IQAC-CSIC

Ismail Amghar Maach

Memòria Estades Cerca 2017

1.Introducció

L'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC), és un centre de recerca adscrit al CSIC (Consejo

Superior de Investigaciones Científicas), considerat l’organisme públic d’investigació més gran

d’Espanya i el tercer a nivell europeu. L’IQAC-CSIC fou creat per fer investigació d’excel·lència en

ciències químiques bàsiques, així com per resoldre problemes específics de la nostra societat, tot

utilitzant eines que provenen de la interfase de la química-biologia, de la química teòrica, de la

nanotecnologia química i biomolecular i de la química sostenible.

Amb el projecte que vaig dur a terme durant el transcurs de les 4 setmanes de la meva estada a

l’IQAC, vaig poder conèixer de primera mà els principis de la síntesi química, tant de pèptids com

oligonucleòtids, així com aprendre a estudiar l’estructura molecular i la interacció de la trombina

amb un conjugat oligonucleòtid (aptàmer d’unió a la trombina, TBA)-pèptid, de forma

computacional.

2. Fitxa tècnica

- Nom: Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC)

- Adreça: Carrer Jordi Girona, 18-26, 08034, Barcelona.

- Línies d’investigació:

• Química Biològica i Modelització Molecular

• Química Biomèdica

• Nanotecnologia Química i Biomolecular

• Tecnologia Química i de Tensioactius

- Àrea o departament: Departament de Nanotecnologia Química i Biomolecular – Grup de Química

d’Àcids Nucleics.

Altres grups relacionats amb el departament:

• Nanobiotecnologia pel Diagnòstic

• Química Col·loïdal i Interficial

• Química de Superfícies

- Investigadors al càrrec: Ramon Eritja i Carme Fàbrega

- Projecte: Síntesi d’un conjugat oligonucleòtid-pèptid

- Període de realització de l’estada: Del 3 de juliol al 31 de juliol de 2017

3. Objectius del projecte

L’objectiu de l’estada era sintetitzar i analitzar el conjugat oligonucleòtid-pèptid TBA-C6-G3EPPEFIE.

Per fer-ho, s’han utilitzat les tècniques de síntesi de pèptids en fase sòlida (SPFS) i cromatografia

analítica HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Paral·lelament, ha sigut necessària la

integració i familiarització amb els procediments bàsics d’un laboratori de química orgànica.

4. Activitats desenvolupades

Durant el transcurs de l’estada, vaig aprendre a utilitzar dos visors moleculars com PyMOL i

Avogadro, per dissenyar un conjugat oligonucleòtid-pèptid que pogués interaccionar amb la

trombina. Posteriorment, es va sintetitzar aquest conjugat oligonucleòtid-pèptid i es va analitzar

mitjançant cromatografia analítica HPLC. Per aquesta raó, vaig aprendre els fonaments bàsics tant

de la síntesi de pèptids com d’oligonucleòtids, així com la seva anàlisi i purificació per HPLC. Per altra

banda, vaig participar en un projecte desenvolupat en el grup de recerca que tractava del disseny i

la síntesi d’ADN origamis de forma rectangular, modificats per poder ser utilitzats en la teràpia del

càncer.

5. Valoració

L’experiència d’aquesta estada a l’IQAC ha sigut molt bona en tots els sentits. Per una banda, em va

agradar molt poder aplicar els coneixements teòrics en química i bioquímica a un treball molt pràctic

i autònom. D’aquesta manera, vaig poder conèixer i aplicar moltes tècniques i procediments que

abans no coneixia. Per altra banda, vaig disposar d’una flexibilitat d’horari que em va permetre

distribuir la realització del projecte al meu ritme i al mateix temps, podia preguntar tots els dubtes

que m’anaven sorgint durant cadascun dels passos que feia.

En resum, vaig poder gaudir d’una estada excel·lent i vaig poder integrar-me al laboratori d’una

forma total i molt ràpida, gràcies a la Carme Fàbrega, en Ramon Eritja i la resta d’investigadors del

grup.

Annexos

1. Representació de l’estructura conjugat TBA-pèptid i interacció amb la trombina

Diferents estudis han descrit l’estructura compacta i amb forma de cadira de l’aptàmer d’unió a la

trombina (TBA), de quàdruplex antiparal·lel unimolecular. La seva estructura, de seqüència:

5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’, es compon de dues tètrades G connectades a dues voltes o bucles

superiors: dues seqüències TT (T3-T4 i T12-T13) i una volta TGT a l'altre extrem (Fig.1).

Aquest oligonucleòtid de 15 bases interacciona específicament amb la trombina i per tant, posseeix

propietats anticoagulants interessants. Inhibeix de forma específica la trombina lligada al coàgul i

redueix la formació de trombes arterials.

L’objectiu és dissenyar un conjugat oligonucleòtid-pèptid, entre el TBA i una seqüència peptídica

(Fig.2A) que també se sap que interacciona amb la trombina (Figs. 2B i 2C), per incrementar la seva

afinitat per la trombina, i així millorar les seves propietats anticoagulants.

Fig.1: A) Estructura plegada del quàdruplex intramolecular adoptat pel TBA. B) Estructura de la G-

tètrada amb la disposició cíclica de 4 guanines formant ponts d’hidrogen de tipus Hoogsteen.

A) B)

A la representació de l’estructura del TBA-espaiador-pèptid (Fig.2A) podem observar la disposició

del pèptid que volem sintetitzar. El pèptid es pot reconèixer perquè produeix una gran desviació en

forma de volta. La figura mostra l’orientació i disposició de l’espaiador, constituït per una cadena de

6 carbonis, juntament amb l’oligopèptid.

Fig.2: Representació d’estructures químiques amb PyMOL A) Estructura del TBA-C6-G3EPPEFIE. B)

Estructura de la interacció entre el TBA i la trombina. C) Representació de la superposició de la

trombina amb TBA-C6-G3EPPEFIE.

Pèptid

TBA

TBA + pèptid

A)

B) C) Trombina

TBA

2.Síntesi d’un conjugat oligonucleòtid-pèptid

Els conjugats oligonucleòtid-pèptid són molècules quimèriques constituïdes per oligonucleòtids

enllaçats covalentment a pèptids. A la figura 3 es detalla l’esquema general del procés de síntesi que

hem utilitzat.

Un dels problemes en la síntesi d’aquest tipus de conjugats és la incompatibilitat dels esquemes

estàndard de protecció per pèptids i oligonucleòtids. Per exemple, al final de la SPFS es requereix

un tractament amb un àcid fort (TFA, àcid trifluoroacètic), que pot provocar una despurinització de

l’ADN. Per tant, en aquesta síntesi es van emprar àcids més suaus com l’àcid tricloroacètic (TCA).

Per evitar reaccions secundàries, també és necessari que l’extrem amino de cada aminoàcid es trobi

protegit, de la mateixa manera que ho han d’estar les seves cadenes laterals si estan

funcionalitzades. En aquesta síntesi, es van utilitzar aminoàcids protegits amb el grup Fmoc en el

seu extrem amino i l’aminoàcid àcid glutàmic (Glu, E) portava un grup protector en la seva cadena

lateral, com és el grup 2-fenilisopropil (PhiPr) èster.

El conjugat oligonucleòtid 5’ pèptid va ser sintetitzat pas a pas en un suport sòlid CPG (controlled

pore glass). Primer, es va sintetitzar la cadena de TBA mitjançant un sintetitzador automàtic i

fosforamidits degudament protegits. Posteriorment, se li va incorporar un espaiador format per una

cadena de 6 carbonis (C6) i acabat en un grup amino, i finalment es va incorporar la cadena peptídica

G3EPPEFIE. El conjugat oligonucleòtid-pèptid que es va obtenir finalment és: TBA-C6-G3EPPEFIE.

Durant tot el procés, es van realitzar rentats de la resina amb diferents dissolvents orgànics com la

N,N’-dimetilformamida (DMF), acetonitril (ACN) o el diclorometà (DCM), per assegurar la completa

eliminació dels excessos de reactius i poder facilitar els acoblaments entre aminoàcids.

Fig.3: Esquema del procediment de síntesi

2.1 Procediment

Sobre el TBA (sintetitzat anteriorment amb un sintetitzador automàtic d’ADN) unit a la resina es va

afegir l’espaiador acabat en un grup amino en el seu extrem 5’, utilitzant N-6-MMT-aminohexil

fosforamidit. A continuació, l’oligopèptid restant es va sintetitzar seguint l’esquema Fmoc, tal com

s’ha explicat prèviament.

• Preparem el següent sistema:

• Traiem els agents de bloqueig presents a sobre de la resina amb un rentat de piperidina al

20% en DMF. Escala de síntesi utilitzada: 0,5µmols.

• Rentem diverses vegades amb DMF i DCM.

• Traiem el grup MMT (monometoxitritil, de color groguenc) amb 3% TCA en DCM durant 10’.

• Afegim a la resina una solució 5% N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA) en DCM durant poc

temps, només per neutralitzar el pH i fer-lo bàsic.

• Fem diversos rentats amb ACN i amb DMF.

• Per a l’acoblament de cadascun dels aminoàcids:

Reactor

Col·lector de buit

Clau de pas

Bomba de buit

Fig.4: Esquema del sistema emprat al laboratori per la incorporació de la cadena peptídica

Flascó de recollida

de residus

- En un eppendorf, pesem la quantitat d’aminoàcid protegit necessària, i en un altre

pesem l’agent acoblant adequat (PyBOP, 5,20 mg o HATU, 3,80 mg).

- Dissolem tant l’aminoàcid com l’agent acoblant en DMF i vortexem per homogeneïtzar

les solucions.

- Afegim DIPEA (base, 3,48 µl) a l’eppendorf que conté la solució amb l’aminoàcid. A

continuació, afegim a sobre la solució amb l’agent acoblant i esperem 1’.

- Afegim aquesta solució dins del reactor que conté la resina.

- Realitzem dos acoblaments de cada aminoàcid (amb l’excepció de Gly3), un al matí i un

altre a la tarda, amb un interval de 4-5 hores entre acoblaments.

Nº

residu

AA MW Nº

eq.

Massa

(mg)

Agent

acoblant/Activador

Observacions

1 Fmoc-(Gly)3-OH 411,41 20 4,11 PyBOP/DIPEA

2 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA Color gris fosc de la

resina

3 Fmoc-Pro-OH 337,37 20 3,37 PyBOP/DIPEA

4 Fmoc-Pro-OH 337,37 20 3,37 PyBOP/DIPEA

5 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA

6 Fmoc-Phe-OH 387,43 20 3,87 PyBOP/DIPEA 1r acoblament Overnight

7 Fmoc-Ile-OH 353,41 20 3,53 PyBOP/DIPEA

8 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA

• Fem diversos rentats amb ACN i DMF.

• Desprotegim l’extrem N-terminal de l’aminoàcid acoblat amb 20% piperidina en DMF (2x5’).

- Aquesta reacció allibera el grup protector Fmoc (Fig.5 passos 1 i 2), i deixa lliure l’extrem

amino de l’aminoàcid perquè pugui reaccionar amb l’aminoàcid següent (Fig.5 pas 3).

En la reacció, s’obté dibenzofulvè com a subproducte (Fig.5 pas 4).

Taula 1: Acoblaments dels aminoàcids de la seqüència polipeptídica

• Per comprovar que la síntesi es duia a terme correctament es va fer un test de ninhidrina:

- Amb l’ajuda d’una espàtula, introduïm algunes perles de la resina a un tub d’assaig petit.

- Afegim 3 gotes del reactiu A i 3 gotes del reactiu B pel test de ninhidrina.

- Posem la mostra dins d’un Thermoblock que està a 110°C.

- Si el color de les boles de resina és groc (resultat negatiu, indicador de l’absència de

grups amino lliures), significa que l’acoblament s’ha dut a terme correctament i s’ha

acoblat totalment l’aminoàcid protegit amb Fmoc. En canvi, si presenten un color blavós

(resultat positiu, indicador de la presència de grups amino lliures), voldrà dir que no s’ha

acoblat l’aminoàcid de forma satisfactòria o que només ho ha fet parcialment, fet que

indicarà la necessitat de reacoblar l’aminoàcid.

• Fem diversos rentats amb ACN i DMF.

• Repetim tot el procés per acoblar el següent aminoàcid, i successivament amb la seqüència

peptídica restant (Taula 1).

• Un cop acabada la síntesi de tota la seqüència peptídica, passem a acetilar l’extrem N-terminal

del conjugat oligonucleòtid-pèptid. Per fer-ho, dissolem la resina en una solució d’anhídrid

acètic (Ac2O, 100 µl): DIPEA (170 µl): DMF (1,53 ml) durant 10’. D’aquesta manera, evitem que

l’extrem N-terminal pugui reaccionar i ciclar-se amb les cadenes laterals dels diferents àcids

glutàmics presents en aquesta seqüència. Posteriorment, rentem la resina amb DMF i ACN.

• Agafem la meitat de la resina i desprotegim les cadenes laterals dels Glu amb 5% TCA en DCM

durant 1h i després rentem amb ACN.

Fig.5: Mecanisme de desprotecció del grup Fmoc amb la piperidina

Fmoc

Aminoàcid protegit

Piperidina

Dibenzofulvè

Aminoàcid

desprotegit Subproducte

4

1 2

3

• Deixem assecar la resina a temperatura ambient. La traspassem a un vial i afegim amoníac

(Overnight a temperatura ambient, o bé 1h a 55°C) per desprotegir les cadenes laterals de

l’oligonucleòtid i separar el suport sòlid del conjugat oligonucleòtid-pèptid desitjat (Fig.6).

• Separem el suport i les sals de desprotecció, del conjugat en una columna Sephadex eluïda amb

aigua (Fig.7). Els producte resultant va ser purificat per HPLC de fase inversa.

2.2 Resultats HPLC

Injectem en una columna XBridgeTM OST C18 2,5µm 10x50mm la mostra obtinguda prèviament a un

gradient 0-30% ACN 20’.

En el cromatograma obtingut (Fig.8) observem un pic pronunciat entre 6 i 9 min, que correspondria

al conjugat oligonucleòtid-pèptid desitjat. Els altres subpics de menys intensitat observats en el

cromatograma corresponen probablement a subproductes o residus acumulats durant el procés de

síntesi (seqüències truncades durant els bloquejos...).

Fig.6: Escalfament del vial amb

l’amoníac a 55°C en un Thermoblock Fig.7: Pas de la resina i el conjugat per

la columna Sephadex

Fig.8: Cromatograma HPLC del conjugat oligonucleòtid-pèptid

Després de 3 injeccions, es van recollir en diferents vials els pics més destacats del cromatograma i

es va mesurar l’absorbància a 260 nm amb un espectrofotòmetre (en OD, 1 ml), per tal de calcular

la quantitat de conjugat obtinguda.

• Pic 6 min – 0,16

• Pic 6,5 min – 0,19/0,18/0,24

• Pic 7 min – 0,15/0,20/0,29

• Pic 7,5 min – 0,14/0,11/0,25

• Pic 8 min – 0,09

• Pic 12 min – 0,07/0,10/0,17

Per últim, és necessari realitzar una espectrometria de masses MALDI-TOF per identificar quin

d’aquests pics correspon al conjugat desitjat per així poder purificar-lo.

Fig.10: Instrument d’HPLC Fig.9: Àrea dels pics del cromatograma

Fig.11: Model espectrometria de masses MALDI-TOF. Es mostra un model de caràcter

representatiu, ja que durant la meva estada no vaig tenir temps de realitzar els espectres de

masses dels nostres productes obtinguts.

3. Disseny i síntesi d’ADN origamis

La síntesi d’ADN origamis permet plegar cadenes simples i llargues de molècules d’ADN aconseguint

formes bidimensionals i tridimensionals (Fig.12). El disseny de la forma desitjada s’aconsegueix

omplint un patró amb un base constituïda

per una molècula d’ADN de cadena simple

(M13), anomenada motllo, i escollint més de

200 cadenes curtes lineals d'oligonucleòtids

(staples o cadenes grapa) complementaris al

motllo que, establint unions per

complementarietat, ajuden a subjectar i

compactar l’estructura final de l’ADN origami

desitjat.

Un cop sintetitzats i barrejats en dissolució, les cadenes de staples i el motllo M13 s’autoensamblen

en un sol pas, mitjançant un procés d’escalfament ràpid a 85°C i un refredament lent.

En el grup de recerca s’estava realitzant un estudi de la utilització dels ADN origamis com a vehicles

nanomètrics per a la introducció de drogues antiproliferatives. Aquest tema em va interessar i vaig

poder participar en alguns experiments que es van dur a terme mitjançant cultius cel·lulars.

Es van sintetitzar 3 models diferents d’ADN origami:

• N origami: Cadena M13 i 250 staples normals (grup origami control).

• F origami: M13, 242 staples, 4 cadenes amb 13-14 subunitats X i 4 staples amb una molècula de

colesterol.

• T origami: M13, 236 staples, 6 cadenes amb 13-14 subunitats X i 8 staples amb una molècula de

colesterol.

El colesterol és una molècula emprada fer facilitar l’entrada i internalitació dels ADN origamis a les

cèl·lules.

Per comprovar l’efectivitat d’aquests origamis es van realitzar diferents experiments:

Fig.12: Diferents formes que poden adoptar els

ADN origamis 1

3.1 Experiment d’apoptosi

Una de les formes més fiables de detectar l’apoptosi en estats primerencs és comprovar la

localitació de la fosfatidilserina a la membrana plasmàtica. La fosfatidilserina és un tipus de

fosfolípid que en cèl·lules viables es manté a la monocapa interior de la membrana plasmàtica.

Tanmateix, quan es comença a desencadenar el procés d’apoptosi, la fosfatidilserina migra a la capa

externa de la mateixa membrana (Fig.13).

Aquesta localitació pot ser detectada fàcilment, ja que l’annexina V s’uneix específicament a la

fosfatidilserina en una reacció dependent del calci. Les molècules d’annexina V es marquen amb

diferents fluoròfors per detectar apoptosi mitjançant tècniques com la citometria de flux.

En estats tardans d’apoptosi, un cop la membrana plasmàtica ha perdut la seva integritat i el DNA

es fa accesible, s’empren molècules fluorescents que actuen com agents intercalants del DNA, com

el iodur de propidi (PI, propidium iodide).

Els experiments es van dur a terme en 2 línies cel·lulars de càncer colorrectal:

HTB 38:

• Control

• DMSO (Dissolvent orgànic, dimetilsulfòxid)

• PBS

• X 10 nM

HCC2998:

• Origami N

• Origami F

• Origami T

• Staples

• X’ 10 nM

• X 10 nM

Fig.13: Procés d’externalització de la fosfatidilserina durant l’apoptosi primerenca

L’objectiu principal d’aquest experiment és analitzar l’efectivitat dels origamis. Per fer-ho, els dos

darrers experiments amb els fàrmacs X’ i un derivat X administrats de forma independent actuen

com a grups control.

Per mesurar l’efectivitat es va realitzar una citometria de

flux (guava easyCyteTM), on es classifiquen les cèl·lules en

4 subtipus, depenent del seu grau de viabilitat, associat a

la interacció amb els dos fluoròfors, associats a l’annexina

V i al iodur de propidi. Aquesta distribució be

representada en un diagrama de 4 quadrants (Fig.14):

• Cèl·lules viables: Part inferior esquerra.

• Cèl·lules en apoptosi primerenca: Part inferior

dreta.

• Cèl·lules en apoptosi tardana: Part superior dreta.

• Cèl·lules necròtiques: Part superior esquerra.

Resultats en la línia cel·lular HTB-38

80

,1

6,0

4

13

,69

0,1

7

86

,49

6,5

3

6,8

6

0,1

3

84

,53

5,6

4 9,4

5

0,3

7

81

,41

5,6

3 12

,65

0,3

2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Cèl·lules viables Apoptosiprimerenca

Apoptosi tardana Necrosi

Pe

rce

nta

tge

cè

l·lu

les

HTB

-38

Control

PBS

DMSO

FdU 10 nM

Fig.15: Gràfic comparatiu del percentatge de cèl·lules HTB-38 en cada estadi.

Fig.14: Exemple d’un diagrama de 4

quadrants obtingut en una citometria

de flux

Viables

Apoptosi

primerenca

Apoptosi

tardana

Necrosi

X 10nM

Podem observar percentatges similars en els 4 estadis cel·lulars diferents, ja que són considerats

controls per a un posterior assaig.

A) Control B) PBS

C) DMSO D) X 10nM

Fig.16: Anàlisi de mostres per citometria de flux (guava easyCyteTM Software)

Resultats en línia cel·lular HCC-2998

Els resultats obtinguts mostren que el percentatge de cèl·lules viables en les mostres tractades amb

els ADN origamis és superior a les de cèl·lules que s’obtenen amb X’ i X. En canvi, és inferior que les

obtingudes en les mostres amb els staples. Per consolidar els resultats obtinguts seria necessari

realitzar rèpliques de l’experiment. De moment, es pot concloure que els ADN origamis amb X’/X i

colesterol tenen una eficàcia inferior a la dels fàrmacs administrats de forma independent. Dels

34

,88 43

,36

63

,04

55

9,9

8,8

3

0,0

1

0

49

,56

44

,31

0,0

3 8,7

5

5,6

5

3,5

1

36

,92

36

,25

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FU 10nM FdU 10 nM Staple Staple 1

Pe

rce

nta

tge

cè

l·lu

les

HC

C-2

99

8

Cèl·lules viables Apoptosi primerenca Apoptosi tardana Necrosi

53

,61

52

,4

46

,69

45

,71

13

,86

8,8

1

17

,92

18

,42

31

,54

36

,43

33

,7

34

,22

0,9

8

2,3

5

1,6

9

1,6

5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Origami N Origami F Origami T Origami T1

Pe

rce

nta

tge

cè

l·lu

les

HC

C-2

99

8

Cèl·lules viables Apoptosi primerenca Apoptosi tardana Necrosi

Fig.17: Gràfic comparatiu del percentatge de cèl·lules HCC-2998 en cada estadi A) Grups control i B)

ADN origamis

A)

B)

X’ X

origamis T i dels staples es van realitzar dues rèpliques, per obtenir resultats més precisos respecte

a la seva eficàcia.

Origami N Origami F

Origami T Origami T1 (Rèplica)

Staples Staples1 (Rèplica)

2.2 Experiment colorimètric MTT (Mort cel·lular)

El principi d’aquest experiment es basa en el colorant 3-

(4,5-dimetilazol-2-il)2,5 bromur difeniltetrazol (MTT), que

és reduït per deshidrogenases mitocondrials de cèl·lules

vives a formazan de color porpra (Fig.20). El resultant

formazan de color porpa pot ser solubilitzat i quantificat a

través de mètodes espectrofotomètrics.

Es van establir 4 grups:

• Control

• PBS (Control)

• Origami F

• Origami T

X’ 10nM X 10nM

Mitochondrial

reductase

Fig.20: Procés de reducció del MTT a Formazan

Fig.18: Anàlisi mostres per citometria de flux (guava easyCyteTM Software)

Fig.19: Anàlisi de les plaques en un

fluoròmetre

Resultats:

Podem observar com els ADN origamis F i T mostren una viabilitat de les cèl·lules lleugerament

inferior que no pas en el medi amb PBS. Tanmateix, la incorporació de 2 cadenes més de X a l’origami

T no sembla disminuir la viabilitat de les cèl·lules de forma proporcional. A més, el fet d’afegir 4

colesterols més a aquest origami T tampoc sembla afavorir de forma significativa la internalització

de X a les cèl·lules i conseqüentment, l’efectivitat del compost. Per tant, serien necessàries més

rèpliques de l’experiment per acabar de comprovar l’efectivitat dels ADN origamis.

Referències

1. Rothemund PW. Folding DNA to create nanoscale shapes and paterns. Nature. 2006;440:297-302.

0

20

40

60

80

100

120

PBS origami F origami TP

orc

en

tatg

e d

e

viab

ilita

t d

e c

èl·

lule

s

Fig.21: Gràfic de viabilitat de cèl·lules en el bioassaig MTT