Intérêt des Biomarqueurs dans les maladies neurodégénératives

Dr A.GabelleDr S. Roche

Service de Neurologie / BiochimieCHU Gui de chauliac / St Eloi Montpellier

Plateforme deProtéomiqueClinique

Biomarqueurs

• Marqueurs – biologiques :

• LCR• Sang• urine

– D’ Imagerie : • Morphologique (volumétrie hippocampique…)• Fonctionnelle (PETscan, PIB, 18F FDDNP…)

– D’une lésion neuropathologique (ex: tau, A…)

– D’un processus physiopathologique (ex: 14-3-3)

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour 1 diagnostic positif

• Intérêt pour 1 diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels

• Intérêt pour analyse des études pharmacologiques & thérapeutiques

• Recherche : déterminer de nx mécanismes physiopathologiques (études protéomiques…)

• Notre expérience

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour 1 diagnostic positif

• Intérêt pour 1 diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels

• Intérêt pour analyse des études pharmacologiques & thérapeutiques

• Recherche : déterminer de nx mécanismes physiopathologiques (études protéomiques…)

• Notre expérience

Intérêt dg : maladie d’Alzheimer

• Démence d’évolution lente

• 14,2% des personnes de plus de 75 ans sont atteint de démence

• 600 000 MA / 750 000 déments en France

• 130 000 nouveaux cas par an

• MA et démences = Problème majeur de santé publique

• Diagnostic est non fait dans 50% des cas avec de la prévalence et de incidence avec l’âge

Prévalence âge

Probability Not Demented

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

50 60 70 80 90 100

Age

Pro

po

rtio

n o

f p

op

ula

tio

n

Probabilitéd’être indemnede démence

Généralités sur la maladie d’Alzheimer

• Efficacité symptomatique des traitements AC Inhibiteurs

• Développement des nouvelles stratégies (vaccins, -sécrétase, -

sécrétase)

Examen clinique Bilan biologique

NeuroimageriePlainte du patient

Testsneuropsychologiques

Diagnostic

• Critères diagnostiques surtout dépendants de critères d’exclusion

• Même si progrès de nombreux doutes diagnostiques subsistent

• Importance du Dg précoce et efficient

Intérêt dg : maladie d’Alzheimer

Neuropathologie

Bases physiopathologiques des biomarqueurs dans la MA

• La physiopathologie MA repose sur

– un déséquilibre de la production et de la clearance du peptide β amyloïde, surtout Aβ1-42, qui s’agrège sous forme de plaques séniles corticales

– un dépôt de Tau qui s’agrège sous forme de DNF dans le neurone

Les protéines Tau et pTau

• Accumulation pTau sous forme de fibrilles

• Perturbation de fonctionnement de l’axone

• Mort neuronale

Kinase

Phosphatase

Microtubules• Phosphorylation

de Tau• Dépolymérisation

des microtubules

Biomarqueurs de la MA

Peptides Aet Protéines Tau

totale et Phosphorylées (P-

Tau)

A42

A40

Rationalité d’utilisation du LCR

• 150 ml de LCR est en contact direct avec l’espace EC cérébral• Modif biochimiques = reflet des processus pathologiques

CSF Biomarqueurs

• Mesure objective• Précise, quantifiable• Reproductible• Robuste• Peu de biais• Physiopathologie• …

• Coût et temps • Prélèvements… • Erreur de mesure• Norme• Statistique• Ethique• …

Avantages/ Intérêts

Inconvénients/Contraintes

Diagnostic positif de MA : profil et méta-analyse

• Abeta : MA vs C– 600 MA– 450 Contrôles– 13 études

• T-tau : MA vs C– 2500 MA– 1400 C– 36 études

• P-tau : MA vs C– 800 MA– 370 C– 11 études

• Conclusion

SPEC SENS

86 % 90%

81% 90%

80% 92%

85-94% 83-100%

Blennow, 2003

Profil de la MA↓ A

↑ t-tau ↑p-tau (231)

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour un diagnostic positif

• Intérêt pour un diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels• Recherche : déterminer de nx mécanismes

physiopathologiques (études protéomiques…)

• Notre expérience

MALADIE D ’ALZHEIMER

SIGNES (Déficit cognitif)

DEPENDANCE

SYMPTOMES

LESIONS CEREBRALES

PHASE PRE-DEMENTIELLE DEMENCE

Plainte

mnésique

« MCI »

Troubles

Cognitifs

modérés

Maladie d’Alzheimer au stade pré-démentiel

Normal Syndrome

démentiel

L’incidence MA chez MCI avec CSF pathologique (n=67) = 27% /anSi CSF normal (n=67) = taux conversion 1% / an

Prédiction des biomarqueurs du LCR pour le diagnostic de la maladie d’Alzheimer au stade prédémentiel

Hansson 2006

CSF Biomarqueurs et prodromal MA

Hansson, 2006

Cohorte de 180 MCI (137 CSF) + forte association entre taux pathologiques de CSF BM ↓Abéta 1- 42 ; ↑t-tau; ↑p-tau et conversion MCI-MA que pour FDR :âge; sexe, NSC,génotype APOE; homocystéine plasmatique

Combinaison Tau totale, ratio A42/P-tau181 Se 95%, Sp 87% pour détecter état prédémentiel

Brys, blennow; 2007

Taux pathologiques de >ou=2 CSF BM prédisent conversion MCI-MA et identifie les formes stables de MCI. Surtout A et Ptau Parnetti, 2006. Herruka 2005

Etude sur 86 sujets MCI n= 22 MCI-AD; 43 MCI-MCI; et 21 contrôles suivi 2ansMCI-AD taux élevé de P-tau231, T-tau, IP, et ratios P-tau231/A 42/40 et T-tau/A42/40 et Taux faible de A42/A40 par rapport aux MCI-MCI et contrôles

Intérêt du P-tau231 (taux de prédiction 80%, p<0.001) comme marqueur de déclin MCI-MA puis P-tau(231)/A42/40 et ratio T-tau/A42/40Intérêt du dosage de isoprostane en longitudinal?

Plasma A et MCI/MA

• N = 1756 sujets Rotterdam study suivis 8,6 ans, combinaison de Aβ1-40 et Aβ1-42 : taux élevé d’Aβ1-40 ; taux faible d’Aβ1-42

• augmente le risque de MA d’un facteur 10• A1-42 / A1-40 plasmatique bas • A1-42 diminuerait juste avant les signes de MA

• risque RR 3.1 d’évolution vers MA ds groupe A42/A40 plus faible

• Analyse conjointe de A1-40, An-40, A1-42 et Abn-42 avec nouvelle technique multiplex immunoassay .

• 2 cohortes indépendantes : • MCI (n=117) suivi 4-7 ans 41% de taux de conversion • Et MCI (n=110) suivi 2-4 ans 14% de conversion

• Aucune isoforme d’A ne différencie les converteurs des non converteurs

• Pas de corrélation entre taux d’ A1-42 dans CSF et plasma• CSF BM sont + prédictifs que BM plasmatiques

Hansson 2008

Van Oijen 2006

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour un diagnostic positif

• Intérêt pour un diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels

• Intérêt pour analyse des études pharmacologiques & thérapeutiques

• Recherche : déterminer de nouveaux mécanismes physiopathologiques (études protéomiques…)

Dr Blennow,Clinical Laboratory International, Oct.2001: 8-10

Diagnostics différentiels

Pathologie Tau total Tau -181P A1-42

Sénescence normal Normal Normal normal

Mal. Alzheimer

Dépression Normal Normal Normal

Mal. Parkinson Normal Normal Normal

Démence alcoolique Normal Normal Normal

Démence fronto-temporale

Normal ou faible Normal ou faible Normal ou faible

Dem. Corps Lewy Normal ou faible Normal Faiblement

Mal. Creutzfeldt-Jakob

Normal ou

Acc.Vascul.Cérébral transitoire Normal Normal

Dem. Vasculaire Données divergentes Normal Normal ou

P-tau 181 pour ≠ MA DCLBlennow, 2006

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour un diagnostic positif

• Intérêt pour un diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels

• Recherche : déterminer de nouveaux mécanismes physiopathologiques (études protéomiques…)

• Notre expérience

Autres protéines dans LCR

• Association aN prostaglandine-d-synthétase (PDS) et de transthyrétine (TTR) formant un complexe protéique dosable dans le LCR par WB et ELISA

• Dans LCR in vivo : Complexe PDS/TTR 6 x plus élevés chez MA que témoins ; SE 100% et SP 93%

• Approche protéomique sur 60 LCR normal, MCI et MA• Taux plus faibles chez MCI et très faibles voire absents chez MA • corrélation durée ou sévérité de la maladie

• Intérêt taux RBP et haptoglobin precursor allele 1 dans CSF comme marqueur de l’évolution normal vers MCI et vers MA

Lovell, Neurology 2008Jung SM Neurosci Lett. 2008

Autres BM dans LCR

Détermination d’un profil de protéine sur 259 patients

Screening de 120 protéines

de signaling

18 sélectionnées

Rôle dans la dysrégulation de

l’hématopoièse, de la réponse

immunitaire, de l’apoptose et du

maintient neuronal chez les

patients MCI qui évoluent

vers une MA

Nouveaux Biomarqueurs

L’analyse clinique protéomique du LCR représente un outil majeur dans la découverte de biomarqueurs dans le champ des affections neurologiques.

Intérêts des biomarqueurs

• Intérêt pour un diagnostic positif

• Intérêt pour un diagnostic précoce

• Intérêt pour diagnostics différentiels

• Intérêt pour analyse des études pharmacologiques & thérapeutiques

• Notre expérience

• Marqueurs biologiques de la maladie d’Alzheimer

• Marqueurs biologiques de la maladie de Creutzfeld Jakob

• Biobanque en Neurologie et Recherche en Protéomique Clinique

Fédération de NeurologieCarcassonne –13 et 14 Juin 2008

Préanalytique : Prélèvement et Transport

• Le prélèvement se fait directement dans des tubes spécifiques en polypropylène uniquement

• Acheminement immédiatement à 4°C (sur glace) vers la Biochimie St Eloi, CHU Montpellier

• Traitement une fois par mois (selon volume)

• Conservation à -80°C….

Dosages et Rendu du Résultat

ELISA peptide A1-42, protéine TAU & protéine phosphoTAU

Patient A1-42

pg/ml

TAU

pg/ml

pTAU

pg/ml

110 387 158 26

112 630 425 42

113 320 213 27

114 204 899 76

115 315 260 32

116 529 187 16

117 194 483 58

SeuilsA1-42 > 500 pg/ml

Tau < 300 pg/ml

450 pg/ml

500 pg/ml

(21 – 50 ans)

(51 – 70 ans)

(> 71 ans)

pTau < 60 pg/ml

Dosages dans le LCR (ELISA - Innogenetics®)

Alzheimer vs Autres Démences

Sensibilité Spécificité Courbe de ROC

Ab42 (<400 pg/ml) 43,5 % 63,3 % 0,560

Tau (>300 pg/ml) 73,9 % 56,7 % 0,740

P-Tau (>60 pg/ml) 69,6 % 90,0 % 0,776

IATI (<1) 82,6 % 53,3 % 0,767

Nos résultats Diagnostics

Neurology 1999;52:1555-1562

1.18[Tau] 240

AIATI

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200

pTau (pg/mL)

ATI

pTau = 60

AT I = 1

Combinaison Tau, Aß42 et P-Tau(181P)

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

100

80

60

40

20

0

Sen

siti

vity

Comparaison des courbes de ROC

A

Tau

P-Tau

IATI

• Marqueurs biologiques de la maladie d’Alzheimer

• Marqueurs biologiques de la maladie de Creutzfeld Jakob

• Biobanque en Neurologie et Recherche en Protéomique Clinique

Fédération de NeurologieCarcassonne –13 et 14 Juin 2008

La biologie des Maladies à Prions

PrPC PrPC PrPC PrPC Situation physiologique

PrPC PrPC PrPCSc

Sc Sc

Sc Sc

Début de l’infection

Processus de conversion et d’agrégation

PrPCSc

Conformation/structure protéique native normale

Conformation/structure protéique pathologique, infectieuse et agrégeant

•L’accumulation de protéine PrPSc induit la mort neuronale.

•Une libération de protéine 14-3-3.•Une libération de protéine Tau.

Les interférences et les faux positifs

• AVC ischémique/hémorragique, Hémorragie méningée

• Etat de mal• Encéphalite (Hashimoto,

infectieuses, toxique, métabolique..) • Néoplasie (myélome..), para-

néoplasie

• Protéinorachie élevée• Ponction traumatique et/ou

hémorragique

Méthode de dosage et rendu du résultat

1 – Contrôle positif

2 – Contrôle douteux

3 & 4 – Echantillon positif

5 – Echantillon négatif

191976451

39

28

14

14-3-3

1 2 3 4 5

79%

7%1%

12%

0%

25%

50%

75%

100%

Négat

if

Non ré

alisa

ble

Doute

ux

Positif

Une aide au diagnostic

• La recherche de 14-3-3 dans les formes sporadiques à une sensibilité de 90% et une spécificité de 95%.

• Le diagnostic de certitude est fait post-mortem par autopsie et analyse histologique du cerveau

• Marqueurs biologiques de la maladie d’Alzheimer

• Marqueurs biologiques de la maladie de Creutzfeld Jakob

• Biobanque en Neurologie et Recherche en Protéomique Clinique

Fédération de NeurologieCarcassonne –13 et 14 Juin 2008

Traçabilité complète des prélèvements

Validée par CPP, déclaration à l’AFSSAPS

à ce jour >210 prélèvements,

150 avec confirmation diagnostique et résultats des marqueurs

Biobanque Neurologie/CHU Montpellier

SLA 15

SEP 18

Psy. 6 MA 34

Hydroceph. 14

MCL 4

Dem. Vascul. 11

DFT 8

Parkinson 9

Autres 20

Témoin 11

128

64

32

16

4 5 6 7 8 9pI

MW

ProteinChip®(SELDI-TOF-MS)

Perspective: recherche protéomique

5000 7500 10000 12500

5000 7500 10000 12500

Weak cation exchange pH 4.5 wash

HPLC Dionex U3000 - Année 2008

2 IPG Phor – 6 gels 13x16cm

Western Blot Grade Clinique

SELDI-TOF, renouvellement en cours

Préanalytique : Prélèvement et Transport

• Le prélèvement se fait directement dans des tubes spécifiques en polypropylène uniquement

• Acheminement immédiatement à 4°C (sur glace) vers la Biochimie St Eloi, CHU Montpellier

• Traitement une fois par mois (selon volume)

• Conservation à -80°C….

Création d’une biobanque LCR

• 1ers résultats sur les 167 patients atteints d’affections neurologiques

• Diagnostics validés par 2 experts en cognition • 18 MA probable dg basé sur les critères du

NINCDS/ADRDA• 46 démences non MA• Dosage A, Tau totale et PhosphoTau(181)•

ABetaTauPhosTauIATI

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

100

80

60

40

20

0

Sen

siti

vity

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

100

80

60

40

20

0

Sen

siti

vity

Comparaison des

Courbes de ROC

MA vs démences

ABeta

PhosTau

IATI

Tau

ABetaTauPhosTauIATI

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

100

80

60

40

20

0

Sen

siti

vity ABeta

PhosTau

IATITau

Comparaison des

Courbes de ROC

MA vs autres

diagnostics

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

100

80

60

40

20

0

Sen

siti

vity

Comparaison des courbes de ROC

A

Tau

P-Tau

IATI

A

1-4

2 (p

g/m

l)

0

500

1000

1500

2000

0 500 1000 1500

Tau (pg/mL)

A 1-42 = 240 + 1.18 Tau

AT I =

A 1-42 / (240 + 1.18 Tau) < 1

“A–Tau index” ou

AT I > 1

Index A–Tau (IATI)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200

pTau (pg/mL)

ATI

pTau = 60

AT I = 1

Combinaison Tau, Aß42 et P-Tau(181P)

Dosages dans le LCR (ELISA - Innogenetics®)

Alzheimer vs Autres Démences

Sensibilité Spécificité Courbe de ROC

Ab42 (<400 pg/ml) 43,5 % 63,3 % 0,560

Tau (>300 pg/ml) 73,9 % 56,7 % 0,740

P-Tau (>60 pg/ml) 69,6 % 90,0 % 0,776

IATI (<1) 82,6 % 53,3 % 0,767

Nos résultats Diagnostics

Neurology 1999;52:1555-1562

1.18[Tau] 240

AIATI

• Es ce qu’on parle de AOI en SELDI?

• On fera de la pub pour les marqueurs en routine?

• Et pour 14-3-3?

Nbre de patients traités et % de patients traités / patients prévalents

33%31%

32%

36%

0

5 000

10 000

15 000

20 000

25 000

30 000N

b. d

e p

ati

en

ts t

rait

és

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

% d

e p

ati

en

ts t

rait

és / p

ati

en

ts p

révale

nts

estimation du nombre de patients traités

% des patients traités/patients prévalents

Moyenne France : 28 %

source : GERS Déc 2003 & INSEE / PAQUID

Validation neuropathologique des biomarqueurs du LCR

N = 27 cas MA,

Dosage AAββ42, , Tau totale et P-Tau181 Se diagnostique = 99% ; Sp = 95% (par rapport aux témoins)

AJ Simon EU P2-165

N = 100 cas démences, Dg bio de MA posé dans 82,7% des cas confirmés anatomiquement. Les BM classent correctement 4/6 cas de MA avec présentation atypique

S Engelborghs, Anvers, 06

Analyse ELISA plasma A40 et A42– Suivi 2 à 12 ans (médiane 3,7ans) pour voir si développement

MCI ou MA– Cohorte de sujets âgés (n= 563) âge moyen 78 ans 62%

femmes

– Au cours du suivi 53 sujets développent MCI ou AD

– Ratio A 42/A40 est plus faible chez groupe avec plus fort risque d’évolution vers une MA RR 3.1

– Après ajustement âge, APOE, les patients avec ratio + faible ont un risque de déclin + élevé (p = 0.02).

– Intérêt du ratio comme marqueur prémorbide du MCI et MA

Graff-Radford NR Arch Neurol. 2007

Association entre faible ratio plasmatique A42/A40 et augmentation du risque chez personnes âgées de développer MCI et MA