Doktori értekezés

FÉLSZÁRAZ ALFÖLDI HOMOKTERÜLETEK SÖTÉT SZEPTÁLT

ENDOFITON (DSE) GOMBÁINAK VIZSGÁLATA

Knapp G. Dániel

Biológia Doktori Iskola

Iskolavezető: Prof. Erdei Anna, az MTA rendes tagja

Kísérletes Növénybiológia Doktori Program

Programvezető: Prof. Szigeti Zoltán

Témavezető: Dr. habil. Kovács M. Gábor, egy. docens, ELTE TTK,

Biológiai Intézet, Növényszervezettani Tanszék

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet

Növényszervezettani Tanszék

Budapest

2015

2

TARTALOMJEGYZÉK oldalszám

BEVEZETÉS 4

1. AZ ENDOFITON GOMBÁK ÁTTEKINTÉSE 5

1.1 Endofiton szervezetek 5

1.2 Endofiton gombák 5

1.2.1 A C-endofitonok 6

1.2.2 Az NC-endofitonok 7

1.3 Gyökérkolonizáló nem patogén gombák 8

1.3.1 Mikorrhiza képző gombák 8

1.3.2 Gyökérendofiton gombák 9

2. A DSE GOMBÁK IRODALMI ÁTTEKINTÉSE 10

2.1 Történeti áttekintés 10

2.2 A DSE gombák 11

2.2.1 A DSE gombák elterjedése 11

2.2.2 A DSE gombák rendszertani besorolása 13

2.2.3 A DSE gombák általános jellemzői 14

2.2.4 A DSE gombák propagulumai 16

2.3 A DSE gombák vizsgálata 17

2.3.1 A DSE gombák növényre gyakorolt hatásának vizsgálata 17

2.3.2 A DSE gombák kolonizációjának fénymikroszkópos vizsgálatai 18

2.3.3 A DSE gombák ultrastruktura vizsgálatai 19

2.3.4 A gombák molekuláris taxonómiai vizsgálata 20

2.3.5 Az Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszer 21

2.3.6 A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alapjai 22

3. CÉLKITŰZÉSEK 24

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 25

4.1 A mintavételi területek 25

4.2 A mintázott növények 26

4.3 A gombák izolálása a gyökerekből 26

4.4 Molekuláris vizsgálatok 27

4.4.1 DNS kivonás 27

4.4.2 Csoportspecifikus PCR és primer fejlesztés 28

4.4.3 Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) vizsgálatok 28

4.4.4 DNS régiók amplifikálása és szekvenálása 28

4.4.5 Filogenetikai analízis 30

4.5 Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) 32

4.5.1 A FISH próbák 32

4.5.2 A minták előkészítése 32

4.5.3 Hibridizációs lépés 33

4.5.4 Poszthibridizációs lépés 33

4.6 Inokulációs rendszerek 34

4.6.1 In vitro kísérletek a DSE sajátságok teszteléséhez 34

4.6.2 A FISH vizsgálatok inokulációs rendszere 34

4.6.3 A TEM vizsgálatokhoz összeállított inokulációs rendszer 35

4.7 Mikroszkópos vizsgálatok 36

4.7.1 Fluoreszcens mikroszkópia 36

4.7.2 Festés és fénymikroszkópos vizsgálatok 36

4.7.3 A minták előkészítése és ultrastruktura vizsgálata, TEM 37

4.7.4 Spóraképzés indukálása 37

3

5. EREDMÉNYEK 39

5.1 A félszáraz alföldi területek endofiton gombái 39

5.1.1 Terepi minták mikroszkópos vizsgálatai 39

5.1.2 Az izolátumok 39

5.2 Az inokulációs tesztek eredményei 39

5.3 Az azonosított DSE gombák 40

5.3.1 A tizennégy DSE csoport 43

5.3.2 Gazda és terület specficitás, szezonalitás és inváziós növények 45

5.4 DSE csoportok ISSR vizsgálatának eredményei 45

5.4.1 A kiválasztott DSE csoportok 45

5.4.2 A DSE-1 és DSE-7 izolátumok célzott gyűjtése és a specifikus PCR 46

5.4.3 ISSR primerek és PCR-ek eredményei 47

5.4.4 Az ISSR profilok eredményei 47

5.5 Az in planta FISH eredményei 51

5.6 Az ultrastruktura vizsgálatok eredményei 52

5.7 A taxonómiai vizsgálatok eredményei 55

5.7.1 Az izolátumok spóraképzése 55

5.7.2 Molekuláris taxonómiai eredmények 57

5.7.3 A három új nemzetség és az új fajok taxonómiai leírása 62

6. DISZKUSSZIÓ 70

6.1. Alföldi félszáraz területek DSE gombái 70

6.1.1 A terepi gyökerek kolonizációja 70

6.1.2 A DSE közösség fontosabb csoportjai 71

6.1.3 A DSE-k gazda- és területspecificitása és szezonalitása 74

6.1.4 A DSE közösség vizsgálatának konklúziói 75

6.2. A 3 DSE csoport izolátumainak ISSR vizsgálata 76

6.3. Az in planta FISH 77

6.4. A Cadophora sp. kolonizációjának TEM vizsgálata 79

6.5. A leírt DSE taxonok 81

6.5.1 Az új DSE nemzetségek elhelyezkedése 82

6.5.2 A Darksidea nemzetségbe tartozó más szekvenciák/izolátumok 83

6.5.3 Ivaros alak és spóraképzés a DSE gombáknál 84

7. ÖSSZEFOGLALÁS 85

8. SUMMARY 86

9. IRODALOMJEGYZÉK 87

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 103

11. FÜGGELÉK 104

12. PUBLIKÁCIÓS LISTA 115

4

BEVEZETÉS

A szárazföldi edényes növények többsége különböző nem patogén gombákkal él

együtt, az esetek többségében gyökerüket sokféle gomba kolonizálhatja, köztük endofitonok

is. Az endofiton gombák életciklusuk teljes, vagy egy meghatározó szakaszán tünetmentesen

élnek a gazdanövényben. Ezek egy formacsoportját alkotják a sötét szeptált endofitonok

(DSE), melyek elnevezésüket a gyökérben inter- és intracellulárisan futó, legtöbb esetben

pigmentált, szeptált hifáikról kapták. Ezekről a gombákról viszonylag kevés ismerettel

rendelkezünk, annak ellenére, hogy jelen vannak az összes ökoszisztémában, különösen

abiotikus stressznek kitett, például száraz-félszáraz élőhelyeken. A DSE gombák életmenet

stratégiájáról, életközösségekben betöltött szerepéről, diverzitásáról, a kolonizációs

lépéseiről és rendszertani besorolásáról információink meglehetősen hiányosak. Dolgozatom

témáját alföldi félszáraz homokterületek DSE gombáinak több irányú vizsgálata adja, mely

közelebbi betekintést adhat a fent említett alapvető kérdések megértéséhez.

A dolgozatban szereplő DSE közösség vizsgálatok már a munkába kapcsolódásom

előtt megkezdődtek (Pintye és Kovács 2006). Mivel ezen korábbi részeredmények az általam

kapottakkal együtt elemezhetők és értelmezhetők jól, továbbá számos új vizsgálatot is

végeztem ezekkel a törzsekkel, a dolgozatomban, jelölve, ezek az eredmények is

szerepelnek.

5

1. AZ ENDOFITON GOMBÁK ÁTTEKINTÉSE

1.1 Endofiton szervezetek

A növények különböző szervezetekkel élnek együtt, melyek a növény felszínén, vagy

szöveteiben is jelen vannak. Az endofiton elnevezés a görög endo (= belül) és phyton (=

növény) szavakból ered, és magában foglalja a növények szöveteiben jelen lévő

organizmusok széles spektrumát a baktériumoktól kezdve a gombákon keresztül a

metazoákig (Wilson 1995). Anton de Bary német botanikus-növénypatológus már 1886-ban

használta az endofiton kifejezést, melyet a növények hajtásaiban jelenlévő

mikroorganizmusok összefoglalására használt (Wilson 1995 alapján). Az endofiton

megnevezés nem feleltethető meg a szimbiózis egyik „de Bary-féle” klasszikus típusának

sem (pl. mutualizmus, kommenzalizmus, parazitizmus), egyedül az adott szervezet

növényben való jelenlétére vonatkozik (Saikkonen és mtsai 1998, Schulz és Boyle 2005,

Junker és mtsai 2012, Andrade-Linares és Franken 2013). Az endofitonok életmenet

stratégiájuk szerint lehetnek például látens patogének, látens szaprotrófok vagy

egyértelműen mutualista gombák is (Porras-Alfaro és Bayman 2011).

1.2 Endofiton gombák

Az endofiton gombák sokféle definíciója ismeretes. Legtöbb esetben azokat a

gombákat nevezzük endofitonoknak, melyek életciklusuk teljes, vagy egy meghatározó

szakaszán megtalálhatók a gazdanövényben, nem okozva látható szöveti károsodást (Petrini

1991, Hirsch és Braun 1992, Wilson 1995, Saikkonen és mtsai 1998, Stone és mtsai 2000,

Hyde és Soytong 2008). Az endofitonok inter- és intracellulárisan kolonizálják a növények

különböző szöveteit, megtalálhatóak az összes biomban és éghajlati övben, így fontos

szerepet tölthetnek be az ökoszisztémákban (Porras-Alfaro és Bayman 2011).

Az endofiton gombákat több féle szempontot figyelembe véve számos módon

kategorizálhatjuk (Hyde és Soytong 2008). Történeti és gazdasági szempontok alapján már a

kezdetektől két nagy csoportra osztották őket, megkülönböztetve/elkülönítve a fás szárú

növények és a fűfélék hajtásainak endofitonjait (Saikkonen és mtsai 1998). A fűfélék

endofitonjait mezőgazdasági jelentőségük miatt főként mezőgazdasági és alkalmazott

mikológiai szempontok alapján kezdték vizsgálni. A biológiai, taxonómiai vagy ökológiai

különbségek csak erősítették az eltérő megközelítésmódot a két különállónak tekintett

endofiton csoportnál (Saikkonen és mtsai 1998). A gazdanövények rendszertani helye és

életmenet stratégiája mellett további alapvető eltérés mutatkozott a két endofiton csoport

6

terjedési stratégiájában (pl. Saikkonen és mtsai 1998, Cheplik és Faeth 2009), mely történhet

ivaros spórával, konídiummal, vagy egyéb képlettel (horizontális terjedés) és a gombák a

növény szaporító képleteiben (pl. mag, szemtermés) is átkerülhetnek a következő gazda

generációba (vertikális terjedés) (Rodriguez és mtsai 2009).

A dolgozatban Rodriguez és mtsai (2009) által bevezetett kategóriák szerint

ismertetem az endofiton gombákat (1. táblázat). Ez a jelenleg is általánosan használt

rendszer (pl. Porras-Alfaro és Bayman 2011, Su és mtsai 2013) az endofitonokat történeti,

filogenetikai, funkcionális, kolonizációs és terjedési sajátosságaik alapján kategorizálja. E

szerint az endofiton gombák két fő csoportba sorolhatók; (i) az egyiket a Clavicipitaceae

(Sordariales, Ascomycota) családba tartozó, fűféléket kolonizáló gombák alkotják, ezeket C-

endofitonoknak nevezzük (CE, Clavicipitaceous endophytes vagy „class-1” endofitonok),

(ii) a másik csoportot a Clavicipitaceae-től eltérő rendszertani csoportokba tartozó NC-

endofitonok (NCE, non-Clavicipitaceous endophytes) alkotják. Az NC-endofitonokat

további három „funkcionális csoportra” oszthatjuk („class-2”, „class-3” és „class-4”, lásd 1.

táblázat) (Rodriguez és mtsai 2009). Ezen csoportokba sorolt gombáknak nincs

meghatározott gazdanövény csoportja, alacsonyabb rendű növények, harasztok,

nyitvatermők és zárvatermők szöveteit is kolonizálhatják.

1.2.1 A C-endofitonok

A C-endofitonok a Clavicipitaceae családba tartozó gombák (pl. Epichloë fajok;

anamorf: Neotyphodium), melyek szisztémásan (jelenlétük nem csak egy szervre-szövetre

korlátozódik) kolonizálják a pázsitfűfélék föld feletti hajtásait (Clay és Schardl 2002,

Rodriguez és mtsai 2009). A C-endofitonokat általánosan a gazdanövény mutualista

partnerének tekintik, főként az intercelluláris terekben fordulnak elő és vertikálisan

(szemterméseken keresztül) is terjednek (Schardl és mtsai 2004, Andrade-Linares és Franken

1. táblázat Az endifiton gombák csoportosítása Rodriguez és mtsai (2009) szerint, módosítva

C-endofitonok NC-endofitonok

szempontok class-1 class-2 class-3 class-4

gazda spektrum szűk széles széles széles

kolonizált szerv hajtás és rizóma hajtás, rizóma

és gyökér hajtás gyökér

kolonizáció mértéke kiterjedt kiterjedt limitált kiterjedt

növényen belüli

diverzitás mértéke alacsony alacsony magas nem ismert

terjedési stratégia vertikális és

horizontális

vertikális és

horizontális horizontális horizontális

7

2013). Az endofiton gombák a C-endofitonoknak köszönhetően kerültek fókuszpontba az

1970-es évek végén, amikor Bacon és mtsai (1977) felfedezték, hogy a legelőfüvekben

előforduló Clavicipitaceae családba tartozó endofiton gombák toxikusak a marhákra és egy

régóta ismert szindróma okozói. Az ezt követő tanulmányok rávilágítottak, hogy mind az

endofitonok, mind a toxinok okozta szindrómák általánosak és elterjedtek. Emiatt válhattak a

C-endofitonok az „egyik legérdekesebb és gazdaságilag legfontosabb típusává” a gomba-

növény interakcióknak (Andrade-Linares és Franken 2013), melyekkel azóta is számos

tanulmány, összefoglaló cikk, könyvfejezet és könyv foglalkozik (pl. Stone és mtsai 2000,

Bacon és White 2000, Faeth és Fagan 2002, Arnold és Lutzoni 2007, Spatafora és mtsai

2007, Cheplick és Faeth 2009, Porras-alfaro és Bayman 2011).

1.2.2 Az NC-endofitonok

Az NC-endofitonokról és ökológiai jelentőségükről relatíve kevesebb ismerettel

rendelkezünk, és csak nagy általánosságokban beszélhetünk erről a csoportról, mivel

rendkívül sokféle gomba sorolható ide. Ezeket feltételezett tulajdonságaik és funkcióik

alapján legalább három csoportba sorolhatjuk (1. táblázat) Rodriguez és mtsai (2009)

kategóriái szerint.

A class-2 endofitonok (1. táblázat) többségükben az aszkuszos gombák

Pezizomycotina altörzsébe tartoznak. Példaként említhetjük többek közt a „Phoma”,

Arthrobotrys, Fusarium culmorum, Colletotrichum magna és a Yellowstone hőforrásoknál

izolált Curvularia protuberata (Redman és mtsai 2002) fajokat. A class-2 endofitonok a

növény gyökerét, szárát és levelét is kolonizálhatják, horizontálisan és vertikális módon is

terjedhetnek. Általában egy speciális élőhelyen kölcsönös „habitat-adaptációt” biztosíthatnak

egymás közt a gazdanövénnyel, illetve egyes esetekben elengedhetetlenek lehetnek a növény

normális fejlődéséhez (Garbary és Macdonald 1995, Rodriguez és mtsai 2009). A „habitat-

adaptált előnyt” abiotikus és biotikus stressznek kitett növényeknek biztosíthatnak, többek

között növelhetik a gyökér és hajtás biomasszáját (pl. Mucciarelli és mtsai 2003), a

patogénekkel szembeni ellenállóképességet (pl. Narisawa és mtsai 2002) és a szárazság-, só-

és hőtűrést (Redman és mtsai 2002, Rodriguez és mtsai 2008).

A class-3 endofitonok (1. táblázat) kizárólagosan a növények föld fölötti szöveteiben

fordulnak elő, horizontálisan terjednek és extrém magas növényen belüli (in planta)

diverzitás jellemző rájuk. Ide sorolható a legtöbb endofiton gomba, melyek a moháktól

kezdve a zárvatermő növényekig, a trópusitól a sarki életközösségekig előfordulnak

8

(Rodriguez és mtsai 2009) a növények szárában, levelében, kérgében, virágában,

gyümölcsében és ide tartoznak a trópusi fák levelében jelen lévő extenzíven vizsgált

endofitonok is (Arnold és mtsai 2000, Tejesvi és mtsai 2005, Arnold és Lutzoni 2007). A

csoport magas diverzitásának köszönhetően nehéz ökológiai vagy egyéb funkcióiról

általános következtetést levonni.

A class-4 csoportba (1. táblázat) olyan endofiton gombák tartoznak, melyek

kolonizációja a növények gyökerére korlátozódik. E gyökérendofiton gombákat

részletesebben tárgyaljuk az 1.3.2 alfejezettől kezdve.

1.3 Gyökérkolonizáló nem patogén gombák

1.3.1 Mikorrhiza képző gombák

A szárazföldi edényes növények többsége mikorrhiza képző gombákkal él együtt. A

tudományos irodalomban növények gyökeréhez asszociált gombák tekintetében legtöbb

esetben ezzel a kapcsolattal találkozhatunk. A mikorrhizák „az abszorpció kettős szervei,

melyek akkor jönnek létre, mikor szimbiotikus gombák kolonizálják a szárazföldi növények

többségének és számos vízi növény és epifiton egészséges felszívó szerveit” (Trappe 1996).

A mikorrhiza képző gombák túlnyomó többsége a valódi gombák három törzsébe, a

Glomeromycota, az Ascomycota és a Basidiomycota törzsekbe tartoznak. A különböző

típusú mikorrhiza kapcsolatokban a gomba partner segíthet a növénynek a víz és a benne

oldott ásványi anyagok felvételében, míg a gombának a növény többek közt asszimilátumot

(cukrokat és más szerves anyagokat) ad át (Smith és Read 2008). Ez a legtöbb esetben

egyértelműen mutualista kapcsolat a gazdanövény és a gomba között, melynek alapja a

kölcsönös anyagátadás, mely sok esetben jól megfigyelhető struktúrákon (pl. intracelluláris

arbuszkulum (AM), intercelluláris Hartig-háló (EcM)) keresztül zajlik (Smith és Read

2008).

Habár a különböző mikorrhizaképző gombákat az endofiton gombák közé

sorolhatnánk az utóbbiak definiciója szerint, azonban viszonylag jól meghatározott

funkcionális tulajdonságaik (pl. mutualista kapcsolat, direkt tápanyag transzfer (Brundrett

2002), és strukturális bélyegeik (pl. köpeny, Hartig-háló, arbuszkulum) alapján a

mikorrhizaképző csoportokat külön kezelik.

9

1.3.2 Gyökérendofiton gombák

A növények láthatóan egészséges gyökereiben gombák széles spektruma megtalálható

(Vandenkoornhuyse és mtsai 2002), melyek között az aszkuszos gombák előfordulása

kiemelkedő mértékű (Addy és mtsai 2005), de mikorrhizát nem képző bazidíumos gombák is

kolonizálhatják a gyökereket (Porras-Alfaro és Bayman 2011, Herrera és mtsai 2010). A

bazídiumos gyökérendofitonok közé tartozik a Piriformospora indica (Basidiomycota,

Sebacinales), melyet egy Indiából származó talajmintában lévő arbuszkuláris mikorrhiza

(AM) képző gomba spórájából izoláltak (Verma és mtsai 1998). Relatíve alapos ismerettel

rendelkezünk e gombáról számos élettani, molekuláris biológiai és kolonizációs vizsgálatnak

köszönhetően (pl. Waller és mtsai 2005, Zuccaro és mtsai 2011, Lahrmann és mtsai 2013).

Néhány tanulmányban mikroszkópos megfigyelések alapján elkülönítették a „fine

endofitonokat”, melyek a gyökerekben általánosan előforduló nagyon vékony, alig látszó és

nehezen festhető hifákkal rendelkeznek és korábban az arbuszkuláris mikorrhiza képző

gombák (AMF) közé sorolták őket Glomus tenue gyűjtőnéven (Olsson és mtsai 2004,

Postma és mtsai 2007). A „fine endofitonok” rendszerani hovatartozása még tisztázatlan és

irodalmi adataik is elenyészők.

Az irodalomban több helyen találkozhatunk a „gyökérasszociált gomba” (RAF, root-

associated fungi) kifejezéssel, mely a gyökerekkel együtt előforduló gombákat jelenti, és sok

esetben (pl. Green és mtsai 2008, Herrera és mtsai 2010, Khidir és mtsai 2010) a gyökerek

felszín-sterilizálását követő molekuláris vizsgálatok során csak DNS szinten kimutatott

gombákat jelöli.

A gyökérendofitonok közül az aszkuszos gombák közé tartozó, pigmentált hifákkal

rendelkező endofiton gombákról viszonylag több ismerettel rendelkezünk, mivel a sötét

hifák relatíve könnyen detektálhatók a gyökerekben és ezek a gombák táptalajon általában

könnyen tenyészthetők (Narisawa és mtsai 2003, Addy és mtsai 2005).

A dolgozat további fejezeteiben az Ascomycota törzs, Rodriguez és mtsai (2009)

szerint class-4 csoportjába (1. táblázat) tartozó, a növények gyökerét kolonizáló és többnyire

pigmentált sejtfalú hifákkal rendelkező sötét szeptált endofiton gombák kerülnek

részletesebb bemutatásra.

10

2. A SÖTÉT SZEPTÁLT ENDOFITONOK IRODALMI ÁTTEKINTÉSE

2.1 Történeti áttekintés

A pigmentált hifákkal rendelkező gyökérkolonizáló gombák történeti áttekintését

Jumpponen és Trappe (1998a) munkája alapján ismertetem röviden.

A gyökereket kolonizáló szeptált hifákról először a XX. század elején Gallaud írt két

növény (Allium sphaerocephalum, Ruscus aculeatus) esetében. A 1920-as évek elején

Peyronel hasonló struktúrákat figyelt meg a nyári búza (Triticum aestivum) gyökerében,

majd Melin izolált „barnás feketés hifákkal rendelkező steril gombákat”, melyeknek a

Mycelium radicis atrovirens (MRA) és a Rhizoctonia sylvestris nevet adta. Előbbi

intracellulárisan, utóbbi a gyökér felszínén képzett szkleróciumokat (lásd Jumpponen és

Trappe 1998a).

Szintén Peyronel pár évvel később 135 zárvatermő növényfaj gyökerében figyelt meg

sötéten pigmentált, a kéregsejteiben pedig aggregált, vastag falú hifákat. A megfigyelt

képleteket „Rhizoctonia-szerű” struktúraként írta le, de tisztában volt vele, hogy ezeket nem

csak ez az egy csoport képzi. Melin később „pszeudomikorrhiza”-ként nevezte meg ezeket a

kapcsolatokat, mivel olyan növényfajokat vizsgált, melyek nem képeznek mikorrhizát és ezt

a kapcsolatot inkább parazita jellegűnek, mint mutualistának tekintette. De tudjuk, hogy ezek

a gombák mikorrhiza képző és nem mikorrhiza képző növények gyökerét egyaránt

kolonizálják (lásd Jumpponen és Trappe 1998a).

A gyökereket kolonizáló, pigmentált és szeptált hifákkal rendelkező gombákkal a

korábbi leírásokban több néven találkozhatunk: alkalmi mikorrhizás endofiton („casual

mycorrhizal endophytic”), pszeudomikorrhizás („pseudomycorrhizal”), Rhizoctonia-szerű,

szeptált endofiton (septate endophytes) és sötét szeptált (dark septate, DS) endofiton (lásd

Jumpponen és Trappe 1998a).

Napjainkban, bár még mindig többféle megnevezéssel találkozhatunk (pl. MRA,

Narisawa és mtsai 2002; DS endofitonok, Cázares és mtsai 2005), és bár O’Dell és mtsai

(1993) már több mint húsz éve jogosan felvetették, hogy a „szeptált endofiton” elnevezés

lenne megfelelő a többek között sok, csak hialin hifával rendelkező gyökérendofiton miatt, a

sötét szeptált endofiton (DSE, Dark Septate Endophytes) maradt a legszélesebb körben

használt megnevezés ezekre a gyökérendofiton gombákra.

11

2.2 A DSE gombák

2.2.1 A DSE gombák elterjedése

A gyökérszerű szöveteket kolonizáló arbuszkuláris mikorrhizaképző gombákat már

körülbelül 450 millió éves ősharasztokban is detektáltak már (Remy és mtsai 1994), ami arra

enged következtetni, hogy a növények szárazföldre lépése idején már meglehetett a

szimbiotikus kapcsolat a gombákkal. Krings és mtsai (2007) egy alsó devon korban jellemző

ősharaszt (Nothia aphylla) rizómájának rizoidszerű struktúráiban figyeltek meg

intracelluláris, nem AMF-re jellemző gombákat, ezért elmondható, hogy endofiton gombák

már legalább 400 millió éve jelen vannak a növények felszívó szerveiben. Klymiuk és mtsai

(2013) mikroszkleróciumhoz hasonló struktúrákat írtak le már az eocénból is.

DSE gombákat 144 növénycsalád közel 600 fajából mutattak ki, melyek közt

mikorrhizát képző és nem képző növények is voltak (Jumpponen és Trappe 1998a, Sieber és

Grünig 2013). A DSE gombák a mikorrhizakápző növényfajok gyökerében a több különböző

mikorrhizaképző gombával egyidejűleg jelen lehetnek (Jumpponen és Trappe 1998a).

Mandyam és Jumpponen (2005) tanulmányukban a különböző ökoszisztémákban

előforduló növények és DSE interakcióinak eloszlását és gyakoriságát foglalták össze. Habár

a DSE gombák jelen vannak az összes nagyobb biomban és éghajlati övben, előfordulásuk

különösen jelentős a szubarktikus, alpesi, mérsékelt övi és száraz területeken, ahol szerepük

a mikorrhizákéhoz is mérhető lehet (Jumpponen 2001), ennek ellenére az elterjedésüket és

diverzitásukat vizsgáló tanulmányok száma elenyésző. Egy korai, mérföldkőnek számító

tanulmány, mely az alpin területek növényeivel együtt élő DSE gombákra irányult (Read és

Haselwandter 1981), azt feltételezte, hogy a DSE gombák jelentősége és előfordulása a

növekvő abiotikus stressznek megfelelően emelkedik egy adott területen. A melanintartalom

is összefüggésbe hozható az abiotikus stressz, különösen a szárazságstressz meglétével (Bell

és Wheeler 1986), és a melanizált sejtfallal rendelkező gombákkal összeállított kísérleti

rendszerekben valóban megnövekedett hőmérsékleti és szárazságstressz elleni rezisztenciát

mutattak ki (Redman és mtsai 2002, McLellan és mtsai 2007). Ezek alapján feltételezhetjük,

hogy a legtöbbször pigmentált hifákkal rendelkező DSE gombák fontos szerepet játszhatnak

az alacsony vízellátottságú ökoszisztémákban.

A szélsőséges körülményeknek kitett élőhelyeken vizsgált növények gyökerében

jelentős mértékben előforduló pigmentált hifák alapján többen valószínűsítették, hogy

kedvezőtlen körülmények között a DSE gombák az arbuszkuláris mikorrhizák szerepét

12

tölthetik be egyes területeken (Haselwandter és Read 1982, Treu és mtsai 1996, Jumpponen

2001, Postma és mtsai 2007). Számos gyökérendofitonokkal foglalkozó, többségükben az

észak-amerikai füves területeken végzett tanulmány is foglalkozott száraz és félszáraz

területek gyökér asszociált gombáival (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008, Mandyam és mtsai

2010, Khidir és mtsai 2010), és egyre több vizsgálat irányul a DSE gombákra, azonban

számos alapvető tulajdonságuk még nem teljesen ismert, például, hogy ezek a gombák

mutatnak-e bármiféle gazda- és területspecificitást, vagy jellemző-e rájuk valamiféle

szezonalitás.

Habár a legtöbb magyarországi mikorrhizáltsági státuszvizsgálat során a szeptált hifák

általi kolonizációt külön jelezték (Kovács 2008), egyes élőhelyek DSE gombáira kevés

kutatás irányult. Alföldi homokterületek vizsgálata során például jelentős gyakoriságú DSE

kolonizációt figyeltek meg (Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002). A fülöpházi

homokgyep növényeinek mikorrhizáltsági státuszvizsgálata során 89 vizsgált növényfajból

63 növény esetében figyeltek meg szeptált gomba általi kolonizációt és 36 esetben találtak

mikroszkleróciumot (Kovács és Szigetvári 2002). Ezek az alföldi homokgyepek a DSE

gombák gyakoriságának köszönhetően ideális területek a DSE közösség vizsgálatához.

Egy endofiton közösségben más gombaközösségekhez hasonlóan lehetnek

gyakori/domináns és generalista gomba csoportok, melyek több növényfajban, többször és

tömegesen fordulnak elő, és lehetnek egy adott növényfajhoz vagy mikrohabitathoz köthető

szórványosan előforduló gombák (pl. Otero és mtsai 2004). Ha szeretnénk információt

szerezni egy gombaközösség általános funkciójáról, a generalista és domináns csoportok

azonosítása és vizsgálata lehet az első lépés.

Tájidegen növények inváziójának a terület növényközösség szerkezetére való föld

fölött jelentkező hatásával régóta tisztában vannak, azonban a földalatti közösségekre

gyakorolt hatásával csak az utóbbi évtizedekben kezdtek el foglalkozni (Hawkes és mtsai

2005). Belnap és mtsai (2005) kimutatták, hogy egy másik fűféle által dominált száraz

területre betörő fedélrozsnok (Bromus tectorum) szignifikánsan lecsökkentette a

talajközösség diverzitását az ízeltlábúaktól a fonalférgeken át a gombákig és feltételezhetően

az eredeti mikrokörnyezethez kevésbé specializálódott fajok maradtak jelen.

Az inváziós növények terjedési sikeressége nagymértékben függ a talajban lévő

mikroorganizmusoktól (Richardson és mtsai 2000, Callaway és mtsai 2004). Rudgers és

mtsai (2005) vizsgálatai során azt az eredményt kapták, hogy egy mutualista endofiton

gomba jelenléte is szignifikánsan növelheti a terjedés és megtelepedés sikerességét egy

13

területre betörő növényfaj esetén. A mikorrhizaképző inváziós növények is sok esetben

arbuszkuláris mikorrhizát képző gombákkal élhetnek együtt, melyekről ismert, hogy

általában generalisták (Richardson és mtsai 2000, Moora és mtsai 2011). Feltételezhetjük, ha

egy inváziós növény gombakapcsolatban él, a gomba generalista lehet, mivel egy specifikus

kapcsolattól való függés gátja lenne a növény sikeres terjedésének.

DSE gomba kolonizációt már kimutattak inváziós növényekből magyarországi

mikorrhizáltsági státuszvizsgálatok során (Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002),

azonban nincs információnk arról, hogy milyen gyökérendofitonok fordulnak elő ezekben a

növényekben.

2.2.2 A DSE gombák rendszertani besorolása

Mivel a DSE gombák a gyökérben előforduló, aszkuszos gombákhoz tartozó

endofitonok egy formacsoportját alkotják (Jumpponen és Trappe 1998a), az ide tartozó fajok

néhány tulajdonságának hasonlósága nem feltétlenül jelent közeli filogenetikai rokonságot.

A DSE gombákat a molekuláris filogenetikai filogenetikai módszerekkel való

meghatározások előtt az aszkuszos és imperfekt gombák különböző csoportjaiba sorolták

(Jumpponen és Trappe 1998a), majd a molekuláris filogenetikai vizsgálatok alapján is az

aszkuszos gombák törzsének számos rendjébe illeszkedtek.

A DSE gombák leginkább a Pezizomycotina altörzsbe és ezen belül többek között a

Helotiales, Pleosporales, Xylariales, Microascales, Hypocreales, Chaetothyriales,

Capnodiales, Eurotiales és Sordariales rendekbe tartoznak (lásd Jumpponen és Trappe

1998a, Addy és mtsai 2005, Kageyama és mtsai 2008, Newsham 2011, Andrade-Linares és

Franken 2013, Diene és mtsai 2013, Walsh és mtsai 2014).

A legújabb DSE fajok leírását is tartalmazó tanulmányok (pl. Diene és mtsai 2013,

Walsh és mtsai 2014) ellenére körülbelül csak 20-25 leírt DSE fajról tudunk (Wang és

Wilcox 1985, Jumpponen és Trappe 1998a, Andrade-Linares és Franken 2013, Sieber és

Grünig 2013). A legtöbb imerettel a Helotiales (Leotiomycetes) rendbe tartozó DSE

gombákról rendelkezünk, melyek például a Cadophora finlandica (syn.: Phialophora

finlandia (Harrington és McNew 2003)), Cadophora orchidicola (syn.: Leptodontidium

orchidicola (Day és mtsai 2012) valamint a relatíve jól ismert és számos tanulmányban

vizsgált Phialocephala fortinii sensu lato - Acephala applanata fajkomplex (PAC) (pl.

Haselwandter és Read 1982, Wilcox és Wang 1987, O’Dell és mtsai 1993, Stoyke és Currah

14

1. ábra Egy MMN táptlajon fenntartott Cadophora (DSE-1 csoport)

izolátum sötéten pigmentált, szeptált hifái. Mérce = 30 µm.

1993, Fernando és Currah 1996, Jumpponen és Trappe 1998b, Narisawa és mtsai 2002,

Upson és mtsai 2009).

A Pleosporales rend a Dothideomycetes osztály legnagyobb és a legtöbb

életközösségben magas fajszámmal reprezentált rendje (Schoch és mtsai 2009, Zhang és

mtsai 2012), mely a legtöbb, félszáraz és száraz területek gyökér asszociált gomba

közösségét vizsgáló tanulmányban is egyike a domináns, a szekvenciák/izolátumok/fajok

többségét tartalmazó rendeknek (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008). Ennek ellenére elsősorban

csak egy ebbe a rendbe tartozó fajt, a Periconia macrospinosa-t vizsgálták több

tanulmányban (pl. Mandyam és mtsai 2012).

2.2.3 A DSE gombák általános jellemzői

A DSE gombákra jellemzők a sötéten pigmentált, szeptált hifák (1. ábra), melyek inter-

és intracellulárisan egyaránt kolonizálják a gyökeret (Currah és mtsai 1993), valamint a

kéregállományban

intracellulárisan létrehozott

jellegzetes struktúrák, a

mikroszkleróciumok (2. ábra)

(Read és Haselwandter 1981,

Jumpponen és Trappe 1998a).

Sok esetben jelenlévő,

azonban kevésbé jól

detektálható képletek a hialin

hifák, melyek többnyire csak

festést követően válnak

láthatóvá, sok esetben pedig még akkor sem (Mandyam és Jumpponen 2008). A sötéten

pigmentált, szeptált hifák könnyen azonosíthatók a gyökérben festés nélkül is. A hifák

struktúrája és pigmentáltsága változhat többek közt kortól, fiziológiás állapottól és

környezeti tényezőktől függően (Zhang és Zhuang 2004, Addy és mtsai 2005). A hifák

sejtfalában a melanin akkumulációja viszonylag gyakori jelenség alacsony hőmérsékleten a

talajokban előforduló gombáknál és fontos szerepet játszhat a hifák környezeti szélsőségek

elleni védelmében (Robinson 2001).

A mikroszkleróciumok legtöbbször a gyökér kéregsejtjeiben elhelyezkedő, általában

erősen pigmentált, vastag sejtfalú struktúrák, azonban lehetnek kevéssé melanizáltak is és

15

2. ábra A DSE1049 Cadophora izolátum (DSE-1 csoport) által

kukorica gyökérben képzett intra- és intercelluláris hifák, valamint a

sejtekben létrejövő kéken festődő mikroszkleróciumok. Mérce = 40 µm.

sok esetben általánosan használt festékekkel is jól festhetők (2. ábra). Megfigyeltek már

vékony falú, hialin struktúrákat is, de valószínű, hogy csupán fiatal, fejlődésük korai

stádiumában lévő mikroszkleróciumokról lehetett szó (Mandyam és Jumpponen 2008).

Jumpponen és Trappe (1998a) a kéregsejtekben intracellulárisan megjelenő melanizált hifák

összességeként nevezte meg a struktúrát, azonban intercelluláris képződést is megfigyeltek

(pl. Münzenberger és mtsai 2009). A mikroszklerócium pontos funkcióját nem ismerjük, a

legnagyobb valószínűség szerint vegetatív szaporító- illetve kitartóképlet lehet, mivel

többnyire vastag falú, pigmentált sejtek alkotják, nagy mennyiségben tartalmaz glikogént,

fehérjéket, polifoszfátot, valamint számos sejtmag található benne (Yu és mtsai 2001).

A hialin hifák

kevésbé vizsgált és

vizsgálható struktúrák,

melyek hasonlóan a sötét

hifákhoz, szeptáltak és

intra- és intercellulárisan

futnak, azonban erősebben

vakuolizáltak és nem

pigmentáltak (Barrow és

Aaltonen 2001, Yu és

mtsai 2001, Mandyam és

Jumpponen 2008).

Barrow és Aaltonen

(2001) elképzelhetőnek tartotta, hogy a hialin hifák falából hiányozhat a kitin, mely általános

alkotóeleme a valódi gombák sejtfalának. Munkájuk során azt tapasztalták, hogy a hifák

nehezen festődnek tripán-kékkel, azonban sudan IV festék használatával láthatóak lettek,

mivel ez megfestette a vakuólumokban található lipidcseppeket (Barrow és Aaltonen 2001).

Egyes feltevések szerint a hialin hifák szerepet játszhatnak a gombák esetleges növénnyel

kialakított anyagcsere-kapcsolatában (Barrow és Aaltonen 2001). Mások azt valószínűsítik,

hogy ezek még pre-melanizációs állapotban lévő, később pigmentálttá váló hifák (Yu és

mtsai 2001).

16

2.2.4 A DSE gombák terjedése

A DSE gombák ivartalan alakban vannak jelen, az anamorf-teleomorf

megfeleltethetőségeik és kapcsolataik nem ismertek (Jumpponen és Trappe 1998a, Grünig és

mtsai 2008, Rodriguez és mtsai 2009). Ivartalan spóraképzés (pl. konidiogenezis) a DSE-

knél nagyon ritka, és sok esetben is csak specifikus kezeléseket követően indukálható (Wang

és Wilcox 1985, Sieber és Grünig 2006). A konídiumot képző gyökérendofiton gombák

esetében megfigyeltek blasztikus akropetális (a konídiumlánc csúcsán van a legfiatalabb

konídium), blasztikus bazipetális (a konídiumlánc alján van a legfiatalabb konídium) és

arthrikus (a vegetatív hifa feldarabolódásával keletkeznek a konídiumok) konídiumképzést

is, melyek alapján már régóta feltételezték a DSE gombák taxonómiai heterogenitását (Addy

és mtsai 2005).

Annak ellenére, hogy a DSE gombák általánosan jelen vannak a nagyobb

ökoszisztémákban és az idetartozó fajok legtöbbször széles körben elterjedtek és különböző

éghajlati övekből is előkerültek, terjedési stratégiájukról kevés ismeret áll rendelkezésre. Az

ivaros spóraképzés hiánya, a csak néhány törzsnél megfigyelhető konídiumképzés vagy a

néhányszor megfigyelt, spórát nem tartalmazó steril termőtestek megjelenése (Currah és

mtsai 1993, Grünig és mtsai 2009) alapvető kérdéseket vet fel e gombák terjedésével

kapcsolatban.

Ha csak érintőlegesen is, de két tanulmányban foglalkoztak ezzel a kérdéssel, melyek

során lehetségesnek tartották, hogy a DSE gombák, kolonizált gyökérdarabokkal és

mikroszkleróciumokkal, emlősállatok közvetítésével terjedhetnek (Herrera és mtsai 2011a,

Fracchia és mtsai 2011). Herrera és mtsai (2011a) észak-amerikai félszáraz területeken négy

növényevő emlős friss ürülékéből mutatott ki a terület gyökérasszociált gomba közösségébe

tartozó szekvenciákat, melyek az összes szekvencia közel 8%-át tették ki. Ezek alapján azt

feltételezték, hogy a gyökerek elfogyasztásával a növényevők szerepet játszhatnak a

gyökérasszociált gombák terjesztésében, ami a gyér földfeletti növényzet miatt száraz

területeken még nagyobb jelentőségű lehet. Fracchia és mtsai (2011) tanulmányukban egy

kistestű rágcsáló (Ctenomys knighti) a DSE gombák terjesztésében játszott lehetséges

szerepét vizsgálták az Argentin Monte-sivatag száraz területein. A rágcsáló ürülékéből

származó gyökérdarabok több mint 96%-át kolonizálták DSE gombák. A vízben feloldott,

kevert és kiszárított ürüléket inokulumnak használva búzával összeállított in vitro tesztek

során a növények 100%-át kolonizálta DSE, valamint további kísérleteik során kilenc, a

területre jellemző növényfajból nyolc esetében figyeltek meg DSE általi kolonizációt.

17

Eredményeik alapján lehetségesnek tartották, hogy rágcsáló fontos szerepet játszik a terület

DSE gombáinak terjesztésében.

2.3 A DSE gombák vizsgálata

2.3.1 A DSE gombák növényre gyakorolt hatásának vizsgálata

Számos vizsgálat irányult DSE gombák és gazdanövényük kapcsolatának

megismerésére, mely során a gombák növényre gyakorolt pozitív, semleges és negatív

hatását is kimutatták (Jumpponen és Trappe 1998a, b, Jumpponen 2001, Addy és mtsai

2005). Az elmúlt években két meta-analízis (Newsham 2011, Mayerhofer és mtsai 2013) az

addigi hatásvizsgálatokat foglalta össze. Mindkét esetben csak kevés tanulmány volt

összehasonlítható és együtt elemezhető, és a két meta-analízis eredményei ellentmondók

voltak. Newsham (2011) által elemzett kutatásokban a DSE gombáknak egyik vizsgált

paraméter alapján sem volt negatív hatása a növényekre. A DSE gombákkal inokulált

növények esetében hajtás és gyökér biomassza, valamint a hajtás nitrogén és foszfor tartalma

is szignifikánsan magasabb volt a kontroll növényekhez képest (Newsham 2011). Ezzel

szemben Mayerhofer és mtsai (2013) által elemzett kutatásokban a DSE gombák

szignifikánsan negatív hatással voltak a teljes növényi biomasszára, a legtöbb más vizsgált

paraméter (pl. gyökér és hajtás biomassza, nitrogén- és foszfortartalom) esetében neutrálisak

voltak. Ezeket az ellentmondó eredményeket a vizsgálatokban különböző gomba- és

növényfajok és kísérleti körülmények beállítása, valamint eltérő paraméterek mérése

magyarázhatja. Például ha egy kísérletben a gomba növényi biomasszára gyakorolt hatását

vizsgálják, nem tapasztalnak szignifikáns hatást, ha azonban a gazdanövény patogénekkel

szembeni ellenállóképességének növekedését vizsgálnák, pozitív hatást tapasztalának (pl.

Redman és mtsai 2001, Rice és Currah 2002, Addy és mtsai2005). Egyes hipotézisek szerint

több DSE gomba látens patogén, és csak a növény legyengülésére „vár” (Promputtha és

mtsai 2007).

A DSE gombák növényre gyakorolt hatását számos kísérletben, számos

gazdanövényen vizsgálták. Az inokulációs kísérleteket legtöbb esetben Helotiales rendbe

tartozó gombafajokkal és ezek közt is kiemelkedően sokszor a Phialocephala fortinii sensu

lato - Acephala applanata fajkomplex (PAC) törzseivel végezték (pl. Fernando és Currah

1996, Jumpponen és Trappe 1998b, Caldwell és mtsai 2000, Tellenbach és mtsai 2011,

Reininger és mtsai 2012).

18

A DSE gombák gazdanövényre (általában ennek biomasszájára) gyakorolt pozitív

hatását többféle módon magyarázhatjuk, például növelhetik a gazdanövény

ellenállóképességét a patogénekkel szemben. Több DSE-nél is megfigyelték, hogy

antibiotikumok termelésével csökkenthetik a rhizoszférában található patogének számát (pl.

Schulz és mtsai 1999, Xu és mtsai 2008). Az endofiton gombák képesek erős védekezési

reakciót kiváltani a gazdanövényben (Schulz és mtsai 1999), ezáltal növelve annak

rezisztenciáját azokkal a patogénekkel szemben, amelyek enélkül képesek lehetnek

válaszreakció kiváltása nélkül betörni a gyökerekbe (Narisawa és mtsai 2002). A talajba

kiválasztott enzimeik révén a DSE gombák a növények számára jobban felvehetővé, jobban

mobilizálhatóvá teszik a talajban oldott szerves és szervetlen anyagokat. Bontóenzimek

(cellulázok, lakkázok, amilázok, lipázok, pektinázok, xylanázok, fehérjebontó enzimek,

tirozinázok, polifenol oxidázok) széles spektrumát kimutatták már különböző DSE

gombáknál (Caldwell és mtsai 2000). A DSE gombák mineralizálhatják a talajban előforduló

szerves nitrogént, aminosavakból tápanyagokat szabadíthatnak fel (Mandyam és Jumpponen

2005, Upson és mtsai 2009), valamint elősegíthetik különböző ionok (pl. magnézium)

felvételét (Postma és mtsai 2007). A pigmentált hifák sejtfalában található melanin szerepet

játszhat a szárazságstressz folyamán létrejött oxigéngyökök megkötésében (Bell és Wheeler

1986, Redman és mtsai 2002).

2.3.2 A DSE gombák kolonizációjának fénymikroszkópos vizsgálatai

Annak ellenére, hogy Gallaud már több mint 100 éve írt gyökerekben futó sötéten

pigmentált hifákról (lásd Jumpponen és Trappe 1998a), ismereteink hiányosak a DSE

gombák gyökérkolonizációjáról. Kevés tanulmány helyezte középpontba a

gyökérendofitonok strukturális és ultrastruktúrális vizsgálatát, és ezek is néhány kivételtől

eltekintve fénymikroszkópos vizsgálatok voltak (lásd Peterson és mtsai 2008).

A DSE gombák mikroszkópos vizsgálataiból származó információkat és a

kolonizációs sajátosságaikat kritikusan kell kezelnünk, mivel ismereteink főként egy adott

rendbe (Helotiales) tartozó néhány gombafaj (PAC, Cadophora finlandica, C. orchidicola)

által kolonizált, főként mikorrhizaképző fásszárú zárvatermők (nyár (Populus sp.), nyír

(Betula sp.) és fűz (Salix sp.)) és nyitvatermők (kéttűs fenyő fajok.) gyökereiről származnak

(Jumpponen és Trappe 1998b, Peterson és mtsai 2008). A PAC fajok általánosságban a

fenyők, vagy más erdőalkotó fafajok gyakori endofitonjai (Grünig és mtsai 2002),

ismereteink viszont hiányosak a száraz területeken megtalálható DSE gombákról és az ottani

19

füves területek növényeinek (főként az itt domináló fűfajok) kolononizációjáról (de lásd pl.

Mandyam és mtsai 2012).

A jól megfigyelhető pigmentált hifák mellett a hialin hifák láthatóvá tétele gyakran,

például a Periconia macrospinosa (Pleosporales rend) esetében nehézkes, mivel a

hagyományosan használt festékek (pl. anilinkék, gyapotkék, tripánkék, tinta) nem minden

esetben festik meg a gomba sejtfalat (Barrow és Aaltonen 2001, Mandyam és Jumpponen

2008).

2.3.3 A DSE gombák ultrastruktura vizsgálatai

Peterson és mtsai (2008) saját eredményeik bemutatása mellett összefoglalják a

gyökérkolonizáló endofiton gombák transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) és

fénymikroszkópos vizsgálatával foglalkozó meglehetősen kevés számú tanulmányt. Peterson

és mtsai (2008) cikkéből kiindulva kerülnek bemutatásra az eddigi eredmények és

ismereteink erről a témáról.

A legtöbb ultrastruktura vizsgálat során a különböző növények gyökerét kolonizáló

Phialocephala fortinii által képzett struktúrákat és a kolonizáció sajátosságait

tanulmányozták. Több esetben hasonló struktúrák kialakulásáról vagy meglétéről számoltak

be, például a két rokon fafaj, egy fűz (Salix glauca) illetve egy nyár (Populus tremuloides)

faj kolonizálásának vizsgálatánál Fernando és Currah (1996) illetve Cameron (1998) a P.

fortinii azonos kolonizációs tulajdonságait, strukturáit írták le, miszerint elsősorban a

gyökérszőrökön keresztül penetráltak a hifák, majd képeztek mikroszkleróciumot. Más

esetekben teljesen eltérő eredményeket kaptak, például P. fortinii-val inokulált közeli rokon

fenyő fajok (Pinus contorta, P. strobus) kolonizációja teljesen eltérő volt. A gyökérben nem

figyeltek meg ektomikorrhizákra jellemző struktúrákat (köpenyt és Hartig-hálót) csak

intracelluláris hifákat és mikroszkleróciumokat (O’Dell és mtsai 1993, Jumpponen és Trappe

1998b), más esetekben pedig Hartig-háló képződött az intracelluláris hifák mellett és nem

találtak mikroszkleróciumot a gyökérben (Peterson és mtsai 2008).

A P. fortinii ultrastruktura vizsgálata mellett más gombákon, többek közt a rezgőnyár

gyökerét kolonizáló Cryptosporiopsis radicicola (Tsuneda és mtsai 2009) és a kínai

káposztát kolonizáló Heteroconium chaetospira (Ohki és mtsai 2002, Yonezawa és mtsai

2004, Usuki és Narisawa 2007) endofiton gombákon végeztek hasonló kísérleteket.

20

Többek közt a kevés vizsgálatnak és tanulmánynak köszönhetően számos fontos

kérdés mind tisztázatlan. Nem ismerjük a kolonizáció első lépéseit, a penetráció helyét és

módját, illetve hogy hogyan alakulnak ki a jellegzetes gomba struktúrák és milyen sejtszintű

változásokat indít el a kolonizáció mind a gomba mind a növényi sejtekben.

2.3.4 A gombák molekuláris taxonómiai vizsgálata

Mivel a gyökérendofitonok ivartalan alakban fordulnak elő, karakterekben szegények,

ráadásul csak néhányuk képez konídiumokat, melyek segíthetnének a határozásban,

rendszertani besorolásuk nehézségekbe ütközhet. A molekuláris módszerek használata

azonban lehetővé teszi a morfológiai alapon nehezen, vagy nem meghatározható szervezetek

elkülönítését.

A molekuláris filogenetikai taxonómiai vizsgálatokban a különböző szervezetek

homológ DNS szakaszainak összevetésével lehet következtetni a rokonsági kapcsolatokra. A

vizsgálni kívánt DNS szakasz kiválasztása általában az összehasonlítani kívánt csoportok

rendszertani szintjétől is függ. A magasabb taxonok (pl. osztály, rend) vizsgálatánál kevésbé

változó, konzervatív régiókat használunk, viszont ha fajok közti különbségeket keresünk,

akkor a DNS egy variábilisabb szakaszát vetjük össze. A gombáknál legtöbbször vizsgált

szakasz, a sejtmagi genomban több kópiában előforduló, konzervatívabb és variábilisabb

szakaszokat tartalmazó riboszómális RNS génkomplex. A fonalas gombák fajszintű

taxonómiai vizsgálatainál legtöbbször a sejtmagi riboszomális DNS (nrDNS) Internal

Transcribed Spacer (ITS) régióját alkalmazzák, mely két variábilis nem kódoló szakaszból

áll (ITS1, ITS2), melyek a 18S (Small Subunit, SSU), 5,8S és 28S (Large Subunit, LSU)

alegységek között helyezkednek el és azokkal egyetlen transzkripciós egységet alkotnak a

kromoszómákon. A gombák nemzetség és faj szintű meghatározására alkalmasnak tartott

ITS régiót közel 25 éve használják (White és mtsai 1990) rendszertani azonosításhoz és

filogenetikai elemzésekhez. Schoch és mtsai (2012) számos gombafaj több DNS

szakaszának elemzése alapján is az ITS régiót tartották a legalkalmasabb „DNS barcode

marker”-nek, mivel magas kópiaszámában van jelen, könnyen amplifikálható-szekvenálható

és a valódi gombacsoportok nagyrészénél lehetővé teszi a fajszintű elkülönítést. A GenBank-

ban és más adatbázisokban is a valódi gombák esetében az ITS régiók szekvenciája szerepel

legtöbbször, melynek használata könnyebbé teszi az adott szervezetek másokkal való

összevetését.

21

Több esetben azonban nem, vagy csak kevéssé használható a gombák esetében

„vonalkódnak” tekintett ITS régió fajok elkülönítésére, mivel a több kópiában lévő ITS

régiók különbözhetnek fajon belül, vagy azonosak lehetnek különböző fajok esetében (pl.

Geiser és mtsai 2007, Nilsson és mtsai 2008, Kovács és mtsai 2011, Kiss 2012, Carlson és

mtsai 2015).

Az ITS mellett más lokuszokat is sokszor használnak a gombák molekuláris

taxonómiájával foglalkozó tanulmányokban. Ilyenek például a kevésbé variábilis 18S és 28S

nrRNS gének, valamint fehérjéket (pl. aktin, tubulin, kalmodulin, transzlációs elongációs

faktor és RNS polimeráz) kódoló DNS szakaszok. Számos esetben például az aktin gén

szekvenciák (pl. Voigt és mtsai 2000) vagy a tubulin és elongációs faktor gén szekvenciák

(pl. Quaedvlieg és mtsai 2014) eredményeznek az ITS régiónál nagyobb és jobb feloldást

vagy faj szintű elkülönülést. Az elmúlt években a taxonómiai és filogenetikai témájú

tanulmányok túlnyomó többségében már több gén szekvenciáján alapuló elemzésekkel

találkozhatunk, és már meghatározott gomba genomok több száz lókuszának filogenetikai

elemzése sem ritka (pl. Galagan és mtsai 2005, Fitzpatrick és mtsai 2006, Nagy és mtsai

2014).

2.3.5 Az Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszer

Egy gomba fajon belüli genetikai variabilitásának vizsgálatához variábilis DNS

szakaszok meghatározása mellett használhatunk más technikákat is. Egy egyszerű módszer

az Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) polimeráz láncreakció (PCR), mely során egy

mikroszatellit szekvenciát használnak primerként. A mikroszatellitek olyan DNS szakaszok,

melyek szekvenciája néhány (1-6) nukleotid tandem ismétlődése (Weising és mtsai 2005,

Lim és mtsai 2004). Ha egy mikroszatellit amplifikálható távolságon belül fordított

helyzetben ismétlődik, akkor a PCR a mikroszatellitek által határolt szakasz

felszaporodásához vezet (Reddy és mtsai 2002). Mivel az ilyen szakaszokból a genomokban

több van, a PCR során több különböző méretű amplikon keletkezik. Ezeket gélelektroforézis

után a gélképen vizsgálhatjuk és ideális esetben az amplikonok több DNS sávból álló

mintázatot adnak (3. ábra). Ez a mintázat az ISSR profil, és ennek egy-egy sávja taxonra,

fajra vagy törzsre is jellemző lehet (Grünig és mtsai 2001, Reddy és mtsai 2002, Bornet és

mtsai 2005) az ITS régióénál jóval nagyobb lehet a felbontása. Az ISSR profilok elemzése

alkalmas lehet intraspecifikus genetikai variabilitás felmérésére és adott törzsek/izolátumok

azonosítására gombák esetében is (Grünig és mtsai 2001, Alaniz és mtsai 2009). Az ISSR

22

3. ábra 12 Cadophora sp. (DSE-1) izolátum ISSR profilja. Az (AAG)6 primerrel végzett PCR

termékek láthatók agaróz gélen futtatva (a létrák balról az 1., 7. és 15. zseb).

előnyei, hogy egyszerűen és viszonylag gyorsan kivitelezhető és az egész genomról ad

információt („ujjlenyomatot”). Más DNS fragment elemzésen alapuló technikával szemben

(pl. RAPD, random amplified polymorphic DNA; AFLP, amplified fragment-lenght

polimorphism) nagyobb polimorfizmust mutathat és jobb reprodukálhatósággal rendelkezik

(Bornet és Branchard 2001, Grünig és mtsai 2001, Reddy és mtsai 2002).

2.3.6 A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alapjai

Egy egészséges gyökeret egyszerre számos nem-patogén gomba kolonizálhat

(Vandenkoornhuyse és mtsai 2002). Ahhoz, hogy közelebb kerüljünk az endofiton gombák

funkciójának megértéséhez, a különböző endofiton gombafajok növény gyökerén belüli

specifikus detektálása, mely mind a terepi gyökerek vizsgálatánál, mind a különböző

gombákkal beállított inokulációs kísérleteknél alapfeltétel. Nem volt olyan tanulmány,

amiben a tenyésztéses és a szekvencia-alapú detektálás mellett ténylegesen egyszerre

festettek meg specifikusan két különböző gyökérendofiton gombát. Az endofiton gombák

gyökéren belüli hagyományos festése sokszor nehézkes a sejtfal sokszor nem konzekvens és

következetes festődése miatt (Barrow és Aaltonen 2001), a fajspecifikus festés pedig

rengeteg akadályba ütközik.

A különböző molekuláris technikákkal végzett diverzitás vizsgálatok során nagy

gombaközösség diverzitással találkozunk (Hibbett és mtsai 2009), azonban még nem áll

rendelkezésre egy általánosan használt és bevált technika arra, hogy specifikusan tegyük

láthatóvá és lokalizáljunk gombafajokat a növényekben.

23

Vannak módszerek, melyek a hifák egyes sejtfal-komponenseinek festésén (pl. Hood

és Shew 1996, Séjalon-Delmas és mtsai 1998), a hifák autofluoreszcenciáján (pl. Dickson és

Kolesik 1999, Hoch és mtsai 2005, Vierheilig és mtsai 2005, Dreyer és mtsai 2006, Diagne

és mtsai 2011), vagy egyes transzformált gombatörzsek esetén az expresszálódó fluoreszcens

fehérjék detektálásán alapulnak (pl. Lorang és mtsai 2001, Bergero és mtsai 2003, Czymmek

és mtsai 2005). A növényi szöveteken belüli fajspecifikus lokalizációját azonban e

módszerek sem teszik lehetővé.

Egy specifikus jelölési módszer a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH, fluorescence

in situ hybridization), melyet mikrobiális közösségek fajainak azonosítására is használnak

(Lundberg és mtsai 2012, Wagner és Haider 2012). A FISH-t már használták szabadon élő

gombák azonosítására (pl. Baschien és mtsai 2008, Jones és mtsai 2011) és gyökéren kívüli

AMF hifák jelölésére is (Trouvelot és mtsai 1999). Az RNS-FISH során fluorofórral jelölt

DNS oligonukleotid próbák hibridizálnak a komplementer RNS szakaszokkal,

leggyakrabban a riboszómális RNS-ekkel. Így a sejtek „citoplazmáját” (az abban lévő rRNS-

eket) festhetjük fluoreszcensen (Daims és mtsai 2005, Wagner és Haider 2012). A gombák

18S és 28S rRNS szekvenciáit használva, az RNS-FISH taxonspecifikus módon teszi

lehetővé a célszervezetek vizsgálatát (Daims és mtsai 2005, Baschien és mtsai 2008). A

jelölés intenzitása a riboszómák mennyiségétől függ, így az információt nyújthat a sejtek

állapotáról és metabolikus aktivitásáról is (Daims és mtsai 2005, Baschien és mtsai 2008,

Wagner és Haider 2012). Az rRNS-FISH alkalmazásakor gombák esetén nehézséget

jelenthet a már említett gombasejtek vagy azok környezetének (pl. növényi ill. állati

szövetek) autofluoreszcenciája, a sejtfal aspecifikus festődése a próbákkal, illetve fonalas

gombák esetén az a jelenség, hogy a különböző korú hifaszakaszok eltérő mértékben

festődnek (Vierheilig és mtsai 2005). Egy RNS-FISH alapú módszer kidolgozásával

lehetővé válna a taxon specifikus jelölés, melynek köszönhetően megoldható lenne egy adott

DSE gomba specifikus jelölése akár terepi mintán, akár egy kísérletben egy másik gomba

mellett.

24

3. CÉLKITŰZÉSEK

Célunk volt a generalista domináns DSE csoportok azonosítása az őshonos és inváziós

növények gyökeréről gyűjtött izolátumok alapján, valamint alföldi félszáraz homokterületek

DSE közösségének kompozicionális diverzitás vizsgálata. Célunk volt a DSE gombák

szezonalitás és terület specificitás vizsgálata, in vitro inokulációs rendszerekben tesztelni,

hogy egy izolátum valóban DSE gomba.

Célunk volt még a kiválasztott, domináns DSE csoportokba tartozó izolátumok további

gyűjtését követően, azok genetikai variabilitásának tesztelése az általánosan használt ITS

(internal transcribed spacer) régió „felbontásán” túlmutató és a teljes genomról információt

nyújtó ISSR (inter sample sequence repeat) vizsgálatokkal. Kérdésünk volt, hogy

elkülöníthetővé válnak-e a konspecifikus DSE izolátumok ezzel a módszerrel.

Célunk volt egy domináns DSE gomba gyökéren belüli specifikus jelölésére alkalmas

fluoreszcens mikroszkópiai módszer adaptálása, beállítása és alkalmazása, mellyel terepi

mintákban és különböző gombákkal egyszerre kolonizált gyökerekben is detektálhatjuk a

DSE gombákat.

Célul tűztük ki egy domináns DSE gomba funkcionális anatómiájának jellemzését

ultrastruktara vizsgálatokkal (TEM), mely új ismereteket nyújtana nem csak a vizsgált

gomba, hanem a DSE-k kolonizációjáról és stratégiájáról.

Viszonylag kevés jól meghatározott DSE fajról vannak ismereteink, ezért célul tűztük

ki a munkánk során előkerülő azonosítatlan DSE gombák taxonómiai vizsgálatát és az

esetleges új DSE taxonok leírását.

25

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

4.1 A mintavételi területek

Mintavételi területeink a Kiskunságban elhelyezkedő bugaci, fülöpházi és

tatárszentgyörgyi félszáraz homokterületek voltak (4. ábra).

Ezek meleg-száraz területek, ahol az éves napsütéses órák száma 2000-2100 körüli, a

csapadékmennyiség 500 és 600 mm közötti és az évi középhőmérséklet 10-12oC. A területek

tengerszint feletti magassága 100-150 m között van, és a humusztartalom mindhárom

területen 1%-nál alacsonyabb (Várallyai 1993, Kovács-Láng és mtsai 2000).

A Bugac környéki terület szélhordta homokkúpság-síkság. Talaja túlnyomórészt

futóhomok, de löszös betelepülések is találhatóak. A talaj enyhén bázikus (pH=7,6-7,8), a

K2O-tartalom 45-70 mg/kg, a P2O5-tartalom 35-50 mg/kg, az NH4-N tartalom 2-2,5 mg/kg, a

NO3-N pedig 2-2,5 mg/kg és a CaCO3 3-6 m/m% körül mozog. A Fülöpháza melletti terület

(4. ábra) homokbuckáit dunai eredetű, szél által szállított bázikus homok alkotja, melynek

pH értéke 8-8,2. A talajban a K2O-tartalom 40-60 mg/kg, a P2O5-tartalom 20-35 mg/kg, az

NH4-N tartalom 3-3,5 mg/kg, a NO3-N pedig 0,8-1,3 mg/kg. A CaCO3 10-13 m/m% körül

mozog. A Tatárszentgyörgynél elterülő futóhomokos terület talajának pH értéke 7,5-7,7. A

K2O-tartalom 55-80 mg/kg, a P2O5-tartalom 35-50 mg/kg, az NH4-N tartalom 2-2,5 mg/kg, a

NO3-N pedig 3,5-4 mg/kg. A CaCO3 6-9 m/m% körül mérhető. A területekről gyűjtött

talajminták analízisét az MTA TAKI szolgáltató laborjában végezték.

A kompozicionális

diverzitás, terület

specificitás és szezonalitás

vizsgálatához a három

területről vettünk fel

gyökérmintákat. A

további vizsgálatokhoz

szükséges, célzottan

gyűjtött izolátumok

egyedül a fülöpházi

homokpusztagyepről

származnak.

4. ábra A fülöpházi homokpusztagyep

26

4.2 A mintázott növények

A félszáraz területek DSE közösségének vizsgálata során nyolc őshonos és három

tájidegen növényfajról gyűjtöttünk mintákat. A mintázott növényfajok gyakoriak a területen,

több életforma típust és rendszertani csoportot reprezentálnak. Őshonos növények a

közönséges boróka (Juniperus communis), ékes napvirág (Helianthemum ovatum), heverő

naprózsa (Fumana procumbens), fehér nyár (Populus alba), serevényfűz (Salix

rosmarinifolia), közönséges csikófark (Ephedra dystachia), magyar csenkesz (Festuca

vaginata) homoki árvalányhaj (Stipa borysthenica) és az apró lucerna (Medicago minima).

Inváziós növények pedig az ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia), selyemkóró

(Asclepias syriaca), és a bálványfa (Ailanthus altissima). A gyökérmintákat 2005 és 2009

között gyűjtöttük véletlenszerűen kiválasztott, egészségesnek látszó növényekről.

A szezonalitás és terület specificitás vizsgálatokhoz mintáinkat mindhárom területen

10-10-10 megjelölt közönséges boróka egyedről gyűjtöttük két éven át (2008-2009) három

évszakban, tavasszal, nyáron és ősszel.

A genetikai variabilitás vizsgálatokhoz szükséges további mintákat közönséges boróka,

serevényfűz és a bálványfa gyökeréről gyűjtöttük 2012 tavaszán.

A taxonómiai munkákhoz szükséges további izolátumok három őshonos domináns

fűféle, a homoki árvalányhaj, magyar csenkesz és a fedélrozsnok (Bromus tectorum)

gyökeréről lettek gyűjtve 2012 nyarán.

A mintázott növények gyökereit kiástuk, vagy a kisebb növények esetében az egész

gyökérzetet távolítottuk el a talajból. A gyökereket nedves homokkal nylon zacskókban 8oC-

on tároltuk a feldolgozásukig, legfeljebb 3 napig.

A DSE közösség vizsgálatánál a mintavételek és az izolálálások egy részét már

korábban elvégezték (Pintye és Kovács 2006). Mivel ezen korábbi részeredmények az

általam kapottakkal együtt elemezhetők és értelmezhetők jól, továbbá számos új vizsgálatot

is végeztem ezekkel a törzsekkel, a dolgozatomban, jelölve, ezek az eredmények is

szerepelnek.

4.3 A gombák izolálása a gyökerekből

A gyökerek alapos tisztítását és mosását követően 1-1,5 cm hosszú, különböző

elhelyezkedésű és fejlettségű szakaszokat vágtunk le a gyökérről. Ezeket a gyökérdarabokat

felszín-sterilizáltuk (90 mp 2%-os nátrium-hipoklorit, 60 mp 70%-os etilalkohol és 3-4 p

27

steril desztillált víz), 4 részre vágtuk sterilizált szikével, majd a 3-4 mm-es gyökér

szegmenseket 9 cm-es Petri-csészében MMN táptalajra (Marx 1969; 250 mg/l (NH4)2HPO4;

500 mg/l KH2PO4; 150 mg/l MgSO4 x 7H2O; 50 mg/l CaCl2 x 2H2O; 25 mg/l NaCl; 20 mg/l

FeEDTA; 10 g/l glükóz; 3 g/l malátakivonat; 0,1 g/l Tiamin HCl; 15 g/l agar; pH=5,8; 10

μg/ml Streptomycin) helyeztük és 18°C-on sötétben tartottuk. A néhány nap után

gyökerekből kinövő gombákat növekedési jellemzőik alapján szétoltottuk, hogy tiszta

tenyészeteket kapjunk. Növényegyedenként a hasonló növekedésű és morfológiájú telepeket

azonosnak tekintettük, és csak egy törzsből vontunk ki DNS-t. Az izolátumokat fenntartásuk

során 18oC-on sötétben tároltuk és négy-hat havonta átoltottuk.

A taxonómiai és genetikai variabilitás vizsgálatokhoz kiválasztott DSE gombák

további törzseinek célzott izolálását a fent leírtakhoz hasonlóan végeztük. Ebben az esetben

a gyökérből kinövő telepekből egy kis micéliumdarabot 30 μl TE pufferben inkubáltunk

(96°C, 10 perc), majd ezt használtuk a diagnosztikai PCR során, ahol az adott csoportra

specifikus primer párokat használtuk. A pozitív reakciókat adó izolátumokat szétoltottuk és

MMN táptalajon tartottuk fent.

4.4 Molekuláris vizsgálatok

4.4.1 DNS kivonás

A DSE közösség molekuláris vizsgálatához DNS kivonást végeztünk a különböző

tenyészetekből kivágott néhány mm-es micéliumdaraból, egyszerűsített CTAB módszerrel.

A mintákat 400 l CTAB pufferben (2% CTAB; 20 mM pH=8 EDTA; 100 mM pH=9 Tris-

HCl; 1,4 mM NaCl) sterilizált kvarchomokkal és üvegtörővel tártuk fel, majd 50 percen

keresztül 60 oC-on szárazblokkban (M.R.C. LTD., Izrael) inkubáltuk. A mintákat 400 l

kloroform hozzáadásával tisztítottuk, 20 percig 13230 g-n centrifugáltuk (Hettich

Mikro200), majd a felülúszóhoz 1 térfogatnyi kloroformot mértünk és újabb 20 perc

centrifugálás után a felülúszóhoz 2 egység 96%-os etanolt és 0,1 egység nátriumacetátot (3M

pH=4,6, Sigma) adtunk majd 16-18 órán keresztül -20oC-on tartottuk. Ezután a mintákat 50

percig centrifugáltuk 13230 g-n, majd felülúszó eltávolítása és 600 l 70%-os etanol

hozzáadása után újabb 15 percig. A kiszárított pelleteket 30 l steril milli-Q vízben oldottuk.

A taxonómiai vizsgálatoknál a DNS kivonást több esetben UltraCleanTM Microbial

DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc., Solana Beach, CA, USA) segítségével

végeztük a gyártó használati utasítása szerint.

28

4.4.2 Csoportspecifikus PCR és primer fejlesztés

A terület domináns DSE csoportjainak azonosítását követően a DSE-1 és DSE-7

csoportokra specifikus diagnosztikai PCR-eket terveztünk, melyek lehetővé teszik az

izolátumok gyors azonosítását, és igazolhatják azok illeszkedését a keresett csoportokba.

Csoportokra specifikus primereket terveztünk a Primer3 (http://primer3.ut.ee/cgi-

bin/primer3) online program segítségével a már meghatározott ITS szekvenciák alapján. A

csoportokba tartozó összes eddigi általunk izolált törzs ITS szekvenciáinak és GenBankból

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) származó szekvenciák illesztése alapján választottuk ki és a

primereket az ITS1 és ITS2 régiók csoportra specifikus szakaszaira terveztük.

A csoportspecifikus detektáláshoz használt PCR profilok és reakcióelegyek leírása a

F1. d. táblázatban található.

4.4.3 Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) vizsgálatok

Munkánk során az ISSR PCR-hez a már azonosított DSE-1, DSE-3 és DSE-7

csoportokba tartozó törzsek DNS kivonatait használtuk. A kivonatok DNS koncentrációit

NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, USA) mértük, majd

egységesített töménységű (30-40 ng/l DNS) oldatokkal dolgoztunk tovább. Tizenegy

különböző ISSR primert választottunk ki tesztelésre ((AAC)6, (AAG)6, (AGG)6, (AGC)6,

(CCG)6, (ATC)6, (ACG)6, (AC)8, (AG)9, (AAT)6, (AT)8) Lim és mtsai (2004) tanulmánya

alapján, melyben 14 gomba genomban vizsgálták mikroszatellit régiók szekvenciáit és ezek

gyakoriságát. A néhány törzs DNS kivonatával végzett gyors tesztelést követően az (AAC)6,

(AAG)6, (AGG)6, (ATC)6, (CCG)6, (AC)8, (AG)9 primereket használtuk az ISSR

vizsgálatokhoz. Ez utóbbi primerek használatával a vizsgált DSE csoport törzsei esetén

értékelhető, több sávot tartalmazó ISSR profilt kaptunk. Az ISSR PCR profiljai és a

reakcióelegyek az F1. c. táblázatban szerepelnek. A sávok által adott mintázat vizsgálatához

10 µl amplifikált terméket futtattunk etídium-bromidot tartalmazó 2%-os agaróz gélben (100

V, 180 percig). Az ISSR PCR termékeket UV fény átvilágítással detektáltuk.

4.4.4 DNS régiók amplifikálása és szekvenálása

A DSE közösség vizsgálatánál a törzsek azonosításához a nrDNS ITS régióját

határoztuk meg az ITS1F (Gardes és Bruns 1993) és ITS4 (White és mtsai 1990) primer

párral, valamint az LSU egy részét az LR0R (Rehner és Samuels 1994) és LR5 (Vilgalys és

Hester 1990) primerekkel. A polimeráz lánc-reakcióhoz Biometra T-Gradient 96 típusú

29

készüléket használtunk. Az amplikonok tisztítását és szekvenálását az amplifikációhoz

használt primerekkel az LGC GmbH (Berlin, Németország) cég végezte. A PCR

reakcióelegyek és profilok részletei a F1. a. táblázatában szerepelnek.

A taxonómiai munkánál vizsgált izolátumokat és a meghatározott DNS régiókat a F2.

táblázat tartalmazza. Munkánk során az izolátumok nrDNS-ének egy nagyobb szakaszát

amplifikáltuk V9G (de Hoog és Gerrits van den Ende 1998) és LR5 primerekkel, majd az

ITS5 (White és mtsai 1990) és ITS4 illetve az LR0R és LR5 primerekkel végeztük az ITS és

LSU régió szekvenálását. A nrDNS kis alegységét (SSU) az NS1 és NS4 (White és mtsai

1990) primer párral, az aktin gént (ACT) Act-512F (Carbone és Kohn 1999) és ACT-2Rd

(Quaedvlieg és mtsai 2011) primerekkel, az elongációs faktor 1-α gént (EF) pedig aEF1-

728F (Carbone és Kohn 1999) és EF-2Rd (Groenewald és mtsai 2013) primer párral

amplifikáltuk és szekvenáltuk. CAL-228F (Carbone és Kohn 1999) és CAL-2Rd

(Groenewald és mtsai 2013) primerekkel amplifikáltuk és szekvenáltuk a kalmodulin gént

(CAL), és a Cyltub1F (Groenewald és mtsai 2013), Bt-2b (Glass és Donaldson 1995) primer

párral pedig a β-tubulin gént (TUB). A hiszton-H3 gén amplifikálása és szekvenálása

sikertelennek bizonyult a CylH3F és CylH3R (Crous és mtsai 2004) valamint a H3-1a és

H3-1b (Glass és Donaldson 1995) primer párokkal különböző kombinációkat, PCR profilt és

reakcióelegyeket használva, így erről nem teszünk több említést. A PCR termékeket BigDye

Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit használatával (Applied Biosystems, Foster City,

CA, USA) szekvenáltuk a használati utasítás szerint, majd a mintákat Sephadex (Sigma-

Aldrich Co. LLC, USA) segítségével tisztítottuk. A szekvenálási reakció termékének

elektroforézisét ABI Prism 3730XL Sequencer (Applied Biosystems) készülékkel végezték.

A munkánk során használt polimeráz láncreakciók profiljai az F1. b. táblázatban

vannak összefoglalva. A reakciók sikerességét agaróz gélelektroforézis segítségével

ellenőriztük, mely során 4 µl amplifikált terméket futtattuk etídium-bromid vagy Sybr Safe

(Invitrogen) fluoreszcens DNS festéket tartalmazó 1,5%-os agaróz gélen. A PCR termékeket

UV fény átvilágítással detektáltuk a BIO-RAD Geldoc készülékkel.

A kapott elektroforegramokat a Pregap4 és Gap4 programokkal (Staden 2000)

ellenőriztük és javítottuk. A szekvenciákat a GenBank (National Center for Biotechnology

Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) adatbázisban deponáltuk. Szekvenciáinkat a

GenBank BLASTn keresőjével (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (Altschul és mtsai 1990)

vetettük össze a nyilvános adatbázisban szereplő szekvenciákkal.

30

4.4.5 Filogenetikai analízis

A DSE közösség összetételének azonosításához az ITS szekvenciák illesztését a

MAFFT 6 online programmal (Katoh és Toh 2008) végeztük, majd az alignment

ellenőrzéséhez a ProSeq2.9 (Filatov 2002) programot használtuk. Az előzetes Minimum

Evolúciós fát MEGA4 software-rel (Tamura és mtsai 2007) készítettünk a Maximum

Composite Likelihood modellt és gap-ek páronkénti ignorálását beállítva. Bootstrap

módszert (Felsenstein 1985) alkalmaztunk az elágazások megbízhatóságának

meghatározására, melyek értékeit 1000 ismétlésből számítottuk.

Az ISSR vizsgálatokhoz az egyes minták ISSR profiljai alapján a látható 200bp és

2000bp hosszúság közötti sávokat prezencia/abszencia alapján GelAnalyser

(http://www.gelanalyzer.com) program segítségével bináris adat formájában rögzítettük. Az

adathalmazból a TREECON programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) a Nei és Li

(1979) koefficiens alapján UPGMA módszert alkalmazva állítottuk elő a dendrogrammot.

A molekuláris taxonómiai munkák során a molekuláris filogenetikai vizsgálatokhoz

három adatsor elemzését végeztük. A kiválasztott DSE csoportok „rend szintű” elemzéséhez

számos taxont tartalmazó adatsort használtunk, hogy információt kapjunk

elhelyezkedésükről a Pleosporales rendben. A DSE-7 csoport reprezentatív izolátumainak

„család szintű” elemzéséhez a Lentitheciaceae család összes ismert fajának szekvenciáit

használtuk, hogy ez esetben a családon belüli elhelyezkedésükről kapjunk képet. Egy

további adatsor a DSE-7 csoport estében a csoporton belüli viszonyok alaposabb

vizsgálatához volt szükséges. A szekvenciák illesztését a MAFFT 6 online programmal

(Katoh és Toh 2008) végeztük. A megfelelő nukleotid szubsztitúciós modellt a jModelTest

0.1.1 (Posada 2008) program AIC (Akaike information criterion) tesztet alkalmazva

választottuk ki. Az alignmenteket MEGA5 (Tamura és mtsai 2011) programmal ellenőriztük.

A filogenetikai elemzést a MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck és Ronquist 2001, Ronquist és

Huelsenbeck 2003) programmal végeztük, majd a topológiai konvergenciákat az AWTY

online software-rel (Nylander és mtsai 2008) ellenőriztük.

A „rend-szintű” és a „család szintű” több lókuszos filogenetikai elemzést az LSU, SSU

és TEF szekvenciák alignmentje alapján a következő paraméterek beállításával végeztük:

GTR+I+G szubsztitúciós modellt alkalmaztunk a SSU és TEF, illetve SYM+I+G modellt az

LSU-hoz. A „rend-szintű” elemzés esetében a négy Markov-lánc 10.000.000 generáción

keresztül futott, minden ötszázadik esetben vettünk mintát és az elemzés során az első 7500

31

fát nem vettük figyelembe (burn-in), a „család-szintű” elemzésnél négy Markov-lánc

10.000.000 generáción keresztül futott, minden ezredik esetben vettünk mintát és az elemzés

során az első 3000 fát nem vettük figyelembe (burn-in).

A DSE-7 törzsek csoporton belüli elhelyezkedésének vizsgálatához szükséges több

lókuszos filogenetikai elemzést a variábilisabb CAL és TEF szekvenciák illesztése

(alignmentje) alapján a következő paraméterek beállításával végeztük: GTR+I+G

szubsztitúciós modellt alkalmaztunk az ITS, ACT, TUB és TEF, illetve K2P modellt a CAL

esetén. Ahhoz, hogy információt kapjunk az ITS alignment indel régióiból (Nagy és mtsai

2012), a GapCoder program (Young and Healy 2003) használatával kódoltuk a gap-eket és

bináris adatsort hoztunk létre. Ennek elemzéséhez Mk2 Lewis modellt alkalmaztunk. A négy

Markov-lánc 10.000.000 generáción keresztül futott, minden ezredik lépésnél vettünk mintát

és az elemzés során az első 3000 fát nem vettük figyelembe (burn-in). A RAxML analízist a

raxmlGUI 1.3 (Silvestro és Michalak 2012) segítségével végeztük a GTR+G szubsztitúciós

modellt és az ágak támogatásának teszteléséhez 1000 ismétléses ML bootstrap vizsgálatot

alkalmazva. A törzsfákat a FigTree 1.4.0 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) és a

MEGA5 (Tamura és mtsai 2011) programcsomagokkal szerkesztettük.

32

4.5 Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)

Az alábbi fejezetben ismertetett in planta FISH protokollt előkísérlet sorozatok előzték

meg, melyek során megoldást találtunk az autofluoreszcencia és a jelölések specificitási

problémáira és beállítottuk az oldatok szükséges koncentrációit és az optimális

hőmérsékleteket. A dolgozatban csak a végleges munkákhoz használt protokoll szerepel.

4.5.1 A FISH próbák

A DSE-1 (Cadophora sp.) csoportra specifikus RNS-FISH próbát a már meglévő LSU

szekvenciák alapján terveztük az LSU gén D1-D2 régiójára. Ahhoz, hogy kikerüljük a

problémát, melyet a növényi szövetek erős autofluoreszcenciája okoz, számos, különböző

életfoma-típust és rendszertani kategoriát reprezentáló növény gyökerének

gerjesztési/emissziós spektrumát vizsgáltuk, és a spektroszkópiai eredmények alapján olyan

hullámhossz tartományban fluoreszkáló fluorofórokat használtunk az oligonukleoditok

jelölésére, melyben az autofluoreszcencia elég gyenge a próbák detektálásához. A

Cadophora specifikus oligonikleotid 5’ vége 546 nm hullámhosszon fluoreszkáló Alexa

Fluor 546 (Sigma) fluorofórral lett jelölve (CadoLSU01_af546: 5’-[A546] GAG AGG AGC

CAC ATT CCC AA 3’). A tervezett DSE-1 csoport specifikus FISH próba mellett AMF

specifikus próbát is terveztünk a Rhizophagus intraradices (Glomus intraradices) LSU

régiója alapján (GintrLSU01_af488: 5’-[A488] CAT ACG GGC AAG TAC ACC CAA 3’),

így lehetővé téve két különböző gyökérkolonizáló gomba együttes, specifikus jelölését.

4.5.2 A minták előkészítése

Az inokulációs rendszerekben nevelt növény gyökereinek alapos mosása és a

talajszemcsék eltávolítása után 6-8 mm hosszú gyökérszakaszokat vágtunk le. A gyökér

szegmenseket (a lipidek eltávolításához és membránok permeabilizálásához) CSK pufferbe

helyeztük (100 mM NaCl, 300 mM szaharóz, 3 mM MgCl2, 10 mM PIPES, 1% Triton

X100, 1 mM EGTA vízben oldva, pH=6.8) és 30 percig szobahőmérsékleten vákuumban

tartottuk. Ezután a gyökereket 4%-os paraformaldehides foszfátpufferbe (PBS, 0.07 M,

pH=7.2) helyeztük és 60 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, közben kétszer oldatot

cserélve. A gyökérmintákat 70%-os etanolban posztfixáltuk és a felhasználásig -20°C-on

tároltuk.

A gyökerekből 90–120 μm vastagságú metszeteket készítettünk Reichert fagyasztó

mikrotommal (Reichert, Austria), majd ezeket hibridizációs pufferben (20 ml pufferhez: 2

33

ml 20× SSC (NaCl - nátrium-citrát; 3 M NaCl, 0.3 M nátrium-citrát, pH=7.0), 2 g dextrán

szulfát (Sigma), 2 mg BSA (Sigma), 8 ml desztillált víz és 50% dimetilformamid (Sigma))

inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át.

4.5.3 Hibridizációs lépés

A hibridizációs folyamat első lépéseként a metszeteket foszfát pufferben inkubáltuk az

etanol kimosódásához, majd 400 μl hibridizációs pufferbe helyeztük mely 1 μl RNáz

inhibítort (RiboLock RNase Inhibitor 40 U/μl, Fermentas), 60 μl lazac DNS-t (10 mg/ml

vízben feloldva, Sigma) és 5 μl FISH próba oldatot is tartalmazott. A FISH próba oldat 20 μg

fluorofórral jelölt nukleotidot tartalmazott 5 μl TE pufferben (10 mM Tris–HCl, 1 mM

EDTA, pH=7.5) oldva. A hibridizációs lépés során a formamid koncentráció és a

hőmérséklet változtatásával tudjuk beállítani jelölés specificitását. Ahhoz, hogy a

hibridizációs beállítások optimalizálásával növeljük specifikus jelölés hatékonyságát két

próba keverékét tettük a pufferbe és a próbákat (CadoLSU01 és GintrLSU01) a Cadophora

izolátum tiszta tenyészetén teszteltük. A formamid koncentráció állandó értéken tartása

mellett a mosási hőmérséklet mértékét és hosszát változtattuk.

Az előzetes eredmények alapján mintáinkat 50%-os formamid koncentrációt

alkalmazva 46°C-on inkubáltuk egy éjszakán keresztül 0.2 ml csövekben PCR készülékben

(Hybaid PCR Sprint).

4.5.4 Poszthibridizációs lépés

A próbák hibridizációja során a felesleges próbák kimosását 1.5 ml csövekben

végeztük 48°C-on MRC szárazblokkon (M.R.C. Ltd). A gyökér mintákat háromszor mostuk

20 percig az előmelegített hibridizációs oldattal (mely nem tartalmazott dextrán szulfátot,

RNáz inhibítort, lazac sperma DNS-t és próbát), ezt követően ismét háromszor 30 percig

mostuk 2xSSC pufferben, majd 4x SSC-ben tároltuk és Fluoroshield (Sigma) lefedőszerrel

fedtük le.

34

4.6 Inokulációs rendszerek

4.6.1 In vitro kísérletek a DSE sajátságok teszteléséhez

Az in vitro kísérletek során a különböző izolátumokkal póréhagymákat (Allium

porrum) inokuláltunk, melyek könnyen csíráztathatók, kisméretűek, gyorsan nőnek és alig

pigmentált, jól vizsgálható gyökereik vannak. A póréhagyma magjait három percig 30%-os

H2O2-ban, 10 percig majd 15 percig steril csapvízben felszínsterilizáltuk. Ezután steril

csapvízzel benedvesített szűrőpapíron Petri-csészékben csíráztattuk őket. A

gyökérendofitonok ITS szekvenciái alapján kapott törzsfa csoportjaiból 1-1 reprezentáns

izolátumot (5. ábra) vizsgáltunk az inokulációs teszttel, hogy el tudjuk dönteni, az adott

csoport DSE gombának tekinthető-e. A növényre látható negatív hatással nem lévő, annak

gyökereit kolonizáló és mikroszkleróciumot képző, és ezekkel egy csoportban lévő

izolátumokat tekintettük DSE gombáknak.

A tenyészetekből pár mm-es, micéliumot tartalmazó agarkockákat vágtunk ki,

melyeket 9 cm-es Petri csészében cukormentes MS táptalajra (Murashige és Skoog 1962,

Sigma Basal Salt Mixture M5524, 15 mg/l agar, pH=5,8, 10 μg/ml Streptomycin) helyezett

14-15 napos hagymanövények mellé tettünk. Egy csíranövény gyökere mellé két telepdarab

került és izolátumonként öt növényt inokuláltunk. Minden vizsgálatsorozatban kontrollként

öt nem inokulált növényt is beállítottunk. A vizsgált növényeket SANYO MRL-350

fényszekrényben neveltük (megvilágítás: 24 oC, 14 óra, kevert fény; sötét: 22

oC, 10 óra) 8-9

héten keresztül. Az inokulálás időtartama alatt a növényeket rendszeresen ellenőriztük és

elrendezésüket változtattuk.

4.6.2 A FISH vizsgálatok inokulációs rendszere

A FISH vizsgálatokhoz DSE gomba partnernek egy DSE-1 kládhoz (Cadophora sp.,

Helotiales, Ascomycota) tartozó, Salix rosmarinifolia gyökeréről származó DSE1049 törzset

használtuk, és ezzel végeztük az inokulációt. A másik gyökérkolonizáló gomba a

Rhizophagus intraradices (Glomus intraradices, Glomeromycota) volt. A G. intraradices

oltóanyagot Yoram Kapulnik (ARO Volcani Center, Israel) bocsátotta rendelkezésünkre. A

növénypartner kukorica (Zea mays) volt, melynek a póréhagymáéhoz hasonlóan kevéssé

pigmentált gyökerei vannak, azonban jóval rövidebb idő alatt nagyobb gyökérzetet fejleszt.

35

A kukorica szemterméseit 50 ml-es Falcon csövekben, csapvízben és 70%-os

etanolban felváltva kétszer-kétszer 1 percig ráztuk, majd a terméseket steril körülmények

között 3 percig 30%-os H2O2-ban, 10 percig majd még 15 percig steril csapvízben tartva

felszínsterilizáltuk. A csíráztatás a fentebb írtakkal megegyező módon történt. A körülbelül

egy hetes csíranövényeket, a gomba inokulumokat és a kétszer sterilizált (2x 30 perc 121°C-

on, és 24 óra szobahőmérsékleten való inkubáció a két autoklávozás között) ültető közeget

(fülöpházi területről származó homoktalaj és zeolit 2:1 arányú keveréke) tartamazó

műanyagcserepekbe helyeztük. A két gombapartnerrel való inokuláláskor a talajba ~40 ml

G. intraradices inokulumot, valamint 10-12 db 5 mm átmérőjű telepdarabot helyeztünk,

melyek MMN táptalajra oltott telepek aktívan növekvő részeiből lettek kivágva. A csak DSE

gombával inokulált rendszerek esetén a cserepek nem tartalmaztak AMF inokulumot.

A vizsgált növényeket SANYO MRL-350 fényszekrényben neveltük (megvilágítás:

24oC, 14 óra, kevert fény; sötét: 22

oC, 10 óra) 6 héten keresztül. Az inokulálás időtartama

alatt a növényeket rendszeresen ellenőriztük és a cserepeket elrendezését változtattuk.

4.6.3 A TEM vizsgálatokhoz összeállított inokulációs rendszer

Az ultrastruktura vizsgálatokhoz az in vitro kísérletek során póréhagymát (Allium

porrum) inokuláltunk a DSE-1 kládhoz (Cadophora sp.) tartozó fentebb már bemutatott

DSE1049 izolátummal.

A póréhagyma magjainak felszín-sterilizálását és nevelését 4.6.1 fejezetben leírtak

szerint végeztük. Ebben a vizsgálatban azonban úgy nevezetett „kivezetett” inokulációs

rendszereket alkalmaztunk. Enyhén megdöntött 9 cm-es műanyag Petri-csészékbe MS

táptalajt öntöttünk, majd a táptalaj megszilárdulását követően izzított csipesszel kb 2-3 mm

széles és mély vájatot égettünk a Petri-csésze alsó részének peremébe (azon a részen ahol a

ferdén öntött MS a legnagyobb teret engedte) és 2-3 mm széles és teljes mélységű rést a

Petri-csésze felső részének peremébe is. Így a Petri-csésze két részét megfelelően

összeillesztve kapott 2-3 mm átmérőjű lyuk lehetővé teszi a növény kivezetését a csésze

oldalán. A körülbelül két hetes hagymákat úgy helyeztük a táptalajt tartalmazó Petri-

csészébe, hogy a gyökérnyak lehetőleg pontosan a résnél legyen és a gyökér bent legyen a

csészében. A Cadophora telepekből pár mm-es micéliumdarabokat vágtunk ki és a gyökerek

mellé helyeztük. A Petri-csészét parafilmmel lezártuk, ügyelve arra, hogy ne legyen rés a

növény mellett. A Petri-csészéket alufóliával borítottuk be, hogy a gyökereket és a gombákat

minél kevesebb fény érje.

36

A rendszereket folyamatosan ellenőriztük (sztereo- és fénymikroszkóppal), és

alkoholos filc-tollal a Petri-csésze alján jelöltük, hogy a gyökerek mely részeit mikor érik el

a hifák. Ezt az időpontot tekintettük a kolonizációs folyamatok kezdetének az adott

gyökérszakaszon. Innentől kezdve 6 héten keresztül kísértük figyelemmel az eseményeket,

és olyan gyökérszakaszokat gyűjtöttünk le, melyek 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6 hete lehettek

kolonizálva. Időpontonként összesen 15-20 gyökeret gyűjtöttünk.

4.7 Mikroszkópos vizsgálatok

4.7.1 Fluoreszcens mikroszkópia

A FISH-próbával való jelölés és a gyökérminták előkészítési lépései a 4.5 fejezetben

szerepelnek. A lefedett gyökérminták vizsgálatára epifluoreszcens és konfokális

mikroszkópot alkalmaztunk. Az fluoreszcens vizsgálatokat Nikon Eclipse 80i

epifluoreszcens mikroszkóppal végeztük, a fényképeket pedig Spot 7.4 Slider (Diagnostic

Instruments Inc.) típusú digitális kamerával készítettük.

A konfokális vizsgálatok során a 3D rekonstrukcióhoz Zeiss 410 konfokális lézer

scanning mikroszkóppal (CLSM) 1024 x 1024 pixeles 8 bites szürkeárnyalatos képeket

készítettünk. Az Alexa488-al jelölt DSE próbák esetén argon lézert (488 nm) és 465–495

nm-es gerjesztőszűrőt, 510 nm-es dikroikus tükröt és 525–550 nm-es zárószűrőt

használtunk. Az Alexa546 fluorofórral ellátott AMF próbák esetén hélium-neon lézerrel

(543 nm), 527–556 nm gerjesztési tartományban használható szűrőkockával, 565 nm felett

átengedő dikroikus tükörrel és 575–630 nm-es fénytartományt átengedő zárószűrővel

dolgoztunk.

Az optikai szeletek vastagságát a mikroszkóp szoftvere által javasoltak alapján

állítottuk be. A projekciókat a próbák emissziós hullámhosszának megfelelően színeztük

Adobe Photoshop 5.1 használatával. A két próba együttes alkalmazásánál a képeket

összeolvasztottuk, hogy a különböző struktúrák különböző színben látszódjanak.

4.7.2 Festés és fénymikroszkópos vizsgálatok

A mintavételi területeken mintázott növények gyökeréből és a gombákkal inokulált

póréhagymák gyökereiből fénymikroszkópos vizsgálatokhoz preparátumokat készítettünk. A

gyökereket alapos tisztítás után néhány cm-es részekre vágtuk, majd 10 percig 65 oC-on

10%-os KOH oldatban színtelenítettük, háromszor 15 percig mostuk desztillált vízben,

37

ezután további 10 percen keresztül tejsavas vízben savanyítottuk. A mintákat Anilin-kékkel

festettük meg, majd tejsavas desztillált vízben mostuk ki a felesleges festéket. A festett

gyökereket PVLG-ben (poli vinil alkohol-tejsav-glicerol) fedtük le. A preparátumokat Nikon

Eclipse 80i fénymikroszkóppal vizsgáltuk hagyományos és Nomarski-féle optikát (DIC)

használva.

4.7.3 A minták előkészítése és ultrastruktura vizsgálata, TEM

A póréhagymák különbőző ideje kolonizált, a táptalajban, vagy annak felszínén futó

gyökérszakaszait szikével óvatosan körbevágtuk, és vékony (1-2 mm) agar réteget hagytunk

a gyökér körül, hogy az annak felszínén levő hifák hozzávetőleges elhelyezkedéséről is

információt kapjunk. A gyökérszakaszokat tartalmazó táptalajhasábokat 2,5%-os

glutáraldehidben fixáltuk, 30 percre szobahőmérsékleten vákuumba helyeztük, majd

felhasználásukig 4 o

C-on tároltuk. A mintákat foszfát pufferben (0,07 M, pH=7,2) mostuk 2

órán át 4x puffert cserélve. A mintákat OsO4 1%-os foszfát pufferes oldatában 2 óráig

utófixáltuk / kontrasztosítottuk, majd a mintákat ismét foszfát pufferben mostuk 3x 20 percig

a puffert cserélve. Ezt követően mintáinkat sztereomikroszkóp alatt még kisebb (3x1x1 mm)

darabokra vágtuk és a felszálló alkoholsoros víztelenítést követően Durcupan ACM (Fluka

Chemie AG) műgyantába ágyaztuk. A félvékony hosszmetszeteket neofuxin-

kristályibolyával festettük, majd fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Az ultravékony metszeteket

Reichert Jung ULTRACUT mikrotommal (Ausztria) készítettük, majd uranil-acetáttal és

ólom-citráttal festettük (Reynolds 1963) és Hitachi 7100 (Japán) transzmissziós

elektronmikroszkóppal, 75 kV gyorsítófeszültséggel vizsgáltuk.

4.7.4 Spóraképzés indukálása

A taxonómiai vizsgálatok során az izolátumok esetleges spóra képzését a

szakirodalomban ismert módszerekkel próbáltuk indukálni. A telepeket 9 cm-es Petri-

csészékben különböző táptalajokra helyeztük és szobahőmérsékleten inkubáltuk. A

táptalajok PDA (potato-dextrose agar), SNA (synthetic nutrient-poor agar) MEA (malt

extract agar), OA (oatmeal agar) (lásd Crous és mtsai 2009), valamint MMN és MS voltak.

Az utóbbi két táptalajra újra törzseket oltottunk és ezeket 10°C-on inkubáltuk.

Továbbá az izolátumokat szobahőmérsékleten és 10°C-on is SNA táptalajra helyezett

sterlizált növényi szervekre, illetve szövetek mellé oltottuk, melyek segíthetik a

spóraképzést. Ezek a növényi részek árpa levelek, fekete fenyő tűlevelek, csalán szár

38

darabok és rozsnok gyökerek, valamint MS táptalajra helyezett vénic-szil ág darabok voltak.

A növényi részekre oltott törzseket 2 ismétlésben szobahőmérsékleten valamint 10°C-on

inkubáltuk. További három egyidejű kezeléshez MMN-re és MEA-ra oltott törzseket

használtunk, melyeket (i) izzított lándzsatűvel égettünk meg néhány helyen majd, 4 hétig

szobahőmérsékleten tároltuk, (ii) 3 napon keresztül UV fénynek tettük ki őket napi 3x 10

percig, ezután 4 hétig szobahőmérsékleten, majd 4°C-on sötétben, valamint (iii) lezárás

nélkül tároltuk a törzseket, ezt követően 3 hónapon keresztül hagytuk őket kiszáradni.

39

5. EREDMÉNYEK

5.1 A félszáraz alföldi területek endofiton gombái

5.1.1 Terepi minták mikroszkópos vizsgálata

A terepen gyűjtött különböző inváziós és őshonos növények festett gyökér-

preparátumainak mikroszkópos vizsgálata során minden esetben találtunk DSE gombákra

jellemző mikroszkleróciumokat, sötéten pigmentált és kéken festődő szeptált hifákat,

továbbá legtöbbször AM gombák általi kolonizációt is megfigyeltünk a gyökerekben.

5.1.2 Az izoláltumok

Az alföldi félszáraz homokterületek DSE közösségének megismeréséhez közel 200

gyökérmintát vettünk fel a három félszáraz homokterület őshonos és inváziós növényeiről. A

felszín-sterilizált gyökerekből 296 törzset izoláltunk, melyek közül 241 ITS régióját

határoztuk meg (ezek közül korábban 43 izolátum gyűjtése és azonosítása történt meg

(Pintye és Kovács 2006)).

A 241 izolátum az ITS szekvenciáik alapján 7 nagyobb (tíznél több izolátum) és 34

kisebb csoportba rendeződtek (5. ábra, F3. táblázat). A csak néhány (<8) izolátum által

reprezentált kisebb csoportok kizárólag őshonos, vagy inváziós növényekről kerültek elő,

míg a nagyobb törzsszámú csoportok őshonos és inváziós növények gyökerét is

kolonizálták. Egy kivételével minden izolátum az aszkuszos gombákhoz tartozott. Ennek

ITS szekvenciája az Auricularia nemzetségbe (Basidiomycota, Auriculariales) tartozó

gombákéval mutatott hasonlóságot, azonban a törzs egy idő után nem volt fenntartható

táptalajon és elvesztettük.

5.2 Az inokulációs tesztek eredményei

Számos tanulmány használja azt az egyszerű meghatározást, hogy endofitonnak

nevezzük azokat a gombákat, melyeket felszínsterilizált egészséges gyökérből izolálhatunk

(Porras-Alfaro és Bayman 2011). Munkánk során azonban csak egésszéges növények

felszínsterilizált gyökeréből izolált, majd in vitro inokulácios kísérletekben a gyökereket

kolonizáló és mikroszkleróciumot képző, a növényben látható károsodást nem okozó

izolátumokat valamint ezekkel egy csoportba tartozó izolátumokat tekintettük DSE-nek.

Az in vitro inokulációs tesztekhez 59 izolátumot választottunk ki, melyek 41 csoportot

reprezentáltak. Ezek közül 16 izolátummal korábban végezték el az in vitro kísérleteket

(Pintye és Kovács 2006). A nagyobb csoportok esetén több izolátummal végeztük a

40

kísérleteket. Az egészségesnek látszó póréhagymák 8-9 hét után fejlett gyökérzettel és 3–4

levéllel rendelkeztek. Kilenc izolátumnak volt egyértelmű negatív hatása a növényekre, ezek

4–5 héten belül elpusztultak. Huszonegy izolátum esetében az inokulált növények nem

különböztek a kontroll növényektől, azonban gyökereiket nem kolonizálták. 29 izolátum

esetében figyeltünk meg az egészségesnek látszó póréhagymák gyökerében gombák általi

kolonizációt. A 14 csoportot reprezentáló 29 izolátum mindegyike intracelluláris hifákkal

kolonizálta a gyökereket és mikroszkleróciumokat képzett. A póréhagymák gyökereit

kolonizáló hifák a legtöbb esetben nem voltak pigmentáltak és anilin kékkel jól festődtek,

valamint kéken festődő és erősen pigmentált mikroszkleróciumokat is megfigyeltünk. Az

egy csoportba tartozó, inokulumként használt izolátumok minden esetben hasonló

kolonizációt mutattak. Az in vitro kísérletek eredményeként tehát 14 csoportot tekintettünk

DSE-nek.

A két leggyakoribb, általunk nem DSE gombának tekintett csoportot ismert és szélesen

elterjedt patogének, az Ilyonectria macrodidyma (25. csoport) és Fusarium oxysporum (27.

csoport) alkották (5. ábra). A többi nem DSE csoportba is sok esetben patogén gombák

tartoztak. Fontos hangsúlyoznunk, hogy az in vitro kísérleti rendszereinkben használt, de az

általunk felállított DSE kritériumoknak nem megfelelő izolátumok lehetséges, hogy DSE

gombák, csak a kísérleti körülményeink között nem bizonyultak annak.

5.3 Az azonosított DSE gombák

Az összes izolátum által alkotott 41 csoportból 14, a 241 izolátumból pedig 142

bizonyult DSE gombának. Így a DSE csoportok az összes csoport ~35%-át, a DSE

izolátumok pedig az összes izolátum közel 60%-át reprezentálták. A 14 DSE csoportot a

dolgozatban ezen túl DSE-1–DSE-14 csoportoknak nevezzük (5. ábra, F3. táblázat).

A filogenetikai elemzések alapján összes DSE gomba az aszkuszos gombák különböző

rendjeibe tartozott. A Pleosporales (7 csoport), Helotiales (2 csoport), Hypocreales (2

csoport), Eurotiales (1 csoport), Xylariales (1 csoport) és a Glomerellales rendbe (1 csoport).

Néhány DSE csoportot faj és nemzetség szinten, másokat csak magasabb taxonómiai szinten

lehetett meghatározni (F4. táblázat). Több DSE csoport (DSE-2, -4, -5, -12) esetében sem az

ITS, sem az LSU szekvenciák nem mutattak hasonlóságot a GenBank-ban lévő

szekvenciákkal (F4. táblázat). A DSE gombák ITS szekvenciáinak BLAST elemzésénél a

hasonló szekvenciák eltérő éghajlati övek és területek növényeinek gyökeréből vagy a

talajból származtak.

41

REF001 (DSE-1)

REF002 (DSE-1 , X)

REF003 (DSE-1)

REF004 (DSE-1)

REF005 (DSE-1)

REF006 (DSE-1)

REF007 (DSE-1)

REF008 (DSE-1)

REF009 (DSE-1)

REF010 (DSE-1)

REF011 (DSE-1)

REF012 (DSE-1)

REF013 (DSE-1)

REF014 (DSE-1)

REF015 (DSE-1)

REF016 (DSE-1)

REF017 (DSE-1)

REF018 (DSE-1)

REF019 (DSE-1)

REF020 (DSE-1)

REF021 (DSE-1)

REF022 (DSE-1)

REF023 (DSE-1)

REF024 (DSE-1)

REF025 (DSE-1 , X)

REF026 (DSE-1)

REF027 (DSE-1)

REF028 (DSE-1)

REF029 (DSE-1)

REF030 (DSE-1)

REF031 (DSE-1)

REF032 (DSE-1)

REF033 (DSE-1)

REF034 (DSE-1)

REF035 (DSE-1)

REF036 (DSE-1)

REF037 (DSE-1 , X)

REF038 (DSE-1)

REF039 (DSE-1 , X)

REF040 (DSE-1)

REF041 (DSE-1)

REF042 (DSE-1)

REF043 (DSE-1)

REF044 (DSE-1)

REF045 (1, X)

REF046 (2, X)

REF047 (3, X)

REF048 (4)

REF049 (4, X)

REF050 (5, X)

REF051 (DSE-2)

REF052 (DSE-2)

REF053 (DSE-2)

REF054 (DSE-2)

REF055 (DSE-2 , X)

REF056 (DSE-2)

REF057 (DSE-2)

REF058 (DSE-2 , X)

REF059 (DSE-2)

REF060 (DSE-2)

REF061 (DSE-2)

REF062 (DSE-3)

REF063 (DSE-3)

REF064 (DSE-3)

REF065 (DSE-3)

REF066 (DSE-3)

REF067 (DSE-3)

REF068 (DSE-3)

REF069 (DSE-3)

REF070 (DSE-3)

REF071 (DSE-3)

REF072 (DSE-3)

REF073 (DSE-3)

REF074 (DSE-3)

REF075 (DSE-3)

REF076 (DSE-3)

REF077 (DSE-3)

REF078 (DSE-3 , X)

REF079 (DSE-3)

REF080 (DSE-3)

REF081 (DSE-3)

REF082 (DSE-3)

REF083 (DSE-3)

REF084 (DSE-3 , X)

REF085 (DSE-3)

REF086 (DSE-3)

REF087 (DSE-3)

REF088 (DSE-3 , X)

REF089 (DSE-3)

REF090 (DSE-3)

REF091 (DSE-3)

REF092 (DSE-3)

REF093 (DSE-3)

REF094 (DSE-3)

REF095 (DSE-3)

REF096 (DSE-3 , X)

REF097 (DSE-3)

REF098 (DSE-3)

REF099 (DSE-4)

REF100 (DSE-4)

REF101 (DSE-4 , X)

REF102 (6)

REF103 (6, X)

REF104 (DSE-5 , X)

REF105 (DSE-5)

REF106 (DSE-6 , X)

REF107 (DSE-6)

REF108 (DSE-6 , X)

REF109 (DSE-6 , X)

REF110 (DSE-6)

REF111 (7 , X)

REF112 (8, X)

REF113 (9)

REF114 (9)

REF115 (9, X)

REF116 (9)

REF117 (9)

REF118 (10)

REF119 (10)

REF120 (10)

REF121 (10, X)

REF122 (10)

REF123 (DSE-7 , X)

REF124 (DSE-7)

REF125 (DSE-7)

REF126 (DSE-7)

REF127 (DSE-7)

REF128 (DSE-7 , X)

REF129 (DSE-7)

REF130 (DSE-7 X)

REF131 (DSE-7)

REF132 (DSE-7 , X)

REF133 (DSE-7)

REF134 (DSE-7)

REF135 (DSE-7)

REF136 (DSE-7)

REF137 (DSE-7)

REF138 (DSE-7)

REF139 (DSE-7)

REF140 (DSE-7 , X)

REF141 (11, X)

REF142 (12, X)

REF143 (DSE-8 , X)

REF144 (DSE-8 , X)

REF145 (DSE-8)

REF146 (DSE-9)

REF147 (DSE-9)

REF148 (DSE-9 , X)

REF149 (DSE-9)

REF150 (DSE-9 , X)

REF151 (DSE-9)

REF152 (DSE-9)

REF153 (DSE-9)

REF154 (DSE-10 , X)

REF155 (DSE-10)

REF156 (DSE-10)

REF157 (13, X)

REF158 (DSE-11 , X)

REF159 (14, X)

REF160 (14)

REF161 (14)

REF162 (14)

REF163 (15, X)

REF164 (16, X)

REF165 (DSE-12 , X)

REF166 (DSE-13)

REF167 (DSE-13)

REF168 (DSE-13 , X)

REF169 (17, X)

REF170 (18, X)

REF171 (19, X)

REF172 (20, X)

REF173 (21, X)

REF174 (22, X)

REF175 (23, X)

REF176 (24, X)

REF177 (25)

REF178 (25)

REF179 (25)

REF180 (25)

REF181 (25, X)

REF182 (25)

REF183 (25)

REF184 (25)

REF185 (25)

REF186 (25)

REF187 (25)

REF188 (25)

REF189 (25)

REF190 (25)

REF191 (25)

REF192 (25)

REF193 (25)

REF194 (25)

REF195 (25)

REF196 (25)

REF197 (25)

REF198 (25)

REF199 (25)

REF200 (25)

REF201 (25, X)

REF202 (25)

REF203 (26, X)

REF204 (26)

REF205 (26)

REF206 (26, X)

REF207 (26)

REF208 (26)

REF209 (DSE-14)

REF210 (DSE-14 , X)

REF211 (DSE-14)

REF212 (27, X)

REF213 (27)

REF214 (27, X)

REF215 (27)

REF216 (27)

REF217 (27)

REF218 (27)

REF219 (27)

REF220 (27)

REF221 (27)

REF222 (27)

REF223 (27)

REF224 (27)

REF225 (27)

REF226 (27)

REF227 (27)

REF228 (27)

REF229 (27)

REF230 (27)

REF232 (27)

REF232 (27)

REF233 (27)

REF234 (27)

REF235 (27)

REF236 (27)

REF237 (27)

REF238 (27)

REF239 (27)

REF240 (27)

REF241 (27)

0.02

78

76

81

72

84

99

71

9796

87

77

99

99

83

91

99

99

99

91

99

99

99

99

90

99

99

86

81

97

98

99

97

98

95

73

99

99

89

91

74

99

99

99

99

99

9699

95

99

98

97

99

99

99

82

99

72

REF001 (DSE-1)

REF002 (DSE-1 , X)

REF003 (DSE-1)

REF004 (DSE-1)

REF005 (DSE-1)

REF006 (DSE-1)

REF007 (DSE-1)

REF008 (DSE-1)

REF009 (DSE-1)

REF010 (DSE-1)

REF011 (DSE-1)

REF012 (DSE-1)

REF013 (DSE-1)

REF014 (DSE-1)

REF015 (DSE-1)

REF016 (DSE-1)

REF017 (DSE-1)

REF018 (DSE-1)

REF019 (DSE-1)

REF020 (DSE-1)

REF021 (DSE-1)

REF022 (DSE-1)

REF023 (DSE-1)

REF024 (DSE-1)

REF025 (DSE-1 , X)

REF026 (DSE-1)

REF027 (DSE-1)

REF028 (DSE-1)

REF029 (DSE-1)

REF030 (DSE-1)

REF031 (DSE-1)

REF032 (DSE-1)

REF033 (DSE-1)

REF034 (DSE-1)

REF035 (DSE-1)

REF036 (DSE-1)

REF037 (DSE-1 , X)

REF038 (DSE-1)

REF039 (DSE-1 , X)

REF040 (DSE-1)

REF041 (DSE-1)

REF042 (DSE-1)

REF043 (DSE-1)

REF044 (DSE-1)

REF045 (1, X)

REF046 (2, X)

REF047 (3, X)

REF048 (4)

REF049 (4, X)

REF050 (5, X)

REF051 (DSE-2)

REF052 (DSE-2)

REF053 (DSE-2)

REF054 (DSE-2)

REF055 (DSE-2 , X)

REF056 (DSE-2)

REF057 (DSE-2)

REF058 (DSE-2 , X)

REF059 (DSE-2)

REF060 (DSE-2)

REF061 (DSE-2)

REF062 (DSE-3)

REF063 (DSE-3)

REF064 (DSE-3)

REF065 (DSE-3)

REF066 (DSE-3)

REF067 (DSE-3)

REF068 (DSE-3)

REF069 (DSE-3)

REF070 (DSE-3)

REF071 (DSE-3)

REF072 (DSE-3)

REF073 (DSE-3)

REF074 (DSE-3)

REF075 (DSE-3)

REF076 (DSE-3)

REF077 (DSE-3)

REF078 (DSE-3 , X)

REF079 (DSE-3)

REF080 (DSE-3)

REF081 (DSE-3)

REF082 (DSE-3)

REF083 (DSE-3)

REF084 (DSE-3 , X)

REF085 (DSE-3)

REF086 (DSE-3)

REF087 (DSE-3)

REF088 (DSE-3 , X)

REF089 (DSE-3)

REF090 (DSE-3)

REF091 (DSE-3)

REF092 (DSE-3)

REF093 (DSE-3)

REF094 (DSE-3)

REF095 (DSE-3)

REF096 (DSE-3 , X)

REF097 (DSE-3)

REF098 (DSE-3)

REF099 (DSE-4)

REF100 (DSE-4)

REF101 (DSE-4 , X)

REF102 (6)

REF103 (6, X)

REF104 (DSE-5 , X)

REF105 (DSE-5)

REF106 (DSE-6 , X)

REF107 (DSE-6)

REF108 (DSE-6 , X)

REF109 (DSE-6 , X)

REF110 (DSE-6)

REF111 (7 , X)

REF112 (8, X)

REF113 (9)

REF114 (9)

REF115 (9, X)

REF116 (9)

REF117 (9)

REF118 (10)

REF119 (10)

REF120 (10)

REF121 (10, X)

REF122 (10)

REF123 (DSE-7 , X)

REF124 (DSE-7)

REF125 (DSE-7)

REF126 (DSE-7)

REF127 (DSE-7)

REF128 (DSE-7 , X)

REF129 (DSE-7)

REF130 (DSE-7 X)

REF131 (DSE-7)

REF132 (DSE-7 , X)

REF133 (DSE-7)

REF134 (DSE-7)

REF135 (DSE-7)

REF136 (DSE-7)

REF137 (DSE-7)

REF138 (DSE-7)

REF139 (DSE-7)

REF140 (DSE-7 , X)

REF141 (11, X)

REF142 (12, X)

REF143 (DSE-8 , X)

REF144 (DSE-8 , X)

REF145 (DSE-8)

REF146 (DSE-9)

REF147 (DSE-9)

REF148 (DSE-9 , X)

REF149 (DSE-9)

REF150 (DSE-9 , X)

REF151 (DSE-9)

REF152 (DSE-9)

REF153 (DSE-9)

REF154 (DSE-10 , X)

REF155 (DSE-10)

REF156 (DSE-10)

REF157 (13, X)

REF158 (DSE-11 , X)

REF159 (14, X)

REF160 (14)

REF161 (14)

REF162 (14)

REF163 (15, X)

REF164 (16, X)

REF165 (DSE-12 , X)

REF166 (DSE-13)

REF167 (DSE-13)

REF168 (DSE-13 , X)

REF169 (17, X)

REF170 (18, X)

REF171 (19, X)

REF172 (20, X)

REF173 (21, X)

REF174 (22, X)

REF175 (23, X)

REF176 (24, X)

REF177 (25)

REF178 (25)

REF179 (25)

REF180 (25)

REF181 (25, X)

REF182 (25)

REF183 (25)

REF184 (25)

REF185 (25)

REF186 (25)

REF187 (25)

REF188 (25)

REF189 (25)

REF190 (25)

REF191 (25)

REF192 (25)

REF193 (25)

REF194 (25)

REF195 (25)

REF196 (25)

REF197 (25)

REF198 (25)

REF199 (25)

REF200 (25)

REF201 (25, X)

REF202 (25)

REF203 (26, X)

REF204 (26)

REF205 (26)

REF206 (26, X)

REF207 (26)

REF208 (26)

REF209 (DSE-14)

REF210 (DSE-14 , X)

REF211 (DSE-14)

REF212 (27, X)

REF213 (27)

REF214 (27, X)

REF215 (27)

REF216 (27)

REF217 (27)

REF218 (27)

REF219 (27)

REF220 (27)

REF221 (27)

REF222 (27)

REF223 (27)

REF224 (27)

REF225 (27)

REF226 (27)

REF227 (27)

REF228 (27)

REF229 (27)

REF230 (27)

REF232 (27)

REF232 (27)

REF233 (27)

REF234 (27)

REF235 (27)

REF236 (27)

REF237 (27)

REF238 (27)

REF239 (27)

REF240 (27)

REF241 (27)

0.02

78

76

81

72

84

99

71

9796

87

77

99

99

83

91

99

99

99

91

99

99

99

99

90

99

99

86

81

97

98

99

97

98

95

73

99

99

89

91

74

99

99

99

99

99

9699

95

99

98

97

99

99

99

82

99

72

5. ábra Az őshonos (O) és inváziós (▲) növényekről gyűjtött 241 izolátum ITS szekvenciái alapján MEGA 4

programmal készített Minimum Evolution fa, mely Maximum Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a

gap-ek páronkénti ignorálásával. A csoportok nevei zárójelben szerepelnek, és jelöltük (X) az inokulációs

kísérletekben használt törzseket. A bootstrap értékek (≥ 70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2

változásnak megfelelő ághosszat jelöl.

**

*

*

42

REF001 (DSE-1)

REF002 (DSE-1 , X)

REF003 (DSE-1)

REF004 (DSE-1)

REF005 (DSE-1)

REF006 (DSE-1)

REF007 (DSE-1)

REF008 (DSE-1)

REF009 (DSE-1)

REF010 (DSE-1)

REF011 (DSE-1)

REF012 (DSE-1)

REF013 (DSE-1)

REF014 (DSE-1)

REF015 (DSE-1)

REF016 (DSE-1)

REF017 (DSE-1)

REF018 (DSE-1)

REF019 (DSE-1)

REF020 (DSE-1)

REF021 (DSE-1)

REF022 (DSE-1)

REF023 (DSE-1)

REF024 (DSE-1)

REF025 (DSE-1 , X)

REF026 (DSE-1)

REF027 (DSE-1)

REF028 (DSE-1)

REF029 (DSE-1)

REF030 (DSE-1)

REF031 (DSE-1)

REF032 (DSE-1)

REF033 (DSE-1)

REF034 (DSE-1)

REF035 (DSE-1)

REF036 (DSE-1)

REF037 (DSE-1 , X)

REF038 (DSE-1)

REF039 (DSE-1 , X)

REF040 (DSE-1)

REF041 (DSE-1)

REF042 (DSE-1)

REF043 (DSE-1)

REF044 (DSE-1)

REF045 (1, X)

REF046 (2, X)

REF047 (3, X)

REF048 (4)

REF049 (4, X)

REF050 (5, X)

REF051 (DSE-2)

REF052 (DSE-2)

REF053 (DSE-2)

REF054 (DSE-2)

REF055 (DSE-2 , X)

REF056 (DSE-2)

REF057 (DSE-2)

REF058 (DSE-2 , X)

REF059 (DSE-2)

REF060 (DSE-2)

REF061 (DSE-2)

REF062 (DSE-3)

REF063 (DSE-3)

REF064 (DSE-3)

REF065 (DSE-3)

REF066 (DSE-3)

REF067 (DSE-3)

REF068 (DSE-3)

REF069 (DSE-3)

REF070 (DSE-3)

REF071 (DSE-3)

REF072 (DSE-3)

REF073 (DSE-3)

REF074 (DSE-3)

REF075 (DSE-3)

REF076 (DSE-3)

REF077 (DSE-3)

REF078 (DSE-3 , X)

REF079 (DSE-3)

REF080 (DSE-3)

REF081 (DSE-3)

REF082 (DSE-3)

REF083 (DSE-3)

REF084 (DSE-3 , X)

REF085 (DSE-3)

REF086 (DSE-3)

REF087 (DSE-3)

REF088 (DSE-3 , X)

REF089 (DSE-3)

REF090 (DSE-3)

REF091 (DSE-3)

REF092 (DSE-3)

REF093 (DSE-3)

REF094 (DSE-3)

REF095 (DSE-3)

REF096 (DSE-3 , X)

REF097 (DSE-3)

REF098 (DSE-3)

REF099 (DSE-4)

REF100 (DSE-4)

REF101 (DSE-4 , X)

REF102 (6)

REF103 (6, X)

REF104 (DSE-5 , X)

REF105 (DSE-5)

REF106 (DSE-6 , X)

REF107 (DSE-6)

REF108 (DSE-6 , X)

REF109 (DSE-6 , X)

REF110 (DSE-6)

REF111 (7 , X)

REF112 (8, X)

REF113 (9)

REF114 (9)

REF115 (9, X)

REF116 (9)

REF117 (9)

REF118 (10)

REF119 (10)

REF120 (10)

REF121 (10, X)

REF122 (10)

REF123 (DSE-7 , X)

REF124 (DSE-7)

REF125 (DSE-7)

REF126 (DSE-7)

REF127 (DSE-7)

REF128 (DSE-7 , X)

REF129 (DSE-7)

REF130 (DSE-7 X)

REF131 (DSE-7)

REF132 (DSE-7 , X)

REF133 (DSE-7)

REF134 (DSE-7)

REF135 (DSE-7)

REF136 (DSE-7)

REF137 (DSE-7)

REF138 (DSE-7)

REF139 (DSE-7)

REF140 (DSE-7 , X)

REF141 (11, X)

REF142 (12, X)

REF143 (DSE-8 , X)

REF144 (DSE-8 , X)

REF145 (DSE-8)

REF146 (DSE-9)

REF147 (DSE-9)

REF148 (DSE-9 , X)

REF149 (DSE-9)

REF150 (DSE-9 , X)

REF151 (DSE-9)

REF152 (DSE-9)

REF153 (DSE-9)

REF154 (DSE-10 , X)

REF155 (DSE-10)

REF156 (DSE-10)

REF157 (13, X)

REF158 (DSE-11 , X)

REF159 (14, X)

REF160 (14)

REF161 (14)

REF162 (14)

REF163 (15, X)

REF164 (16, X)

REF165 (DSE-12 , X)

REF166 (DSE-13)

REF167 (DSE-13)

REF168 (DSE-13 , X)

REF169 (17, X)

REF170 (18, X)

REF171 (19, X)

REF172 (20, X)

REF173 (21, X)

REF174 (22, X)

REF175 (23, X)

REF176 (24, X)

REF177 (25)

REF178 (25)

REF179 (25)

REF180 (25)

REF181 (25, X)

REF182 (25)

REF183 (25)

REF184 (25)

REF185 (25)

REF186 (25)

REF187 (25)

REF188 (25)

REF189 (25)

REF190 (25)

REF191 (25)

REF192 (25)

REF193 (25)

REF194 (25)

REF195 (25)

REF196 (25)

REF197 (25)

REF198 (25)

REF199 (25)

REF200 (25)

REF201 (25, X)

REF202 (25)

REF203 (26, X)

REF204 (26)

REF205 (26)

REF206 (26, X)

REF207 (26)

REF208 (26)

REF209 (DSE-14)

REF210 (DSE-14 , X)

REF211 (DSE-14)

REF212 (27, X)

REF213 (27)

REF214 (27, X)

REF215 (27)

REF216 (27)

REF217 (27)

REF218 (27)

REF219 (27)

REF220 (27)

REF221 (27)

REF222 (27)

REF223 (27)

REF224 (27)

REF225 (27)

REF226 (27)

REF227 (27)

REF228 (27)

REF229 (27)

REF230 (27)

REF232 (27)

REF232 (27)

REF233 (27)

REF234 (27)

REF235 (27)

REF236 (27)

REF237 (27)

REF238 (27)

REF239 (27)

REF240 (27)

REF241 (27)

0.02

78

76

81

72

84

99

71

9796

87

77

99

99

83

91

99

99

99

91

99

99

99

99

90

99

99

86

81

97

98

99

97

98

95

73

99

99

89

91

74

99

99

99

99

99

9699

95

99

98

97

99

99

99

82

99

72

REF001 (DSE-1)

REF002 (DSE-1 , X)

REF003 (DSE-1)

REF004 (DSE-1)

REF005 (DSE-1)

REF006 (DSE-1)

REF007 (DSE-1)

REF008 (DSE-1)

REF009 (DSE-1)

REF010 (DSE-1)

REF011 (DSE-1)

REF012 (DSE-1)

REF013 (DSE-1)

REF014 (DSE-1)

REF015 (DSE-1)

REF016 (DSE-1)

REF017 (DSE-1)

REF018 (DSE-1)

REF019 (DSE-1)

REF020 (DSE-1)

REF021 (DSE-1)

REF022 (DSE-1)

REF023 (DSE-1)

REF024 (DSE-1)

REF025 (DSE-1 , X)

REF026 (DSE-1)

REF027 (DSE-1)

REF028 (DSE-1)

REF029 (DSE-1)

REF030 (DSE-1)

REF031 (DSE-1)

REF032 (DSE-1)

REF033 (DSE-1)

REF034 (DSE-1)

REF035 (DSE-1)

REF036 (DSE-1)

REF037 (DSE-1 , X)

REF038 (DSE-1)

REF039 (DSE-1 , X)

REF040 (DSE-1)

REF041 (DSE-1)

REF042 (DSE-1)

REF043 (DSE-1)

REF044 (DSE-1)

REF045 (1, X)

REF046 (2, X)

REF047 (3, X)

REF048 (4)

REF049 (4, X)

REF050 (5, X)

REF051 (DSE-2)

REF052 (DSE-2)

REF053 (DSE-2)

REF054 (DSE-2)

REF055 (DSE-2 , X)

REF056 (DSE-2)

REF057 (DSE-2)

REF058 (DSE-2 , X)

REF059 (DSE-2)

REF060 (DSE-2)

REF061 (DSE-2)

REF062 (DSE-3)

REF063 (DSE-3)

REF064 (DSE-3)

REF065 (DSE-3)

REF066 (DSE-3)

REF067 (DSE-3)

REF068 (DSE-3)

REF069 (DSE-3)

REF070 (DSE-3)

REF071 (DSE-3)

REF072 (DSE-3)

REF073 (DSE-3)

REF074 (DSE-3)

REF075 (DSE-3)

REF076 (DSE-3)

REF077 (DSE-3)

REF078 (DSE-3 , X)

REF079 (DSE-3)

REF080 (DSE-3)

REF081 (DSE-3)

REF082 (DSE-3)

REF083 (DSE-3)

REF084 (DSE-3 , X)

REF085 (DSE-3)

REF086 (DSE-3)

REF087 (DSE-3)

REF088 (DSE-3 , X)

REF089 (DSE-3)

REF090 (DSE-3)

REF091 (DSE-3)

REF092 (DSE-3)

REF093 (DSE-3)

REF094 (DSE-3)

REF095 (DSE-3)

REF096 (DSE-3 , X)

REF097 (DSE-3)

REF098 (DSE-3)

REF099 (DSE-4)

REF100 (DSE-4)

REF101 (DSE-4 , X)

REF102 (6)

REF103 (6, X)

REF104 (DSE-5 , X)

REF105 (DSE-5)

REF106 (DSE-6 , X)

REF107 (DSE-6)

REF108 (DSE-6 , X)

REF109 (DSE-6 , X)

REF110 (DSE-6)

REF111 (7 , X)

REF112 (8, X)

REF113 (9)

REF114 (9)

REF115 (9, X)

REF116 (9)

REF117 (9)

REF118 (10)

REF119 (10)

REF120 (10)

REF121 (10, X)

REF122 (10)

REF123 (DSE-7 , X)

REF124 (DSE-7)

REF125 (DSE-7)

REF126 (DSE-7)

REF127 (DSE-7)

REF128 (DSE-7 , X)

REF129 (DSE-7)

REF130 (DSE-7 X)

REF131 (DSE-7)

REF132 (DSE-7 , X)

REF133 (DSE-7)

REF134 (DSE-7)

REF135 (DSE-7)

REF136 (DSE-7)

REF137 (DSE-7)

REF138 (DSE-7)

REF139 (DSE-7)

REF140 (DSE-7 , X)

REF141 (11, X)

REF142 (12, X)

REF143 (DSE-8 , X)

REF144 (DSE-8 , X)

REF145 (DSE-8)

REF146 (DSE-9)

REF147 (DSE-9)

REF148 (DSE-9 , X)

REF149 (DSE-9)

REF150 (DSE-9 , X)

REF151 (DSE-9)

REF152 (DSE-9)

REF153 (DSE-9)

REF154 (DSE-10 , X)

REF155 (DSE-10)

REF156 (DSE-10)

REF157 (13, X)

REF158 (DSE-11 , X)

REF159 (14, X)

REF160 (14)

REF161 (14)

REF162 (14)

REF163 (15, X)

REF164 (16, X)

REF165 (DSE-12 , X)

REF166 (DSE-13)

REF167 (DSE-13)

REF168 (DSE-13 , X)

REF169 (17, X)

REF170 (18, X)

REF171 (19, X)

REF172 (20, X)

REF173 (21, X)

REF174 (22, X)

REF175 (23, X)

REF176 (24, X)

REF177 (25)

REF178 (25)

REF179 (25)

REF180 (25)

REF181 (25, X)

REF182 (25)

REF183 (25)

REF184 (25)

REF185 (25)

REF186 (25)

REF187 (25)

REF188 (25)

REF189 (25)

REF190 (25)

REF191 (25)

REF192 (25)

REF193 (25)

REF194 (25)

REF195 (25)

REF196 (25)

REF197 (25)

REF198 (25)

REF199 (25)

REF200 (25)

REF201 (25, X)

REF202 (25)

REF203 (26, X)

REF204 (26)

REF205 (26)

REF206 (26, X)

REF207 (26)

REF208 (26)

REF209 (DSE-14)

REF210 (DSE-14 , X)

REF211 (DSE-14)

REF212 (27, X)

REF213 (27)

REF214 (27, X)

REF215 (27)

REF216 (27)

REF217 (27)

REF218 (27)

REF219 (27)

REF220 (27)

REF221 (27)

REF222 (27)

REF223 (27)

REF224 (27)

REF225 (27)

REF226 (27)

REF227 (27)

REF228 (27)

REF229 (27)

REF230 (27)

REF232 (27)

REF232 (27)

REF233 (27)

REF234 (27)

REF235 (27)

REF236 (27)

REF237 (27)

REF238 (27)

REF239 (27)

REF240 (27)

REF241 (27)

0.02

78

76

81

72

84

99

71

9796

87

77

99

99

83

91

99

99

99

91

99

99

99

99

90

99

99

86

81

97

98

99

97

98

95

73

99

99

89

91

74

99

99

99

99

99

9699

95

99

98

97

99

99

99

82

99

72

**

5. ábra Folytatás.

***

***

A

B

B )

43

5.3.1 A tizennégy DSE csoport

Az inokulációs kísérletekkel bizonyíthatóan DSE gombának tekintett izolátumokat az

aszkuszos gombák számos gyökérkolonizáló endofitont is magában foglaló rendjeibe

tartoztak. A DSE törzseink ITS és LSU szekvenciájuk alapján a következő rendekbe

tartoztak: Helotiales (DSE-1,2), Pleosporales (DSE-3,4,5,6,7,8,9,10), Xylariales (DSE-11),

Eurotiales (DSE-12), Glomerellales (DSE-13) és Hypocreales (DSE-14).

A legtöbb izolátum (44) a DSE-1 csoprotba tartozott, ITS szekvenciáik a Cadophora

nemzetségbe tartozó fajokéval mutattak hasonlóságot és a BLAST találatok fák gyökeréből,

talajból és gyümölcsökről is származtak. A DSE-1 csoport amellett, hogy egyértelműen egy

leszármazási vonalat reprezentál, az elemzéseink alapján két alcsoportra bontható

(REF001–REF038 és REF039–REF044, 5. ábra)

A másik Helotiales rendbe tartozó csoport a DSE-2 volt, melybe 12 törzs tartozott.

Az adatbázisok hasonló szekvenciái legtöbb esetben nem azonosított nemzetségként vagy

fajként voltak megnevezve. Volt ektomikorrhizát és erikoid mikorrhizát képző gombának

nevezett találat is.

A második legnagyobb (37 izolátum) csoportot (DSE-3) a BLAST találatok alapján,

kétséget kizáróan Rhizopycnis vagum (Pleosporales) izolátumok alkották, melyek több

növényfaj gyökereiről származtak.

A DSE-4 csoport három izolátumot tartalmazott, melyek ITS és LSU szekvenciái

annyira különböztek a leghasonlóbb BLAST találatoktól is, hogy még család szintű

azonosításuk sem volt lehetséges. A csoporttal később részletesebben foglalkozunk.

A DSE-5 csoportba két izolátum tartozott, a BLAST vizsgálatok alapján

egyértelműen az Alternaria nemzetségébe tartoztak.

A DSE-6 csoportot alkotó izolátumok ITS szekvenciái teljes egyezést mutattak száraz

területek különböző növényeinek gyökereiről származó gomba szekvenciákkal. Volt olyan

találat is (Setophoma sacchari), mely az általában szárazabb helyekről származó adatokkal

szemben nedves élőhelyekre jellemző pelyhes selyemperje (Holcus lanatus) gyökeréből

származott (Sánchez-Márquez 2008).

A DSE-7 csoport annak ellenére, hogy rendkívül változatos telepmorfológiát mutató

és egymástól eltérő ITS szekvenciával rendelkező izolátumokat foglalt magában,

egyértelműen egy leszármazási vonalat képviselt (5. ábra). Taxonómiai azonosítása még

család szinten sem sikerült, annak ellenére, hogy a GenBankban számos ide tartozó, csak

44

szekvenciaként létező találat szerepelt. Ezek a szekvenciák kivétel nélkül több kontinens

száraz és félszáraz füves területek fűféléinek gyökeréből és az ottani talajból származtak. E

csoport részletesen az 5.7 alfejezetben kerül tárgyalásra.

A DSE-8 csoportot három izolátum alkotta, és bár a telepmorfológiák és szekvenciák

alapján is látszott, hogy valószínűleg ezek két alcsoportot reprezentálnak, mivel viszonylag

kis eltérés volt az ITS szekvenciák között és a BLAST találatok is hasonló eredményt

adtak, egy csoportként kezeltük őket. Ezt a csoportot a Periconia macrospinosa két

izolátuma (REF144 és REF145), és egy ezekhez hasonló izolátum alkotta (REF143).

A DSE-9 csoportba tartozó 8 izolátum őshonos növényekről került elő, melyek közt

fás és lágyszárú kétszikűek és fűfélék is voltak. A BLAST találatok alapján

megállapíthatjuk, hogy a csoportot az Embellisia nemzetségbe tartozó izolátumok alkotják.

A DSE-10 csoportot a Curvularia nemzetségbe sorolható három izolátum alkotta,

melyeket fás szárú növényekről izoláltunk és hasonló BLAST találataik száraz területek

talajából és gyökerekből származtak.

A DSE-11 csoportot egy Microdochium nemzetségbe (Xylariales) tartozó izolátum

alkotta, mely szekvenciái száraz és félszáraz területek talajából és gyökerekről származó

szekvenciákkal mutattak hasonlóságot.

A DSE-12 csoportot egy izolátum alkotta, melynek ITS szekvenciájától még a

legnagyobb hasonlóságot mutató szekvenciák is jelentősen különböztek. Ezek közt (pl.

Aspergillus spp., Chaetosartorya spp., Thermoascus crustaceus) nem voltak

törzsgyűjteményben elhelyezett, publikált, vagy biztosan jól meghatározott törzsek

szekvenciái, így ezek alapján sem feltétlenül következtethetünk a rendszertani helyzetükre.

A DSE-13 csoportot három törzs alkotta, melyek a Plectosphaerella nemzetségbe, és

valószínűleg a P. cucumerina fajhoz tartoztak.

A DSE-14 csoportot a széles körben elterjedt, talajban és növényekben dominánsan

jelenlévő és legtöbbször növényi patogénként ismert Fusarium nemzetségbe tartozó 3

izolátum alkotta.

A különböző DSE csoportokba tartozó izolátumok telepmorfológiája és növekedési

jellemzői egymásétól jól láthatóan különböztek, az egy csoportba tartozó törzseknél a

legtöbb esetben ezek a jellemzők megegyezetek. Ez alól a DSE-7 és DSE-8 csoportok

voltak kivételek, melyek részletes tárgyalására a 5.7. fejezetben kerül sor.

45

5.3.2 Gazda és terület specificitás, szezonalitás és inváziós növányek

A terület specificitás és szezonalitás vizsgálatokhoz 48 DSE gombának bizonyuló

izolátumot gyűjtöttünk a jelölt közönséges borókákról a három területen, 3 évszakban. Az

izolátumok egy kivételével a DSE-1, DSE-2 és DSE-3 csoportokba tartoztak. A DSE-1

csoportba mindhárom területről és mindhárom évszakban gyűjtött izolátumok tartoztak, míg

a DSE-2 csoport két területről származó (Fülöpháza, Tatárszentgyörgy) és mindhárom

évszakban izolált törzseket foglalt magában. A DSE-3 csoportba két területről (Fülöpháza,

Tatárszentgyörgy) és két évszakban (tavasz, nyár) gyűjtött izolátumok tartoztak. Egyik DSE

csoport sem tartalmazott csak egy területről származó vagy csak egy évszakban gyűjtőtt

izolátumokat.

A gyakori DSE csoportok őshonos és inváziós növényekről izolált törzseket egyaránt

magukban foglaltak. Az egy izolátum által reprezentált (szingleton) DSE csoportok mellett

(DSE-11, DSE-12) a kisebb csoportok izolátumai csak inváziós (DSE-5, DSE-13 és DSE-

14) vagy csak őshonos növényekről (DSE-4 és DSE-8) származtak. A DSE-9 csoportba

tartozó 8 izolátum csak őshonos növényekről és egy területről került elő. A szingleton

csoportok mellett a DSE-4, DSE-5 és a DSE-8 csoport izolátumai származtak csak egy

évszakból vagy egy területről, a DSE-10 csak egy évszakban, a DSE-6 és DSE-9 pedig csak

egy területről került elő (F3. táblázat).

5.4 DSE csoportok ISSR vizsgálatának eredményei

Az félszáraz területeken végzett DSE gombák kompozicionális diverzitás

vizsgálatának eredményeként megkaptuk melyek a terület gyakori, domináns és generalista

DSE csoportjait. Ezek közül választottunk ki hármat (DSE-1, DSE-3 és DSE-7), melyek

izolátumai közötti genetikai variabilitást vizsgáltuk.

5.4.1 A kiválasztott DSE csoportok

A DSE-1 (Cadophora sp.) csoportba tartozott a legtöbb izolátum. Ezek ITS régiója

viszonylag nagy heterogenitást mutatott, azonban számos izolátum szekvenciái

megegyeztek. Az ITS alapján két, egyértelműen elkülönülő alcsoportba sorolódtak a törzsek

(REF001–REF038 és REF039–REF044). A legtöbb ide tartozó törzs bórókáról származott és

megegyező telepmorfológiával rendelkezett.

46

A DSE-3 (Rhizopycnis vagum) csoportba tartozott a második legtöbb izolátum, melyek

több gazdanövényről kerültek elő, és egy, az ITS alapján szinte teljesen homogén csoportot

alkottak. Habár az ITS alapján két alcsoportot alkottak az izolátumok, a két alcsoportba

teljesen azonos ITS régióval rendelkező izolátumok tartoztak és a csoportotok csupán 1

nukleotidban különböztek. Az izolátumok telepmorfológiája ez esetben is teljesen azonos

volt.

A DSE-7 (Pleosporales sp.) csoport volt a harmadik legnagyobb izolátumszámmal

rendelkező DSE csoport. Az izolátumok, annak ellenére, hogy voltak azonos ITS

szekvenciával rendelkező alcsoportok, összességében nagymértékű heterogenitást mutattak,

és szinte minden telep morfológiája, növekedési jellemzője különbözött. Érdekesség, hogy

az ITS amplikonok gélelektroforézisét követően a gélképeken még az azonos ITS régióval

rendelkező izolátumok amplikonjai is eltértek, mivel számos esetben az ITS1F primer az

SSU 3’ végétől a megszokottnál távolabb kötött be, jóval nagyobb amplikont eredményezve.

5.4.2 A DSE-1 és DSE-7 izolátumok célzott gyűjtése és a specifikus PCR

A DSE-3 csoport esetén relatíve sok izolátum állt rendelkezésünkre, melyek számos

különböző gazdanövényről származtak és nagyon kis eltérés volt az ITS szekvenciáik közt.

Emiatt ebben az esetben nem gyűjtöttünk további izolátumokat. Ezért a kevesebb

gazdanövényfajról származó, az ITS régiókban nagyobb változatosságot mutató DSE-1

csoport és a nagy ITS különbségekkel és változatos telepmorfológiával rendelkező DSE-7

csoport esetében gyűjtöttünk további izolátumokat.

A kiválasztott csoportok törzseire tervezett specifikus primereket használtuk a gyors

azonosításhoz: DSE-1: DSE1F: 5’ AGT CGT CGA ACC TCT CGG AGA A 3’, DSE1R: 5’

GAC AGG CAC CGC CAC TGA TT 3’. Amplifikált szakasz mérete: ~350bp. DSE-7:

DSE7F: 5’ GTT GTT TCC TCG GCA GGT C 3’, DSE7R: 5’ ACG ACC GCT GCC AAT

ACC 3’. Amplifikált szakasz mérete: ~330bp.

A tervezett primerekkel összeállított specifikus PCR kidolgozását a két csoport

meglévő összes izolátumán és az ezekkel közeli rokonságot mutató, azonban más csoportba

tartozó izolátumokon teszteltük.

A DSE-1 (Cadophora sp.) és DSE-7 csoportokra specifikus PCR-ek segítségével

összesen további 13 DSE-1 (F3. táblázat) és 19 DSE-7 törzset (F2. táblázat) izoláltunk. Az

újonnan gyűjtött izolátumok ITS régióját meghatároztuk, és a szekvenciák kivétel nélkül

megerősítették az izolátomok két kiválasztott csoportba tartozását. Nem volt olyan izolátum,

47

ami pozitív reakciót adott a specifikus PCR során és az ITS szekvenálás alapján nem a két

csoportba tartozott volna, valamint a két csoporthoz közeli csoportok izolátumainak

tesztelése során sem tapasztaltunk pozitív reakciót. Ezek alapján elmondható, hogy a DSE-1

és DSE-7 csoportokra tervezett diagnosztikai primerek specifikus PCR-t adtak, és lehetővé

teszik a gyors és célzott izolátumgyűjtést, azonosítást.

5.4.3 ISSR primerek és PCR-ek eredményei

Az (AAT)6 és (AT)8 primereket az előzetes tesztelések során elvetettük, mivel a

legtöbb esetben nem kaptunk pozitív reakciót, a (ACG)6 és (AGC)6 primerekkel végzett

ISSR PCR esetében pedig az ISSR profilok nehezen kiértékelhető mintázatokat mutattak. Az

(AAC)6, (AAG)6, (AGG)6, (ATC)6, (CCG)6, (AC)8, (AG)9 primerekkel beállított ISSR PCR

profilok beállításával (F1. táblázat) minden esetben értékelhető, 200 és 2000 bp

mérettartományban jól látható és elkülönülő sávokat tartalmazó ISSR mintázatokat kaptunk.

Munkánk során hét primerrel és összesen 111 (55 DSE-1, 25 DSE-3 és 31 DSE-7) izolátum

DNS kivonatával végeztünk hét ISSR PCR-t a kapott mintázatok kiértékelése alapján

létrehozott és összesített bináris adatsorokból képeztünk dendrogramot (6–8. ábra).

5.4.4 Az ISSR profilok eredményei

A DSE-1 csoport esetében a hét ISSR profil alapján készített UPGMA fán jól látható,

hogy az ITS régió alapján azonos törzsek is elkülönültek egymástól, sőt négy izolátum

kivételével (REF021–REF024) nincs két olyan izolátum, melynek az összes vizsgált ISSR

mintázata megegyezne (6. ábra). Az ITS régió alapján elkülönülő B alcsoport (6. ábra)

izolátumai a REF042 kivételével ISSR profiljaik alapján is együtt helyezkedtek el.

Általánosságban véve az izolátumok alcsoportokon belüli elhelyezkedése eltérő volt az ITS

alapú csoportosulásukhoz képest (6. ábra). Az ISSR mintázatok alapján az elrendeződés nem

mutatott összefüggéseket sem az izolátumok gyűjtési dátumával, sem a gyűjtési évszakkal,

sem a származási területtel, sem az eltérő gazdanövényekkel.

A DSE-3 csoport esetén sem tapasztaltunk összefüggéseket az izolátumok

csoportosulása és a gyűjtési dátum és évszak, származási terület és gazdanövény fajok között

sem. Ebben az esetben is elkülönült az ITS alapján létrejövő két alcsoport (A és B), melyek

izolátumainak ITS szekvenciái egyetlen nukleotid különbségben tértek el. Az ISSR profilok

elemzésével jóval finomabb felbontást tapasztaltunk. Kilenc izolátumot nem számítva

(REF066–REF068, REF095–REF098 és REF089–REF090) a legtöbb esetben lehetővé vált

az azonos ITS régióval rendelkező izolátumok elkülönítése (7. ábra).

48

a b

6. ábra (a) A DSE-1 (Cadophora sp.) csoport izolátumainak ITS alapú Minimum Evolution (ME) fája, mely

Maximum Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a gap-ek páronkénti ignorálásával. A bootstrap

értékek (≥ 70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl. (b) A

DSE-1 csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett UPGMA dendrogram. Az ITS szekvenciák alapján

létrejövő alcsoportokat jelöltük (A és B). A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-onként.

B

A

B

A

B

A

A

49

7. ábra A DSE-3 (Rhizopycnis vagum) csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett

UPGMA dendrogram. Jelöltük a két alcsoportot (A és B) melyek ITS szekvenciái alcsoportonként

azonosak voltak, de a csoportok egy nukleotid különbségben eltértek. Nem lett volna informatív egy

ITS alapú ME fa. A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-onként.

B

A

A DSE-7 csoport esetében sem tapasztaltunk korrelációt a már említett vizsgált

tényezőkkel. Ebben az esetben is néhány szekvencia eltérő pozíciójától eltekintve

megkaptuk az ITS alapján elkülönülő hat nagyobb alcsoportot (A, B, C, D, E, F) (7. ábra).

A legtöbb izolátumot tartalmazó „A” alcsoport egyértelműen elvált az ISSR profil alapján

is a többi alcsoporttól, de míg az ITS régiói ezeknek az izolátumoknak sok esetben

azonosak voltak, az UPGMA fán jól látható, hogy két kivétellel (REF025-REF026) minden

izolátum egyedi ISSR mintázattal rendelkezett. A kisebb alcsoportok esetében általánosan

nagyobb különbségeket kaptunk az ISSR alapján, és a hosszú ágakkal rendelkező taxonok

nem pontosan olyan rokonságot tükröztek az UPGMA fán, mint amilyet az ITS fa alapján

vártunk. Ezért a kisebb alcsoportok esetében (B–F) elmondható, hogy egyértelműen

elkülönülnek az „A” csoporttól, és mind az alcsoportok egymástól, mind pedig saját

izolátumaik is jelentősen különböznek.

50

pl_28

pl_33

pl_29

pl_34

ref_137

pl_23

ref_137

ref_139

ref_136

pl_04

pl_24

pl_25

pl_26

pl_27

pl_22

ref_138

pl_30

pl_02

ref_132

pl_01

ref_133

pl_06

ref_127

ref_128

pl_31

ref_124

pl_03

ref_129

ref_130

pl_32

ref_131

95

95

89

82

85

99

0.002

8. ábra (a) A DSE-7 csoport izolátumainak ITS alapú Minimum Evolution (ME) fája, mely Maximum

Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a gap-ek páronkénti ignorálásával. A bootstrap értékek (≥

70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl. (b) A DSE-7

csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett UPGMA dendrogram. Az ITS szekvenciák alapján

létrejövő alcsoportokat jelöltük (A, B, C, D, E és F). A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-

onként.

b a

D

C

B E

B

B

C

A A

D

E F

F

A DSE-7 csoport izolátumainak ISSR vizsgálata esetében kaptuk a legnagyobb

távolságokat az izolátumok között, melyből arra következtethettünk, hogy egy komplex és

heterogén csoportról van szó, mely több fajt is magában foglalhat.

Elmondható, hogy mindhárom csoport esetében néhány kivételtől eltekintve, a

törzsek egyedi ISSR profillal rendelkeztek, mely lehetővé teheti a törzs szintű azonosítást

ezzel a módszerrel.

51

a b

c d

9. ábra FISH próbával jelölt gyökérkolonizáló gombák kukorica gyökerében. a. Cadophora sp. (DSE1049)

intracelluláris rövid tagú elágazó (balra) és „felfújódott” hifái (jobbra). b. A Cadophora sp.

mikroszkleróciumai a kortex sejtekben. c, d. Rhizophagus intraradices és Cadophora sp. (DSE1049) jelölése

kukorica gyökérmetszeten a GintrLSU01_af488 és CadoLSU01_af546 próbákat alkalmazva. Zöld színnel

látszik (Alexa Fluor 488) a Rhizophagus, a Cadophora sp. pedig narancssárga (Alexa Fluor 546). c. R.

intraradices intercelluláris hifái és sejten belüli Cadophora sp. képletek, d. AMF vezikulum és DSE

intracelluláris szeptált hifák. Mérce =10 μm. A 9. b, c, d ábrák Vági és mtsai (2014) által publikált képek.

5.5 Az in planta FISH eredményei

A kifejlesztett és beállított protokoll szerint eljárva specifikusan tudtunk jelölni a

gyökéren belüli DSE-gomba struktúrákat (9. ábra). A kukorica gyökerében a sejtfalak

autofluoreszcenciája csak kismértékben zavarta a detektálást. A konfokális mikroszkópos

vizsgálatoknak köszönhetően kijelenthetjük, hogy a Cadophora sp. az epidermisz és kortex

sejtjeit egyaránt kolonizálta és mindkét sejttípusban képzett mikroszkleróciumot (9.b. ábra),

azonban a központi szövethengerben nem volt megtalálható.

52

Mintáinkban intra- és intercelluláris hifákat is megfigyeltünk. A sejteket kolonizáló

hifák morfológiájukat tekintve különböztek egymástól és alapvetően kétféle hifát figyeltünk

meg. Egyik esetben sűrűn elágazó és rövid tagokkal rendelkező hifákat figyeltünk meg a

gyökérsejtekben (9. a. ábra), máskor pedig „moniliform” struktúrákat. Néhány esetben

„átmeneti”, kissé teltebb tagokkal rendelkező hifák is előfordultak.

A Cadophora sp. izolátumra specifikus, és az AMF specifikus próbákat együtt

alkalmazva is specifikusan festették meg a különböző gombák által képzett struktúrákat (9.

c, d. ábra). A különböző AM struktúráktól (hifák, vezikulum) jelölődésük alapján

egyértelműen elkülönültek a Cadophora sp. által képzett hifák és mikroszkleróciumok (9.

a, b. ábra).

5.6 Az ultrastruktura vizsgálatok eredményei

A Cadophora törzs (DSE1049) kolonizációjának ultrastruktura vizsgálata során a

gyökérszakaszok legyűjtését és fixálását követően nem figyeltünk meg egyértelmű

kolonizációt a különböző „kolonizációs idejű” gyökérszakaszok esetén sem

sztereomikroszkóppal, sem fénymikroszkóppal. A minták OsO4-os kontrasztosítása során

sem volt látható kolonizáció egyik fixált mintánk esetében sem, így a beágyazás a

gyökérszakaszok véletlenszerű kiválasztásával történt. A különböző „kolonizációs idejű”

gyökérszakaszok félvékony metszetein csak a hat hetes gyökérszakaszokban volt

megfigyelhető kismértékű, hifák általi kolonizáció. Ezért munkánk során a minták

összehasonlítása helyett a legidősebb és a hifák által leghosszabb ideje elért

gyökérszakaszokat vizsgáltuk alaposabban.

A hat hetes gyökérszakaszok TEM vizsgálata során néhány gyökérszakaszban

megfigyeltünk kolonizációt, ezek ultrastrukturájáról felvételeket készítettünk. Annak

ellenére, hogy csak néhány gyökérrészen volt kolonizáció, a növényi sejtek felszínén,

valamint élő és nekrotikus növényi sejtekben is sikerült hifákat megfigyelnünk. A

nekrotizálódott növényi sejtekben a hifák körül a legtöbb esetben egy, valószínűleg a

gombák által kiválasztott fibrilláris anyag volt látható (10. a, b. ábra). Ezt az anyagot

általában kondenzálódott növényi citoplazma vette körül (10. b. ábra). Több esetben is

másodlagos sejtfalvastagodásokat figyeltünk meg a hifák közelében lévő növényi

sejtekben.

53

10. ábra Cadophora sp. (DSE1049) izolátummal inokulált póréhagyma gyökerek hifák által hat hete elért

szakaszairól készült TEM felvételek a, b: Nektrotizált növényi sejtekben futó gombafonalak hossz- illetve

keresztmetszetei. CCP: kondenzált növényi citoplazma, FCP: gomba citoplazma, FM: fibrilláris anyag, N:

gomba sejtmag, NPC: nekrotizált növényi sejt, S: szeptum, V: gomba vakuoluma, WB: Woronin-test,

fekete nyílhegy: gomba sejtmembrán, fekete kettős nyílhegy: gomba sejtfal, fehér nyílhegy: vakuolum

membrán, fehér kettős nyílhegy: növényi sejtfal. Mérce: a = 500 nm; b = 2 µm. Dr. Bóka Károly felvételei.

Megfigyeltünk teljesen ép citoplazmával rendelkező növényi sejtben futó hifákat is

(11. a, b. ábra). Itt a hifa és a növényi sejt citoplazmáját is a saját ép sejtmembránja

határolta (11. b. ábra). Mind a gomba, mind a növényi sejtmembrán esetében membrán

betűrődések voltak láthatók. A hifa körüli növényi sejtmembránt nem határolta növényi

sejtfal, és a gomba sejtfala és a növényi plazmamembrán között egy kevésbé elektrondenz

laza mátrix anyag volt megfigyelhető (11. b. ábra).

b a

54

11. ábra Cadophora sp. (DSE1049) izolátummal inokulált póréhagyma gyökerek hifák által hat hete

elért szakaszairól készült TEM felvételek. a, b: Növényi sejtet kolonizáló intracelluláris hifa két

nagyítással készült keresztmetszeti képe. FCP: gomba citoplazma, M: mitokondrium, N: gomba

sejtmag, P: peroxiszóma, PCP: növény citoplazma, PP: polifoszfát szemcsék, PV: növényi sejt

vakuolum, V: gomba vakuolum, *: membrán betűrődés/vezikulum, fekete nyílhegy: gomba

sejtmembrán, fekete kettős nyílhegy: gomba sejtfal, fehér nyílhegy: növényi sejt membrán, fehér

kettős nyílhegy: mátrix anyag. Mérce: a, d = 500 nm; b, c = 2 µm. Dr. Bóka Károly felvételei.

a

b

55

5.7 A taxonómiai vizsgálatok eredményei

A DSE közösség vizsgálatát követően három Pleosporales rendbe tartozó, de ennél

pontosabban nem meghatározható DSE csoport taxonómiai vizsgálatát végeztük el. A

munkákhoz a rendkívül változatos, és a harmadik legnagyobb izolátumszámmal rendelkező

DSE-7 csoportot választottuk, melyhez az ISSR vizsgálatokhoz gyűjtött, további 19

izolátummal rendelkeztünk. Ezek mellé az ismert, adatbázisokban elhelyezett és az általunk

meghatározott többi izolátum szekvenciáitól is nagyban különböző DSE-4 csoportot

választottuk ki taxonómiai vizsgálatokhoz. Harmadik vizsgálandó csoportként a DSE-8A

alcsoport lett kijelölve, mivel a két Periconia macrospinosa izolátumtól (REF144 és

REF145, DSE-8B alcsoport, 5. ábra) valószínűleg elkülönülő harmadik izolátum (REF143,

DSE-8A alcsoport) külön taxont képviselhet. A korábban, az ISSR vizsgálatokhoz

szükséges izolálátumgyűjtés során sikerült ezzel az izolátummal egy leszármazási vonalat

alkotó törzset (DSE-8/A), valamint egy további P. macrospinosa (DSE-8/B) izolátumot

gyűjtenünk. Így két izolátumunk ált rendelkezésre a DSE-8A alcsoport taxonómiai

vizsgálatához. Az újonnan izolált P. macrospinosa-t referenciaként használtuk a csoport

vizsgálatakor. A taxonómiai munkához használt törzseket a 16. ábra és az F2. táblázat

mutatja.

Munkánk során összesen 40 izolátumot vizsgáltunk (34 DSE-7 izolátum, 3 DSE-4, 2

DSE-8A és 1 DSE-8B (Periconia macrospinosa)), és ezek ITS, LSU, SSU, ACT és CAL

régióit, a DSE-7 csoport esetén még két további régiót (TEF és TUB) határoztuk meg (F2.

táblázat). A DSE-7/9 izolátum esetén csak az ITS állt rendelkezésünkre, a DSE-7/10 és a

DSE-7/29 izolátumoknál pedig a TEF illetve a CAL régiókat nem sikerült meghatározni

(F2. táblázat). Izolátumainkat elhelyeztük a CBS Fungal Biodiversity Centre

gyűjteményébe (CBS 135627–CBS 135664, CBS 135760–CBS 135761, F2. táblázat), és

ezentúl a CBS számok alapján nevezzük meg a korábban izolált törzsinket is.

5.7.1 Az izolátumok spóraképzése

Annak ellenére, hogy számos táptalajon és különböző kezeléssel próbáltunk

spóraképzést indukálni, csak néhány törzs esetében figyeltünk meg termőtesteket. Ezeket

SNA táptalajra helyezett sterilizált csalán szár darabokra oltott törzsek képezték

szobahőmérsékleten az inokulálást követő 3-4. héten (12. ábra). Csak a DSE-7 csoport több

izolátuma esetén figyeltünk meg ilyen képleteket, a DSE-4 és DSE-8 csoportok esetében

nem tapasztaltunk hasonlót. A DSE-7 csoport több izolátuma képzett sötétbarna,

56

12. ábra Darksidea fajok aszkuszai és aszkospórái. A–E: Darksidea zeta (CBS 135640). A, B: termőtest;

C, D: aszkuszok; e: aszkospórák. f–j: Darksidea alpha (CBS 135650); F,G: termőtest; H, I; aszkuszok; J:

aszkospórák. Mérce: A, B = 200 µm, F, G = 180 um, minden más = 10 µm. Dr. Perdo W. Crous felvételei,

Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra.

gömbölyded termőtesteket aszkuszokkal és aszkospórákkal. Az izolátumok többségét

tartalmazó első (pl. CBS 135650, CBS 135652, CBS 135660), valamint második (CBS

135637), harmadik (CBS 135634) és hatodik alcsoport (CBS 135640) esetében figyeltünk

meg termőtesteket (12. ábara). A fénymikroszkópos vizsgálatok során megfigyeltük, hogy a

képletet létrehozó törzsek egy kivételével 180–250µm átmérőjű, gömb alakú ivaros

termőtestet hoztak létre, melyekben 4–6 spórát tartalmazó aszkuszok voltak. A CBS

135634 törzs által képzett képlet, bár hasonló színű, alakú és méretű volt a többi törzs által

képzettekhez, azonban ezek oszciólummal rendelkező, steril, majdnem gömb alakú

piknídium-szerű struktúrák voltak.

A törzsek egyszeri alkalommal képeztek termőtesteket, és bár azonos körülmények

között többször megismételtük kísérletet, soha többé nem sikerült újra indukálni ezeket a

struktúrákat.

57

5.7.2 Molekuláris taxonómiai eredmények

A „rend-szintű” filogenetikai vizsgálatok során (13. ábra) mindhárom kiválasztott

DSE csoport a Pleosporales rend Massarineae alrendjébe illeszkedett. A DSE-4 csoport a

Morosphaeriaceae család bazális csoportjaként, míg a DSE-8B csoport a Massarinaceae

családhoz közeli erősen támogatott incertae sedis kládba került a Massarina igniaria (CBS

845.96), Noosia bankssiae (CPC 17282) és a Periconia macrospinosa (DSE-8A, CBS

135663) törzsekkel együtt. A DSE-7 csoport reprezentatív szekvenciái egyértelműen a

Lentitheciaceae családba illeszkedtek és egy leszármazási vonalat alkottak a Tingoldiago

graminicola testvércsoportjaként.

A család-szintű filogenetikai vizsgálatok során (14. ábra) a DSE-7 csoport izolátumai

szintén egy leszármazási vonalat alkottak a Tingoldiago graminicola törzsekkel.

Izolátumaink egy nagyobb csoportot alkottak a Keissleriella és Lentithecium nemzetségek

több fajával és a Pleurophoma pleurospora törzseivel. A család típusfaja, a Lentithecium

fluviatile külön leszármazási vonalat képviselt a családon belül, míg a L. arundinaceum és a

Stagonospora macropycnidia, valamint a két bambuszon előforduló faj, a Katumotoa

bambusicola és az Ophiosphaerella sasicola is külön alkládokat alkottak.

A DSE-7 izolátumok a csoporton belüli elhelyezkedésük vizsgálatánál különálló és

sokszor erősen támogatott alcsoportokat alkottak (15. ábra). Egy klád tartalmazta az

izolátumok többségét (23 izolátum), ezek nagy heterogenitást mutattak. A második klád

három izolátumot tartalmazott, és testvércsoportja volt a szintén három kládot tartalmazó

harmadik kládnak. A negyedik kládba ugyancsak három izolátum illeszkedett, és ennek a

testvércsoportja egy szingleton csoport volt egy izolátummal. A hatodik kládot szintén egy

izolátum alkotta, mely az összes DSE-7 izolátum testvércsoportjaként helyezkedett el (15.

ábra). A DSE-7 csoport ISSR módszerrel végzett csoporton belüli genetikati variabilitás

vizsgálata során megkaptuk körülbelül azokat a csoportokat (8. ábra), melyek az öt

variábilisabbnak mondható lókusz elemzésével is kialakultak (15. ábra). Ez esetben is

nagyobb felbontást tapasztaltunk és az izolátumok csoportokon belüli elhelyezkedései

többször eltérőek voltak. Az egy csoportba tartozó izolátumok morfológiai és biológiai

jellemzői is sokszor különböztek.

Eredményeink alapján a három DSE csoport három új nemzetséget reprezentál a

Pleosporales rend Massarineae alrendjében.

58

Keissleriella genistae strain CBS 113798

Pleurophoma pleurospora CBS 116668

Lentithecium fluviatile strain CBS 123090

Morosphaeria velataspora isolate BCC 17059

Pyrenophora phaeocomes DAOM 222769

Kirschsteiniothelia elaterascus strain A22 11B

Leptosphaerulina australis CBS 317.83

Phoma radicina CBS 111.79

Kirschsteiniothelia elaterascus HKUCC 7769

Corynespora olivacea strain CBS 484.77

Phoma betae CBS 109410

Cochliobolus sativus DAOM 226212

Aquilomyces patris (CBS 135662)

Lentithecium aquaticum CBS 123099

Morosphaeria ramunculicola BCC 18405

Neophaeosphaeria filamentosa CBS 102202

Phoma herbarum CBS 276.37

Lentithecium lineare voucher IFRD 2008

Leptosphaeria calvescens strain CBS 193.87

Dothidotthia aspera strain CPC 12933

Keissleriella cladophila strain CBS 104.55b

Helicascus nypae strain BCC 36752

Phaeosphaeria caricis CBS 120249

Phoma glomerata CBS 528.66

Didymella exigua CBS 183.55

Trematosphaeria pertusa CBS 122371

Ascochyta pisi CBS 126.54

Massarina igniaria CBS 845.96

Melanomma rhododendri ANM 73

Corynespora olivacea CBS 114450

Leptosphaeria biglobosa CBS 303.51

Phaeosphaeria eustoma CBS 573.86

Massarina cisti strain CBS 266.62

Melanomma pulvis-pyrius SMH 3291

Pleospora herbarum CBS 191.86

Arthopyrenia salicis 1994 Coppins

Stagonospora macropycnidia CBS 114202

Loratospora aestuarii JK 5535B

Phoma complanata CBS 268.92

Aquilomyces patris (CBS 135661)

Pyrenophora triticirepentis OSC 100066

Roussoella hysterioides CBS 125434

Phoma heteromorphospora CBS 115.96

Periconia macrospinosa (CBS 135663)

Phoma exigua CBS 431.74

Pithomyces valparadisiacus culture collection CBS 113339

Julella avicenniae BCC 20173

Phaeodothis winteri CBS 182.58

Chaetosphaeronema hispidulum CBS 216.75

Aquilomyces patris (CBS 135760)

Melanomma pulvis-pyrius strain CBS 124080

Paraconiothyrium minitans CBS 122788

Tingoldiago graminicola strain KH 68

Cucurbitaria berberidis strain CBS 394.84

Pleomassaria siparia CBS 279 74

Pleospora ambigua CBS 113979

Roussoellopsis sp. MAFF 239638

Saccothecium sepincola CBS 278.32

Darksidea beta (CBS 135637)

Pleurophoma pleurospora CBS 130329

Tingoldiago graminicola strain KH 155

Massarina eburnea CBS 473.64

Roussoella pustulans MAFF 239637

Setomelanomma holmii CBS 110217

Asteromassaria pulchra CBS 124082

Phaeosphaeria avenaria DAOM 226215

Phaeosphaeria brevispora MAFF 239276

Darksidea zeta (CBS 135640)

Tingoldiago graminicola strain KH 891

Phaeosphaeria luctuosa CBS 308.79

Lentithecium arundinaceum CBS 619.86

Didymocrea sadasivanii CBS 438.65

Darksidea epsilon (CBS135658)

Flavomyces fulophazii (CBS 135761)

Phoma zeae-maydis CBS 588 69

Karstenula rhodostoma CBS 690.94

Darksidea alpha (CBS 135650)

Dothidotthia symphoricarpi strain CPC 12929

Phaeosphaeria brevispora NBRC 106240

Lentithecium arundinaceum strain CBS 123131

Trematosphaeria pertusa strain CBS 122368

Flavomyces fulophazii (CBS 135664)

Pyrenochaeta nobilis CBS 407.76

Byssothecium circinans CBS 675.92

Phaeosphaeria elongata strain CBS 120250

Julella avicenniae BCC 18422

Helicascus nypae strain BCC 36751

Kalmusia scabrispora MAFF 239517

Letendraea helminthicola CBS 884.85

Phoma bryoniae CBS 133.96

Wettsteinina lacustris CBS 618.86

Setosphaeria monoceras AY016368

Letendraea padouk CBS 485.70

Cochliobolus heterostrophus CBS 134.39

Morosphaeria velataspora isolate BCC 17058

Montagnula opulenta CBS 168.34

Kalmusia scabrispora NBRC 106237

Monascostroma innumerosum CBS 345.50

Alternaria alternata CBS 916.96

Ophiosphaerella herpotricha CBS 620.86

Leptosphearia maculans DAOM 229267

Lentithecium fluviatile CBS 122367

Ophiosphaerella sasicola MAFF 239644

Keissleriella rara CBS 118429

Camarosporium quaternatum CBS 483.95

Neottiosporina paspali CBS 331.37

Roussoella hysterioides MAFF 239636

Noosia banksiae culture collection CPC 17282

Leptosphaerulina argentinensis CBS 569.94

Splanchonema platani CBS 221.37

Melanomma pulvis-pyrius CBS 371 75

Leptosphaeria dryadis CBS 643.86

Katumotoa bambusicola MAFF 239641

Bimuria novaezelandiae CBS 107.79

Entodesmium rude CBS 650.86

Falciformispora lignatilis BCC 21117

Arthopyrenia salicis CBS 368 94

Pyrenochaeta unguishominis strain CBS 378.92

Phaeosphaeriopsis musae CBS 120026

Leptosphaeria doliolum CBS 505.75

Keissleriella cladophila CBS 104.55a

Monotosporella tuberculata CBS 256 84

Phaeosphaeria ammophilae CBS 114595

Morosphaeria ramunculicola strain JK 5304B

94

-

100

100

100

99

100

100

100

100

100

100

91

95/ -

100

99

98

-

100

100

100

100

100

93

100

82

100

89

100

100

99/ -

96/ -

94

-

100

100

96/ -

100

-

99

-

97/ -

100

98

-

97

-

100

99

100

100

100

100

99

92

100

100

100

100

94/ -

99

97

100

100

100

98

100

100

99

-

100

82

100

75

100

95

96

-

100

94

98

-

93/ -

99/100

94

82

99

72

100

87

100

73

100

100

100

94

97

-

100

99

100

100

100

100

100

100

91

-

100

99

100

100

100

97

100

100

100/83 98

84

99

77

95/86

2/3//

Falciformispora lignatilis BCC 21118

Halomassarina thalassiae JK 5262DHalomassarina thalassiae isolate BCC 17055

2/3//

Pleosporineae

Massarineae

Didymellaceae

Leptosphaeriaceae

Phaeosphaeriaceae

Cucurbitariaceae

Pleosporaceae

Dothidotthiaceae

Trematosphaeriaceae

Montagnulaceae

Lentitheciaceae

Morosphaeriaceae

Flavomyces

Massarinaceae

Melanommataceae /

Pleomassariaceae

Julellaceae

Massariaceae?

-

70

-

80

-

87

-

71

-

70

- /75

-

92

- /80

-

96

- /97

Aquilomyces

Darksidea

13. ábra A három sötét szeptált endofioton nemzetség (pirossal jelölve), a Darksidea, az Aquilomyces, a

Flavomyces és Dothydeomycetes osztály reprezentatív szekvenciái alapján készült filogenetikai fa.

Részletek a következő oldalon.

59

0.2

Lindgomyces breviappendiculata HHUF 28193Lindgomyces ingoldianus ATCC 200398

Dothiora cannabinae CBS 737.71

Lophiostoma caulium CBS 623.86

Zasmidium cellare CBS 146.36

Triplosphaeria maxima MAFF 239682

Phaeocryptopus gaeumannii CBS 267.37

Gloniopsis praelonga CBS 112415

Psiloglonium clavisporum CBS 123338

Stylodothis puccinioides CBS 193.58

Lophiostoma crenatum CBS 629.86

Teratosphaeria suberosa CPC 11032

Pseudotetraploa curviappendiculata KT 2558

Westerdykella cylindrica CBS 454.72

Preussia funiculata CBS 659.74

Teratosphaeria associata CBS 112224

Aigialus grandis 2Q

Mycosphaerella marksii CBS 110942

Mytilinidion tortile EB 0377

Hysterium angustatum CBS 123334

Lophiostoma compressum IFRD 2014

Mytilinidion andinense CBS 123562

Dothistroma septosporum CBS 112498

Diplodia mutila CBS 431.82

Westerdykella angulata CBS 610.74

Lindgomyces rotundatus HHUF 27999

Spencermartinsia viticola CBS 117009

Teratosphaeria cryptica CBS 110975

Dothidea sambuci DAOM 231303

Lophiostoma alpigenum GKM 1091b

Mycosphaerella punctiformis CBS 113265

Opegrapha dolomitica DUKE 0047528

Mycosphaerella endophytica CBS 114662

Dothidea insculpta CBS 189.58

Lophium mytilinum CBS 269.34

Phaeocryptopus nudus CBS 268.37

Ramichloridium cerophilum CBS 103.59

Saccharata proteae CBS 115206

Hysterobrevium mori GKM 1013

Mytilinidion acicola EB 0349

Massariosphaeria grandispora CBS 613.86

Oedohysterium insidens CBS 238.34

Tetraplosphaeria nagasakiensis KT 1682

Dothidea hippophaes CBS 188.58

Aigialus rhizophorae strain BCC 33573

Botryosphaeria dothidea CBS 115476

Friedmanniomyces simplex CBS 116775

Preussia terricola DAOM 230091

Pseudocercospora vitis CPC 11595

Gloniopsis subrugosa CBS 123346

Delphinella strobiligena CBS 735.71

Verrucisporota daviesiae CBS 116002

Rimora mangrovei JK 5246A

Batcheloromyces proteae CBS 110696

Otthia spiraeae CBS 114124

Cercospora beticola CBS 116456

Mytilinidion scolecosporum CBS 305.34

Macrophomina phaseolina CBS 227 33

Psiloglonium araucanum CBS 112412

Teratosphaeria stellenboschiana CBS 116428

Westerdykella ornata CBS 379.55

Lophium elegans EB 0366

Mycosphaerella heimii CBS 110682

Guignardia citricarpa CBS 102374

Mytilinidion mytilinellum CBS 303.34

Lophiostoma arundinis CBS 621.86

Mytilinidion californicum EB 0385

Oedohysterium sinense CBS 123345

Aureobasidium pullulans CBS 584.75

Pseudotetraploa curviappendiculata MAFF 239495

Lophiostoma scabridisporum strain BCC 22835

Mytilinidion resinicola CBS 304.34

Massaria anomia CBS 591.78

Aigialus grandis JK 5244A

Preussia lignicola CBS 264.69

Hysterium barrianum ANM 1495

Catenulostroma elginense CBS 111030

Macrovalsaria megalospora 178149

Aulographina pinorum CBS 174.90

Sydowia polyspora CBS 116.29

Kabatiella caulivora CBS 242.64

Aigialus parvus A6

Hysterobrevium smilacis CBS 114601

Gloniopsis arciformis GKM L166ARhytidhysteron rufulum CBS 306.38

Bagnisiella examinans CBS 551.66

Sporormiella minima CBS 524.50

Schismatomma decolorans DUKE 0047570

Neofusicoccum ribis CBS 115475

Teratosphaeria fibrillosa CBS 121707

Mycosphaerella graminicola CBS 115943

Catenulostroma abietis CBS 459.93

Botryosphaeria tsugae CBS 418.64

Dothiora ellyptica CBS 736.71

Columnosphaeria fagi CBS 171.93

Kirschsteiniothelia maritima CBS 221.60

97

76

100

87

91

-

98

-

94

-

100

90

98/86

100

100

100

99

100

100

100

85

100

100

99

73

100

100

100

76

100

-

100

100

100

98

100/9897/75

100

99

100

83

99

70

100

97

100

99 100

90

100

97

100

98

90

-

100

79

100

100

100

100

100

98

100

75

100

100

100

-

100

76

100

100

100

-

100

93

100

100

100

92

100

100

99

80

100

100

100

91

99

-

100

100

100/ -

100

93

100

100

100

96

100

98

100

99

99

-

100

98

100

95

100

100

100

100

96

-

100

100

100

100

100

98

100

86

100

100

100

100

100

100

98

-

100

77

1/2//

Pleosporales Lindgomycetaceae

Sporomiaceae

Lophiostomataceae

Tetraplosphaeriaceae

Mycosphaerellaceae

Botryosphaeriales

Hysteriales

Aigialaceae

Dothideales

Teratosphaeriales

Mytilinidiales

-

74

13. ábra folytatása A három sötét szeptált endofioton nemzetség (pirossal jelölve), a Darksidea, az Aquilomyces,

a Flavomyces és a Dothydeomycetes osztály reprezentatív szekvenciái a Bayes analízis alapján készült

filogenetikai fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely három lókusz (LSU, SSU, TEF) kombinált

adatsora bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során kapott, posterior valószínűségi értékek

százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb RAxML bootstrap értékek találhatók. A

színezett háttér a családot vagy a rendet jelzi ahova a törzsek besorolhatók. A külcsoport a Schismatomma

decolorans (DUKE 0047570) volt. Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra. A mérce 100 karakteren 2

változásnak megfelelő ághosszat jelöl.

60

14. ábra A Lentitheciaceae családba tartozó fajok és a Darksidea nemzetség reprezentatív szekvenciái

(vastagítva) a Bayes analízis alapján készült filogenetikai fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely három

lókusz (LSU, SSU, TEF) kombinált adatsora bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során

kapott, posterior valószínűségi értékek százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb

RAxML bootstrap értékek találhatók. A külcsoport a Massarina eburnea (CBS 47364) volt. Knapp és mtsai

(2015) által publikált ábra. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl.

Darksidea alpha (CBS 135660)

Darksidea alpha (CBS 135628)

Darksidea alpha (CBS 135650)

Darksidea alpha(CBS 135652)

Darksidea alpha (CBS 135631)

Darksidea gamma (CBS 135634)

Darksidea beta (CBS 135637)

Darksidea delta (CBS 135638)

Darksidea epsilon (CBS 135658)

Darksidea zeta (CBS 135640)

Tingoldiago graminicola strain KH 155

Tingoldiago graminicola strain KH 68

Tingoldiago graminicola strain KH 891

Lentithecium aquaticum CBS 123099

Pleurophoma pleurospora CBS 116668

Lentithecium lineare voucher IFRD

Keissleriella rara CBS 118429

Pleurophoma pleurospora CBS 130329

Keissleriella genistae strain CBS 113798

Keissleriella cladophila strain CBS 104.55b

Keissleriella cladophila CBS 104.55a

Lentithecium fluviatile CBS 122367

Lentithecium fluviatile strain CBS 123090

undescribed CBS strain 193.87

Ophiosphaerella sasicola MAFF 239644

Katumotoa bambusicola MAFF 239641

Stagonospora macropycnidia CBS 114202

Lentithecium arundinaceum strain CBS 123131

Lentithecium arundinaceum CBS 619.86

Wettsteinina lacustris CBS 618.86

Neottiosporina paspali CBS 331.37

Massarina eburnea CBS 473.64

100

77

100

100

84

76

100

100

100/9991/ -

99/72

99/71

100

100

100

100

96

95

98

-

99

98100

97

94/86

100

89

100

100

0.2

Darksidea

61

DSE7/30 (CBS 135656)

DSE7/28 (CBS 135654)

DSE7/29 (CBS 135655)

DSE7/33 (CBS 135659)

DSE7/34 (CBS 135660)

DSE7/5 (CBS 135631)

DSE7/6 (CBS 135632)

DSE7/16 (CBS 135642)

DSE7/17 (CBS 135643)

DSE7/19 (CBS 135645)

DSE7/18 (CBS 135644)

DSE7/22 (CBS 135648)

DSE7/23 (CBS 135649)

DSE7/24 (CBS 135650)

DSE7/27 (CBS 135653)

DSE7/26 (CBS 135652)

DSE7/25 (CBS 135651)

DSE7/20 (CBS 135646)

DSE7/4 (CBS 135630)

DSE7/1 (CBS 135627)

DSE7/2 (CBS 135628)

DSE7/15 (CBS 135641)

DSE7/21 (CBS 135647)

DSE7/3 (CBS 135629)

DSE7/12 (CBS 135638)

DSE7/13 (CBS 135639)

DSE7/32 (CBS 135658)

DSE7/14 (CBS 135640)

DSE4/100 (CBS 135760)

96/ -

- /70

98/ -

100

100

100/98

100/99

100/100

100/86

98/100

98

84

99

99

99/78

100

99

98

96

0.02

1/2

96/74

100

99

100

100

DSE7/10 (CBS 135636)

DSE7/11 (CBS 135637)

DSE7/31 (CBS 135657)

DSE7/7 (CBS 135633)

DSE7/8 (CBS 135634)

D. alpha

D. gamma

D. zeta

D. epsilon

D. delta

D. beta

- /77

15. ábra A hat Darksidea faj izolátumainak szekvenciái a Bayes analízis alapján készült filogenetikai

fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely öt lókusz (ITS ACT, TUB, TEF, CAL) kombinált

adatsora Bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során kapott, posterior

valószínűségi értékek százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb RAxML

bootstrap értékek találhatók. A külcsoport az Aquilomyces patris (CBS 135760) volt. Knapp és mtsai

(2015) által publikált ábra. A mérce 100 bázispárra jutó 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl.

62

5.7.3 A három új nemzetség és az új fajok taxonómiai leírása

Ebben a fejezetben a DSE-4 és DSE-8A csoportok izolátumai (16. ábra) által reprezentált

két monospecifikus nemzetség, valamint a DSE-7 csoport által alkotott nemzetség és ebbe

tartozó hat faj (16. ábra) leírását mutatjuk be. A taxonok hivatalos leírását Knapp és mtsai

(2015) közölték és jelen dolgozatban a taxonok diagnózisát nem fordítottuk le, ez eredeti

(angol) nyelven szerepel.

Aquilomyces patris D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. & spec. nov.

MycoBank MB810756 (nemzetség); MB810757 (faj);

Angol diagnózis. Aquilomyces patris differs from its closest phylogenetic neighbour, Morosphaeria

ramunculicola (BCC 18405) by unique fixed alleles in the LSU and SSU loci based on alignments of the

separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU positions: 129 (T), 139 (A), 145 (C), 232 (T), 335

(C), 349 (C), 355 (A), 357 (T), 369 (A), 382 (T), 422 (G), 478 (G), 550 (T), 661 (C), 662 (T), 669 (T); SSU

positions: 24 (C), 70 (T), 71 (C), 72 (C), 79 (C), 80 (T), 295 (G), 1002 (C), 1094 (C), 1123 (C).

Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét

táptalajon. MMN táptalajon a telepek bolyhosak, sötétbarnás-szürkéstől a sötétbarnáig

füstszürkések, élesen elhatárolható marginális zónával. MEA táptalajon a telepek kevésbé

bolyhosak, sötétbarnás-szürkéstől a sötétbarnáig változhatnak, füstszürke marginális

zónával.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Populus alba gyökér,

Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135661 törzs metabolikusan inaktív

állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22895 = CBS 135661 = DSE-4/099 = REF099); (CPC

22896 = CBS 135760 = DSE-4/100 = REF100); (CPC 22897 = CBS 135662 = DSE-4/101 =

REF101).

Etimológia: Az erősen pigmentált hifáknak és a telepnek megfelelően (aquilus = sötét

színű), és Knapp G. Dániel édesapjának emlékére és tiszteletére (patris = apa).

Megjegyzések. Az Aquilomyces patris izolátumai fehérnyár (Populus alba) gyökeréből

származnak a fülőpházi homokpusztagyepről.

Flavomyces fulophazii D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. & spec. nov.

MycoBank MB810758 (nemzetség); MB810759 (faj);

Angol diagnózis. Flavomyces fulophazii is a fungal root endophyte. Flavomyces fulophazii (CBS 135761)

differs from its closest phylogenetic neighbour, Massarina igniaria (CBS 84596) by unique fixed alleles in

the LSU and SSU loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU

positions: 38 (C), 48 (A), 65 (T), 74 (C), 78 (G), 84 (C), 146 (deletion), 147 (T), 174 (C), 435 (C), 456–481

(insertion), 490 (C), 624 (G), 630 (C), 658–672 (insertion), 860 (C), 862 (G), 864 (A); SSU positions: 22 (C),

63

26 (G), 34 (G), 39 (G), 71 (T), 294 (C), 408–834 (insertion), 890 (A), 971 (G), 1011 (C), 1028 (A), 1050 (G),

1081(A), 1082 (T), 1083 (A), 1084 (G), 1090 (G).

Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét

táptalajon. MMN esetén a telepek táptalajba süllyedtek, fehéres-sárgástól sötét-sárgáig

változhatnak és diffúz élénksárga pigmentet választanak ki a táptalajba, mely tulajdonság

eltűnhet egy idő után. MEA táptalajon a telepek táptalajba süllyedtek, fehérek és kissé

bolyhosak.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2012, E. Zajta & D.G. Knapp (holotípus: CBS 135761 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22900 = CBS 135761 = DSE-8/S); Fülöpháza, N

46°52’E 19°25’, Festuca vaginata gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (CPC

22899 = CBS 135644 = DSE-8/143 = REF143).

Etimológia. A táptalajt jellegzetesen élénksárgára színező tulajdonságára (sárga = flavo) és

a gyűjtési helyre (Fülöpháza, Magyarország) utalva.

Megjegyzések. Az Flavomyces izolátumai mind magyar csenkesz (Festuca vaginata)

gyökeréből származnak a fülőpházi homokpusztagyepről.

Darksidea D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. nov. MycoBank MB810760;

Angol diagnózis. Ascomata globose, brown; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of brown textura

angularis, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among asci, hyaline, septate,

hyphal, anastomosing. Asci bitunicate, clavate to ellipsoid, with weakly developed apical chamber, stipitate,

4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid. The genus

Darksidea contains root endophytic fungi associated almost exclusively with grasses in arid and semiarid

areas. Darksidea isolates can be collected from surface-sterilised roots and can be cultured and maintained on

general media. Using the primer pairs DSE7F / DSE7R (this study), an approximately 300-bp-long partial ITS

region of fungi belonging to the genus Darksidea can be amplified by PCR.

Típus faj. Darksidea alpha D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov.

Megjegyzések. Darksidea fajok telep morfológiája rendkívül változatos. A forma, a

növekedési jellemzők, a szín, exudátumok és diffúz pigmentek megléte változhat egy faj

izolátumai között (16. ábra). A telepek általában sterilek. Az izolátumok Festuca vaginata,

Stipa borysthenica, Bromus tectorum, Fumana procumbens és Ailanthus altissima

felszínsterilizált gyökeiről lettek gyűjtve. Nem tenyésztett Darksidea fajok szekvenciái

Stipa hymenoides (Hawkes és mtsai 2006), Bouteloua gracilis (pl. Green és mtsai 2008),

Sporobolus cryptandrus (pl. Herrera és mtsai 2011a), Stipa grandis (Su és mtsai 2010) és

Ammophila arenaria (Sánchez-Márquez és mtsai 2008) földalatti szöveteiből valamint

félszáraz füves területek talajából (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2011) is előkerültek.

64

Darksidea fajok szekvenciái legalább 3 kontinens félszáraz területeinek domináns fűféléiből

előkerültek (Porras-Alfaro és mtsai 2008, Su és mtsai 2010).

Etimológia. A „sötét oldal” nyomán, ami a pigmentált hifákkal rendelkező sötét szeptált

endofitonokra és ezek kevéssé ismert tulajdonságaira utal.

Darksidea alpha D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank

MB810761;

Angol diagnózis Ascomata globose, brown, up to 180 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of

textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among

asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, clavate, with weakly developed

apical chamber, stipitate, 60–80 40–45 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate,

aseptate, thick-walled, ellipsoid, 18–30 12–17 µm. Darksidea alpha is a fungal root endophyte. Darksidea

alpha (CBS 135650) differs from Tingoldiago graminicola (KH 68) by unique fixed alleles in the LSU and

SSU loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU positions: 30

(A); SSU positions: 442 (C), 467 (C), 555 (C), 649 (C), 675 (C), 742 (G), 743 (A), 815 (T), 816 (T).

Telep morfológia. MMN és MEA táptalajon a telepek lehetnek fehéres sárgásak (pl. CBS

135645 és CBS 135646), sötét-szürkék (pl. CBS 135630 és CBS 135643) vagy

halványbarnák (pl. CBS 135653). A telepek lehetnek lassú (pl. CBS 135631 és CBS

135632 nem érték el a Petri-csésze szélét 12 hét alatt 24°C-on) vagy gyors növekedésűek

(pl. CBS 135627 és CBS 135628 két hét alatt benőtte a Petri-csészét 24°C-on), laposak egy

határozott telepszegélyel és kevés légmicéliummal (pl. CBS 135643 és CBS 135650), vagy

bolyhosak, táptalajba süllyedt marginális zónával (pl. CBS 135655). A telepek többsége

festi a táptalajt halványsárga színtől a narancs-barnán át a mélyvörösig (pl. CBS 135631,

CBS 135643, CBS 135647 és CBS 135650). Két törzs vöröses kristályokat választott ki a

táptalajba (CBS 135631 és CBS 135632), míg mások exudátumokat a telepen (pl. CBS

135654 és CBS 135655).

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2012, D.G. Knapp & E. Zajta (holotípus: CBS 135650 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22884 = CBS 135650 = DSE-7/24); (CPC

22862 = CBS 135628 = DSE-7/2); (CPC 22882 = CBS 135648 = DSE-7/22); (CPC 22883

= CBS 135649 = DSE-7/23); (CPC 22885 = CBS 135651 = DSE-7/25); (CPC 22886 =

CBS 135652 = DSE-7/26); (CPC 22887 = CBS 135653 = DSE-7/27); (CPC 22888 = CBS

135654 = DSE-7/28); (CPC 22889 = CBS 135655 = DSE-7/29); (CPC 22890 = CBS

135656 = DSE-7/30); September 2010, D.G. Knapp (CPC 22865 = CBS 135631 = DSE-

7/5); (CPC 22866 = CBS 135632 = DSE-7/6); Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (CPC

22876 = CBS 135642 = DSE-7/16 = REF133); (CPC 22878 = CBS 135644 = DSE-7/18 =

65

REF136); (CPC 22880 = CBS 135646 = DSE-7/20 = REF138); (CPC 22881 = CBS

135647 = DSE-7/21 = REF139); Stipa borysthenica gyökér, Július 2012, D.G.Knapp & E.

Zajta (CPC 22864 = CBS 135630 = DSE-7/4); Május 2005, G.M. Kovács & A. Pintye

(CPC 22877 = CBS 135643 = DSE-7/17 = REF135); (CPC 22879 = CBS 135645 = DSE-

7/19 = REF137); Július 2012, D.G.Knapp & E. Zajta (CPC 22893 = CBS 135659 = DSE-

7/33); (CPC 22894 = CBS 135660 = DSE-7/34); Bromus tectorum gyökér, Június 2012,

(CPC 22861 = CBS 135627 = DSE-7/1); Tatárszentgyörgy, N 47°03.5' E 19°24.3',

Ailanthus altissima gyökér, Július 2008, D.G. Knapp (CPC 22875 = CBS 135641 = DSE-

7/15 = REF132).

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.

Megjegyzések. Termőtestet több törzsénél figyeltük meg szobahőmérsékleten inkubált,

SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az

inokulálást követően.

Darksidea beta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank

MB810762;

Angol diagnózis. Ascomata globose, brown, up to 250 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of

textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among

asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 4–5 µm diam. Asci bitunicate, ellipsoid, with weakly developed

apical chamber, stipitate, 50–90 35–50 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate,

aseptate, thick-walled, ellipsoid, 23–30 14–19 µm. Darksidea beta is a fungal root endophyte. Darksidea

beta (CBS 135637) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT and TEF loci

based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 102 (T), 263

(T), 607 (A), 614 (deletion); ACT positions: 292 (T), 400 (C), 553 (T); TEF positions: 201 (T), 414 (A).

Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét

táptalajon. MMN esetében a telepek hamuszürkéstől halvány barna színig változhatnak

világosbarna besüllyedt marginális zónával, és gyér légmicéliummmal. MEA táptalajon

hamuszürkéstől zöldes-szürke színig változhatnak a telepek, világosbarna besüllyedt

marginális zónával és exudátumokkal.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135637 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22871 = CBS 135637 = DSE-7/11 = REF128);

(CPC 22870 = CBS 135636 = DSE-7/10 = REF127); Július 2012, D.G. Knapp & E. Zajta

(CPC 22891 = CBS 135657 = DSE-7/31).

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.

66

Megjegyzések. Termőtestetet figyeltük meg a CBS 135637 törzs esetében

szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra

oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.

Darksidea gamma D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank

MB810763;

Angol diagnózis. Forming sterile, erumpent, subglobose, brown pycnidial-like sporocarps with a central

ostiole. Ascomata globose, brown, up to 200 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of textura

angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among asci,

hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, clavate, with weakly developed apical

chamber, stipitate, 60–80 20–30 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, granular to

guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid, 14–25 9–14 µm. Darksidea gamma is a fungal root endophyte.

Darksidea gamma (CBS 135634) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS,

ACT and TEF loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS

positions: 104 (T), 224 (T), 498 (T), 595 (G), 601 (deletion); ACT positions: 72 (G), 134 (T), 140 (T), 161

(deletion), 164 (C), 616 (T); TEF positions: 8 (C), 113 (A), 150 (T), 619 (T), 688 (T).

Telep morfológia. A telepek mindkét táptalajon 24°C-on 2-3 hét alatt borítják be a Petri-

csészét. MMN táptalajon hamuszürkéstől zöldes-szürkéig változhatnak a telepek,

világosbarna besüllyedt marginális zónával és gyér légmicéliummal. MEA táptalajon

hamuszürkéstől zöldes-szürke színig változhatnak a telepek, jelentős mennyiségű

légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135634 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22868 = CBS 135634 = DSE-7/8 = REF124);

CPC 22867 = CBS 135633 = DSE-7/7 = REF123); CPC 22869 = CBS 135635 = DSE-7/9 =

REF125.

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.

Megjegyzések. Termőtesteket figyeltük meg a CBS 135634 törzs esetében

szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra

oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.

Darksidea delta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank

MB810764;

Angol diagnózis. Darksidea delta is a fungal root endophyte. Darksidea delta (CBS 135638) differs from

D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT, TEF, and CAL loci based on alignments of

the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 238 (T), 281 (A), 465 (C); ACT

positions: 200 (T), 337 (C), 547 (T); TEF positions: 38 (C), 39 (G), 40 (A), 230 (T), 404 (T); CAL positions:

142 (A), 256 (T), 633 (T).

67

Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 3-5 hét alatt borítják be a Petri-

csészét. MMN táptalajon hamuszürkéstől halvány-barna színig változhatnak a telepek,

jelentős mennyiségű légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.

A telepek MEA táptalajon 24°C-on 6 hét alatt borítják be a Petri-csészét. Itt hamuszürkéstől

kezdve a sárgáson át fehér színig változhatnak a telepek, éles marginális zónával, gyér

légmicéliummal és néha exudátum cseppekkel.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135638 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22872 = CBS 135638 = DSE-7/12 = REF129);

Június 2012, D.G. Knapp & E. Zajta (CPC 22863 = CBS 135629 = DSE-7/3); Fumana

procumbens gyökér, Június 2008, D.G. Knapp (CPC 22873 = CBS 135639 = DSE-7/13 =

REF130).

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.

Megjegyzések. Termőtestet figyeltük meg a CBS 135629 törzs esetében

szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra

oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően, bár ezek sterilek voltak

Darksidea epsilon D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank

MB810765;

Angol diagnózis. Darksidea epsilon is a fungal root endophyte. Darksidea epsilon (CBS 135658) differs

from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT, TUB and CAL loci based on

alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 86 (T), 289 (T); ACT

positions: 108 (A), 189 (T), 322 (T), 406 (G); TUB positions: 37 (T), 402 (G); CAL positions: 56 (deletion),

57 (deletion), 461 (A), 579 (T).

Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 3 hét alatt borítják be a Petri-

csészét. MMN táptalajon zöldes-szürkéstől barnáig változhatnak a telepek, jelentős

mennyiségű légmicéliummal, halvány barna marginális zónával és exudátum cseppekkel a

telep közepénél. A telepek MEA táptalajon 24°C-on 6 hét alatt borítják be a Petri-csészét.

Itt sárgás-fehérek a telepek, gyér légmicéliummal és exudátum cseppekkel a telep

közepénél.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Stipa borysthenica

gyökér, Július 2012, E. Zajta & D.G. Knapp (holotípus: CBS 135658 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22892 = CBS 135658 = DSE-7/32).

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.

68

Megjegyzések. A CBS 135658 törzs steril maradt.

Darksidea zeta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. — MycoBank

MB810766;

Angol diagnózis. Ascomata globose, brown, erumpent, up to 200 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4

layers of textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled

among asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, ellipsoid, with weakly

developed apical chamber, stipitate, 60–80 40–50 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline,

guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid, 19–30 12–15 µm. Darksidea zeta is a fungal root endophyte.

Darksidea zeta (CBS 135640) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT,

TUB, TEF, and CAL loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626:

ITS positions: 173 (G), 220 (C), 246 (deletion), 256 (T), 604 (A); ACT positions: 42 (T), 94 (C), 156 (C), 161

(C), 166–168 (deletion), 173 (T), 183 (G), 185 (T), 186 (C), 250 (T), 253 (A), 525 (T), 577 (T); TUB

positions: 63 (T), 81 (T), 246 (C), 276 (T), 282 (T); TEF positions: 10 (C), 153 (G), 194 (T), 202 (G), 230

(G), 269 (C), 362 (T), 409 (G), 622 (T), 835 (T), 877 (C); CAL positions: 107 (T), 167 (G), 258 (G), 307 (C),

431 (G).

Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 4-5 hét alatt borítják be a Petri-

csészét. Itt a telepek barnás-szürkések gyér légmicéliummal, halvány barna besüllyedt

marginális zónával és exudátum cseppekkel a telep közepe felé. A telepek MEA táptalajon

24°C-on 2 hét alatt borítják be a Petri-csészét. Itt fehéres-füstszürkék a telepek, közepes

mennyiségű légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.

Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata

gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135640 törzs metabolikusan

inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22874 = CBS 135640 = DSE-7/14 = REF131).

Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően

Megjegyzések. Termőtesteket figyeltük meg a CBS 135640 törzs esetében

szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra

oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.

69

16. ábra A három új nemzetség és a P. macrospinosa izolátumai MMN táptalajon. a–w: Darksidea alpha;

x–ac: Darksidea beta; ad–ag: Darksidea gamma; ah: Darksidea delta; ai–ak: Aquilomyces patris; al–am:

Flavomyces fulophazii; an: Periconia macrospinosa. Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra.

70

6. DISZKUSSZIÓ

6.1 Alföldi félszáraz területek DSE gombái

6.1.1 A terepi gyökerek kolonizációja

A duna-tisza közi homokgyepek, különösen a mintavételi területeinkre is jellemző

nyílt gyepek, néhol félsivatagi tulajdonságokkal rendelkező félszáraz terüleket

reprezentálnak (Fekete és mtsai 2002). Ezeken a területeken már végeztek

gyökérkolonizáló gombákra irányuló vizsgálatokat, például mikorrhizáltsági

státuszvizsgálatot, mely során jelentős mértékű DSE gomba kolonizációt írtak le a

növények gyökerében (Kovács és Szigetvári 2002). A világon több különböző száraz-

félszáraz területen végeztek vizsgálatokat gyökérasszociált gombák esetében (pl. Mandyam

és Jumpponen 2005, Herrera és mtsai 2010, Fracchia és mtsai 2011) és úgy tűnik ezeken a

területeken általánosan gyakori gyökérkolonizálók a DSE gombák.

A fülöpházi homokterületeken végzett mikorrhizáltsági státuszvizsgálat során

(Kovács és Szigetvári 2002) az általunk is vizsgált növényfajok közül a selyemkóró,

ürömlevelű parlagfű és a közönséges boróka esetében nem találtak, a közönséges napvirág,

naprózsa, apró lucerna és a bálványfa gyökerében megfigyeltek DSE struktúrákat. Egy

másik alföldi élőhelyen, a kunfehértói területeken végzett vizsgálat során szeptált endogén

hifákat figyeltek meg az ürömlevelű parlagfű gyökerében, azonban mikroszkleróciumot

nem találtak (Kovács és Bagi 2001).

A terepen gyűjtött gyökerek vizsgálatakor sok esetben figyeltünk meg DSE és AM

gombák általi együttes kolonizációt. Ez a megfigyelés összhangban van számos más

tanulmányban leírtakkal, miszerint a DSE gombák és más mikorrhizaképző gombák a

gyökeret egyidejűleg kolonizálhatják (pl. Jumpponen és Trappe 1998a, Kovács és

Szigetvári 2002, Postma és mtsai 2007).

A mintázott homokgyepeken a bálványfa, selyemkóró és a parlagfű rendkívül fontos

és veszélyes, nem csak ökológiai, hanem gazdasági problémákat is okozó, területre betörő

növények (Bagi 2004, Udvardy 2004, Szigetvári és Benkő 2004). Korábban csak a

bálványfa és a parlagfű esetében figyeltek meg DSE kolonizációt ezeken a területeken

(Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002), azonban munkánk során mindhárom

inváziós növénynél megfigyeltünk sötéten pigmentált szeptált hifákat és

mikroszkleróciumokat a gyökérben.

71

6.1.2 A DSE csoportok

Munkánk során csak azokat az izolátumokat tekintettük DSE gombának, amelyek,

vagy melyekkel egy csoportban lévő izolátumok in vitro inokulációs tesztjeink során a

kolonizálta a gyökereket, képzett mikroszkleróciumot és nem volt negatív hatással a

gazdanövényre. Ez azért fontos, mert a molekuláris diverzitási vizsgálatok esetében sokszor

a gyűjtött szekvenciák deponálásakor csak az adatbázisokban lévő adatokkal való

összevetés alapján jelölik meg a gombák stratégiáját (pl. ha ezek gyökérből származó

aszkuszos gomba szekvenciák, akkor endofitonnak vagy mikorrhiza képzőnek nevezhetik)

anélkül, hogy azt funkcionális vizsgálatokkal ellenőriznék (Brundrett 2009).

Habár nem is volt célunk kvantitatív kérdések megválaszolására alkalmas mintavétel,

az összesen 41 gomba csoport és a 14 DSE csoport (5. ábra, F2táblázat) törzsszámbeli

eloszlása hasonló volt más endofitonokkal foglalkozó tanulmányban leírtakéhoz (Sánchez-

Márquez és mtsai 2010). Az izolátumok többsége néhány nagyobb csoportba tartozott,

melyeket a terület RAF közösségének domináns vagy általános tagjainak nevezhetünk, és

21 csoportot egy izolátum reprezentált. Annak ellenére, ha egy DSE csoport vizsgálataink

során alacsony izolátumszámmal volt reprezentálva, nem jelenthetjük ki bizonyosan, hogy

valóban nem gyakori a területen. Ugyanis ezek az eredmények nagyban függenek a

vizsgálati módszerektől (pl. különböző táptalajok használata). Az izolálás alapú technikák

mellett egyre több molekuláris diverzitást vizsgáló munka jelenik meg, melyekben gomba-

specifikus primerekkel azonosítják a gyökerekhez asszociált gomba közösségek tagjait (pl.

Herrera és mtsai 2010). Például a molekuláris módszerekkel észak-amerikai füves

területeken végzett diverzitásvizsgálatok során általában bazídiumos gomba szekvenciák is

előkerültek, mint gyakori tagjai a RAF közösségnek (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008,

Khidir és mtsai 2010). Habár ettől eltérő területeken végeztük vizsgálatainkat, az

izolálásaink során számos aszkuszos gomba csoportot azonosítottunk, melyek az észak-

amerikai füves területeken is jelen voltak, azonban csak egy bazídiumos gombát sikerült

izolálnunk, így arra következtethetünk, hogy az izoláláson alapuló módszerek

alulreprezentálhatják a bazídiumos gombákat az aszkuszos gombákkal szemben.

A DSE törzsek ITS szekvenciáinak BLAST vizsgálata során a legtöbb esetben

találtunk ezekkel nagyfokú hasonlóságot mutató szekvenciákat. Ezek a GenBank találatok

(F4. táblázat) nagyrészt több földrész (Észak-Amerika, Dél-Amerika, Ázsia, Európa) száraz

és alpesi területeiről és általában talajmintákból vagy gyökerekből származtak (pl. Schadt

és mtsai 2001, Khidir és mtsai 2010, Porras-Alfaro és mtsai 2008.

72

A DSE-1 izolátumok a Cadophora nemzetségbe tartoztak, mely széles körben

elterjedt, általános gyökérkolonizáló gombákat foglal magába, többek között a C.

finlandica és C. orchidicola fajokat, melyeket számos tanulmányban vizsgáltak (pl. Wilcox

és Wang 1987, Fernando és Currah 1996, Jumpponen és Trappe 1998a, Andrade-Linares és

mtsai 2011). Szekvenciáinkkal a legnagyobb egyezést mutató BLAST találatok a C. luteo-

olivacea szekvenciái voltak, melyek legtöbbször kiwi és szőlő ültetvényeken izolált

patogén gombákból származtak (pl. Spadaro és mtsai 2010). Az általunk izolált Cadophora

csoport (DSE-1) az ITS és az LSU szekvenciák filogenetikai elemzése alapján valóban a C.

luteo-olivacea fajjal mutat egyértelmű, közelebbi rokonságot, azonban külön leszármazási

vonalakat reprezentálnak. Észak-amerikai félszáraz füves területekről is izoláltak DSE

törzseket, amiket a GenBank-ban szereplő szekvenciák alapján C. luteo-olivacea-ként

azonosítottak (Kageyama és mtsai 2008). Ezek valószínűleg a DSE-1 csoporthoz tartoznak,

azonban e szekvenciák nem lettek deponálva és publikálva, így nem tudtuk összevetni a

sajátjainkkal. Érdekesség, hogy a GenBank-ban csak a DSE-1 csoport esetében találtunk

DSE gombaként deponált hasonló szekvenciát, melyet egy alpesi növényből Schadt és

mtsai (2001) izoláltak, ami valószínűleg C. orchidicola lehetett.

A második legnagyobb csoportot (DSE-3) az irodalomban legtöbbször a dinnyefélék

patogénjeként azonosított, azonban DSE gombaként is ismert Rhizopycnis vagum

izolátumok alkották (Farr és mtsai 1998). Számos, ebbe a csoportba illeszkedő szekvencia

különböző területről és gazdanövényről származott, például mediterrán nyitvatermő és

kétszikű növényekről (Girlanda és mtsai 2002) vagy nedves szubtrópusi területek egyszikű

növényéről (Xu és mtsai 2008) (F4. táblázat). Néhány tanulmány patogénként írja le a R.

vagum-ot. Köztük Armengol és mtsai (2003) a R. vagum patogenitását vizsgálta különböző

növényekről és területekről származó izolátumokkal, és bár csak kis mértékben, de

patogénnek bizonyultak az izolátumok a sárgadinnyével összeállított kísérletekben. A R.

vagum patogénként viselkedett több, szintén dinnyefélékkel végzett kísérletek során (Farr

és mtsai 1998, Westphal és mtsai 2011). Az, hogy munkánk során nem voltak egyértelmű

negatív hatással a kísérleti növényekre, azzal is magyarázható, hogy az endofitonok a

különböző kísérleti körülmények, és a dinnyeféléktől teljesen eltérő gazdanövény miatt

„endofiton életszakaszban” maradhattak, de további magyarázat lehet a konspecifikus

izolátumok esetleges funkcionális eltérése is.

A DSE-8 csoport egyik leszármazási vonalát biztosan alkotó P. macrospinosa egy

széles körben elterjedt DSE gomba, melyet eddig fűfélék gyökeréből mutattak ki. Általában

73

nehezen megfigyelhető hialin hifákkal kolonizálja a gyökereket, azonban legtöbb esetben

pigmentált, vastag falú mikroszkleróciumot hoz létre (Barrow és Aaltonen 2001, Mandyam

és Jumpponen 2008). Mandyam és mtsai (2010, 2012) három különböző P. macrospinosa

izolátumot használt kolonizációs kisérletekhez, melyben 5 pázsitfű és 6 kétszikű lágyszárú

növényfajra gyakorolt hatását vizsgálták, és az eredmények egyfajta trendet mutattak. A

gombák erősebb hatással voltak a fűfélékre, mint más növényekre. Ez alapján arra

következtethetünk, hogy a P. macrospinosa funkcionális szempontok alapján is a

fűfélékhez asszociált endofiton.

A 8 izolátummal reprezentált DSE-9 csoport is az észak-amerikai félszáraz és füves

területek RAF közösségének tagja (Green és mtsai 2008, Porras-Alfaro és mtsai 2008), de

teljesen más területek növényeiből is előkerült már, például antarktiszi mohákról (Bradner

és mtsai 2000). Az Embellisia nemzetség tisztázatlan taxonómiája miatt, izolátumaink faj

szintű azonosítását nem tudtuk elvégezni.

A DSE-10 csoportot alkotó Curvularia nemzetséget a bevezetésben is külön

említettük, mivel e nemzetség egy törzsével végezték Redman és mtsai (2002) kísérleteiket,

melyek során amellett, hogy a pigmentált hifákkal rendelkező endofiton gomba növelte a

hőforrásnál élő növény hőmérsékleti stressztűrését, a gombának is szüksége volt a

gazdanövényre az optimumnál magasabb hőmérsékleten való túléléshez. A DSE-10

csoportba tartozó izolátumaink szekvenciái azonban egyértelműen különböztek a Redman

és mtsai (2002) által izolált Curvularia törzstől.

A DSE-11 csoport izolátuma ITS szekvenciája alapján egyezést mutatott Kansas

(USA) félszáraz füves területein izolált törzsekkel, melyeket növényre gyakorolt hatás

vizsgálatokhoz és enzim aktivitás tesztekhez használtak (Mandyam és mtsai 2010, 2012).

Munkánk során csak egy Xylariales (Sordariomycetes) rendbe tartozó izolátumot

gyűjtöttünk annak ellenére, hogy ez a csoport a gyökérendofitonok közösségeiben

egyébként sok esetben dominánsan van jelen (pl. Porras-Alfaro és Bayman 2011, Porras-

Alfaro és mtsai 2011).

A DSE-14 csoportot Fusarium nemzetségbe tartozó izolátumok alkották. E

legtöbbször növényi patogénként ismert nemzetség izolátumait azonban sokszor lehet

egészséges növények egészséges gyökeréből izolálni és szekvencia szinten is kimutatni

(Khidir és mtsai 2010), és több tanulmány számol be endofiton Fusarium törzsekről is (pl.

Phan és mtsai 2004, Paparu és mtsai 2006). Az izolátumainkéval teljesen megegyező ITS

74

szekvenciák ismét észak-amerikai prérik növényeinek gyökeréről is előkerültek, mint RAF

(Khidir és mtsai 2010, Herrera és mtsai 2010), mely arra enged következtetni, hogy sokkal

szélesebb körben lehetnek jelen nem-patogén Fusarium törzsek.

6.1.3 A DSE-k gazda- és területspecificitása és szezonalitása

Az irodalomban néhány tanulmány alapján arra következtethetünk, hogy a DSE

gombák széles gazda-spektrumú gyökérkolonizáló gombák (pl. Jumpponen és Trappe

1998a, Mandyam és mtsai 2012). Ennek ellenére idáig csak kevés munka foglalkozott a

terület-, gazda- és szövetspecificicitás illetve a szezonalitás vizsgálatával. Herrera és mtsai

(2010) különböző észak-amerikai félszáraz területeken vizsgálták a gyökérasszociált gomba

közösséget fűfélékben, és csak néhány esetben találtak gyökérasszociált gomba

szekvenciákat a gyökéren kívül, más szervekben. Ugyanebben a tanulmányban a több

területen vizsgált RAF közösség néhány tagja csak néhány vagy egy területhez volt

köthető, azonban a gyökérkolonizáló gombák domináns csoportjai általánosak voltak az

összes területen. Szintén észak-amerikai félszáraz területek RAF közösségének

vizsgálatakor hasonló eredményeket mutató munkájukban, Khidir és mtsai (2010) arra a

következtetésre jutott, hogy a domináns gyökérkolonizáló gombacsoportok megegyeznek

az Észak-amerikai félszáraz területeken.

Munkánk során nem csak fűfélékről, hanem a területek őshonos és inváziós

növényeiről is gyűjtöttünk izoláltumokat. A gyakori DSE gombák közül csak az Embellisia

sp. (DSE-9) volt az, ami csak őshonos növényekről került elő. Eredményeink alapján

elmondhatjuk, hogy a leggyakoribb DSE gombák generalisták, azonban jóval több adatra

lenne szükség ahhoz, hogy egyed- és ökoszisztéma szinten és több megközelítésben

értelmezhető legyen a gazda specificitás kérdésköre (Poulin és mtsai 2011).

Mandyam és mtsai (2010, 2012) több Periconia izolátumot vizsgáltak és

eredményeik alapján valószínűsítették a DSE gombák széles gazda spektrumát. Mandyam

és mtsai (2012) több növényfajon végzett inokulációs kísérleteik során a fűfajok

gyökerében nagyobb mértékű DSE gomba kolonizációt figyeltek meg, és arra a

következtetésre jutottak, hogy a DSE izolátumok fűfélék esetében „nagyobb

kompatibilitással” rendelkeznek, mint más növények esetében. Ezt a következtetést és az

eredményeket is kritikusan kell kezelnünk, mivel ezek az izolátumok kizárólag füvekről

lettek gyűjtve és lehet, hogy más növényekről gyűjtött DSE izolátumoknál ez nem

mutatkozna.

75

A DSE gombák szezonalitását több tanulmányban vizsgálták (Mandyam és

Jumpponen 2008 és az itt idézett irodalom), azonban ezekben a DSE gombák általi

kolonizációt figyelték terepi mintákban, nem pedig a közösségek dinamikájára fókuszáltak.

A DSE közösség domináns csoportjaiban az izolátumok legalább két különböző évszakban

lettek gyűjtve, így elmondhatjuk, hogy nem tapasztaltunk szezonalitást. Azonban, hogy

ennél közelebb kerüljünk a DSE gombák évszakhoz köthető funkcionális és diverzitásbeli

dinamikájához számos további, ezt a kérdéskört középpontba helyező vizsgálatra van

szükség.

A talaj mikrobiális közösségének az inváziós növényekre és terjedési sikerükre

gyakorolt hatását már számos tanulmány igazolta (pl. Richardson és mtsai 2000, Callaway

és mtsai 2004), és a mikorrhizaképző gombák általi kolonizáció hatását is többször

vizsgálták ilyen kontextusban (Pringle és mtsai 2009). Ennek ellenére nem ismerünk olyan

tanulmányt, melyben inváziós növényeket kolonizáló DSE gombákat vizsgáltak. A

selyemkóró és a parlagfű DSE általi kolonizációját vizsgálták már eredeti élőhelyükön,

észak-amerikai területeken. Itt mindkettő gyökerei kolonizáltak voltak, és a selyemkórót

még kísérletes rendszerekben is sikeresen inokulálták Periconia-val (Mandyam és mtsai

2012).

Munkánk során a domináns és gyakori DSE csoportok az őshonos és inváziós

növények gyökeréről is előkerültek, ami alátámasztja azt a hipotézist, hogy ezek a gombák

generalista és széles gazdaspektrumú gyökérkolonizálók. Mivel a DSE gombák gyakoriak

és fontos szerepük lehet a növények kitett élőhelyeken való túlélésében, ezek a gombák

talán az inváziós növények terjedési sikerességéhez is hozzájárulhatnak.

6.1.4 A DSE közösség vizsgálatának konklúziói

Khidir és mtsai (2010) számos tanulmány eredménye alapján azt a hipotézist

fogalmazta meg, hogy „Észak-Amerika száraz területein a fűfélék gyökerében a gomba

közösségek főbb csoportjai megegyeznek”. Ezt a hipotézist saját eredményeink alapján

kibővíthettük, nagyobb léptékben nézve elmondhatjuk, hogy általánosan a (fél)száraz füves

területek növényeiben a DSE közösség domináns tagjai megegyeznek, habár ennek

bizonyítására globális, a kontinensek félszáraz területeinek átfogó RAF / DSE vizsgálata

szükséges. Eddig már számos tanulmány kiemelte (pl. Mandyam és Jumpponen 2005,

Mandyam és mtsai 2010, Porras-Alfaro és Bayman 2011) a DSE gombák

ökoszisztémákban való jelenlétének és funkcióinak megértésének fontosságát, melyhez

76

átfogó diverzitás vizsgálatok, további inokulációs kísérletek és rendszerbiológiai

megözelítések lehetnek szükségesek (Porras-Alfaro és Bayman 2011).

Munkánk során azonosított összes nagy létszámú DSE csoport generalistának

tekinthető, mivel őshonos és inváziós növényekről is előkerültek, valamint nem mutattak

sem terület specificitást, sem szezonalitást. Továbbá a domináns DSE csoportok

szekvenciái nagy hasonlóságot mutattak több éghajlati övből és területről származó

gyökérkolonizáló gombákéival, mely ugyancsak megerősíti ezek generalista életmódját. Így

a félszáraz homokterületekről gyűjtött izolátumaink olyan kísérleteknél és vizsgálatoknál

lehetnek használhatók, melyek segíthetnek megérteni a fél(száraz) területeken és akár más

életközösségekben jelenlévő DSE közösség funkcióját.

6.2 A 3 DSE csoport izolátumainak ISSR vizsgálata

Mindhárom kiválasztott csoport esetén (DSE-1, DSE-3 és DSE-7) nagyobb

különbségeket tapasztaltunk ISSR vizsgálattal a csoportok izolátumai között, mint amilyet

az ITS szekvenciák vizsgálatával kaptunk (6–8. ábra).

A szakirodalomban több esetben írnak le a DSE-1 csoportba tartozó vagy ahhoz

nagyon közel álló Cadophora luteo-olivacea törzseket, melyek egyes növényekfajok

patogénkjeiként ismertek (pl. Prodi és mtsai 2008, Spadaro és mtsai 2010), de más

növények esetében, más területeken tünetmentesen kolonizálják a gyökereket (pl.

Kageyama és mtsai 2008).

A DSE-3 csoport esetén is hasonló megfigyeléseket találhatunk. Számos

tanulmányban patogénként említették a Rhizopycnis vagum-ot (pl. Farr és mtsai 1998,

Westphal és mtsai 2011), más esetekben pedig endofitonként írnak róla (pl. Girlanda és

mtsai 2002). Számos különböző területről, gazdáról származó patogén vagy endofitonként

megnevezett törzs ISSR vizsgálatával ezek talán elkülöníthetőek lennének, mivel a gomba

izolátumok nagymértékű csoporton belüli variabilitása összefügghet az esetleges

funkcionális, kolonizációs és más biológiai különbségekkel. Alaniz és mtsai (2009)

munkájában például, egy patogén gomba (Cylindrocarpon macrodidymum) nagyobb

virulenciával rendelkező törzsei az ISSR mintázatok alapján váltak elkülöníthetővé a

kevésbé virulensektől.

A DSE-7 csoport esetében az 5.7 fejezetben ismertetett taxónomiai vizsgálat során

megállapítottuk, hogy legalább hat fajhoz tartoznak izolátumaink. A korábban elvégzett

ISSR vizsgálatok ugyanezt a mintázatot mutatták, azonban jóval nagyobb izolátumok

77

közötti különbségekkel mint a másik két DSE csoport esetében, mely alapján már látszott,

hogy valószínűleg nem egy fajról van szó.

Eredményeink összhangban vannak a tudomásunk szerint egyetlen, DSE gombákat

ISSR mintázatok alapján vizsgáló tanulmány eredményeivel. Grünig és mtsai (2001)

munkájuk során a PAC komplexbe tartozó nem sporuláló és egy sporuláló faj 14-14 törzsét

vizsgálták, és a két taxon, valamint a törzsek specifikus elkülönítéséhez használtak ISSR-

PCR-t. Mind a 28 törzs esetében specifikus mintázatot kaptak, és az izoenzim vizsgálatok

során kapott alcsoportok is megegyeztek az ISSR alapján kapottakkal. Az izolátumok

esetükben sem mutattak korrelációt a gyűjtési területtel és a gazdanövényekkel. Az

elsődlegesen a mérsékelt övi erdős területeken domináns DSE csoportként jelen lévő PAC

(Queloz és mtsai 2011) és munkánk során félszáraz füves területek három gyakori DSE

csoportjának ISSR vizsgálata alapján elmondható, hogy ezekre a DSE gombákra jellemző a

nagymértékű fajon belüli genetikai variabilitás, és az alcsoportok nem korrelálnak az oda

tartozó izolátumok geográfiai és gazdanövény szerinti származásával.

Habár nem tapasztaltunk korrelációt a vizsgált paraméterekkel a három kiválasztott

DSE csoport esetében sem, fontos eredmény, hogy az ISSR vizsgálattal nagyfokú

csoporton belüli variabilitást tudtunk kimutatni, még megegyező ITS régióval rendelkező

törzsek esetében is. Viszonylag könnyen találhatunk egy adott izolátumra specifikus sávot

az ISSR profilban, mely lehetővé teszi egy izolátum specifikus azonosítását például a

specifikus sáv meghatározásával és az erre tervezett SCAR (Sequenced Characterized

Amplified Region) markerek fejlesztésével.

Az izolátum-specifikus markerek konspecifikus, de eltérő izolátumok elkülönítését

teszik lehetővé, így a két izolátummal külön-külön és együtt inokulált növény-kísérletek

eredményeként akár az is kiderülhet, hogy ez a nagymértékű variabilitás az izolátumok

közötti esetleges funkcionális eltérések mögött állhat, mely összefüggésbe hozható az

ökoszisztémákban betöltött szerepükkel.

6.3 Az in planta FISH

Az elmúlt években egyre több tanulmány foglalkozik a gyökérendofiton gombák

gyökéren belüli fluoreszcens jel detektálásán alapuló módszerekkel, melyek során vagy

fluoreszcens sejtfalfestékek (pl. WGA, wheat germ agglutinin) használatával (pl. Andrade-

Linares és mtsai 2011, Lahrmann és mtsai 2013), vagy különböző GFP transzformáns

78

törzsekkel dolgoznak (pl. Maciá-Vicente és mtsai 2009, Behie és mtsai 2012, Su és mtsai

2013). Nemrég Rath és mtsai (2014) közöltek egy módszertani tanulmányt, melyben több

gomba-növény interakció különböző módon való fluoreszcens jelölését és ezek konfokális

mikroszkópos detektálását mutatják be részletesen. Ezek a módszerek jól alkalmazhatók

olyan kísérleti rendszerekben, ahol nem cél a különböző gombák elkülönítése. Az általunk

kidolgozott, a 4.5 fejezetben leírt FISH protokoll alapján specifikusan jelölhetünk két

különböző gombát egy gyökérszakaszon, mely lehetővé teszi számos további kérdés

tisztázását.

A Cadophora sp. a központi szövethengerben nem volt megtalálható, amit néhány

megfigyelés során egyes DSE gombáknál már megállapítottak és ezeket patogénnek is

nevezték (pl. Su és mtsai 2013). Több esetben megfigyeltünk már más tanulmányokban

néhány gyökérkolonizáló gomba esetén is leírt, „moniliform” struktúrákat (pl. Gutiérrez és

mtsai 2003, Uma és mtsai 2010, Klymiuk és mtsai 2013), amiket „felfújódott” kevésbé

elágazó hifatagok tömege alkotott (9. a ábra). A két eltérő intracelluláris struktúra

lehetséges, hogy képződő mikroszkleróciumok két különböző ontogenetikus stádiumát

mutathatja. Ezt valószínűsítheti, hogy nem találtunk olyan sejtet, ahol a „moniliform”

struktúra nem töltötte volna ki nagyrészt vagy teljesen a sejtet. Néhány esetben meg is

figyeltünk kissé teltebb tagokkal rendelkező hifákat is. Lahrmann és mtsai (2013)

munkájuk során megfigyelték, hogy egy növény akár egymás melletti gyökérsejtjeit az

endofiton Piriformospora indica különböző morfológiájú hifái kolonizálnak. Az élő

sejtekben jelenlévő, vastagabb hifákból álló tömegből kiinduló vékonyabb hifák

elpusztították a környező növénysejteket. A vastagabb hifákat kizárólag élő sejtekben

figyeltek meg, a vékony hifákat pedig nekrotizálódó vagy teljesen halott sejtekben

(Lahrmann és mtsai 2013).

Az egyértelműen mutualista arbuszkuláris mikorrhiza képző gombák által kolonizált

gyökér részek élő szövetek jelenlétét is bizonyítják, mivel az obligát biotróf AM gomba

hifák sejtbe való bejutásának bonyolult, kétoldalú folyamatához az élő növényi sejt is

szükséges (pl. Parniske 2008, Oldroyd 2013). Ez azért lehet érdekes, mert bár a DSE által

kolonizált sejtek állapotáról nem mondhatunk semmit, azonban elmondható, hogy több

esetben a mikroszkleróciumokat és hifákat tartalmazó sejtet határoló sejtek élő sejtek,

valamint hogy a vizsgált szakaszok sem halott részei a gyökérzetnek.

Legjobb tudomásunk szerint egy tanulmányban végeztek sikeres FISH jelölést

gyökéren belüli gombákra, mely során egy májmoha gametofitonját kolonizáló

79

arbuszkuláris mikorrhizákat és a gombákhoz asszociált baktériumokat jelölték specifikus

fluoreszcens próbákkal (Desirò és mtsai 2012). A munkában nem esik szó a sejtfalak

autofluoreszcenciája okozta problémákról, sem a két jelölt organizmus specifikus

jelölésének nehézségeiről. Azonban fontos különbség, hogy a vizsgálatuk során csak a

baktériumok gombák melletti jelenlétének vizsgálatára alkalmas, vékony

keresztmetszeteket készítettek parafomaldehides fixálást követően a májmoha telepből,

melynek sejtjei egészen különböznek az edényes növényekétől, és a sejtfaluk szerkezete

valamint a sejtfalanyagok összetétele is különbözhet (Popper és Fry 2003). A jelölések

specificitását pedig valószínűleg az, hogy két teljesen eltérő organizmust (gombát és

baktériumot) vizsgáltak, már önmamagában magyarázhatja.

Munkánk során egy olyan RNS FISH protokollt adaptáltunk, amely alkalmas lehet a

gyökereket kolonizáló, akár több DSE gomba egyidejű specifikus detektálására és

lokalizációjára. A riboszómális RNS-hez hibridizáló próbák segítségével akár terepi

mintákban tudjuk specifikusan detektálni életképes gyökérkolonizáló gombákat, köztük az

esetleges látens módon jelenlévő patogén gombákat, így a kifejlesztett módszer gazdasági

szempontokból is fontos lehet.

6.4 A Cadophora sp. kolonizációjának TEM vizsgálata

Egy gyökérszakaszt kolonizáló gombák gyökéren belüli ultrastruktura vizsgálatához a

minta megfelelő gyökérszakaszának kiválasztása a DSE gombák esetében nem mindig

egyszerű, mivel a kolonizációs képességükben különbözhetnek egy egyébként jól

kolonizáló gombafaj eltérő törzsei (Mandyam és Jumpponen 2012), valamint a kolonizáció

a gazdanövénytől és a körülményektől is függhet (Mandyam és Jumpponen 2012). És bár a

minták kontrasztozásakor a magas lipid-tartalmú gomba struktúrák láthatóvá válnak és

fénymikroszkóp alatt ki lehet jelölni célzottan gyökérszakaszokat a beágyazáshoz (Kovács

és mtsai 2003), esetünkben ez nem nyújtott segítséget.

A Cadophora sp. izolátummal inokulált póréhagyma gyökerének ultrastruktura

vizsgálata során, annak ellenére, hogy mintáink csak egy kolonizációs időpontból

származtak, érdekes eredményeket kaptunk, melyek több kérdésre választ adhatnak.

A kísérleteink során használt kísérleti rendszer és az alkalmazott növény és gomba

fajok is eltérnek az eddigi tanulmányokban vizsgáltaktól. Egyszikű növények DSE

kolonizációjának ultrastruktúrális jellemzőiről legjobb tudomásunk szerint csak csak Yu és

80

mtsai (2001) és Zimmermann és Peterson (2007) számoltak be. Utóbbi számunkra kevésbé

érdekes, mert egy Phialocephala fortinii-vel inokulált terresztris orchidea csírázását és

fejlődését vizsgálták. Yu és mtsai (2001), tanulmányukban Asparagus officinalis

gyökerében vizsgálták a P. fortinii általi kolonizációt.

Vizsgálataink során néhány, a hifák környezetében lévő növényi sejt esetében

papillák jelenléte volt megfigyelhető a növényi sejtfalon. Ez a sejtfal anyag appozíció egy

általános jelenség a növények patogének elleni védekezésében (pl. Hückelhoven 2007).

Eddig nem írtak le hasonló struktúrákat DSE gombák esetében, azonban a növényi sejtbe

penetráló hifákról Currah és mtsai (1993) azt írták a P. fortinii esetében, hogy az

általánosnál vékonyabb hifákkal történik a betörés és itt a növényi sejtfalban nem történik

látható változás, mely következtetéseik szerint enzimatikus sejtfalbontásra utalhat. A

szintén P. fortinii által kolonizált Arabidopsis thaliana gyökérben sem tapasztalták a sejtfal

anyagok appozícióját a hifa közelében (Peterson és mtsai 2008).

Vizsgálataink során számos esetben jól megfigyeltő volt az intracelluláris hifák körül

a mátrix anyag és a kondenzálódott növényi citoplazma (10. a,b ábra), melyet számos

tanulmányban megemlítenek. Currah és mtsai (1993) és Yu és mtsai (2001) a növényi

sejtbe behatoló hifa körül elektrondenz anyagok jelenlétét írták le, Peterson és mtsai (2008)

és Yonezawa és mtsai (2004) vizsgálataik során a hifákat fibrilláris anyag vette körül. Ezt, a

több különböző kísérlet során megfigyelt elektrondenz fibrilláris anyagot Peterson és mtsai

(2008) csak kondenzált citoplazmának valószínűsítik, melyet ez eredményeink is

megerősítenek.

Élő, teljesen ép citoplazmával rendelkező növényi sejtben is sikerült hifát

megfigyelnünk (11. a ábra). A növényi sejten belül a gomba sejtfalat egy laza mátrixanyag

választotta el a növényi sejtmembrántól és növényi sejtfal nem volt megfigyelhető (11. a,b

ábra). Ezek alapján elmondhatjuk, hogy legjobb tudomásunk szerint először figyeltünk meg

perifungális membránt egy DSE gomba gyökérkolonizációja esetében. Számos

tanulmányban említik meg külön a perifungális membrán hiányát (pl. Currah és mtsai 1993,

O’Dell és mtsai 1993, Abdellatif és mtsai 2009). Yu és mtsai (2001) sem a cortex sejtekbe,

sem az epidermisz sejtekbe behatoló hifák körül nem figyeltek meg perifungális membránt,

és hozzájuk hasonlóan más ultrastrukturális tanulmányban sem detektálták ezt (pl. Cameron

1998, Jumpponen és Trappe 1998b, Yonezawa és mtsai 2004, Peterson és mtsai 2008). A

korábban megfigyelt kolonizációhoz köthető ultrastrukturális változások és jellegek (pl.

nincs perifungális membrán és nyilván nincs mátrix anyag a növényi sejt és a gomba

81

membránja között) alapján azt valószínűsítették, hogy a gyökérendofiton és a gazdanövény

viszonya inkább tekinthető egy nekrotróf-patogén kapcsolatnak (Peterson és mtsai 2008),

mivel az eddigi tanulmányok során a kolonizált növényi sejtek citoplazmája nekrotikus

vagy degradált volt, és nem figyeltek meg élő sejtet kolonizáló hifákat sem.

Mivel a gomba és növényi sejtmembránon is sokszor megfigyelhetőek voltak

membrán betűrődések/vezikulumok (11. a,b ábra), feltételezhetjük, hogy jelentős endo- és

exocitotikus folyamatok zajlanak mindkét sejt esetében. A mátrix anyag jelenléte is érdekes

lehet, mivel az arbuszkuláris mikorrhizák esetében fontos szerepet játszik a gomba és

növényi citoplazma közötti mátrix anyagnak az anyagcsere kapcsolatban (Smith és Read

2008), és nem kizárt, hogy a DSE gomba növény interakciókban is lehet szerepe.

A perifungális membrán jelenlétére több magyarázat is lehetséges, kezdve a

kísérletben használt organizmusokon és kísérleti rendszereken keresztül egy adott tényleges

mutualista kapcsolat meglétéig, az azonban bizonyosan elmondható, hogy a kapcsolatnak

van egy biotróf stádiuma. Lehetséges az is, hogy a kolonizáció még csak kezdeti

szakaszban volt, és ez nem eredményezett látható degradációt a növényi sejtben.

Habár ultrastruktura vizsgálataink eredményei sok kérdést vethetnek fel a DSE

gombák kolonizációjáról, így életközösségekben betöltött funkciójukról is, azonban a

jelenségek tisztázásához és alaposabb megismeréséhez számos további vizsgálatok

szükségesek.

6.5 A leírt DSE taxonok

Taxonómiai vizsgálataink során a nemzetségek és fajok leírását a megfelelő és

konzekvens morfológiai karakterek mellett a DNS szekvenciák az adott taxonra jellemző és

egyedülálló karakterei alapján végeztük. Új taxonok DNS szekvencia alapú leírása annak

ellenére, hogy számos tanulmányban alkalmazzák (pl. Browne és mtsai 2013, Gomes és

mtsai 2013) nem általánosan bevett. Azonban olyan esetekben, ahol nem állnak

rendelkezésünkre megbízható morfológiai karakterek, ezen leírási mód alkalmazása

szükségszerű.

Annak ellenére, hogy egyre több tanulmány foglalkozik a gyökérasszociált gomba

közösségek szerkezetének vizsgálatával (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2011, Herrera és mtsai

2012) vagy új DSE fajok leírásával (pl. Walsh és mtsai 2014), még így sem több mint 20-

82

25 pontosan leírt DSE fajról tudunk (pl. Kageyama és mtsai 2008, Andrade-Linares és

Franken 2013).

Mindhárom, általunk leírt nemzetség a Pleosporales rend Massarineae alcsaládjába

illeszkedett (13. ábra), amely főként szaprotróf vízi és szárazföldi gombákat foglal magába

(Zhang és mtsai 2012). A DSE-7 csoport egy új nemzetséget és hat fajt (15. ábra)

reprezentált, a DSE-4 izolátumai egy monospecifikus nemzetséget alkottak és a DSE-8B

csoport szintén egy új nemzetséget reprezentált.

6.5.1 Az új DSE nemzetségek elhelyezkedése

A Darksidea nemzetség a molekuláris eredményeink alapján a Lentitheciaceae

(Zhang és mtsai 2009) családba tartozik, azonban mind az aszkospórák tulajdonságai

alapján, mind a száraz élőhelyekhez való asszociáció alapján elkülönül a család

többszörösen szeptált aszkospórájú és legtöbbször nedves vagy vizes élőhelyeken

előforduló fajaitól (Zhang és mtsai 2012). A Lentitheciaceae családba a Tingoldiago

graminicola testvércsoportjaként illeszkedtek (14. ábra). A Darksidea fajok

telepmorfológiája rendkívül változatos lehet (16. ábra).

Az Aquilomyces patris a Morosphaeriaceae (Suetrong és mtsai 2009) családba került

egy új bazális csoportot alkotva a Heliascus, Kirschsteiniothelia, Morosphaeria,

Pithomyces nemzetségek és az Asteromassaria pulchra mellett, melyek elsősorban

tengerben és más vízi/vízes élőhelyeken előforduló gombák (Suetrong és mtsai 2009) (11.

ábra). Az Aquilomyces patris telepei sötétszürkések, nemzetségnevüket is erről kapták (9.

ábra).

A Flavomyces fulophazii egy erősen támogatott, de különálló „incertae sedis” kládot

alkotott az eddig Massarinaceae családba sorolt Massarina igniaria, Periconia

macrospinosa és Noosia banksiae fajokkal. Ez a klád azonban nem képzett monofiletikus

csoportot a Massarinaceae család további fajaival, melyek közé a család típusfaja

(Massarina eburnea) is tartozott. Korábbi elemzések során a most F. fulophazii-val egy

kládba tartozó M. igniaria a Massarinaceae család bazális elágazását alkotta (Zhang és

mtsai 2009, 2012), azonban elemzéseink során használt további taxonok és más lókuszok

vizsgálata megváltoztatták a csoport helyzetét (13. ábra). A F. fulophazii telepei

élénksárgára színezik a táptalajokat, azonban ez a gomba festési képessége a fenntartás

során egy idő után eltűnhet (16. ábra).

83

6.5.2 A Darksidea nemzetségbe tartozó más szekvenciák/izolátumok

Már évekkel a Darksidea nemzetség leírása előtt számos, e nemzetség fajainak ITS

szekvenciájával megegyező/hasonló GenBankban elhelyezett és lepublikált szekvenciát

ismertünk. Mindegyik szekvencia száraz és félszáraz füves területről került elő diverzitás

vizsgálatoknál, elsősorban nem tenyésztett gombából származó szekvenciaként.

Legjobb tudomásunk szerint az első, Darksidea fajokkal jelentős mértékű

hasonlóságot mutató ITS szekvenciát Hawkes és mtsai (2006) helyezték el a GenBankba,

melyet Stipa hymenoides gyökeréből mutatták ki Utah (USA) félszáraz füves területeiről,

majd Sánchez-Márquez és mtsai (2008) Ammophila arenaria rizómájából izolált egy ide

tartozó törzset Galicia (Spanyolország) északi részén elterülő homokterületeken. Green és

mtsai (2008) mutatott ki több ITS szekvenciát, melyet Új Mexikó (USA) félszáraz füves

területeken dominánáló fűféle (Bouteloua gracilis) gyökerét övező talajból határoztak meg,

majd Porras-Alfaro és mtsai (2011) ugyanezen a területen végzett talajközösség vizsgálatok

során további Darksidea szekvenciákat mutatott ki. Ezt megelőzően a B. gracilis

gyökérasszociált gomba közösségének vizsgálatát végző tanulmány során Porras-Alfaro és

mtsai (2008) egy a „RAF közösségben domináló, Pleosporales rendbe tartozó új DSE

csoportról” írt, melyet „A csoport”-nak nevezett és benne két alcsoportot különített el („B

és C alcsoportok”). Az ITS szekvenciák sajátjainkéval való összehasonlítása alapján a „B

alcsoport” egyértelműen együtt csoportosult a Darksidea nemzetséggel. Khidir és mtsai

(2010) szintén gyűjtött ITS szekvenciákat, melyek az előbb említett „B alcsoport”-ba

tartoztak, és ezt a csoportot Camara és mtsai (2001) által leírt Paraphaeospheria fajokkal

való rokonsága alapján Paraphaeospheria sp.-nek nevezte. Ez a megnevezés, melyet

később Herrera és mtsai (2010) is használtak, biztosan nem megfelelő, mivel a

Paraphaeospheria nemzetség egyértelműen a Montagnulaceae családva tartozik (Zhang és

mtsai 2009, Verkley és mtsai 2014). A B. gracilis RAF közösségének egy területi grádiens

mentén való vizsgálata során a közösségek állandó és általános tagjaként említették a most

Darksidea nemzetségbe tartozó gombákat (Herrera és mtsai 2010). E nemzetség szintén

előkerült emlősök ürülékéből két különböző füves területen is (Herrera és mtsai 2011a),

valamint egy másik fűféle, a Sporobolus cryptandrus gyökeréről is (Herrera és mtsai

2011b). A nemzetség előfordul az eurázsiai sztyepp öv nyugati szélén (a dolgozatban

ismertetett izolátumok) és a keleti régióiban is (Su és mtsai 2010). Su és mtsai (2010) a

belső mongóliai plató félszáraz sztyepp zónájában izolált Stipa grandis gyökeréről 3

törzset, melyek a Darksidea alpha fajjal mutattak nagy hasonlóságot.

84

A fent felsorolak és saját adataink alapján elmondhatjuk, hogy a Darksidea

nemzetség domináns tagja a félszáraz területek DSE közösségeinek világszerte.

6.5.3 Ivaros alak és spóraképzés a DSE gombáknál

Izolátumaink spóraképzésének indukálására irányuló munkáink során egyszer sikerült

termőtesteket megfigyelnünk csalán száron (12. ábra), és az egyszer már működő kísérleti

körülmények többszöri ismétlésének ellenére, a törzsek nem képeztek több hasonló

struktúrát. Elmondhatjuk, hogy legjobb tudásunk szerint a DSE gombák esetén először

sikerült ivaros alakot megfigyelnünk, és több esetben az ivaros termőtestekben aszkuszok

és aszkospórák is jelen voltak (12. ábra). Ez fontos eredmény lehet, mivel a DSE gombák

ivartalan gombák (Jumpponen és Trappe 1998a), melyeknél még a konídiumképzés is a

legtöbb esetben csak extrém körülmények hatására indul meg (pl. Wang és Wilcox 1985,

Grünig és mtsai 2009).

Néhány tanulmányban a szerzők feltételezték, hogy néhány DSE gombának lehet

vagy lehetett ivaros állapota (Grünig és mtsai 2009). Zaffarano és mtsai (2011) 19 PAC faj

több ezer izolátumának ivaros folyamatokban szerepet játszó, párosodási típust

meghatározó (mating type, MAT) lókuszainak vizsgálata alapján is azt feltételezték, hogy

kriptikus ivaros folyamatok rendszeresen jelen vannak, vagy lehettek, a vizsgált DSE

gombáknál. Habár populációgenetikai tanulmányok, genom vizsgálatok és a MAT

lokuszok tulajdonságai az ivaros alak jelenlétét bizonyítják (pl. Zaffarano és mtsai 2011),

ivaros alak megfigyelése és indukálása ezidáig nem járt eredménnyel a DSE gombák

esetében. Termőtestképzést célzó kísérletek során PAC fajoknál nem figyeltek meg ivaros

alakot, azonban a PAC egy közeli rokona, a Phaeomollisia piceae esetében megfigyeltek

steril termőtestet (Grünig és mtsai 2009), mely hasonlított egy Currah és mtsai (1993) által

Acephala fajnál (UAMH 6816) megfigyelt, spórákat szintén nem tartalmazó termőtesthez.

Nem tudunk a Darksidea fajok mellett egy DSE gombáról sem, amelynél spórákat

tartalmazó termőtestek képződését leírták volna. A gyakori Darksidea fajok, például a D.

alpha törzseinek bizonyított ivaros spóra képzési képessége és vizsgálatokban való

alkalmazása segíthet jobban megérteni a gyökérkolonizáló endofiton gombák

életközösségekben való széles elterjedését és általános előfordulását.

85

7. ÖSSZEFOGLALÁS

A dolgozatban bemutatott munka során alföldi félszáraz területek növényeinek

gyökerét kolonizáló DSE gombákat vizsgáltuk. (1) Célul tűztük ki a vizsgált homokterület

DSE közösségének kompozicionális diverzitás vizsgálatát, és az őshonos és inváziós

növényeket mintázva megtalálni a generalista, gyakori és domináns DSE csoportokat.

Kérdésünk volt még, hogy mutatnak-e a DSE gombák szezonalitást vagy terület

specificitást. (2) Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszerrel teveztük vizsgálni, hogy

konspecifikus DSE izolátumok elkülöníthetők-e egyes tulajdonságaik alapján. (3) Célunk

volt egy fluoreszcens festési módszer fejlesztése mely lehetővé teszi bizonyos DSE gombák

gyökéren belüli specifikus jelölését, valamint (4) információkat szerezni egy DSE gomba

gyökérkolonizációjáról ultrastruktura (TEM) vizsgálatokkal. (5) Terveztük még a munkánk

során előkerülő azonosítatlan DSE gombák taxonómiai vizsgálatát.

(1) A DSE közösség vizsgálatánál összesen 14 DSE csoportot azonosítottunk és

azonosítottuk a közösség domináns generalista csoportjait. Nem tapasztaltunk sem

szezonalitást, sem terület specificitást. Észak-amerikai félszáraz területek gyökérkolonizáló

gomba közösségével való jelentős hasonlóság alapján elmondhatjuk, hogy (fél)száraz füves

területek növényeiben az DSE közösség általánosan megegyezik.

(2) Az ISSR módszerrel vizsgált DSE csoportok izolátumai nem voltak

elkülöníthetők gyűjtési helyük, idejük és gazdanövényeik alapján sem, azonban nagyfokú

csoporton belüli variabilitást tudtunk kimutatni. Ez lehetővé teszi a különböző

konspecifikus törzsek specifikus azonosítását.

(3) Sikerült olyan fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) módszert adaptálnunk,

mely lehetővé tette DSE gombák specifikus jelölését a gyökéren belül, így két különböző

gomba által kolonizált gyökérben is ezek elkülöníthetővé váltak az egyidejű jelöléssel.

(4) Az ultrastruktura vizsgálatok során elsőként figyeltünk meg élő növényi sejtben

DSE hifát, és az ehhez kapcsolódó sejttani változásokat. A gomba- és a növényi sejt között

egy laza mátrix anyagot figyeltünk meg, és először azonosítottuk a biotróf kapcsolatokra

jellemző perifungális membránt a gyökerek DSE kolonizációja esetében.

(5) Munkánk során előkerült három DSE csoport taxonómiai vizsgálata során három

új nemzetséget és nyolc fajt írtunk le, melyek a Pleosporales rend Massarineae alrendjébe

illeszkednek.

(6) A polifázikus taxonómiai munka során először sikerült a DSE gombáknál ivaros

alakot indukálnunk, az ivaros termőtestekben aszkuszokat és aszkospórákat megfigyelnünk.

86

8. SUMMARY

In this study, we investigated dark septate endophytes originating from semiarid areas

of the Great Hungarian Plain. The main objectives of this work were (1) to study the

compositional diversity of DSE fungi colonizing the plants of semiarid sandy areas and to

identify the generalist, dominant and frequent members of the community by comparing

DSE community of indigenous and invasive plants. We aimed to test the area specificity

and the seasonality as well. Our further aims were (2) to investigate whether conspecific

isolates can be differentiated using Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) method, (3) to

adapt a fluorescent method for specific detection and visualization of fungal endophytes in

the root, (4) to gain information on ultrastructural features of DSE colonization using TEM

and (5) to describe unidentified DSE lineages revealed in our investigations.

(1) More than 200 samples were taken from native and invasive plants of the three

sites. According to the analyses of 296 ITS sequences obtained from 241 isolates, isolates

clustered into 41 groups and found that 14 of these were DSE. The generalist and dominant

DSE groups were identified, neither area specificity nor seasonality were found. According

to the significant similarities with root associated fungal community of semi arid regions of

North America we may extend this statement by hypothesizing that plants of semiarid

grasslands share common dominant DSE fungal community.

(2) Isolates of assigned DSE groups could not be differentiated based on sampling

area, sampling date or host plant using ISSR, however high variability were found among

the isolates that enables specific identification of conspecific strains.

(3) An rRNA fluorescent in situ hybridization (FISH) method was adapted for

specific labeling of fungal endophytes in root for the first time enabling simultaneous

specific detection of different fungi colonizing the same root.

(4) In this study, we reported DSE hypha in living plant cell and related cellular

changes for the first time examined by TEM. A loose matrix material were found between

the fungal and plant cell and we observed for the first time perifungal membrane that

known to be specific to biotrophic interactions.

(5) Based on the results of taxonomic work of three unindentified DSE groups,

isolates were found to represent three novel genera with eight novel species within the

suborder Massarineae in the order Pleosporales.

(6) In our study, we managed for the first time to induce DSE to form their sexual

morphs, where asci and ascopsores could be detected in the sporocarps.

87

9. IRODALOMJEGYZÉK

Abdellatif L, Bouzid S, Kaminskyj S, Vujanovic V. 2009. Endophytic hyphal

compartmentalization is required for successful symbiotic Ascomycota association with

root cells. Mycological Research 113: 782–791.

Addy HD, Piercey MM, Currah RS. 2005. Microfungal endophytes in roots. Canadian

Journal of Botany 83: 1–13.

Alaniz S, Armengol J, León M, García-Jiménez J, Abad-Campos P. 2009. Analysis of

genetic and virulence diversity of Cylindrocarpon liriodendri and C. macrodidymum

associated with black foot disease of grapevine. Mycological Research 113: 16–23.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search

tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–10.

Andrade-Linares DR, Franken P. 2013. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy,

colonization patterns, and functions. In: Aroca R. (eds) Symbiotic endophytes, Soil biology,

Springer-Verlag, Berlin 37: 311–334.

Andrade-Linares DR, Grosch R, Franken P, Karl HR, Kost G, Restrepo S, de Garcia MC,

Maximova E. 2011. Colonization of roots of cultivated Solanum lycopersicum by dark

septate and other ascomycetous endophytes. Mycologia 103: 710–721.

Armengol J, Vicent A, Martínez-Culebras P, Bruton BD, García-Jiménez J. 2003.

Identification, occurrence and pathogenicity of Rhizopycnis vagum on muskmelon in Spain.

Plant Pathology 52: 68–73.

Arnold AE, Lutzoni F. 2007. Diversity and host range of foliar fungal endophytes: are

tropical leaves biodiversity hotspots? Ecology 88: 541–549.

Arnold AE, Maynard Z, Gilbert GS, Coley PD, Kursar TA. 2000. Are tropical fungal

endophytes hyperdiverse? Ecology Letters 3: 267–274.

Bacon CW, Porter JK, Robbins JD, Luttrell ES. 1977. Epichloë typhina from toxic tall

fescue grasses. Applied and Environmental Microbiology 34: 76–81.

Bacon CW, White JF. 2000. Microbial Endophytes. Marcel Dekker, Inc., New York.

Bagi I. 2004. Selyemkóró. In: In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai inváziók

Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó 319–

336.

Barrow JR, Aaltonen RE. 2001. Evaluation of the internal colonization of Atriplex

canescens (Pursh) Nutt. roots by dark septate fungi and the influence of host physiological

activity. Mycorrhiza 11: 199–205.

Baschien C, Manz W, Neu TR, Marvanová L, Szewzyk U. 2008. In Situ detection of

freshwater fungi in an alpine stream by new taxon-specific fluorescence in situ

hybridization probes. Applied and Environmental Microbiology 74: 6427–6436.

88

Behie SW, Zelisko PM, Bidochka MJ. 2012. Endophytic insect–parasitic fungi translocate

nitrogen directly from insects to plants. Science 336: 1576–1577.

Bell AA, Wheeler MH. 1986. Biosynthesis and functions of fungal melanins. Annual

Reviews of Phytopathology 24: 411–451.

Belnap J, Phillips S L, Sherrod S, Moldenke A. 2005. Soil biota can change after exotic

plant invasion: does this affect ecosystem processes? Ecology 86: 3007–3017.

Bergero R, Harrier LA, Franken P. 2003. Reporter genes: applications to the study of

arbuscular mycorrhizal (AM) fungi and their symbiotic interactions with plant roots. Plant

and Soil 255: 143–155.

Bornet B, Antoine E, Françoise S, Marcaillou-Le Baut C. 2005. Development of sequence

characterized amplified region markers from inter simple sequence repeat fingerprints for

the molecular detection of toxic phytoplankton Alexandrium catenella (Dinophyceae) and

Pseudo-nitzschia delicatissima (Bacillariophyceae) from French coastal waters. Journal of

Phycology 41: 704–711.

Bornet B, Branchard M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (issr) markers:

reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology

Reporter 19: 209–215.

Bradner JR, Sidhu RK, Yee B, Skotnicki ML, Selkirk PM, Nevalainen KMH. 2000. A new

microfungal isolate, Embellisia sp., associated with the Antarctic moss Bryum argenteum.

Polar Biology. 23: 730–732.

Browne AGP, Fisher MC, Henk DA. 2013. Species-specific PCR to describe local-scale

distribution of four cryptic species in the Penicillium chrysogenum complex. Fungal

Ecology 6: 419–429.

Brundrett MC. 2002. Co-evolution of roots and mycorrhizas of land plants. New

Phytologist 154: 275–304

Brundrett MC. 2009. Mycorrhizal associations and other means of nutrition of vascular

plants: understanding the global diversity of host plants by resolving conflicting

information and developing reliable means of diagnosis. Plant and Soil 320: 37–77.

Caldwell BA, Jumpponen A, Trappe JM. 2000. Utilization of major detrital substrates by

dark-septate root endophytes. Mycologia 92: 230–232.

Callaway RM, Thelen GC, Rodriguez A, Holben WE. 2004. Soil biota and exotic plant

invasion. Nature 427: 731–733.

Camara MPS, Palm ME, Berkum P van, Stewart EL. 2001. Systematics of

Paraphaeosphaeria: a molecular and morphological approach. Mycological Research 105:

41–56.

Cameron SL. 1998. Colonization of Populus tremuloides seedlings by the fungus

phialocephala fortinii in the presence of the ectomycorrhizal fungus Thelephora terrestris.

Aspen Bibliography 1315.

89

Carbone I, Kohn LM. 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in

filamentous ascomycetes. Mycologia 91: 553–556.

Carlson AL, Justo A, Hibbett DS. 2015. Species delimitation in Trametes: a comparison of

ITS, RPB1, RPB2 and TEF1 gene phylogenies. Mycologia (in press).

Cázares E, Trappe JM, Jumpponen A. 2005. Mycorrhiza-plant colonization patterns on a

subalpine glacier forefront as a model system of primary succession. Mycorrhiza 15: 405–

416.

Cheplick GP, Faeth SH. 2009. Ecology and Evolution of the Grass Endophyte Symbiosis.

New York, Oxford.

Clay K, Schardl C. 2002. Evolutionary origins and ecological consequences of endophyte

symbiosis with grasses. The American Naturalist 160: 99–127.

Crous PW, Groenewald JZ, Risede J-M, Hywel-Jones NL. 2004. Calonectria species and

their Cylindrocladium anamorphs: species with sphaeropedunculate vesicles. Studies in

Mycology 50: 415–429.

Crous PW, Verkley GJM, Groenewald JZ, Samson RA (eds). 2009. Fungal Biodiversity.

CBS Laboratory Manual Series, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The

Netherlands 1: 1–269.

Currah RS, Tsuneda A, Murakami S. 1993. Morphology and ecology of Phialocephala

fortinii in roots of Rhododendron brachycarpum. Canadian Journal of Botany 71: 1071–

1078.

Czymmek KJ, Bourett TM, Howard RJ. 2005. Fluorescent protein probes in fungi. In:

Savidge T, Pothoulakis C. (eds) Methods in Microbiology. Microbial Imaging Elsevier:

Amsterdam 34: 27–62.

Daims H, Stoecker K, Wagner M. 2005. Fluorescence in situ hybridization for the detection

of prokaryotes. In: Osborn AM, Smith CJ. (eds) Molecular Microbial Ecology Taylor &

Francis Group, New York 213–239.

Day MJ, Hall JC, Currah RS. 2012. Phialide arrangement and character evolution in the

helotialean anamorph genera Cadophora and Phialocephala. Mycologia 104: 371–381.

Desiro A, Naumann M, Epis S, Novero M, Bandi C, Genre A, Bonfante P. 2013.

Mollicutes-related endobacteria thrive insideliverwort-associated arbuscular mycorrhizal

fungi. Environmental Microbiology 73: 132–144.

Diagne N, Escoute J, Lartaud M, Verdeil JL, Franche C, Kane A, Bogusz D, Diouf D,

Duponnois R, Svistoonoff S. 2011. Uvitex2B: a rapid and efficient stain for detection of

arbuscular mycorrhizal fungi within plant roots. Mycorrhiza 21: 315–321.

Dickson S, Kolesik P. 1999. Visualisation of mycorrhizal fungal structures and

quantification of their surface area and volume using laser scanning confocal microscopy.

Mycorrhiza 9: 205–213.

90

Diene O, Wang W, Narisawa K. 2013. Pseudosigmoidea ibarakiensis sp. nov., a dark

septate endophytic fungus from a cedar forest in Ibaraki, Japan. Microbes and

Environments 28: 381–387.

Dreyer B, Morte A, Pérez-Gilabert M, Honrubia M. 2006. Autofluorescence detection of

arbuscular mycorrhizal fungal structures in palm roots: an underestimated experimental

method. Mycological Research 110: 887–897.

Faeth SH, Fagan WF. 2002. Fungal endophytes: common host plant symbionts but

uncommon mutualists. Integrative and Comparative Biology 42: 360–68.

Farr DF, Miller ME, Bruton BD. 1998. Rhizopycnis vagum gen. et sp. nov., a new

coelomycetous fungus from roots of melons and sugarcane. Mycologia 90: 290–296.

Fekete G, Molnár Z, Kun A, Botta-Dukát Z. 2002. On the structure of the Hungarian forest

steppe: grasslands on sand. Acta Zoologica Academica Scientia Hungarica 48: 137–150.

Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.

Evolution 39: 783–791.

Fernando AA, Currah RS. 1996. A comparative study of the effects of the root endophytes

Leptodontidium orchidicola and Phialocephala fortinii (Fungi Imperfecti) on the growth of

some subalpine plants in culture. Canadian Journal of Botany 74: 1071–1078.

Filatov DA. 2002. ProSeq: a software for preparation and evolutionary analysis of DNA

sequence data sets. Molecular Ecology Notes 2: 621–624.

Fitzpatrick DA, Logue ME, Stajich JE, Butler G. 2006. A fungal phylogeny based on 42

complete genomes derived from supertree and combined gene analysis. BMC Evolutionary

Biology 6: 99.

Fracchia S, Krapovickas L, Aranda-Rickert A, Valentinuzzi VS. 2011. Dispersal of

arbuscular mycorrhizal fungi and dark septate endophytes by Ctenomys cf. knighti

(Rodentia) in the northern Monte Desert of Argentina. Journal of Arid Environments 75:

1016–1023.

Galagan JE, Henn MR, Ma L-J, Cuomo CA, Birren B. 2005. Genomics of the fungal

kingdom: Insights into eukaryotic biology. Genome Research 15: 1620–1631.

Garbary DJ, Macdonald KA. 1995. The Ascophyllum polysiphonia Mycosphaerlla

symbiosis. 4. Mutualism in the Ascophyllum mycosphaerella interaction. Botanica Marina

38: 221–225.

Gardes M, Bruns TD. 1993. ITS primers with enhanced specifity for Basidiomycetes –

application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecolology 2: 113–118.

Geiser DM, Klich M, Frisvad J, Peterson S, Varga J, Samson R. 2007.The current status of

species recognition and identification in Aspergillus. Studies in Mycology 59: 1–10.

Girlanda M, Ghignone S, Luppi AM. 2002. Diversity of sterile root-associated fungi of two

mediterranean plants. New Phytologist 155: 481–498.

91

Glass NL, Donaldson G. 1995. Development of primer sets designed for use with PCR to

amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Applied and Environmental

Microbiology 61: 1323–1330.

Gomes RR, Glienke C, Videira SIR, Lombard L, Groenewald JZ, Crous PW. 2013.

Diaporthe: a genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia 31: 1–

41.

Green LE, Porras-Alfaro A, Sinsabaugh RL. 2008. Translocation of nitrogen and carbon

integrates biotic crust and grass production in desert grassland. Journal of Ecology 96:

1076–1085.

Groenewald JZ, Nakashima C, Nishikawa J, Shin H-D, Park J-H, Jama AN, Groenewald

M, Braun U, Crous PW. 2013. Species concepts in Cercospora: spotting the weeds among

the roses. Studies in Mycology 75: 115–170.

Grünig CR, Queloz V, Duò A, Sieber TN. 2009. Phylogeny of Phaeomollisia piceae gen.

sp. nov.: a dark, septate, conifer-needle endophyte and its relationships to Phialocephala

and Acephala. Mycological Research 113: 207–221.

Grünig CR, Queloz V, Sieber TN, Holdenrieder O. 2008. Dark septate endophytes (DSE)

of the Phialocephala fortinii s.l. – Acephala applanata species complex in tree roots:

classification, population biology, and ecology. Canadian Journal of Botany 86: 1355–

1369.

Grünig CR, Sieber TN, Holdenrieder O. 2001. Characterisation of dark septate endophytic

fungi (DSE) using inter-simple-sequence-repeat-anchored polymerase chain reaction

(ISSR-PCR) amplification. Mycological Research 105: 24–32.

Grünig CR, Sieber TN, Rogers SO, Holdenrieder O. 2002. Spatial distribution of dark

septate endophytes in a confined forest plot. Mycological Research 106: 832–840.

Gutiérrez A, Morte A, Honrubia M. 2003. Morphological characterization of the

mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and

Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza 13: 299–307.

Harrington TC, McNew D. 2003. Phylogenetic analysis places the Phialophora-like

anamorph genus Cadophora in the Helotiales. Mycotaxon 87: 141–151.

Haselwandter K, Read DJ. 1982. The significance of root-fungus association in two Carex

species of high-alpine plant communities. Oecologia 53: 352–354.

Hawkes CV, Belnap J, D’Antonio C, Firestone MK. 2006. Arbuscular mycorrhizal

assemblages in native plant roots change in the presence of invasive exotic grasses. Plant

and Soil 281: 369–380.

Hawkes CV, Wren IF, Herman DJ, Firestone MK. 2005. Plant invasion alters nitrogen

cycling by modifying the soil nitrifying community. Ecology Letters 8: 976–985.

Herrera J, Khidir HH, Eudy DM, Porras-Alfaro A, Natvig DO, Sinsabaugh RL. 2010.

Shifting fungal endophyte communities colonize Bouteloua gracilis: effect of host tissue

and geographical distribution. Mycologia 102: 1012–1026.

92

Herrera J, Ravin Poudel, Khidir HH. 2011a. Molecular characterization of coprophilous

fungal communities reveals sequences related to root-associated fungal endophytes

Microbial Ecology 61: 239–244.

Herrera J, Poudel R, Nebel KA, Collins SL. 2011b. Precipitation increases the abundance

of some groups of root-associated fungal endophytes in a semiarid grassland. Ecosphere

2:art50.

Hibbett DS, Ohman A, Kirk PM. 2009. Fungal ecology catches fire. New Phytologist 184:

279–282.

Hirsch G, Braun U. 1992. Communities of parasitic microfungi. In: Winterhoff W. (eds)

Handbook of Vegetation Science, Fungi in Vegetation Science. Dordrecht, The

Netherlands: Kluwer Academic Publishers 19: 225–250.

Hoch HC, Galvani CD, Szarowski DH, Turner JN. 2005. Two new fluorescent dyes

applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia 97: 580–588.

Hood ME, Shew HD. 1996. Applications of KOH-aniline blue fluorescence in the study of

plant-fungal interactions. Phytopathology 86: 704–708.

Hoog GS de, Gerrits van den Ende AHG. 1998. Molecular diagnostics of clinical strains of

filamentous Basidiomycetes. Mycoses 41: 183–189.

Huelsenbeck JP, Ronquist F. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees.

Bioinformatics 17: 754–755.

Hückelhoven R. 2007. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and

susceptibility. Annual Reviews of Phytopathology 45: 101–127.

Hyde KD, Soytong K. 2008. The fungal endophyte dilemma. Fungal Diversity 33: 163–

173.

Jones MD, Forn I, Gadelha C, Egan MJ, Bass D, Massana R, Richards TA. 2011.

Discovery of novel intermediate forms redefines the fungal tree of life. Nature 474: 200–

203.

Jumpponen A, Trappe JM. 1998a. Dark septate endophytes: a review of facultative

biotrophic root-colonizing fungi. New Phytologist 140: 295–310.

Jumpponen A, Trappe JM. 1998b. Performance of Pinus contorta inoculated with two

strains of root endophytic fungus, Phialocephala fortinii: effects of synthesis system and

glucose concentration. Canadian Journal of Botany 76: 1205–1213.

Jumpponen, A. 2001. Dark septate endophytes – are they mycorrhizal? Mycorrhiza. 11:

207–211.

Junker C, Draeger S, Schulz B. 2012. A fine line – endophytes or pathogens in Arabidopsis

thaliana. Fungal Ecology 5: 657–662.

Kageyama SA, Mandyam KG, Jumpponen A. 2008. Diversity, function and potential

applications of root-associated endophytes, In: Mycorrhiza: state of the art genetics and

93

molecular biology, eco-function, biotechnology, eco-physiology, structure and

systematics. Springer, Berlin and Heidelberg, Germany 29–57.

Katoh K, Toh H. 2008. Improved accuracy of multiple ncRNA alignment by incorporating

structural information into a MAFFT-based framework. BMC Bioinformatics 9: 212.

Khidir HH, Eudy DM, Porras-Alfaro A, Herrera J, Natvig DO, Sinsabaugh RL. 2010. A

general suite of fungal endophytes dominate the roots of two dominant grasses in a

semiarid grassland. Journal of Arid Environments 74: 35–42.

Kiss L. 2012. Limits of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) sequences

as species barcodes for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109:

E1811.

Klymiuk AA, Taylor TN, Taylor EL. 2013. Paleomycology of the Princeton Chert II. Dark-

septate fungi in the aquatic angiosperm Eorhiza arnoldii indicate a diverse assemblage of

root-colonizing fungi during the Eocene. Mycologia 105: 1100–1109.

Kovács GM. 2008. Magyarországi növények mikorrhizáltsági vizsgálatainak

összefoglalása. Mit mondhatnak ezek az adatok? Kitaibelia 8: 62–73.

Kovács GM, Bagi I. 2001. Mycorrhizal status of a mixed deciduous forest from the Great

Hungarian Plain with special emphasis on the potential mycorrhizal partners of Terfezia

terfezioides (Matt.) Trappe. Phyton 41: 161–168.

Kovács GM, Szigetvári C. 2002. Mycorrhizae and other root-associated fungal structures of

the plants of a sandy grassland on the Great Hungarian Plain. Phyton 42: 211–223.

Kovács GM, Kottke I, Oberwinkler F. 2003. Light and electron microscopic study on the

mycorrhizae of sporophytes of Botrychium virginianum – arbuscular structures resembling

fossil forms. Plant Biology 5: 574–580.

Kovács GM, Jankovics T, Kiss L. 2011. Variation in the nrDNA ITS sequences of some

powdery mildew species: Do routine molecular identification procedures hide valuable

information? European Journal of Plant Pathology 131: 135–141.

Kovács-Láng E, Kröel-Dulay GY, Kertész M, Fekete G, Mika J, Dobi-Wantuch I, Rédei T,

Rajkai K, Hahn I, Bartha S. 2000. Changes in the composition of sand grasslands along a

climatic gradient in Hungary and implications for climate change. Phytocoenologia 30:

385–407.

Krings M, Taylor TN, Hass H, Kerp H, Dotzler N, Hermsen EJ. 2007. Fungal endophytes

in a 400-million-yr-old land plant: infection pathways, spatial distribution, and host

responses. New Phytologist 174: 648–57.

Lahrmann U, Ding Y, Banhara A, Rath M, Hajirezaei MR, Döhlemann S, von Wirén N,

Parniske M, Zuccaro A. 2013 Host-related metabolic cues affect colonization strategies of a

root endophyte. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 110: 13965–13970.

Lim S, Notley-McRobb L, Lim M, Carter DA. 2004. A comparison of the nature and

abundance of microsatellites in 14 fungal genomes. Fungal Genetics and Biology 41:

1025–1036.

94

Lorang JM, Tuori RP, Martinez JP, Sawyer TL, Redman RS, Rollins JA, Wolpert TJ,

Johnson KB, Rodriguez RJ, Dickman MB, Ciuffetti LM . 2001. Green fluorescent protein

is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology 67: 1987–1994.

Lundberg DS, Lebeis SL, Paredes SH, Yourstone S, Gehring J, Malfatti S, Tremblay J,

Engelbrektson A, Kunin V, del Rio TG, Edgar RC, Eickhorst T, Ley RE, Hugenholtz P,

Tringe SG, Dangl JL. 2012. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.

Nature 488: 86–90.

Macia-Vicente JG, Jansson HB, Talbot NJ, Lopez-Llorca LV. 2009. Real-time PCR

quantification and live-cell imaging of endophytic colonization of barley (Hordeum

vulgare) roots by Fusarium equiseti and Pochonia chlamydosporia. New Phytologist 182:

213–228

Mandyam K, Fox C, Jumpponen A. 2012. Septate endophyte colonization and host

responses of grasses and forbs native to a tall grass prairie. Mycorrhiza 22: 109–119.

Mandyam K, Jumpponen A. 2005. Seeking the elusive function of root-colonising dark

septate endophytic fungi. Studies in Mycology 53: 173–189.

Mandyam K, Jumpponen A. 2008. Seasonal and temporal dynamics os arbuscular

mycorrhizal and dark septate endophytic fungi in a tallgrass prairie ecosystem are

minimally affected by nitrogen enrichment. Mycorrhiza 18: 145–155.

Mandyam K, Loughin T, Jumpponen A. 2010. Isolation and morphological and metabolic

characterization of common endophytes in annually burned tallgrass prairie. Mycologia

102: 813–821.

Marx DH. 1969. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine

roots to pathogenic infection. I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic

infection fungi and soil bacteria. Phytopathology 59: 153–163.

Mayerhofer MS, Kernaghan G, Harper KA. 2013. The effects of fungal root endophytes on

plant growth: a meta-analysis. Mycorrhiza 23: 119–128.

McLellan CA, Turbyville TJ, Wijeratne EMK, Kerschen A, Vierling E, Queitsch C,

Whitesell L, Gunatilaka LAA. 2007. A rhizosphere fungus enhances Arabidopsis

thermotolerance through production of an HSP90 inhibitor1. Plant Physiology 145: 174–

182.

Moora M, Berger S, Davison J, Öpik M, Bommarco R, Bruelheide H, Kühn I, Kunin WE,

Metsis M, Rortais A, Vanatoa A, Vanatoa E, Stout JC, Truusa M, Westphal C, Zobel M,

Walther GR. 2011. Alien plants associate with widespread generalist arbuscular

mycorrhizal fungal taxa: evidence from a continental-scale study using massively parallel

454-sequencing. Journal of Biogeography 38: 1305–1317.

Mucciarelli M, Scannerini S, Bertea C, Maffei M. 2003. In vitro and in vivo peppermint

(Mentha piperita) growth promotion by nonmycorrhizal fungal colonization. New

Phytologist 158: 579–591.

Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 155: 473–497.

95

Münzenberger B, Bubner B, Wöllecke J, Sieber TN, Bauer R, Fladung M, Hüttl RF. 2009.

The ectomycorrhizal morphotype Pinirhiza sclerotia is formed by Acephala

macrosclerotiorum sp. nov., a close relative of Phialocephala fortinii. Mycorrhiza 19:

4813–492.

Nagy LG, Kocsubé S, Csana Z, Kovács GM, Petkovits T, Vágvölgyi C, Papp T. 2012. Re-

mind the gap! Insertion–deletion data reveal neglected phylogenetic potential of the nuclear

ribosomal internal transcribed spacer (ITS) of fungi. PLoS ONE 7: e49794.

Nagy LG, Ohm RA, Kovács GM et al. 2014. Latent homology and convergent regulatory

evolution underlies the repeated emergence of yeasts. Nature Communications 5: 4471.

Narisawa K, Chen M, Hashiba T, Tsuneda A. 2003. Ultrastructural study on interaction

between a sterile, white endophytic fungus and eggplant roots. Journal of General Plant

Pathology 69: 292–296.

Narisawa K, Kawamata H, Currah RS, Hashiba T. 2002. Suppression of Verticillium wilt in

eggplant by some fungal root endophytes. European Journal of Plant Pathology 108: 103–

109.

Nei M, Li W. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of

restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 76:

5269–5273.

Newsham KK. 2011. A meta-analysis of plant responses to dark septate root endophytes.

New Phytologist 190: 783–793.

Nilsson RH, Kristiansson E, Ryberg M, Hallenberg N, Larsson KH. 2008. Intraspecific ITS

variability in the Kingdom Fungi as expressed in the international sequence databases and

its implications for molecular species identification. Evolutionary Bioinformatics Online 4:

193–201.

Nylander JA, Wilgenbusch JC, Warren DL, Swofford DL. 2008. AWTY (are we there

yet?): A system for graphical exploration of MCMC convergence in Bayesian phylogenetic

inference. Bioinformatics 24: 581–583.

O’Dell TE, Massicotte HB, Trappe JM. 1993. Root colonization of Lupinus latifolius

Agardh. and Pinus contorta Dougl. by Phialocephala fortinii Wang & Wilcox. New

Phytologist 124: 93–100.

Ohki T, Masuya H, Yonezawa M, Usuki F, Narisawa K, Hashiba T. 2002. Colonization

process of the root endophytic fungus Heteroconium chaetospira in roots of Chinese

cabbage. Mycoscience 43: 191–194.

Oldroyd GED. 2013. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial

symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology 11: 252–263.

Olsson PA, Eriksen BE, Dahlberg A. 2004. Colonization by arbuscular mycorrhizal and

fine endophytic fungi in herbaceous vegetation in the Canadian High Arctic. Canadian

Journal of Botany 82: 1547–1556.

96

Otero JT, Ackerman JD, Bayman P. 2004. Differences in mycorrhizal preferences between

two tropical orchids. Molecular Ecology 13: 2393–2404.

Paparu P, Dubois T, Gold C, Niere B, Adipala E, Coyne D. 2006. Colonisation pattern of

nonpathogenic Fusarium oxysporum, a potential biological control agent, in roots and

rhizomes of tissue cultured Musa plantlets. Annals of Applied Biology 149: 1–8.

Parniske M. 2008. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature

Reviews Microbiology 6: 763–775.

Peterson RL, Wagg C, Pautler M. 2008. Associations between microfungal endophytes and

roots: do structural features indicate function? Botany 86: 445–456.

Petrini O. 1991. Fungal endophytes of tree leaves. In: Andrews JH. & Hirano SS. (eds)

Microbial Ecology of Leaves. Springer-Verlag, New York 179–197.

Phan HT, Burgess LW, Summerell BA, Bullock S, Liew ECY, et al. 2004. Gibberella

gaditjirrii (Fusarium gaditjirrii) sp. nov., a new species from tropical grasses in Australia.

Studies in Mycology 50: 261–272.

Pintye A, Kovács GM. 2006. Isolation and characterisation of root colonizing endophytic

fungi from a semi-arid grassland of the Great Hungarian Plain. Annual Meeting of the

Hungarian Society for Microbiology, Abstracts, Acta Microbiologica et Immunologica

Hungarica 53: 333.

Popper ZA, Fry SC. 2003 Primary cell wall composition of bryophytes and charophytes.

Annals of Botany 91: 1–12.

Porras-Alfaro A, Bayman P. 2011. Hidden fungi, emergent properties: Endophytes and

microbiomes. Annual Review of Phytopathology 49: 291–315.

Porras-Alfaro A, Herrera J, Natvig DO, Lipinski K, Sinsabaugh RL. 2011. Diversity and

distribution patterns of soil fungal communities in a semiarid grassland. Mycologia 103:

10–21.

Porras-Alfaro A, Herrera J, Sinsabaugh RL, Odenbach KJ, Lowrey T, Natvig DO. 2008.

Novel root fungal consortium associated with a dominant desert grass. Applied and

Environmental Microbiology 74: 1308–1315.

Posada D. 2008. jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and

Evolution 25: 1253–1256.

Postma JWM, Olsson PA, Falkengren-Grerup U. 2007. Root colonization by arbuscular

mycorrhizal, fine endophytic and dark septate fungi across a pH gradient in acid beech

forests. Soil Biology and Biochemistry 39: 400–408.

Poulin R, Krasnov BR, Mouillot D. 2011. Host specificity in phylogenetic and geographic

space. Trends in Parasitology 27: 355–361.

Pringle A, Bever JD, Gardes M, Parrent JL, Rillig MC, Klironomos JN. 2009. Mycorrhizal

symbioses and plant invasions. Annual Reviews of Ecology Evolution and Systematics 40:

699–715.

97

Prodi A, Sandalo S, Tonti S, Nipoti P, Pisi A. 2008. Phialophora-like fungi associated with

kiwifruit elephantiasis. Journal of Plant Pathology 90: 487–494.

Promputtha I, Lumyong S, Dhanasekaran V, McKenzie EHC, Hyde KD, Jeewon RA. 2007

Phylogenetic evaluation of whether endophytes become saprotrophs at host senescence.

Microbial Ecology 53: 579–90.

Quaedvlieg W, Binder M, Groenewald JZ, Summerell BA, Carnegie AJ, Burgess TI, Crous

PW. 2014. Introducing the consolidated species concept to resolve species in the

Teratosphaeriaceae. Persoonia 33: 1–40.

Quaedvlieg W, Kema GHJ, Groenewald JZ, Verkley GJM, Seifbarghi S, et al. 2011.

Zymoseptoria gen. nov.: a new genus to accommodate Septoria-like species occurring on

graminicolous hosts. Persoonia 26: 57–69.

Queloz V, Sieber TN, Holdenrieder O, McDonald BA, Grünig CR. 2011. No

biogeographical pattern for a root-associated fungal species complex. Global Ecology and

Biogeography 20: 16–169.

Rath M, Grolig F, Haueisen J, Imhof S. 2014. Combining microtomy and confocal laser

scanningmicroscopy for structural analyses of plant–fungus associations. Mycorrhiza 24:

293–300.

Read DJ, Haselwandter K. 1981. Observations on the mycorrhizal status of some alpine

plant communities. New Phytologist 88: 341–352.

Reddy MP, Sarla N, Siddiq EA. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism

and its application in plant breeding. Euphytica 128: 9–17.

Redman R S, Sheehan KB, Stout RG, Rodriguez JR, Henson JM. 2002. Thermotolerance

generated by plant/fungal symbiosis. Science 298: 1581.

Redman RS, Dunigan DD, Rodriguez RJ. 2001. Fungal symbiosis from mutualism to

parasitism: who controls the outcome, host or invader? New Phytologist 151: 705–716.

Rehner SA, Samuels GJ. 1994. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from

nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Research 98: 625–634.

Reininger V, Grünig CR, Sieber TN. 2012. Host species and strain combination determine

growth reduction of spruce and birch seedlings colonized by rootassociated dark septate

endophytes. Environmental Microbiology 14: 1064–1076.

Remy W, Taylor TN, Hass H, Kerp H. 1994. Four hundred-million-year-old vesicular

arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: 11841–

11843.

Reynolds ES. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in

electron microscopy. Journal of Cell Biology 17: 208–212.

Rice AV, Currah RS. 2002. New perspectives on the niche and holomorph of the

myxotrichoid hyphomycete, Oidiodendron maius. Mycological Research 106: 1463–1467.

98

Richardson DM, Allsopp N, D'Antonio CM, Milton SJ, Rejmanek M. 2000. Plant invasions

– the role of mutualisms. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 75:

65–93.

Robinson CH. 2001. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytologist 151:

341–353.

Rodriguez R, White J, Arnold A, Redman R. 2009. Fungal endophytes: diversity and

functional roles. New Phytologist 182: 314–330.

Rodriguez RJ, Henson J, Van Volkenburgh E, Hoy M, Wright L, Beckwith F, Kim Y,

Redman RS. 2008. Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis. International

Society of Microbial Ecology 2: 404–416.

Ronquist F, Huelsenbeck JP. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under

mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574.

Rudgers J, Mattingly W, Koslow J. 2005. Mutualistic fungus promotes plant invasion into

diverse communities. Oecologia 144: 463–471.

Saikkonen K, Faeth SH, Helander M, Sullivan TJ. 1998. Fungal endophytes: A continuum

of interactions with host plants. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics 29:

319–343.

Sánchez Márquez S, Bills GF, Domínguez Acuna L, Zabalgogeazcoa I. 2010. Endophytic

mycobiota of leaves and roots of the grass Holcus lanatus. Fungal Diversity 41: 115–123.

Sánchez Márquez S, Bills GF, Zabalgogeazcoa I. 2008. Diversity and structure of the

fungal endophytic assemblages from two sympatric coastal grasses. Fungal Diversity 33:

87–100.

Schadt CW, Mullen RB, Schmidt SK. 2001. Isolation and phylogenetic identification of a

dark-septate fungus associated with the alpine plant Ranunculus adoneus. New Phytologist

150: 747–755.

Schardl CL, Leuchtmann A, Spiering MJ. 2004. Symbioses of grasses with seedborne

fungal endophytes. Annual Reviews of Plant Biology 55: 315–340.

Schoch CL, Crous PW, Groenewald JZ, Boehm EWA, Burgess TI et al. 2009. A class-wide

phylogenetic assessment of Dothideomycetes. Studies in Mycology 64: 1–15.

Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W and

Fungal Barcoding Consortium. 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)

region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy

of Sciences USA 109: 6241–6246.

Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic continuum. Mycological Research 109: 661–686.

Schulz B, Römmert AK, Dammann U, Aust HJ, Strack D. 1999. The endophyte-host

interaction: a balanced antagonism? Mycological Research 103: 1275–1283.

99

Séjalon-Delmas N, Magnier A, Douds DD, Bécard G. 1998. Cytoplasmic autofluorescence

of an arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora gigantea and nondestructive fungal

observations in planta. Mycologia 90: 921–926.

Sieber TN, Grünig CR. 2006. Biodiversity of fungal root-endophyte communities and

populations in particular of the dark septate endophyte Phialocephala fortinii. In: Schulz B,

Boyle C, Sieber TN. (eds) Microbial Root Endophytes. Springer, Berlin 107–132.

Sieber TN, Grünig CR. 2013. Fungal root endophytes. In: Wasel Y, Eshel A, Kafkafi U.

(eds) Plant roots: the hidden half, 3rd ed, Marcel Dekker, New York 38: 1–49.

Silvestro D, Michalak I. 2012. raxmlGUI: A graphical front-end for RAxML. Organisms

Diversity & Evolution 12: 335–337.

Smith SE, Read DJ. 2008. Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, Cambridge.

Spadaro D, Galliano A, Pellegrino C, Gilardi G, Garibaldi A, Gullino ML. 2010. Dry

matter and mineral composition, together with commercial storage practices, influence the

development of skin pitting caused by Cadophora luteo-olivacea on kiwifruit ‘Hayward’.

Journal of Plant Pathology 92: 339–346.

Spatafora JW, Sung G-H, Sung J-M, Hywel-Jones NL, White JFJ. 2007. Phylogenetic

evidence for an animal pathogen origin of ergot and the grass endophytes. Molecular

Ecology 16: 1701–1711.

Staden R, Beal KF, Bonfield JK. 2000. The Staden package, 1998. Methods in Molecular

Biology 132: 115–130.

Stone JK, Bacon CW, White JF. 2000. An overview of endophytic microbes: endophytism

defined. In: Bacon CW, White JF. (eds) Microbial endophytes. Dekker, New York 3–30.

Stoyke G, Currah RS. 1993. Resynthesis in pure culture of a common subalpine fungus-

root association using Phialocephala fortinii and Menziesia ferruginea (Ericaceae). Arctic

and Alpine Research 25: 189–193.

Su YY, Guo LD, Hyde KD. 2010. Response of endophytic fungi of Stipa grandis to

experimental plant function group removal in Inner Mongolia steppe, China. Fungal

Diversity 43: 93–101.

Su ZZ, Mao LJ, Li N, Feng XX, Yuan ZL, Wang LW, Lin FC, Zhang CL. 2013. Evidence

for biotrophic lifestyle and biocontrol potential of dark septate endophyte Harpophora

oryzae to rice blast disease. PLoS ONE 8. e61332.

Suetrong S, Schoch CL, Spatafora JW, Kohlmeyer J, Volkmann- Kohlmeyer B, et al. 2009.

Molecular systematics of the marine Dothideomycetes. Studies in Mycology 64: 155–173.

Szigetvári C, Benkő Z. 2004. Parlagfű. In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai

inváziók Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó

337–370.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, and Kumar S. 2011. MEGA5:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary

100

distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731–

2739.

Tejesvi MV, Mahesh B, Nalini MS, Prakash HS, Kini KR, Subbiah V, Shetty HS. 2005.

Endophytic fungal assemblages from inner bark and twig of Terminalia arjunia W. & A.

(Combretaceae). World Journal of Microbiology and Biotechnology 21: 1535–1540.

Tellenbach C, Grünig CR, Sieber TN. 2011. Negative effects on survival and performance

of Norway spruce seedlings colonized by dark septate root endophytes are primarily

isolate-dependent. Environmental Microbiology 13: 2508–2517.

Trappe JM. 1996. What is a mycorrhiza? In: Azcon-Aguilar C, Barrea J-M. (eds)

Mycorrhiza in integrated systems–from genes to plant development. Proceedings of the 4th

European Symposium on Mycorrhizae, EC Report EUR 16728, Luxembourg 3–6.

Treu R, Laursen GA, Stephenson SL, Landolt JC, Densmore R. 1996. Mycorrhizae from

Denali National Park and Preserve, Alaska. Mycorrhiza 6: 21–29.

Trouvelot S, van Tuinen D, Hijri M, Gianinazzi-Perason V. 1999. Visualization of

ribosomal DNA loci in spore interphasic nuclei of glomalean fungi by fluorescence in situ

hybridization. Mycorrhiza 8: 203–206.

Tsuneda A, Wang W, Tsuneda I, Currah RS. 2009. Endomembrane system of aspen root

cells plays a key role in defense against a common fungal root endophyte, Cryptosporiopsis

radicicola. Mycologia 101: 182–189.

Udvardy L. 2004. Bálványfa. In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai inváziók

Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó 143–

160.

Uma GE, Muthukumar T, Sathiyadash K, Muniappan V. 2010. Mycorrhizal and dark

septate fungal associations in gingers and spiral gingers. Botany 88: 500–511.

Upson R, Read DJ, Newsham KK. 2009. Nitrogen form influences the response of

Deschampsia antarctica to dark septate root endophytes. Mycorrhiza 20: 1–11.

Usuki F, Narisawa K. 2007. A mutualistic symbiosis between a dark septate endophytic

fungus, Heteroconium chaetospira, and a nonmycorrhizal plant, Chinese cabbage.

Mycologia 99: 175–84.

van de Peer Y, de Wachter Y. 1994. TREECON for Windows: a software package for the

construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment.

Computer Applications in the Biosciences 10: 569–70.

Vandenkoornhuyse P, Baldauf SL, Leyval C, Straczec J, Young JPW. 2002. Extensive

fungal diversity in plant roots. Science 295: 2051

Várallyai Gy. 1993. Soils in the region between the rivers Danube and Tisza (Hungary). In:

Szujkó-Lacza J, Kováts D. (eds) The Flora of the Kiskunság National Park. Magyar

Természettudományi Múzeum, Budapest 21–42.

101

Verkley GJM, Dukik K, Renfurm R, Göker M, Stielow JB. 2014. Novel genera and species

of Coniothyrium-like fungi in Montagnulaceae (Ascomycota). Persoonia 32: 25–51.

Verma S, Varma A, Rexer K-H, Hassel A, Kost G, Sarabhoy A, Bisen P, Bütehorn B,

Franken P. 1998. Piriformospora indica, gen. et sp. nov., a new root-colonizing fungus.

Mycologia 90: 896–903.

Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. 2005. An overview of methods for the detection

and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum 125: 393–

404.

Vilgalys R, Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically

amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology 172:

4238–4246.

Voigt K, Wöstemeyer J. 2000. Reliable amplification of actin genes facilitates deep-level

phylogeny. Microbiological Research 155: 179–195.

Wagner M, Haider S. 2012. New trends in fluorescence in situ hybridization for

identification and functional analyses of microbes. Current Opinion in Biotechnology 23:

96–102.

Waller F, Achatz B, Baltruschat H, Fodor J, Becker K, Fischer M et al. 2005. The

endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to salt-stress tolerance, disease

resistance, and higher yield. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 102:

13386–13391.

Walsh E, Luo J, Zhang N. 2014. Acidomelania panicicola gen. et. sp. nov. from

switchgrass roots in acidic New Jersey Pine Barrens. Mycologia 106: 856–864.

Wang CJK, Wilcox HE. 1985. New species of ectendomycorrhizal and pseudomycorrhizal

fungi: Phialophora finlandia, Chloridium paucisporum, and Phialocephala fortinii.

Mycologia 77: 951–958.

Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G. (eds) 2005. DNA Fingerprinting in Plants.

Principles, Methods, and Applications, 2nd ed, CRC Press, Taylor & Francis Group, USA.

Westphal A, Xing L, Goodwin SB. 2011 Mature watermelon vine decline: Suppression

with fumigants of a soil-borne problem and association with Rhizopycnis vagum. Crop

Protection 30: 111–117.

White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor JW. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ.

(eds) PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., New York

315–322.

Wilcox HE, Wang CJK. 1987. Mycorrhizal and pathological associations of dematiaceous

fungi in roots of 7-month-old tree seedlings. Canadian Journal of Forest Research 17:

884–889.

Wilson D. 1995. Endophyte: the evolution of a term, and clarification of its use and

definition. Oikos 73: 274–76.

102

Xu L, Zhou L, Zhao J, Li J, Li X, Wang J. 2008. Fungal endophytes from Dioscorea

zingiberensis rhizomes and their antibacterial activity. Letters in Applied Microbiology 46:

68–72.

Yonezawa M, Takahashi J, Hashiba T, Usuki F. Narisawa K. 2004. Anatomical study on

the interaction between the root endophytic fungus Heteroconium chaetospira and Chinese

cabbage. Mycoscience 45: 367–371.

Young ND, Healy J. 2003. GapCoder automates the use of indel characters in phylogenetic

analysis. BMC Bioinformatics 4: 6.

Yu T, Nassuth A, Peterson RL. 2001. Characterization of the interaction between the dark

septate fungus Phialocephala fortini and Asparagus officinalis roots. Canadian Journal of

Microbiology 47: 741–753.

Zaffarano PL, Queloz V, Duò A, Grünig CR. 2011. Sex in the PAC: A hidden affair in dark

septate endophytes? BMC Evolutionary Biology 11: 282.

Zhang Y, Crous PW, Schoch CL, Hyde KD. 2012. Pleosporales. Fungal diversity 53: 1–

221.

Zhang Y, Schoch CL, Fournier J, Crous PW, De Gruyter J, Woudenberg JHC, Hirayama K,

Tanaka K, Pointing SB, Spatafora JW, Hyde KD 2009. Multi-locus phylogeny of

Pleosporales: a taxonomic, ecological and evolutionary re-evaluation. Studies in Mycology

64: 85–102.

Zhang YH, Zhuang WY. 2004. Phylogenetic relationships of some members in the genus

Hymenoscyphus (Ascomycetes, Helotiales). Nova Hedwigia 78: 475–484.

Zimmerman E, Peterson RL. 2007. Effect of a dark septate fungal endophyte on seed

germination and protocorm development in a terrestrial orchid. Symbiosis 43: 45–52.

Zuccaro A, Lahrmann U, Güldener U, Langen G, Pfiffi S. et al. 2011. Endophytic life

strategies decoded by genome and transcriptome analyses of the mutualistic root symbiont

Piriformospora indica. PLoS Pathogens 7: e1002290.

103

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Első sorban szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Kovács M.

Gábornak, munkámban nyújtott rengeteg segítségért, a tanácsokért, építő kritikákért,

odafigyelésért, végtelen türelméért, lelkiismeretes témavezetéséért, és akinek gondolatai,

támogatása és tanácsai nem csak a szakmai, hanem a mindennapi életben is nagy

segítségemre voltak.

Köszönöm Prof. Böddi Béla tanszékvezetőnek, hogy munkámat az ELTE

Növényszervezettani Tanszékén végezhettem, valamint a tanszék minden tagjának, hogy

kellemes körülmények között tudtam dolgozni.

Köszönetek szeretnék mondani Dr. Vági Pálnak a munkáim során – különösen a

különböző mikroszkópós vizsgálatokban – nyújtott rengeteg segítségért, valamint

köszönöm Dr. Bóka Károlynak és Gergely Csillának az elektronmikroszkópos munkákban

nyújtott segítséget, Dózsainé Kerekes Piroskának pedig a technikai segítséget.

Szeretnék köszönetet mondani a mikológia (men(s)aa) csoport minden jelenlegi és

volt tagjának – Balázs K Tímea, Lukács F Alena, Németh B Julianna, Dr. Pintye

Alexandra, Seress Diána, Gáspár K Bence, Németh Z. Márk, Zajta Erik – hogy egy ilyen

fantasztikus légkörben végezhettem és végezhetem munkámat.

Dr. Pintye Alexandrának külön köszönöm, hogy a bevezetett a DSE gombák

vizsgálatának technikai részleteibe, és Neki valamint Dr. Bereczki Zsoltnak az ISSR

vizsgálatban nyújtott segítségüket.

Köszönöm Prof. Pedro W. Crous-nak és Dr. Ewald Groenewald-nak segítségüket,

tanácsaikat és hogy a CBS Fungal Biodiversity Centerben végezhettem taxonómiai munkák

jelentős részét, valamint szeretnék köszönetet mondani a CBS Evolutionary

Phytopathology csoport minden tagjának, hogy minden szempontból fantasztikus

körülmények között dolgozhattam.

Köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy támogatták a pályámat, mellettem

álltak, segítettek és nem utolsó sorban nagyban segítették szakmai fejlődésemet.

A dolgozatban szereplő kutatásokat az OTKA K27727 és a K109102 támogatta. A

FEMS ösztöndíj támogatása nyújtott lehetőséget, hogy taxonómiai munkáim egy részét

Hollandiában a CBS Fungal Biodiversity Centerben végezhettem.

Köszönöm apukámnak, Knapp Gábornak, hogy megismertett a természettudományos

világgal és gondolkodásmóddal. Ezért az Ő tiszteletére és emlékére ajánlom ezt a

dolgozatot.

104

11. FÜGGELÉK

A DSE közösség csoportjainak azonosításához az ITS és LSU régiókat határoztuk

meg, és az amplifikálásához az F.1.a táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az

elegyet 20 µl végtérfogatban mértük össze és a reakciók profilja a következő volt: 3 m 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94

oC-on, denaturáció 30 s annealing 52

oC-on, 90

s extenzió 72 oC-on. A ciklusok után 10 m végső extenzió következett 72

oC-on.

A DSE-4, DSE-7 és DSE-8 csoportok taxonómiai vizsgálatához az ITS, LSU, SSU,

ACT, TUB, CAL és TEF régiókat határoztuk meg, és az amplifikálásához az F.1.b

táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az elegyet 12,5 µl végtérfogatban

mértük össze, és a reakciók profilja a következő volt: Az ITS és LSU valamint az SSU

régiók esetén; 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94

oC-on, 50 s

annealing 48 o

C-on, 2 m extenzió 72 o

C-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett

72 o

C-on; Az aktin és tubulin gének esetében 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30

s denaturáció 94 o

C-on, 50 s annealing 55 (ACT) illetve 22 o

C-on (TUB), 1 m extenzió 72

oC-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett 72

oC-on.

A CAL és TEF régiók esetében touch-down PCR-t végeztünk: 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután összesen 40 ciklus 30 s denaturáció 94

oC-on, 50 s annealing 65

oC-ról 60

oC-

ra csökkentve 16 ciklus alatt (CAL) illetve 58 o

C-ról 52 o

C-ra csökkentve 10 ciklus alatt

(TEF), 2 m extenzió 72 oC-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett 72

oC-on.

F.1 a táblázat. Az izolátumok meghatározásához használt PCR reakcióelegyek

Összetevők Összetevők mennyisége (µl)

ITS LSU

Target DNS 1,00 1,00

H2O 10,00 10,00 MgCl2 (Fermentas, 25 mM) 2,00 2,00 (NH4)2SO4 puffer (Fermentas) 2,00 2,00

dNTP (Fermentas, 2 mM) 2,00 2,00 F primer (Sigma, 10 µM) 1,00 1,00 R primer (Sigma, 10 µM) 1,00 1,00 LC Taq (Fermentas 1U/µl) 1,00 1,00

F.1 b táblázat. A taxonómiai vizsgálatokhoz használt PCR reakcióelegyek

Összetevők Összetevők mennyisége (µl)

TUB CAL TEF ACT ITS LSU SSU

target DNS 1,00 3,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

H2O 7,77 5,26 7,45 8,65 7,06 7,06 6,25 MgCl2 (BioLine, 25 mM) 0,75 1,26 1,00 0,50 1,26 1,26 1,00 Puffer (BioLine) 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 2,50

dNTP (Fermentas, 2 mM) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,70 0,70 0,50 F primer (10µM, Sigma, 10 µM) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 R primer (10µM, Sigma, 10 µM) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 BioTaq (BioLine, 5 U/µl) 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,05 DMSO (Sigma) 0,63 0,00 0,70 0,00 0,63 0,63 0,70

105

Az ISSR-PCR-ekhez az F.1.c táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az elegyet

10 µl végtérfogatban mértük össze, és a reakciók profilja a következő volt: 5 m denaturáció

94 oC-on, ezután 35 ciklus 40 s denaturáció 94

oC-on, 30 s annealing a primereknek

megfelelő hőmérsékleteken [42 o

C-on az (AAG)6, (AAC)6, (ATC)6 és (AG)9, 40 o

C-on az

(AC)8, 56 o

C-on az (AGG)6] illetve 84 o

C-on a (CCG)6], 60 s extenzió 72 o

C-on. A ciklusok

után 10 m végső extenzió következett 72 oC-on.

A kiválsztott DSE-1 és DSE-7 csoportokba tartozó izolátumok célzott gyűjtésekor a

diagnosztikai PCR-ekhez az F.1.d táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az

elegyet 10 µl végtérfogatban mértük össze és a reakciók profilja a következő volt: 5 m

denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94

oC-on, 30 s annealing 60

oC-on

(DSE-1) illetve 55 o

C-on (DSE-7), 40 s extenzió 72 o

C-on. A ciklusok után 5 m végső

extenzió következett 72 oC-on.

F.1 c táblázat. Az ISSR PCR-ekhez használt reakcióelegy

Összetevők Összetevők mennyisége (µl)

Target DNS 0,50

H2O 6,40

DreamTaq puffer (Fermentas) 1,00 dNTP (Fermentas, 2 mM) 1,00 primer (Sigma, 10 µM) 1,00 DreamTaq (Fermentas 5 U/µl) 0,10

F.1 d táblázat. A diagnosztikai PCR-ekhez használt reakcióelegy

Összetevők Összetevők mennyisége (µl)

Target DNS 0,50

H2O 6,40 DreamTaq puffer (Fermentas) 1,00 dNTP (Fermentas, 2 mM) 1,00 F primer (Sigma, 10 µM) 0,50 R primer (Sigma, 10 µM) 0,50 DreamTaq (Fermentas 5 U/µl) 0,10

106

ITS: internal transcribed spacer; LSU: 28S RNS nagy alegysége; SSU: 18S RNS kis alegysége; ACT: aktin; TUB: béta-tubulin; CAL:

kalmodulin; TEF: transzlációs elongációs faktor 1-alfa. CBS: CBS Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, Hollandia

F2. táblázat A taxonómiai munkákhoz használt 40 DSE izolátum adatai

CBS szám

törzs szám

gazdanövény REF szám

ITS LSU SSU ACT TUB CAL TEF

135627 dse-7 / 1 Bromus tectorum - KP183966 KP184005 KP184044 KP184093 KP184192 KP184122 KP184160

135628 dse-7 / 2 Festuca vaginata - KP183965 KP184035 KP184054 KP184083 KP184193 KP184123 KP184161

135629 dse-7 / 3 Festuca vaginata - KP183980 KP184006 KP184067 KP184106 KP184194 KP184144 KP184183

135630 dse-7 / 4 Stipa borysthenica - KP183987 KP184032 KP184058 KP184090 KP184195 KP184126 KP184162

135631 dse-7 / 5 Festuca vaginata - KP183968 KP184033 KP184051 KP184101 KP184196 KP184142 KP184180

135632 dse-7 / 6 Festuca vaginata - KP183969 KP184034 KP184052 KP184103 KP184197 KP184143 KP184181

135633 dse-7 / 7 Festuca vaginata REF123 KP183984 KP184031 KP184072 KP184110 KP184198 KP184149 KP184187

135634 dse-7 / 8 Festuca vaginata REF124 KP183985 KP184028 KP184073 KP184111 KP184199 KP184151 KP184188

135635 dse-7 / 9 Festuca vaginata REF125 KP183986 – – – – – –

135636 dse-7 / 10 Festuca vaginata REF127 KP183976 KP184008 KP184076 KP184114 KP184200 KP184152 –

135637 dse-7 / 11 Festuca vaginata REF128 KP183978 KP184023 KP184074 KP184112 KP184201 KP184153 KP184189

135638 dse-7 / 12 Festuca vaginata REF129 KP183981 KP184024 KP184069 KP184107 KP184202 KP184145 KP184184

135639 dse-7 / 13 Fumana procumbens REF130 KP183982 KP184027 KP184068 KP184108 KP184203 KP184146 KP184185

135640 dse-7 / 14 Festuca vaginata REF131 KP183979 KP184013 KP184071 KP184115 KP184204 KP184148 KP184191

135641 dse-7 / 15 Ailanthus altissima REF132 KP183970 KP184037 KP184055 KP184086 KP184205 KP184124 KP184163

135642 dse-7 / 16 Festuca vaginata REF133 KP183967 KP184026 KP184053 KP184097 KP184206 KP184141 KP184182

135643 dse-7 / 17 Stipa borysthenica REF135 KP183988 KP184022 KP184048 KP184091 KP184207 KP184139 KP184171

135644 dse-7 / 18 Festuca vaginata REF136 KP183989 KP184030 KP184059 KP184100 KP184208 KP184127 KP184179

135645 dse-7 / 19 Stipa borysthenica REF137 KP183990 KP184036 KP184060 KP184092 KP184209 KP184140 KP184172

135646 dse-7 / 20 Festuca vaginata REF138 KP183994 KP184015 KP184066 KP184084 KP184210 KP184128 KP184164

135647 dse-7 / 21 Festuca vaginata REF139 KP183997 KP184018 KP184061 KP184094 KP184211 KP184125 KP184175

135648 dse-7 / 22 Festuca vaginata - KP183993 KP184016 KP184062 KP184104 KP184212 KP184129 KP184165

135649 dse-7 / 23 Festuca vaginata - KP183991 KP184025 KP184063 KP184105 KP184213 KP184130 KP184170

135650 dse-7 / 24 Festuca vaginata - KP183998 KP184019 KP184049 KP184102 KP184214 KP184131 KP184166

135651 dse-7 / 25 Festuca vaginata - KP183996 KP184017 KP184064 KP184087 KP184215 KP184132 KP184167

135652 dse-7 / 26 Festuca vaginata - KP183992 KP184020 KP184050 KP184089 KP184216 KP184133 KP184168

135653 dse-7 / 27 Festuca vaginata - KP183995 KP184021 KP184065 KP184085 KP184217 KP184134 KP184169

135654 dse-7 / 28 Festuca vaginata - KP183972 KP184010 KP184045 KP184095 KP184218 KP184135 KP184176

135655 dse-7 / 29 Festuca vaginata - KP183975 KP184011 KP184046 KP184096 KP184219 – KP184177

135656 dse-7 / 30 Festuca vaginata - KP183971 KP184007 KP184047 KP184088 KP184220 KP184136 KP184178

135657 dse-7 / 31 Festuca vaginata - KP183977 KP184009 KP184075 KP184113 KP184221 KP184150 KP184190

135658 dse-7 / 32 Stipa borysthenica - KP183983 KP184029 KP184070 KP184109 KP184222 KP184147 KP184186

135659 dse-7 / 33 Stipa borysthenica - KP183973 KP184012 KP184056 KP184098 KP184223 KP184137 KP184173

135660 dse-7 / 34 Stipa borysthenica - KP183974 KP184014 KP184057 KP184099 KP184224 KP184138 KP184174

135661 dse-4 / 099 Populus alba REF099 KP184002 KP184041 KP184077 KP184119 – KP184154 –

135760 dse-4 / 100 Populus alba REF100 KP184004 KP184042 KP184078 KP184120 – KP184155 –

135662 dse-4 / 101 Populus alba REF101 KP184003 KP184043 KP184079 KP184121 – KP184156 –

135663 dse-8 / B Festuca vaginata - KP183999 KP184038 KP184080 KP184117 – KP184157 –

135664 dse-8 / 143 Festuca vaginata REF143 KP184000 KP184039 KP184081 KP184116 – KP184159 –

135761 dse-8 / S Festuca vaginata - KP184001 KP184040 KP184082 KP184118 – KP184158 –

107

F3. táblázat A 241 izolátum, valamint a célzottan gyűjtött Cadophora sp. izolátumok adatai

Izolátum Csoport GenBank

szám Gazdanövény Mintavételi terület

Gyűjtési

évszak

REF001 DSE-1 JN859221 Juniperus communis Bugac Nyár

REF002 DSE-1 JN859222 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF003 DSE-1 JN859223 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár

REF004 DSE-1 JN859224 Juniperus communis Bugac Nyár

REF005 DSE-1 JN859225 Juniperus communis Bugac Nyár

REF006 DSE-1 JN859226 Juniperus communis Bugac Nyár

REF007 DSE-1 JN859227 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF008 DSE-1 JN859228 Juniperus communis Bugac Ősz

REF009 DSE-1 JN859229 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF010 DSE-1 JN859230 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF011 DSE-1 JN859231 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF012 DSE-1 JN859232 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF013 DSE-1 JN859233 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár

REF014 DSE-1 JN859234 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF015 DSE-1 JN859235 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF016 DSE-1 JN859236 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF017 DSE-1 JN859237 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF018 DSE-1 JN859238 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF019 DSE-1 JN859239 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF020 DSE-1 JN859240 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF021 DSE-1 JN859241 Juniperus communis Bugac Ősz

REF022 DSE-1 JN859242 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF023 DSE-1 JN859243 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF024 DSE-1 JN859244 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF025 DSE-1 JN859245 Juniperus communis Bugac Ősz

REF026 DSE-1 JN859246 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF027 DSE-1 JN859247 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF028 DSE-1 JN859248 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF029 DSE-1 JN859249 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF030 DSE-1 JN859250 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF031 DSE-1 JN859251 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF032 DSE-1 JN859252 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF033 DSE-1 JN859253 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF034 DSE-1 JN859254 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF035 DSE-1 JN859255 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF036 DSE-1 JN859256 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF037* DSE-1 JN859257 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF038 DSE-1 JN859258 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF039 DSE-1 JN859259 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF040 DSE-1 JN859260 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF041 DSE-1 JN859261 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF042* DSE-1 JN859262 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF043 DSE-1 JN859263 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF044 DSE-1 JN859264 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF045 1 JN859265 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF046 2 JN859266 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF047 3 JN859267 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár

REF048 4 JN859268 Juniperus communis Bugac Ősz

REF049 4 JN859269 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF050 5 JN859270 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF051 DSE-2 JN859271 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár

REF052 DSE-2 JN859272 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF053 DSE-2 JN859273 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF054 DSE-2 JN859274 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz

REF055 DSE-2 JN859275 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

108

REF056 DSE-2 JN859276 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF057 DSE-2 JN859277 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF058 DSE-2 JN859278 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF059 DSE-2 JN859279 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF060 DSE-2 JN859280 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF061 DSE-2 JN859281 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár

REF062 DSE-3 JN859282 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF063 DSE-3 JN859283 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF064* DSE-3 JN859284 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF065 DSE-3 JN859285 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF066 DSE-3 JN859286 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár

REF067 DSE-3 JN859287 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár

REF068 DSE-3 JN859288 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF069 DSE-3 JN859289 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF070 DSE-3 JN859290 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF071* DSE-3 JN859291 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF072* DSE-3 JN859292 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF073 DSE-3 JN859293 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF074 DSE-3 JN859294 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF075 DSE-3 JN859295 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF076 DSE-3 JN859296 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF077 DSE-3 JN859297 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF078 DSE-3 JN859298 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF079 DSE-3 JN859299 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár

REF080 DSE-3 JN859300 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF081 DSE-3 JN859301 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF082 DSE-3 JN859302 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF083* DSE-3 JN859303 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF084* DSE-3 JN859304 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF085 DSE-3 JN859305 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF086 DSE-3 JN859306 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz

REF087 DSE-3 JN859307 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF088 DSE-3 JN859308 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF089 DSE-3 JN859309 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár

REF090 DSE-3 JN859310 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF091 DSE-3 JN859311 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Nyár

REF092 DSE-3 JN859312 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF093* DSE-3 JN859313 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF094* DSE-3 JN859314 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF095 DSE-3 JN859315 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF096 DSE-3 JN859316 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF097 DSE-3 JN859317 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF098 DSE-3 JN859318 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Nyár

REF099* DSE-4 JN859319 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF100* DSE-4 JN859320 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF101* DSE-4 JN859321 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF102 6 JN859322 Juniperus communis Bugac Nyár

REF103 6 JN859323 Juniperus communis Bugac Nyár

REF104 DSE-5 JN859324 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz

REF105 DSE-5 JN859325 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz

REF106* DSE-6 JN859326 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF107 DSE-6 JN859327 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF108* DSE-6 JN859328 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF109 DSE-6 JN859329 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF110 DSE-6 JN859330 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF111 7 JN859331 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF112* 8 JN859332 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF113 9 JN859333 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF114 9 JN859334 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF115 9 JN859335 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

109

REF116 9 JN859336 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF117 9 JN859337 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF118 10 JN859338 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz

REF119 10 JN859339 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz

REF120 10 JN859340 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz

REF121 10 JN859341 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz

REF122 10 JN859342 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz

REF123* DSE-7 JN859343 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF124* DSE-7 JN859344 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF125* DSE-7 JN859345 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF126* DSE-7 JN859346 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF127* DSE-7 JN859347 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF128* DSE-7 JN859348 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF129* DSE-7 JN859349 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF130 DSE-7 JN859350 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár

REF131* DSE-7 JN859351 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF132 DSE-7 JN859352 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF133* DSE-7 JN859353 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF134* DSE-7 JN859354 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF135* DSE-7 JN859355 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz

REF136* DSE-7 JN859356 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF137* DSE-7 JN859357 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz

REF138* DSE-7 JN859358 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF139* DSE-7 JN859359 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF140* DSE-7 JN859360 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz

REF141* 11 JN859361 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF142 12 JN859362 Juniperus communis Bugac Ősz

REF143* DSE-8A JN859363 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF144* DSE-8B JN859364 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF145* DSE-8B JN859365 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF146 DSE-9 JN859366 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF147 DSE-9 JN859367 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár

REF148 DSE-9 JN859368 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF149 DSE-9 JN859369 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár

REF150* DSE-9 JN859370 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF151* DSE-9 JN859371 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF152* DSE-9 JN859372 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF153* DSE-9 JN859373 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár

REF154 DSE-10 JN859374 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF155 DSE-10 JN859375 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF156 DSE-10 JN859376 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF157 13 JN859377 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár

REF158 DSE-11 JN859378 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF159 14 JN859379 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF160 14 JN859380 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF161 14 JN859381 Juniperus communis Bugac Ősz

REF162 14 JN859382 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF163 15 JN859383 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF164 16 JN859384 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF165 DSE-12 JN859385 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF166 DSE-13 JN859386 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF167 DSE-13 JN859387 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF168 DSE-13 JN859388 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF169 17 JN859389 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF170 18 JN859390 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF171 19 JN859391 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF172 20 JN859392 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz

REF173 21 JN859393 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF174 22 JN859394 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF175 23 JN859395 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

110

REF176 24 JN859396 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF177 25 JN859397 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF178 25 JN859398 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF179 25 JN859399 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF180 25 JN859400 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF181* 25 JN859401 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF182 25 JN859402 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF183 25 JN859403 Juniperus communis Bugac Ősz

REF184 25 JN859404 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF185 25 JN859405 Juniperus communis Bugac Ősz

REF186 25 JN859406 Juniperus communis Bugac Ősz

REF187 25 JN859407 Juniperus communis Bugac Ősz

REF188 25 JN859408 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF189 25 JN859409 Juniperus communis Fülöpháza Ősz

REF190 25 JN859410 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF191 25 JN859411 Juniperus communis Bugac Nyár

REF192 25 JN859412 Juniperus communis Bugac Nyár

REF193 25 JN859413 Juniperus communis Bugac Nyár

REF194 25 JN859414 Juniperus communis Bugac Nyár

REF195 25 JN859415 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF196 25 JN859416 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF197 25 JN859417 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF198 25 JN859418 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF199 25 JN859419 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz

REF200 25 JN859420 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF201 25 JN859421 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF202 25 JN859422 Juniperus communis Bugac Tavasz

REF203* 26 JN859423 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF204 26 JN859424 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár

REF205 26 JN859425 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz

REF206 26 JN859426 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF207 26 JN859427 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF208 26 JN859428 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF209 DSE-14 JN859429 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF210 DSE-14 JN859430 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF211 DSE-14 JN859431 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF212* 27 JN859432 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF213* 27 JN859433 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF214 27 JN859434 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF215 27 JN859435 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF216 27 JN859436 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF217 27 JN859437 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF218 27 JN859438 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF219 27 JN859439 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF220 27 JN859440 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz

REF221 27 JN859441 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár

REF222 27 JN859442 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF223 27 JN859443 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz

REF224 27 JN859444 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF225 27 JN859445 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár

REF226 27 JN859446 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF227 27 JN859447 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF228 27 JN859448 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár

REF229 27 JN859449 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF230 27 JN859450 Juniperus communis Bugac Nyár

REF231 27 JN859451 Juniperus communis Bugac Nyár

REF232 27 JN859452 Juniperus communis Bugac Ősz

REF233 27 JN859453 Juniperus communis Bugac Ősz

REF234 27 JN859454 Juniperus communis Bugac Ősz

REF235 27 JN859455 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár

111

REF236 27 JN859456 Populus alba Fülöpháza Nyár

REF237 27 JN859457 Juniperus communis Fülöpháza Nyár

REF238 27 JN859458 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár

REF239 27 JN859459 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz

REF240 27 JN859460 Medicago minima Fülöpháza Nyár

REF241 27 JN859461 Juniperus communis Bugac Nyár

c01 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

c05 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Ősz

c06 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

c08 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

c09 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

c11 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

c12 DSE-1 – Salix rosmarinifolia Fülöpháza Ősz

c13 DSE-1 – Ailanthus altissima Fülöpháza Tavasz

c14 DSE-1 – Populus alba Fülöpháza Tavasz

c15 DSE-1 – Populus alba Fülöpháza Tavasz

c16 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár

* korábbi munkák során izolált és meghatározott törzsek

112

F4. táblázat A DSE csoportok reprezentáns izolátumainak legközelebbi BLAST találatai ( A BLAST keresés 2011. 11. 17-én történt)

DSE csoport Izolátum Legközelebbi GenBank szekvencia Származás / Gazdanövény Származási

Ország

Átfedés

(Coverage)

Hasonlóság

(Similarity)

1 REF025 u. mikorrhizás aszkuszos gomba (AY634148) H: Epipactis atrorubens, TT: mikorrhizált gyökérszakasz, ES Németország 100 99

Cadophora sp. (FJ666349) H: Populus tremuloides Kanada 99 98

Cadophora sp. (GU212389) IS: dobozcsomagoló anyag Antarktisz 100 97

Cadophora sp. (DQ317329) IS: Ross Sea régió Antarktisz 100 97

Cadophora luteo-olivacea is. (FJ486274) 100 97

u. Cadophora c. (EU517022) IS: talaj, ES Ausztria 97 98

Cadophora luteo-olivacea st. (DQ404348) IS: Actinidia deliciosa elszíneződött fatest Olaszország 100 96

Cadophora luteo-olivacea st. (GU128589) IS: alma gyümölcs Olaszország 100 96

Cadophora luteo-olivacea is. (GQ214536) 100 96

Cadophora luteo-olivacea st. (FJ430742) IS: talaj Csehország 100 96

u. aszkuszos gomba is. (AY833035) H: Cephalanthera damasonium, IS: orchid mikorrhiza, ES Franciaország 96 97

REF039 u. talaj gomba c. (EU490132) IS: szavanna-talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA: TX 98 97

Cadophora luteo-olivacea (HM116748) H: Actinidia deliciosa cv. Hayward Új Zéland 98 96

Cadophora luteo-olivacea st. (DQ404349) 97 97

Rhexocercosporidium sp. (DQ275614) H: Panax ginseng Kanada 97 96

u. talaj gomba c. (DQ420925) IS: talaj, ES USA: MN 97 96

u. Leptodontidium is. (FJ378720) H: Kobresia sp., ES Kína 97 96

dark septate endophyte (AF168783) H: Ranunculus adoneus USA: CO 99 95

u. aszkuszos gomba is. (DQ182423) IS: gazda gyökere, H: Cephalanthera longifolia, ES 97 96

Leptodontidium orchidicola st. (AF486133) H: Platanthera hyperborea 97 96

2 REF058 u. gomba c. (GQ921746) IS: talaj, ES Ausztralia 100 99

u. Helotiales c. (FJ197867) IS: talaj, ES Ausztria 95 99

u. gomba c. (EU292653) IS: talaj , ES USA: AK 100 97

u. Helotiales c. (GU327458) H: Epipactis helleborine, IS: mikorrhizált csemete, ES Csehország. 92 99

u. talaj gomba (GU083256) IS: talaj, ES USA: AK 100 97

u. gomba c. (FJ553784) IS: erdei talaj, ES Kanada 100 96

u. Helotiales is. (DQ182427) H: Cephalanthera longifolia, IS: gazdanövény gyökere, ES 100 96

Ericoid mikorrhiza gomba sp. (AY046400) IS: Quercus ilex Olaszország 99 96

u. aszkuszos gomba c. (FJ440888) IS: Pyrola sp. gyökere, ES USA: OR/CA 100 96

u. ektomikorrhizaképző gomba (Helotiales) is.

(EF644169)

IS: Populus tremula ektomikorrhizált gyökérvégei, TT: ektomikorrhiza

gombaköpeny, ES

Ausztria 97 96

u. ectomycorrhiza (Leohumicola verrucosa) c.

(DQ497978)

H: Tsuga heterophylla, IS: gyökér, ES Kanada 100 94

Leohumicola minima st. (AY706329) IS: vulkanikus hamu-talaj Chile 98 94

endofiton gomba sp. (EU686206) H: Scapania sp. Wales 100 94

3 REF078 endofiton gomba (AF373055) H: Rosmarinus officinalis, IS: gazdanövény endomikorrhizája Olaszország 100 99

endofiton gomba (AF373052) H: Pinus halepensis, IS: gazdanövény ektomikorrhizája Olaszország 100 99

u. endophytic gomba (AJ879648) IS: gyökérvégek, TT: ektomikorrhiza, ES Olaszország 100 99

u. endophytic gomba c. (FJ524327) IS: Oryza granulate gyökér endofiton, ES Kína 100 99

Rhizopycnis vagum is. (HQ610506) IS: fertőzött gyökér, H: Citrullus lanatus USA: IN 100 99

aszkuszos gomba sp. (HM208718) IS: gyökér, H: Rhododendron fortunei Kína 100 99

aszkuszos gomba sp. (AM944359) IS: Lycopersicum esculentum felszínsterilizált gyökér Kolumbia 100 99

endofiton gomba sp. (DQ459005) H: Dioscorea zingiberensis rizóma Kína 100 99

gomba sp. (HM208743) IS: gyökér, H: Rhododendron fortunei Kína 100 98

Rhizopycnis vagum (AF022786) Holotype culture

(TX951120)

IS: Cucumis melo var. cantalupensis USA: TX 100 98

Rhizopycnis sp. (DQ682600) H: Coffea arabica gyökér 97 99

endofiton gomba sp. (EU250374) IS: gazdanövény gyümölcse, H: Camptotheca acuminata 100 95

Pleosporales sp. (EU002891) IS: endofiton, H: Coffea arabica, ES USA: HI 100 95

endofiton gomba sp. (EU625406) IS: eperfa gyökér 96 98

Rhizopycnis sp. (FJ827623) IS: Coffea arabica endofiton Etiópia 93 99

aszkuszos gomba sp. (EF672295) H: Coffea arabica gyökér USA 92 99

Pleosporales sp. (FJ624263) H: mangrove 95 94

Rhizopycnis vagum st. (FJ582640) 100 93

4 REF101 Pithomyces valparadisiacus (EU552152) H: Protea lepidocarpodendron Délafrikai kt 60 85

u. gomba c. (GQ921741) IS: talaj, ES Ausztrália 42 100

u. gomba is. (GU564990) H: Populus tremula, ES Svédország 32 88

Coniothyrium sp. (GU062312) H: Alnus incana, IS: faanyag Lettország 43 100

u. gomba (FN397425) IS: T. melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES Franciaország 43 100

u. aszkuszos gomba c. (FJ553168) IS:erdei talaj, ES Kanada 35 100

Coniothyrium fuckelii is. (FJ228185) H: Fraxinus excelsior Svédország 43 100

aszkuszos gomba sp. (AJ972833) Törökország 39 84

endofiton gomba (FN394698) H: Holcus lanatus Spanyolország 27 93

u. aszkuszos gomba c. (EU490122) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA 42 100

Saccharicola sp. (GU973718) IS: gyökérendofiton, H: cukorrépa Brazília 42 100

Coniothyrium fuckelii (AY904055) H: Rosa sp., TT: szár Mexikó 42 100

u. gomba (AM260897) IS: tőzeg, ES UK 43 100

5 REF104 Alternaria helianthi st. (DQ156343) India 100 90

Alternaria helianthi (AY154713) H: Helianthus annus (levelek) Irán 100 90

Alternaria leucanthemi st. (AF314586) 100 90

Alternaria leucanthemi st. (AY372684) Kína 99 90

Alternaria helianthi is. (HM449994) IS: magok, H: Helianthus annuus cv. Bhanu India 90 91

u. gomba c. (EU516993) IS: talaj, ES Ausztria 88 89

Leptosphaeria lindquistii is. (HM003206) H: Helianthus annuus, TT: micélium Kína 87 89

u. gomba c. (FJ237205) IS: hóborította alpesi talaj, ES Ausztria 93 88

Leptosphaeria maculans (M96663) 91 87

u. gomba c. (GU817175) H: Bistorta vivipara egyed, IS: gyökérzet Norvégia 93 87

113

Leptosphaeria sp. (DQ093683) IS: Pinus sylvestris pusztuló gyökér, ES Litvánia 96 86

6 REF106 u. aszkuszos gomba c. (EF154351) H: Fagopyrum esculentum gyökér, ES 100 100

u. aszkuszos gomba c. (HM162252) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99

u. aszkuszos gomba c. (EU358787) H: Capsicum annuum, ES Mexikó 100 99

u. aszkuszos gomba c. (EU177123) H: Capsicum annuum, IS: gyökér Mexikó 100 99

u. talaj gomba c. (EU490117) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA TX 100 99

Alternaria sp. (HQ630996) H: Miscanthus giganteus USA: IL 100 98

Thielaviopsis basicola is. (GQ131878) IS: barack gyökér, TT: micélium Olaszország 94 99

Alternaria longissima is. (DQ865104) H: Linaria hegelmaieri Spanyolország 95 99

REF109 Setophoma sacchari (FN394730) H: Holcus lanatus Spanyolország 100 100

Hypocreales sp. (GQ923970) IS: Ojuelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 100 99

u. endofiton gomba c. (EF505610) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok ES USA 100 99

aszkuszos gomba sp. (EF672299) H: Coffea arabica Kolumbia 99 99

Setophoma sacchari (AB499793) H: Allium fistulosum Japán 98 99

endofiton gomba st. (FJ450016) 100 99

7 REF123 u. talaj gomba c. (EU480270) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 97

u. gyökérasszociált gomba c. (EU144602) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97

gyökérasszociált gomba sp. (EU144366) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 96

u. gyökérasszociált gomba c. (FJ449545) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 96 96

REF128 u. talaj gomba c. (EU480184) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 99 97

u. gyökérasszociált gomba c. (EU144953) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 99 97

Pleosporales sp. (GQ923954) IS: füves területek, H: Bouteloua gracilis Kanada: SK 100 97

u. Pleosporales c. (GQ924050) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis USA: SD 99 97

gomba sp. (FJ449549) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 93 97

REF130 u. root-associated gomba c. (EU145013) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97

u. root-associated gomba c. (FJ361958) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97

gyökérasszociált gomba sp. (EU144367) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97

u. talaj gomba c. (EU479732) IS: Bouteloua gracilis rizoszféra-talaj, ES USA: NM 100 97

REF132 u. gyökérasszociált gomba c. (FJ361994) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 100 99

u. talaj gomba c. (EU480264) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 99

u. root-associated gomba c. (EU145010) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 99

u. Pleosporales c. (GQ924025) IS: gyökerek, Konza Préri, H: Bouteloua gracilis USA: KS 100 99

Pleosporales sp. (GQ923972) IS: Oujelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 100 96

REF140 u. gyökérasszociált gomba c. (EU144759) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 98 99

u. mikorrhizás gomba c. (AY929107) IS: gyökér; félszáraz füves területek, H: Stipa hymenoides, ES USA: UT 99 98

u. Pleosporales c. (HQ389473) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 96 99

u. Pleosporales c. (GQ924053) IS: gyökerek, SNWR, H: Bouteloua gracilis USA: NM 96 99

8 REF144 Periconia macrospinosa st. (FJ536208) IS: C4 füvek gyökerei USA: KS 100 99

u. aszkuszos gomba c. (HM162309) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99

u. Periconia c. (GU055658) IS: füves terület talaj Ausztria 99 89

Periconia macrospinosa (AJ246159) IS: Avena sativa cv. Gerald gyökér UK 95 100

Pleosporales sp. (GQ923975) IS: Ojuelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 95 99

u. talaj gomba c. (DQ420990) IS: talaj, ES USA: MN 100 97

Periconia sp. (HQ631028) H: Saccharum officinarum USA: LA 100 97

Periconia macrospinosa (FN393421) H: Holcus lanatus gyökér Spanyolország 92 99

u. gomba c. (HQ260291) IS: gyökér, H: Ericaceae, ES USA: AK 100 97

Massarina sp. (GQ141701) IS: barnarizs, H: rizs 93 98

Periconia sp. (HQ130695) H: Warburgia ugandensis 96 97

Massarina igniaria st. (EU715627) IS: branch, H: Taxus globosa Mexikó 93 97

u. gomba c. (GQ999275) IS: levegő minta, ES 100 94

Periconia macrospinosa st. (HQ328037) 93 97

Periconia sp. (FJ903341) IS: pusztuló faanyag, H: Picea abies Lettország 90 97

endofiton gomba sp. (EU685980) H: Cheilolejeunea sp. Peru 93 96

Massarina igniaria st. (GQ377480) H: Taxus globosa, IS: ágak Mexikó 91 97

Periconia macrospinosa (AM262349) H: Dactylis glomerata Spanyolország 81 100

endofiton gomba sp. (EU977233) H: Macairea thyrsiflora Peru 88 97

9 REF148 u. talaj gomba c. (EU480177) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 100

Embellisia sp. (AY345356) H: Hennediella heimii Antarktisz 100 99

u. gyökérasszociált gomba c. (FJ362231) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 100 99

Embellisia astragali st. (FJ914716) 100 99

Embellisia sp. (AY864335) H: Hennediella heimii Antarktisz 100 99

Alternaria japonica (AY154703) H: Raphanus sativus (levelek) Iran 100 95

REF150 Embellisia sp. (AF212309) Antarktisz 100 99

u. talaj gomba c. (EU480175) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 99

u. gyökérasszociált gomba c. (EU144461) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 96 99

Embellisia telluster st. (FJ357316) H: Oxytropis spp. USA: NM 97 99

Embellisia allii (AY278840) 96 99

Embellisia allii (AB477430) H: Allium sativum Kína 92 98

Pleospora papaveracea is. (DQ885386) H: Papaver somniferum Spanyolország 100 94

Chalastospora gossypii (FN868458) H: Pinus halepensis Spanyolország 100 92

10 REF154 u. gomba (FN397304) IS: Tuber melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES Franciaország 100 100

Curvularia inaequalis (FM163616) IS: orrüregi váladék Olaszország 100 100

u. Ascomycota c. (HM161938) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99

u. endophytic gomba c. (EF505555) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok, ES USA 99 100

Curvularia coicicola (AB453880) IS: Coicis lacryma-jobi L. Kína 100 99

Curvularia inaequalis st. (HM101095) 98 100

Curvularia inaequalis st. (AF120261) 98 99

u. ascomycete c. (EU489922) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) C4 fűvek alatt, ES USA 100 97

Curvularia inaequalis (AF313409) 100 97

u. talaj gomba c. (DQ420883) IS: talaj, ES USA: MN 100 97

Curvularia geniculata (AB245085) H: Agrostis stronifela Japán 99 97

Curvularia inaequalis st. (AY941256) 92 100

114

11 REF158 Microdochium bolleyi (AM502264) 100 100

Microdochium bolleyi st. (GU566298) IS: rizoszféra, H: Phalaris arundinacea Czech Rep. 100 100

Microdochium sp. (AJ279489) H: Phragmites australis gyökér Germany 100 100

Microdochium sp. (HQ630981) H: Miscanthus giganteus USA: IL 100 99

u. gomba (FN391313) IS: Tuber melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES France 100 99

Xylariales sp. (EU755004) IS: talaj és repce gyökér, ES 100 99

u. endofiton gomba c. (EF505625) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok , ES USA 100 99

Microdochium sp. (FJ439588) IS: talaj UK 98 100

aszkuszos gomba sp. (AY243053) H: Ammophila arenaria, IS: növények USA: CA 96 99

Microdochium bolleyi (AM924150) H: Elymus farctus Spain 92 100

u. Xylariales c. (GQ924061) H: Bouteloua gracilis, IS: gyökér, ES USA: SD 92 99

Microdochium bolleyi is. (HM007082) IS: Stipa grandis, IS: gyökér China 90 99

Microdochium sp. (FJ536210) H: C4 füvek gyökere USA: KS 92 100

u. Xylariales c. (DQ317371) IS: Ross Sea régió, ES Antarctica 66 100

12 REF165 gomba sp. (HM036626) H: Pinus sylvestris, IS: gyökérvég Lithuania 83 99

Thermoascus crustaceus st. (EU021597) 99 87

Byssochlamys verrucosa (DQ073329) Australia 99 87

Thermoascus crustaceus (U18353) TT: micélium 99 87

Penicillium inflatum (AJ608959) Bulgaria 99 87

Penicillium inflatum st. (AF033393) 99 87

Thermoascus crustaceus st. (FJ389925) H: Parthenium argentatum USA 98 87

Aspergillus wenti is. (FJ537089) 95 88

Aspergillus wentii is. (EF652158) 95 88

Aspergillus dimorphicus (FR727119) IS: levélfelszín Czech Rep. 95 88

Aspergillus heteromorphus (AJ876879) IS: befertőződött kultúra Brazil 99 87

Talaromyces leycettanus st. (AF454080) 99 87

13 REF168 u. Plectosphaerella c. (GU327453) H: Epipactis helleborine, IS: mikorrhizált csemete, ES Czech Rep. 100 99

Phyllachoraceae sp. (EU755008) IS: talaj és repce gyökér, ES 100 99

u. gomba (FM875855) IS: biofilter, ES 100 99

Plectosphaerella sp. (FJ430715) Czech Rep. 100 99

u. aszkuszos gomba c. (AY615882) IS: rizoszféra, ES Nedherlands 100 99

u. aszkuszos gomba (AM901905) IS: háztartási por, ES Finland 98 99

u. gomba c. (GQ921802) IS: talaj, ES Australia 98 99

Plectosphaerella cucumerina st. (EF495236) IS: Paris polyphylla var. yunnanensis rizóma China 100 99

Plectosphaerella sp. (GQ407099) H: Musa acuminata, IS: gyökér, N: endofiton gomba Malaysia 100 98

Plectosphaerella cucumerina st. (DQ779781) IS: talaj 98 99

Plectosphaerella cucumerina (AJ492873) H: burgonya fonalféreg UK 100 98

Plectosphaerella cucumerina (FM178318) Australia 96 99

Plectosphaerella sp. (HQ008920) H: Arrabidaea candicans Ecuador 100 98

Plectosphaerella cucumerina (AB469880) H: Homo sapiens szaruhártya 100 98

Colletotrichum pisi st. (EU400150) 100 97

14 REF210 Fusarium sp. (HQ166538) H: Buxus sempervirens, IS: fertőzött levelek Switzerland 100 100

Hypocreales sp. (GQ923966) H: Bouteloua gracilis USA: SD 100 100

Fusarium acuminatum st. (HM068325) 100 100

Fusarium sp. (GU480954) H: búza, IS: szemek Mexico 100 100

Fusarium sp. (GQ505464) USA: TX 100 100

Fungal sp. (GQ866861) H: Spiranthes sinensis (Pers.) Ames China 100 100

u. gyökérasszociált gomba c. (FJ362249) H: Yucca glauca, IS: gyökér, ES USA: NM 100 100

Fusarium solani (AB470848) H: Larix gmelinii var. principis-rupprechtii China 100 100

Fusarium sp. (EU910079) H: Cicer arietinum 100 100

Fusarium tricinctum (FJ233196) H: kiwi gyümölcs China 100 100

Hypocreales sp. (EU754934) IS: talaj repce gyökér, ES 100 100

Gibberella avenacea is. (EU255801) 100 100

u. Fusarium c. (EU003042) H: alma csemete, IS: gyökér, ES 100 100

u. talajbeli gomba c. (DQ421028) IS: talaj, ES USA: MN 100 100

Fusarium tricinctum (AY188923) 100 100

endofiton gomba is. (EU167917) H: Picrorhiza kurrooa 99 100

u. Gibberella (FM178250) IS: víz, ES 100 99

Gibberella pulicaris st. (FJ481029) H: Populus sp., IS: gyökér 100 99

A DSE csoportok reprezentáns izolátumainak ITS szekvenciáival legnagyobb hasonlóságot mutató GenBank találatok. Rövidítések: nem tenyésztett (u, uncultured), klón (c, clone), izolátum (is, isolate), törzs

(st, strain), gazdanövény (H, Host), Izolálási hely (IS, Isolation Source), Szövet típus (TT, Tissue Type), Környezeti minta (ES,Environmental Sample)

115

12. PUBLIKÁCIÓS LISTA

A PhD-dolgozat témájához kapcsolódó publikációk:

Impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:

Knapp DG, Kovács GM, Zajta E, Groenewald JZ, Crous PW. 2015. Dark septate

endophytic pleosporalean genera from semiarid areas. Persoonia 35: 87-100. IF:

4,225

Vági P, Knapp DG, Kósa A, Seress D, Horváth A, Kovács GM. 2014. Simultaneous

specific in planta visualization of root-colonizing fungi using fluorescence in situ

hybridization (FISH). Mycorrhiza 24: 259–66. IF: 2,985

Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2012. The dark side is not fastidious – dark septate

endophytic fungi of native and invasive plants of semiarid sandy areas. PLOS ONE 7:

e32570. IF: 3,730

Impakt faktorral nem rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:

Knapp DG, Kovács GM. 2010. A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata

a fülöpházi félszáraz homokterületen. Mikológiai Közlemények – Clusiana 49: 67–77.

Konferencia – összefoglalók:

Knapp DG, Kovács GM, Zajta E, Groenewald JZ, Crous PW. 2014. Alföldi félszáraz

területek új sötét szeptált endofiton (DSE) taxonjai. A Magyar Mikrobiológiai

Társaság 2014. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás, legjobb előadó díj]

Kovács GM, Balázs TK, Blaszkowski J, Buscot B, Gáspár BK, Geml J, Knapp DG, Lukács

AF, Németh JB, Seress D, Wubet T. 2013. Looking for the generalists in a specific

environment: mycorrhizal and root-endophytic fungi of semiarid sandy areas. Power

of Microbes. Primosten, Horvátország. [előadás]

Knapp DG, Zajta E, Pintye A, Kovács GM. 2013. The dominant DSE lineages of semiarid

sandy areas of the Great Hungarian Plain - What can they point out? Endophytes for

plant protection: the state of the art, Berlin, Németország. [előadás]

Horváth ÁN, Seress D, Knapp DG, Vági P, Kovács GM. 2013. Fluoreszcens in situ

hibridizációs módszer optimalizálása növény-gomba kölcsönhatások vizsgálatára. A

Magyar Mikroszkópos Társaság Éves Konferenciája. Siófok. [előadás]

Knapp DG, Kovács GM. 2012. Félszáraz homokgyepek sötét szeptált endofiton gombáinak

ISSR (inter sample sequence repeat) vizsgálata. A Magyar Mikrobiológiai Társaság

2012. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás, legjobb előadó díj]

Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2012. Őshonos és inváziós növények gyökérendofiton

gombáinak vizsgálata alföldi félszáraz területeken. V. Magyar Mikológiai

Konferencia, Budapest. [előadás]

116

Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2011. Study of dark septate endophytic fungi colonizing

invasive and indigenous plants on semiarid sandy areas. XVI. Congress of European

Mycologists (CEM), Halkidiki, Görögország. [előadás]

Knapp D, Kovács GM. 2009. Study of root colonizing dark septate endophytic fungi of

invasive and indigenous plants of semiarid sandy areas. Second Central European

Forum for Microbiology (CEFORM), Keszthely. [poszter, legjobb poszter díj]

Knapp D, Seress D, Kovács GM. 2009. Inváziós növények nempatogén gyökérkolonizáló

gombáinak vizsgálata félszáraz homokterületeken. VIII. Magyar Ökológiai

Kongresszus, Szeged. [poszter]

A PhD-dolgozat témájához nem kapcsolódó publikációk:

Impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:

Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W, and

Fungal Barcoding Consortium (…, Knapp DG, …, Kovács GM, …). 2012. Nuclear

ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode

marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109: 6241–

6245. IF: 8,910

Konferencia – összefoglalók:

Németh JB, Knapp DG, Tamás L, Ohm RA, Lipzen A, Nolan M., Barry KW, Grigoriev IV,

Spatafora JW, Kovács GM. 2014. Szimbiózis ortológ gének vizsgálata gyökér

kolonizáló sötét szeptált endofiton gombákban. A Magyar Mikrobiológiai Társaság

2014. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás]

Simon J, Knapp DG, Vági P, Lukács AF, Németh JB, Borsodi AK, Kovács GM. 2014.

Szimbionta baktériumok kimutatása és azonosítása félszáraz területen élő gyökér

endofita gombák esetében. A Magyar Mikrobiológiai Társaság 2014. évi

Nagygyűlése, Keszthely. [előadás]

Németh MZ, Bóka K, Kovács GM, Knapp DG, Seress D, Preininger É. 2014. Egy

endofiton gomba interakciója in vitro növényi rendszerekkel. A Magyar

Mikroszkópos Társaság Éves Konferenciája. Konferencia. Siófok. [előadás]

117