnėmis kinazėmis, adaptorinėmis molekulėmis, sudarančiomis ryšį su dar tolesniais signalo perdavėjais.

• 1. Įvairiuose navikuose (daugiausia hematologiniuose) yra nustatytos kinazesaktyvuojančios mutacijos kritiniuose kinazių aktyvumą kontroliuojančiuose regionuose (taškinės, insercijos/delecijos, translokacijos).

• 2. Mutuotos tirozinkinazės yra įvairių kinazių inhibitorių taikiniai – LML su bcr-abl,GIST su C-Kit, plaučių vėžys su EGFR mutacijomis. ŪML ~30% atvejų turi aktyvuojančias FLT3 mutacijas.

Mutacijos tirozinkinazių domenuose

• 1. Neląstelinis domenas

• Šitas domenas naudojamas sąveikai su ligandu ir receptoriaus dimerizacijai. Tam tikros Ig sritys yra būtinos receptoriaus dimerizacijai. Mutacijos šioje kinazėsvietoje blogina (silpnina) receptoriaus aktyvaciją.

• 2. Mutacijos transmembraniniame domene

• Transmembraninis domenas yra hidrofobinis tarpininkas tarp neląstelinės ir viduląstelinės receptoriaus dalių. Dalyvauja receptoriaus aktyvacijoje. Šioje srityje rastos kelios C-Kit mutacijos; silpnai aktyvuoja C-Kit.

• 3. Priemembraninio domeno mutacijos

• Receptorinėse kinazėse – (auto)inhibicinė kinazės domeno funkcija. Priemembraninis domenas susijungia su C-galine dalimi. Prisijungus ligandui, ši struktūra suyra - kinazė aktyvuojasi. Šis mutacijų tipas pirmiausia taikomas FLT3. Mutacijos aktyvuojančios.

Mutacijos tirozinkinazių domenuose

• 4. Mutacijos kinazės domene, aktyvacijos kilpoje

• Kinazės domeno aktyvacijos kilpose yra 1-3 tirozinai, kurie yra fosforilinami. Neaktyvioje būsenoje aktyvacijos kilpa yra uždaryta, t.y. N-galas ir C-galas yra susijungę, todėl substratas (ATP) nepatenka į aktyvųjį centrą. Kai pasifosforilina 1-3 tirozinai, uždara struktūra atsidaro ir ATP/substratas gali jungtis. Mutacijos aktyvuojančios.

• 5. C-galinės dalies mutacijos

• Tai dalis, esanti žemiau kinazės domeno. Labai skiriasi tarp skirtingų tirozinkinazių. Randami polimorfizmai, nepatogeninės mutacijos; neoplazmose nenustatyta įgytų transformuojančių mutacijų. Gali sąlygoti baltymo sutrumpėjimą, tačiau (PDGFR) trumpesni receptoriai įvardijami kaip normalios izoformos.

Translokacijos

……………………

Mutacijos

• Mutuotos ir laukinio tipo kinazės nekeičia ląstelės fosfotirozino kiekio

• Ba/F3 ląstelių linijose įvertintas bendras fosforilinimo lygis nesant IL-3. Ląstelės transfekuotos laukinio tipo ir mutuotomis kinazėmis (DDR1 ir TEK mutacijos JM domene; FES mutacijos aktyvacijos kilpoje).

• Mutuotų ir laukinio tipo kinazių ekspresija patvirtinta, bet bendras ląstelės fosfotirozinų kiekis nesiskyrė – nei padidėjo, nei sumažėjo. Vadinasi, bent jau šiame kontekste mutuotos kinazės nėra konstitutyviai aktyvuotos.

• Mutuotos kinazės nekeičia jautrumo saviems ligandams

• Patikrintas kai kurių mutuotų kinazių signalo perdavimo intensyvumas – nepakito.

• Prieštarauja neseniai publikuotai informacijai apie FLT3, kuris mutuotas tampa hiperjautrus savo ligandui.

• Mutuotų kinazių onkogeninės transformacijos geba

• Ar gali mutuotos kinazės transformuoti ląsteles į nuo IL-3 nepriklausomas? Pagamintos Ba/F3 ląstelės su dauguma mutuotų kinazių – vertintas gebėjimas proliferuoti be IL-3. Neproliferuoja. Vienintelė mutacija FLT3 R834Q augo be IL-3.

NGS

• Galima nustatyti: taškines mutacijas, duplikacijas, insercijas, delecijas, indels.

• Metodas: Specifinių regionų pagausinimas ir jų NGS, spec. bioinformacinė analizė. Amplikonų gausinimo metodikos: Ion Torrent AmpliSeq, Illumina TruSeq, Agilent HaloPlex, RainDance.

• Custom (targeted) paneliai. Skaitomi lokusai specifinių genų (galima 1-100).

• Tyrimo trukmė: kelios dienos, savaitės, priklausomai nuo tyrimo sudėtingumo (kiek genu bus analizuojama).

• Už: viename tyrime nustatomos paprastos taškinės mutacijos ir sudėtingesni pakitimai visuose analizuojamuose genuose. Reikia mažai DNR. Padengimas 1000x – galima aptikti negausias mutacijas. Gal greitesnis tyrimas, nes analizuojamas ne visas genomas, o tik specifiniai genai.

• Prieš: brangus; spec DNR paruošimo metodas. Nenustato geno kopijų skaičiaus pokyčių. Yra naudojamai platformai būdingų artefaktų – klaidingai teigiamos insercijos, delecijos, etc. Būtina bioinformacinės analizės optimizacija, kad sekų pakitimai nebūtų praleisti (pvz., kaip su CALR). Naudojant 1000x padengimą, jautrumas bus didelis, kaip vertinti labai mažų kiekių mutacijas?

1. WGS

• Viso genomo sekvenavimas (intronai + egzonai + UTR)

• Labai „masyvus“, labai (per)daug informacijos

• 98-99% netransliuojamos sekos, 1-2% transliuojamos

• Paraleliai tiriama normos DNR (atmetant gemalines mutacijas; per 1 generaciją atsiranda ~70 naujų mutacijų – reikia sekti duombazių updatus)

• Nustatomi visi sekos pakitimai.

2. WES

• Trumpesnė WGS versija. 1-2% transliuojamų sekų yra ~85% visų vėžio mutacijų. • Paraleliai taip pat reikia tirti normos DNR.• Nenuskaitys egzonų telomeriniuose kartotinių sekų regionuose, intronuose ir

mitochondrijose• Neras translokacijų ir inversijų, UPD, mikro RNR, epigenetinių pokyčių• Neatskirs tripletinių pakitimų (Huntington’s disease ir fragile X syndrome)• Indel-ų nustatymo geba tik skaitinio (read) ribose, t.y. iki 30-35 nt. • (1) Somatinių mutacijų nustatymui; (2) driver mutacijų nustatymui; (3) mutacijų

tarpusavio sąveikos rekonstrukcijai; (4) predispozicijai įvertinti

3. TS – transcriptome (RNA) sequencing

• Taikoma: (1) genų ekspresijai tirti; (2) sekos pakitimų (SNP) nustatymui (tik transliuojamų sekų regionuose = egzonuose); (3) sulietų genų nustatymui.

• Apribojimai: a) Audinio specifika: genų ekspresija nėra vienoda visose ląstelėse ir priklauso nuo audinio. RNR sekvenavimas suteikia informacijos apie transkriptomos struktūrą duotu ląstelės gyvenimo momentu (snapshot).

• b) Ląstelės vystymosi stadija: keičiasi laike genų ekspresijos lygis. Todėl norint išsiaiškinti pvz., naviko genų ekspresijos dinamiką, reikia sekvenuoti RNR etapiškai – to nepadarysi pacientų mėginiuose (solidinių navikų), tik in vitro ląstelių linijose.

• c) Sekos padengimas: nuo jo priklauso mutacijų suradimas. Alelės galima nerasti, nes ji neekspresuojama, arba degraduota dėl stabilumą įtakojančių mutacijų, arba silpnai ekspresuojama (yra FLT3 silpnesnės ekspresijos atvejų, vienas PML atvejis MRD mėginiuose beveik visai nebeturi FLT3 transkripto) ir mutacija nustatoma nepatikimai.

• 90% total RNA sudaro ribosominė RNR ir tik 10% informacinė RNR. Reikalingas mRNR enrichmento etapas (su polyT oligos) ir cDNR sintezė.

• mRNR sekvenavimas; Total RNR sekvenavimas; Targeted RNR sekvenavimas; FFPE RNR sekvenavimas

Kinazių aberacijų paieška

• 1. WGS – mutacijos, translokacijos, ins, del, etc. Taikiniai – kinazės, signalo perdavimo dalyviai prieš kinazes.

• 2. GEP – nes reikia išsiaiškinti, ar rastos mutacijos/translokacijos yra aktyvuojančios (gal loss-of function); transkriptomos tyrimas, targeted santykinai padidėjusio transkripto kiekio nustatymas (signalo perdavimo kelio galutinio taikinio).

• 3. Ląstelių kultūros? Turbūt ne....

• 4. Nustatyta aktyvuojanti kinazės/kinazės kelio mutacija.

• 5. TKI.

ABL Nilotinib ponatinib

cenisertib dasatinib

bafetinib bosutinib

Imatinib

EGFR (HER1/ERBB1)

HER2 (ERBB2/neu)

HER4 (ERBB4)

pelitinib

poziotinib

dacomitinib

VEGFR2 Ponatinib cediranib

Vandetanib sorafenib

Brivanib rebastinib

Lenvatinib midostaurin

Sunitinib cabozantinib

Apatinib

mTOR ridaforolimus

(deforolimus)

Sirolimus dactolisib

temsirolimus

Apitolisib gedatolisib

Everolimus voxtalisib

AKT Cenisertib ipatasertib

afuresertib

uprosertib

FAK masitinib VEGFR2/3 telatinib

ALK

(Anaplastic

Lymphoma

Kinase)

dalantercept

gilteritinib

alectinib

ceritinib

crizotinib

FGFR1/2/3 masitinib

ponatinib

nintedanib

lucitanib

sulfatinib

dovitinib

VEGFR1/2/3 Ilorasertib axitinib

Motesanib regorafenib

Nintedanib lucitanib

Pazopanib fruquintinib

Tivozanib

KIT Masitinib axitinib

Motesanib cenisertib

Telatinib regorafenib

Dasatinib pazopanib

Tandutinib amuvatinib

Midostaurin imatinib

Sunitinib cabozantinib

Aurora A cenisertib

alisertib

FLT3 Quizartinib ponatinib

Cenisertib gilteritinib

Sorafenib lestaurtinib

Crenolanib tandutinib

Amuvatinib midostaurin

Sunitinib cabozantinib

PDGFRβ Linifanib axitinib

Sorafenib telatinib

regorafenib

sunitinib

orantinib

MEK Pimasertib selumetinib

Refametinib cobimetinib

Trametinib binimetinib

Foretinib volitinib

Amuvatinib crizotinib

cabozantinib

Aurora B cenisertib

barasertib

JAK1/2 momelotinib

ruxolitinib

EGFR

(HER1/ERBB1)

vandetanib

afatinib

icotinib

canertinib

rociletinib

epitinib

theliatinib

erlotinib

gefitinib

PDGFR ilorasertib

motesanib

nintedanib

pazopanib

tandutinib

imatinib

Aurora A/B/C ilorasertib

danusertib

JAK2 lestaurtinib

fedratinib

pacritinib

PDGFRα crenolanib

amuvatinib

midostaurin

CDK 4,6 abemaciclib

palbociclib

AXL gilteritinib JAK2 V617F pacritinib

gandotinib

CHEK2 rabusertib

BRAF dabrafenib

vemurafenib

JAK3 tofacitinib citrate NTRK1 (TRKA) lestaurtinib MAPK1 (ERK) ralimetinib

BTK cenisertib

ibrutinib

LYN bafetinib

cenisertib

CDK 1,2,5,9 dinaciclib CDK 2,7,9 seliciclib

CDK 1,2,4,5,6,7,9

(pan-CDK)

alvocidib CDK 1,2,4,7,9 (pan-CDK) roniciclib

Tyrosine kinase inhibitor therapy is likely to be effective in Ph-like ALL

Amžius Citogenetika TKI Išeitys

82 ETV6-ABL1 Dasatinibas 100 mg/daily Po 2 sav. - morfologinė ir citogenetinė remisija;

Toliau 4 sav. dasatinibas ir 2 ciklai prednizolono (50 mg orally daily) – 8 mėn. trunkanti

citogenetinė remisija

9 t(3;9)(p13;q34) FOX-ABL1 Dasatinibas Dasatinib was added to induction chemotherapy by day 10. Still receiving induction therapy

12 NUP214-ABL1 Dasatinibas 4 drug induction and had 12.4% MRD at the end of induction. After an additional month of

consolidation chemotherapy the MRD level was still 0.7% and dasatinib was added to

chemotherapy

12 t(2;9)(q11.2;q34) RANBP2-ABL1 Imatinibas intensive chemotherapy plus imatinib; remains in remission 4 months following diagnosis

6 t(1;9)(q24;q34) RCSD1-ABL1 Imatinibas poor response to 4-drug induction chemotherapy with end induction MRD 16.4% in the bone

marrow. Imatinib was added and bone marrow blasts were 2% at day 29

11 ZMIZ1-ABL1 Dasatinibas 4-drug induction and end induction MRD was 5.4%. MRD was 0.88% 3 weeks

after dasatinib was added. The patient continues to receive chemotherapy plus dasatinib

approximately 6 months after initial diagnosis

14 t(5;9)(q12;p1?3) SSBP2-JAK2 Ruksolitinibas consolidation chemotherapy with addition of ruxolitinib (20 mg/m2/dose). A bone marrow

performed 3 weeks later showed 1% MRD and end consolidation bone marrow showed 0.3%

MRD. Ruxolitinib has been held intermittently due to thrombocytopenia

7 EBF1-PDGFRB Imatinibas Imatinib, cyclophosphamide and etoposide were commenced with MRD 4.3% after 1 month.

Imatinib dose was increased with MRD 0.44% after additional month of treatment. MRD was

0.0226% after two months of dasatinib treatment. To SCT

11/12 pacientų, pradėtų gydyti TKI, greitai pasiekė ilgalaikius atsakus.