TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİ

SÜRÜLERİNDE KÜLTÜR VE PCR TEKNİKLERİ İLE

TEŞHİSİ

Khair Elsid ABDALLA

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Hakan YARDIMCI

2010- ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİ

SÜRÜLERİNDE KÜLTÜR VE PCR TEKNİKLERİ İLE

TEŞHİSİ

Khair Elsid ABDALLA

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Hakan YARDIMCI

2010-ANKARA

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller vii Çizelgeler viii 1. GİRİŞ 1 1.1. Genel Bilgiler 1 1.2. Etiyoloji 2 1.3. Kanatlılarda Mikobakteri İnfeksiyonları 4 1.4. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Epizootiyolojisi 6 1.4.1. Mikobakteriyozisin İnsidensi 8 1.4.2. İnfeksiyon Kaynakları 8 1.4.3. Çevresel Koşullara Direnci 9 1.4.4. Hayvan Rezervuarı 9 1.5. Konakçı Duyarlılığı 10 1.6. Cinsiyet ve Yaş 11 1.7. Ekonomik Önem 11 1.8. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Bulaşma ve Patogenezi 12 1.9. Klinik Belirtiler 13 1.9.1. Ante-Mortem Bulgular 13 1.9.2. Post-Mortem Bulgular 14 1.10. Hastalığın Teşhisi 15 1.10.1. Klinik Buguları 15 1.10.2. Makroskobik Bulgular 15 1.10.3. Mikroskobik Değerlendirme 16 1.10.4. Kültür 17 1.10.5. Moleküler Tanı 19 1.11. Kanatlılarda Mikobakteriyozisin Tedavisi 20 1.12. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Kontrolü 21 1.12.1. Dezenfeksiyon 22 1.12.2. Aşılama 23 2. GEREÇ VE YÖNTEM 24 2.1. Gereç 24 2.1.1. Standart Suş 24 2.1.2. Örneklerin Toplanması 24 2.1.3. Kullanılan Besiyerleri ve Boyalar 25 2.1.4. Bakteriyolojik Muayenelerde Kullanılan Cihazlar 28 2.1.5. Primerler 29 2.1.6. PCR testinde Kullanılan Cihazlar ve Ekipmanlar 29 2.2. Yöntem 30

iv

2.2.1. Nekropsi 30 2.2.2. Ziehl-Neelsen Boyama 30 2.2.3. Standart Suşların Aktivasyonu 31 2.2.4. İzolasyonu ve İdentifikasyon 31 2.2.4.1.Organ Örnekleri 31 2.2.4.2.Dışkı Örnekleri 32 2.2.5. İdentifikasyon 33 2.2.5.1.Kristal Violet Içermeyen MacConkey Agar’da Üreme 33 2.2.5.2. İnhibisyon ve Tolerans Testi 33 2.2.6. PCR Tekniği 34 2.2.6.1.DNA Eldesi (Ekstraksiyon) 34 2.2.6.2.PCR Amplifikasyonu 35 2.2.6.3.Elekroforez 36 2.2.7. İstatistiksel Değerlendirme 36 3. BULGULAR 37 3.1. Nekropsi ve Ziehl-Neelsen Boyama Bulguları 37 3.2. İzolasyon ve İdentifikasyon Bulguları 42 3.3. PCR Bulguları 48 4. TARTIŞMA 50 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 56 ÖZET 58 SUMMARY 59 KAYNAKLAR 60 ÖZGEÇMİŞ 70

v

ÖNSÖZ

Kanatlı tüberkülozu olarak bilinen kanatlı mikobakteriyozisine en sık Mycobacterium avium serovar 1-3 ve son zamanlarda da M. genavense neden olmaktadır. İnfeksiyon bütün kanatlı türlerinde görülmektedir. Dünyanın çeşitli yerlerinde ve çok sayıda kanatlı türünde, diğer hayvan türlerinde, özellikle HIV infeksiyonu taşıyan immun sistemi baskılanmış ya da sağlıklı insanlarda görüldüğü bildirilmiştir. İnfeksiyon Türkiye’de ve diğer ülkelerde hayvanat bahçelerinde oldukça sık görülür. Ancak, özellikle yumurtacı tavuk ve hindi sürülerinde ise bildirimi azdır. İnfeksiyonun inkübasyon süresinin uzun olması nedeniyle yabani ve yaşlı kanatlılar etkilenir. Ticari kanatlı işletmelerinde bu infeksiyon, yeterli bakım ve idare uygulamaları, uygun biyogüvenlik şartları, ticari tavuk ve hindilerin çok genç yaşta kesime gönderilmesi nedeniyle nadir görülmektedir. Aynı zamanda, kanatlı yetiştiriciliği yapan aile işletmelerinde hijyenik olmayan çevresel koşulların olması önemli bir problemdir ve bu durum kanatlı mikobakteriyozisi yanında farklı infeksiyonların oluşmasına da zemin hazırlar. Farklı kanatlı türlerinde oluşan mikobakteriyozis ile ilgili pek çok çalışma olmasına karşın hastalığın yumurtacı tavuk ve hindilerde görülmesi ile ilgili bilgiler sınırlıdır. Ev tipi yetiştiricilikte önemsiz sayılabilecek ölümlere neden olan infeksiyon duyarlı çiftlik hayvanları ve insanlar için risk oluşturur. Buna rağmen aile işletmeleri, hindi yetiştiriciliği ve yumurtacı işletmelerde bu infeksiyonların teşhisi için PCR ve diğer moleküler tekniklerin kullanımı sık olmamaktadır. Bu çalışmada, tavuk ve hindi sürülerine ait iç organ ve dışkı örneklerinden kanatlı tipi mikobakteriyozis etkenlerinin varlığının izolasyon ve moleküler yöntemle (PCR) teşhisi amaçlanmıştır. Tez çalışmasının belirlenmesinde ve yürütülmesinde bana yol gösteren danışman hocam Sayın Prof. Dr. Hakan YARDIMCI başta olmak üzere ve tez izleme komitesi üyesi hocalarım Sayın Prof. Dr. Osman KUTSAL ve Sayın Prof. Dr. Mehmet AKAN’a, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı hocam Sayın Prof. Dr. Serdar DİKER’e ve öğretim üyeleri; Prof. Dr. Müjgan İZGÜR, Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL, moleküler çalışmalarda yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Barış SAREYYÜPOĞLU’na, istatistiksel analiz konusunda yardımcı olan Doçent Dr. Safa GÜRCAN’a, materyal toplamamda yardımcı olan Araş. Gör. Bülent BAŞ, Vet. Hekim Ramin JAHED, Mehmet CENGİZ, Mehmet NOYAN’a, çeviride yardımcı olan Dr. Sibel GÜNGÖRDÜ, Araş. Gör. Dr. Seyda CENGİZ, Vet. Hekim Orkun BABACAN ve Nihan ALTINSOY DUYGU’ya, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Görevlilerine, doktora ve yüksek lisans yapan arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.

vi

SİMGELER VE KISALTMALAR

ADC Middlebrook ADC (Albumin, Dextrose, Catalase) Enrichment ARB Asidorezistans Bakteri AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome AM Kanatlı Mikobakteriyozisi bp Baz çifti cm Santimetre dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asid D.S. Distile su DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay g Gram HCl Hidroklorik Asid KH2PO4 Potasyum di-hidrojen Fosfat L-J Löwenstein-Jensen besiyeri MAA Mycobacterium avium subsp. avium MAC Mycobacterium avium complex MgCl Magnezyum Klorür µl Mikrolitre µm Mikrometre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre NaOH Sodyum Hidroksit NTM Non-Tuberculous Mycobacteria OADC Middlebrook OADC (Oleik Asid, Albumin, Dekstroz ve

Katalaz) Enrichment 1N Bir normal PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu SDA Sabouraud dekstroz agar TBE Tris borate EDTA UV Ultra-Violet Z-N Ziehl-Neelsen boyama

vii

ŞEKİLLER

Şekil 3.1. Dalak, splenomegali, multifokal noduler granülomlar 38

Şekil 3.2. Karaciğer kesitinde multiple tüberküloz görünümü 39

Şekil 3.3. Karaciğerin Z-N boyası ile hazırlanan preparatında ARB görünümü 39

(x100)

Şekil 3.4. Akciğerlerde multiple tüberküloz görünümü 40

Şekil 3.5. Z-N boyama yapılan preparatta Mikobakterilerin asidorezistans 40

(ARB) görünümü (x100)

Şekil 3.6. Kalpte beyaz tüberküller 41

Şekil 3.7. L-J Besiyerinde Mycobacterium spp. üremesi 43

Şekil 3.8. L-J Besiyerinde küçük pigmentsiz koloniler 43

Şekil 3.9. Middlebrook (7H10) agar’da farklı koloni morfolojileri 44

Şekil 3.10. Middlebrook (7H9) buyyon’da üreme 44

Şekil 3.11. İzole edilen Mycobacterium genusunun izolatlarında16S-rRNA 48

(543 bp) PCR bulguları

Şekil 3.12. İzole edilen M. avium complex izolatlarında IS1245 (427 bp) 49

PCR bulguları

Şekil 3.13. İzole edilen M. avium subsp. avium izolatlarında (509 bp ve 376 bp) 49

(IS901) nested-PCR bulguları

viii

ÇİZELGELER

Çizelge 1.1. Farklı kanatlı türlerinden izole edilen mikobakteriyel izolatlar 7 Çizelge 2.1. Materyal kaynakları ve alınan örnek sayıları 25 Çizelge 2.2. Çalışmada kullanılan primerler 29 Çizelge 3.1. İncelenen doku ve dışkı preparatlarında Z-N bulguları 41 Çizelge 3.2. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan 45 üç ticari tavuğun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması Çizelge 3.3. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan 46 dört ev tavuğunun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması Çizelge 3.4. İzole edilen suşların bazı identifikasyon testleri 47

1

1. GİRİŞ

1.1. Genel Bilgiler Kuş tipi veya kanatlı mikobakteriyozisi, tüm dünyada görülmektedir ve genellikle

Mycobacterium avium complex serotip 1-3 tarafından meydana getirilir. Kronik

olarak seyreden bulaşıcı bir hastalıktır. Bu infeksiyon, tavuklarda büyük zararlara

neden olmaktadır. Hindi, güvercin, ördek, kaz, kanarya, papağan ve sülün gibi diğer

kanatlılarda da görülmektedir. Bu hastalığa doğal koşullarda yaşıyan kuşlarda

rastlanmaz. Fakat hayvanat bahçelerinde bulundurulanlarda görülebilir (Akay, 1999;

Tell ve ark., 2001; Hoop, 2002; Yardımcı, 2006).

Mikobakterilerin identifikasyonu ve teşhisi, 1800’lü yılların sonlarına doğru

tüberküloz (Bacterium tuberculosis) ve lepra bakterisinin (Bacillus laprae) keşfi ile

başlamış ve Lehman–Neumann’nın bu türleri 1876 yılında Mycobacterium cinsi

içerisinde incelemesi ile yapılmıştır. Robert Koch, 1882 yılında tüberkülozu

laboratuarda bir hastalık etkeni olarak bulmuş ve bu yüzyıl sonunda mikobakteri

etkenleri kanatlılarda ve bazı hayvanlarda hastalığa neden olan ancak çevresel olarak

hastalığa neden olmayan organizmalar olarak tanımlanmıştır. M. tuberculosis etkeni

dışındaki mikobakteri etkenleri (nontüberküloid mikobakteriler-NTM) 1880’li

yılların sonlarında bulunmuş, Alvarez ve Tavil bu organizmayı M. smegmatis olarak

tanımlamıştır. Tavuklarda bulunan ilk tüberküloz bulgusu Mycobacterium avium

complex (MAC) olarak tanımlanmış, insanlarda infeksiyon 1868 yılında İngiltere’de

görülmüştür. 1890’lı yıllarda “avian bacteria” olarak (Mycobacterium avium)

tanımlanan etken insan infeksiyonlarına neden olan M. tuberculosis etkenlerinden

ayrılmıştır (Shinnick ve Good, 1994; Biet ve ark., 2005).

2

1.2. Etiyoloji Kanatlı mikobakteriyozisi etkeni, Actinomycetales takımının Mycobacteriaceae

familyasına bağlı tek genus olan Mycobacterium genusu içindedir. Bu genusda alt

türlerle birlikte 60’dan fazla tür vardır. Etken Mycobacterium avium olup 1.0-10 µm

uzunlukta, 0.2- 0.6 µm genişlikte, ince çomak şeklinde, bazı preparatlarda kıvrık,

asido-rezistans, sporsuz, hareketsiz, Gram pozitif boyanma özelliğinde ve aerobik

olarak pH 6.8-7.3 ve 25°-42°C arasında üreyebilen bir mikoorganizmadır (Thorel ve

ark., 1990; Levy-Frebault ve Portales, 1992; Yardımcı, 2006). Mycobacterium

avium özellikle, gliserin içeren sıvı ve katı besiyerlerinde daha iyi üreme

göstermektedir. Yumurtalı besiyerlerinde, 10-21 gün içinde küçük, yapışkan, gri-

beyaz koloniler oluşur, sıvı besiyerlerinde ise, üreme tüpün dibinde olup,

çalkalandığında tüpün hafifçe bulandığı görülür (Akay, 1980; Benson ve Ellner,

1993; Atlas, 2004).

Günümüzde, Mycobacterium genusu içindeki türlerin minimum standartları; 1)

asit-alkole dirençli, 2) 60-90 karbon atomu içeren mikolik asit varlığında pyrolisiz ile

C22 ve C26 yağ aside esterazlarına bölünmesi, 3) % 61-71 oranında G+C yüzdesi

bulunmasıdır (Levy-Frebault ve Portales, 1992). Taksonomik olarak mikobakteriler

Actinomycetales’lerden ayrılarak Mycobacteriaceae ailesi içerisinde Mycobacterium

genusu içerisinde incelenir. Actinomycetales etkenleri geniş bir mikroorganizma

grubudur ve hücre duvarlarında bulunan mikolik asit sentezi ile kolaylıkla ayırt

edilebilir. Mikobakteriler aerobik, aside dirençli, çomak şekilli, fakültatif intraselüler

etkenlerdir ve uzun süre çevrede, kurumuş dışkıda hayatta kalabilirler (Levy-Frebault

ve Portales, 1992). Mycobacterium avium, sığır ve insan tipi mikobakterilere oranla

besi yerlerinde daha kolay ve çabuk üremektedir. Etken 25-45°C’lerde

üreyebilmektedir ancak, optimum ısı 37.5-40°C’ler arasındadır. M. avium katı besi

yerinde ürediği zaman yaygın, yapışkan, gri-beyaz koloniler meydana getirir (Akay,

2002).

Mycobacterium avium gibi pek çok mikobakteri türü hem insan hem de hayvan

populasyonları için patojeniktir. M. avium ve yakın ilişkili M. intracellulare, M.

3

avium-intracellulare kompleksi olarak bir bakteri grubu şeklinde tanımlanmıştır.

Mycobacterium avium complexi, M. avium subsp. paratuberculosis etkenlerini içerir.

M. paratuberculosis etkeni ruminant ve diğer memeli hayvan türlerinde Johne

hastalığı veya paratüberküloz olarak adlandırılan hastalığa neden olur (Biet ve ark.,

2005; Tell ve ark., 2001).

Kanatlılarda yapılan deneysel infeksiyon çalışmalarında M. paratuberculosis‘in

kanatlı tüberkülozunda etiyolojik ajan olduğuna dair bir kanıt bulunamamıştır

(Sykes, 1982). Kanatlılardan izole edilen M. avium izolatlarının büyük çoğunluğu

IS901 sekansına sahiptir ve RFLP ile IS1245 yapısına karakteristik 3 bant meydana

getirdiği görülmüştür. Kanatlılarda etkenin patojenitesi IS901’in bulunması ile

kanıtlanmıştır (Dvorska ve ark., 2003). Bu sekans M. slyvaticum etkenlerinde de

bulunur ve bu mikobakteri türü de kanatlılarda infeksiyona neden olmaktadır. IS901

sadece M. avium suşlarında 1, 2 ve 3 serotiplerinde saptanmıştır ve bu serotiplerin

kanatlılarda diğer serotiplere oranla daha patojenik etkili olduğu belirlenmiştir

(Pavlik ve ark., 2000; Tell, ve ark., 2001).

Kanatlı mikobakteriyozisinin varlığı Türkiye’de de yıllar önce saptanmıştır.

Birçok araştırıcı 20. yüzyılın başlarından itibaren hastalıkla ilgili değişik çalışmalar

yapmıştır. Bu çalışmalar ile daha çok tüberkülozun epidemiyolojisi, etiyolojisi,

teşhisi (geleneksel ve moleküler) ve immunolojisi üzerinde durulmuştur. A.Ü.

Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda 1933 yılından günümüze kadar

kanatlı hayvan hastalıkları ve tüberküloz olgularına ait bazı yayınlar yapılmış olup

(Ertürk ve Pamukçu, 1974), 1933-1974 yılları arası incelenen kanatlıların hastalık

olguları arasında 18 olguda, tavukta ve hindiler üzerinde yapılan bir çalışmada ise 14

olguda çeşitli organlarda tüberküloz lezyonlarına rastlanılmıştır.

Tantaş ve ark. (1990) tarafından bir ticari işletmede ani ölümlerle karakterize bir

kanatlı mikobakteriyozisi olgusu tanımlanmıştır. Bu olgularda tavuklarda viseral

tüberküloz lezyonları ve bu lezyonların periorbital yerleşimi görülmüştür. Beytut ve

4

ark. (2001), aside dirençli bakterileri Ziehl-Neelsen (Z-N) boyama yöntemi ile

parafinlenmiş dokularda görüntülemişlerdir.

Akay (1980), deneysel olarak infekte edilen hindilerde, hastalığın allerjik ve

serolojik yöntemlerle teşhisini gerçekleştirmiş ve Malya Devlet Üretme Çiftliği’nden

sağlanan tüberkülozlu hindilerden izole ve identifiye edilen 16 M.avium suşunun ise

biyokimyasal, patojenite ve serotipik karakterlerini incelemiştir. Son çalışmalarda

güvercinlerde tüberküloz varlığı gösterilmiştir (Sezen ve ark., 1986; Kutsal ve

Sağlam, 1988; Gümüşsoy ve ark., 2006). Kanatlı türleri içerisinde kazların hastalığa

direnç göstermesine rağmen, infeksiyonun görüldüğüne dair bir adet olgu

raporlanmıştır (Özcan ve ark., 2001). Daha önce yapılan çalışmalarda da

Türkiye’deki hayvanat bahçelerinde uzun gagalı akbabalarda (Buteo rufinus),

mandarin ördeklerinde (Aix galericulto), hindilerde (Meleagris gallopavo),

sülünlerde (Phasianus colchicus) tavuskuşu (Pavo cristatus) ve kümes

hayvanlarında infeksiyona yüksek oranda rastlanmıştır (Kul ve ark., 2005; Gümüşsoy

ve ark., 2006).

1.3. Kanatlılarda Mikobakteri İnfeksiyonları Kanatlı mikobakteriyozisi ilk olarak 1868 yılında İngiltere’de tanımlanmıştır. Tüm

dünyada yaygın olarak vahşi kanatlılarda, serbest yaşayan kafes kuşları türlerinde ve

tavuklarda görülen bir infeksiyondur. Mikobakteriyozis terimi kullanım olarak daha

geniş içeriklidir ve pek çok kanatlı türünde infeksiyona neden olur. Temel olarak M.

avium, M. intracellulare ve M. genavense infeksiyon oluşturur. M. avium ve M.

intracellulare’nin pek çok üreme özelliği olmasının yanı sıra türe spesifik antijenleri

bulunur ve bu türler sıklıkla M. avium-intracellulare (MAI) olarak gruplandırılır. M.

avium subsp. paratuberculosis (sığırlarda hipertrofik enteriditis veya Johne

hastalığına neden olur) ve M. lepramurium (rodentlerde lepra benzeri etki oluşturur)

M. avium ile yakın ilişkilidir ve MAI kompleks içerisinde gruplandırılır. M.

scrafulaceum MAI kompleksi içinde gruplanan diğer bir mikobakteri türüdür. Ancak

bu türler nadiren mikobakteriyozise neden olur (Grange ve ark., 1990).

5

M. genavense son zamanlarda identifiye edilmiş, genetik olarak tiplendirilmiş

ancak klinik ve histopatolojik bulguları yönünden MAI’den ayrılamamıştır (Portales

ve ark., 1996). M. fortuitum nadiren kanatlı türlerinde lezyonlara neden olur (Hoop

ve ark., 1996). M. tuberculosis ve M. bovis az görülse de kanatlılarda infeksiyon

şekillendirdiği raporlanmıştır (Van der Heyden, 1997a).

Yaklaşık bir asır öncesinde kanatlı hayvanlarda görülen mikobakteriyozis

olgularının MAI kompleksinden kaynaklandığı bildirilmiştir. İnfeksiyona neden olan

etkenler 1990’lı yıllarda büyük oranda M. avium iken (Çizelge 1.1.), bu tarihten önce

yapılan çalışmalarda etkenler asido-rezistans boyamada görülmüş ancak kültüre

edilememişlerdir (Keymer ve ark., 1982). Buna benzer durumlarda daha çok M.

genavense izole edilmiştir ve bu etken DNA yapısı ile teşhis edilen ve kültüründe

problemler oluşturan bir bakteridir. Etken ilk olarak 1990 yılında tanımlanmış olup,

AIDS’li bir hastadan izole edilmiştir (Bottger ve ark., 1992).

Mycobacterium avium etkeninin 3 serotipi (Serotip 1-3) ve M. intracellulare

etkeninin 20’den fazla serotipi tanımlanmıştır (Grange ve ark., 1990). M. avium’un

1-3 serotipi kanatlılarda M. intracellulare’den daha patojenik etki oluşturmuştur.

Aynı çalışmada M. intracellulare’nin 12 serotipinin 11’inin tavuklar için patojen

olmadığı bulunmuştur (Collins ve ark., 1983; Thorel ve ark., 1997). Buna karşın, M.

avium etkenlerinden test edilen 21 adet etkenin 19’u tavuklarda infeksiyon

oluşturmuş, 17 suş inokulasyon sonrası 115. günde letal etki göstermiştir. Ferguson

ve ark. (1969), bir ağaç ördeğinde dissemine bir tüberküloz olgusuna rastlamış,

ancak bu organizmanın tavuklar için nonpatojen bir etken olduğunu bildirmiştir.

M. avium’un klasik 3 serotipi arasında virulens farklılıklarının olduğu

gözlenmiştir. Collins ve ark. (1983) tarafından yapılan çalışmada, M. avium serotip

3’den sadece bir tanesi patojen olarak bulunurken diğerlerinin düşük virulense sahip

olduğu belirtilmiştir. M. avium serotip 2’den ise 6 suşdan 5 tanesinin ölümcül

özelliğe sahip olduğu belirlenmiştir. Virulens özelliği kuş türleri arasında değişim

6

göstermektedir. Serotip 2 ve 3’ün İngiltere de bazı su kuşlarında yüksek mortaliteye

sahip olduğu belirlenmiştir (Painter, 1997; Schaefer ve ark., 1973).

1.4. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Epizootiyolojisi Kanatlı mikobakteriyozisi tüm dünyada yaygın olarak görülür ve genelllikle M.

avium serotip 1-3 tarafından meydana getirir. Hastalık açık yetiştiricilik yapılan

yetişkin kanatlılarda görülür, ilerlemiş enfeksiyonlarda kanatlıların dışkılarıyla dışarı

saçılan bakteriler toprakta uzun süre canlı kalırlar (Yardımcı, 2006), ancak Japonya

gibi bazı ülkelerde bu hastalık bildirilmemiştir (Morita ve ark., 1994b). Bu hastalık

şu anda ticari tavukçulukta nadiren görülmektedir, çünkü alınan kontrol önlemleri

başarılı sonuçlar vermektedir (Gill ve Blandy 1986; Smith ve ark., 1987; Mutalib ve

Riddell 1988; Tantaş ve ark., 1990). Geçen 20 yılda, pek çok kanatlı

mikobakteriyozisi pet kuşları, geniş kanatlı toplulukları (örn. hayvanat bahçesi ve

yabani hayvan rezervleri), uçamayan çiftlik ve küçük kanatlı sürülerinde

bildirilmiştir (Singbeil ve ark., 1993; Hoop ve ark., 1996; Portales ve ark., 1996;

Painter, 1997; Doneley ve ark., 1999).

7

Çizelge 1.1. Farklı kanatlı türlerinden izole edilen mikobakteriyel izolatlar (Tell ve ark., 2001) Kanatlı türleri Mikobakteriyel izolatlar Anseriformes Çin kazı (Cygnopsis cygnodes M.avium Mandarin ördeği (Aix galericulata) M.avium complex Ahşap ördeği (Aix sponsa) M.intracellulare Columbiformes Güvercin (Columba livia f. Domestica) Mycobacteria Beyaz carneaux güvercini (Columba livia) M.avium Posta güvercini (Columba sp. ) M.avium serotype 2 Galliformes Tavuk (Gallus gallus) M.avium , M. fortuitum Tavuk (Gallus gallus) M.avium Renkli sülün (Phasianus colchius) M.avium Hindi ARB Gruiformes Whooping crane(Grus americana) M.avium serotype 1 Sandhill crane (Grus canadensis) M.avium serotype 1 Passeriformes Avrupalı çekirgekuşu (Staurnus vulgaris) M.avium Mavi-ve-beyaz flycather M. genavense (Canoptila cyanomelana) Zebra finch (Taeniopygia guttata) M. genavense Ada kanarya kuşusu (Serinus canaria) M. genavense Psittaciformes Yeşil Amerika papağanı (Ara chloropterus) M.tuberculosis Sarı papağan M. genavense (Amazona ochrocephala auropalliata) Portakal renkli papağan t (Amazona amazonica) M. genavense Raptors Kuzey goshawk (Accipiter gentilis) ARB Dişi şahin (Falco biamicus) M.avium serotype 2 Kırmızı kuyruklu şahin (Buteo jamaicenisi) M.avium serotype 2 Ratites Amerika devekuşu (Rhea americana) M.avium Amerika devekuşu (Rhea americana) M.avium complex Devekuşu (Ostruthio camelus) ARB Devekuşu (Ostruthio camelus) M.avium Kivi (Apteryx australis mantelli) M.avium Diğer Küçük flamingo(Phoenicopterus minor) M.avium serotype 1 Turaco (Musophaga sp. and Turaco sp.) M.avium-intracellulare complex Yaygın buzzard (Buteo buteo) M.avium serotype 2

8

1.4.1. Mikobakteriyozisin İnsidensi Kafes kuşlarında mikobakteriyel infeksiyonların insidensi tam olarak bilinmemekte

ancak türe, yaşa, yaşam koşullarına ve kuşların bulundukları ortamlara göre değişim

gösterdiği görülmektedir. Pek çok araştırıcı kafes kuşlarında ve diğer kanatlı

hayvanlarda tüberküloz insidensini yapılan nekropsiler sonucunda %0.5-%14

arasında bulmuştur (Keymer ve ark., 1982; Panigraphy ve ark., 1983; Portales ve

ark., 1996). Farklı mikobakteri türlerinin ve serotiplerinin insidensi hakkında az

miktarda bilgi mevcuttur. Çünkü etkenin kültüre edilememesi nedeniyle geçmişte bu

hastalığa ait bulgular sınırlı seviyede bulunmuştur. İsviçre’de 5345 kafes kuşunu

içeren geniş bir çalışmada hayvanlara nekropsi yapılmış ve mikobakteri infeksiyonu

%3.8 oranında bulunmuştur. Bu izolatların büyük çoğunluğunu da (%30.9) M.

genavense oluşturmuştur (Hoop ve ark., 1996).

1.4.2. İnfeksiyon Kaynakları Mycobacterium avium complex (MAC) içinde yer alan çevresel mikobakterilerin

ekolojisi önemlidir. Etkenler yaşam alanlarında patojenitelerini kaybetmeden

yaşayabilir. Bazı suşlar doğal biyotip aracılığı ile infeksiyon oluşturur ve bu

biyotipler hastalık geçişi için bir rezervuar kabul edilir. Etkenlerin bu patojenik

özelliklerine rağmen pek çok özellikleri saprofit etkenlerin özelliklerine benzer.

Üreme için geniş ısı aralıklarına sahip olmaları, 37°C’den ziyade 20°C’de üremeleri,

bulundukları çevreye adaptasyonu hızlandırır. Etkenlerin sentetik besiyerlerinde

üreme kapasiteleri yüksektir. MAC üyeleri pH 4-7.5 arasında iyi gelişim gösterirler.

Ancak optimal pH aralığı 5.4-6.5 arasındadır (Yoder, ve ark., 1999).

Yaşam alanlarına bakıldığında MAC içindeki mikobakteri türleri atık su, su

tankı, aerosol, protozoa, taze vejetasyon alanlarında, hayvanlarda ve insanlarda

bulunabilir. İnsan immun yetmezlik virusu ile infekte hastalarda bulunan pek çok

opurtunistik patojen arasında MAC üyeleri de bulunur ve Mycobacterium avium

subspecies avium (MAA) temel olarak immun yetmezliği olan hastalarda bir yönetim

9

problemi olarak ortaya çıkar. Taşınabilir su kaynakları da MAC infeksiyonu

açısından insanlar için primer kaynak olabilmektedir (Ristol ve ark., 1999; Morita ve

ark., 1994). Gıdaların da MAA geçişinde etkili olduğu ve muhtemel hastalık

kaynağının tavuklar olabileceği düşünülmektedir (Tantaş ve ark., 1990; Yoder, ve

ark., 1999).

1.4.3. Çevresel Koşullara Direnci Mycobacterium avium complex içindeki mikobakteriler çeşitli çevre koşulları altında

yaşayabilirler (Primm ve ark., 2004). Düşük pH, farklı ısılar, klor veya ozonla

müdahale, düşük oksijen seviyesi (Falkinham ve ark., 1984) koşulları altında

yaşayabilme özelliklerine sahiptirler. Bu nedenle, etkenler pek çok biyotipte

yaşayabilir ve besleyici yapıları kullanabilirler. Etkenlerin yaşadıkları çevreye

adaptasyonları mikobakterilerin geçirgen hücre duvarı, yavaş üreme gibi fizyolojik

karakterleri ile ilişkilir ( Rastogi ve Barrow 1994; Brennan ve Nikaido, 1995 ).

1.4.4. Hayvan Rezervuarı Mycobacterium avium complex’de bulunan mikobakteri türleri farklı hayvan

türlerinde hastalıklara neden olurlar. Bu hastalıklar konakçılara göre 3 bölüme

ayrılabilir. İlk bölümü vahşi ruminantlar, 2. bölümü vahşi olmayan ruminant grubu

ve son bölümü kanatlılarda görülen infeksiyonlar olarak tanımlanabilir (Tell ve ark.,

2001).

10

1.5. Konakçı Duyarlılığı Mikobakteriyozis hemen hemen tüm kanatlılarda infeksiyon oluşturur (Çizlege 1.1.).

Bulgular çalışmalara göre farklılık gösterebilmektedir. En duyarlı zoolojik kanatlı

ailesi içindeki türler; kazlar, gruiformes ve galliformes ailesi içindeki kuş türleridir

(Keymer ve ark., 1982).

Hejlicek ve Tremel (1995), yabani ve evcil kanatlılarda M.avium etkeninin

patogenezisi ve epidemiyolojisi üzerine çalışmışlardır. Araştırıcılar, kümes

hayvanlarının, papağan, sülün, keklik, martı (Larus atricella) türlerinin hastalığa çok

duyarlı olduğunu belirlemiştir. Hindiler ve tavuklar orta derecede duyarlı iken, kaz

ve ördeklerin daha dirençli olduğu görülmüştür. Kazların M. avium ile oral

infeksiyona çok dirençli olduğunu bildirmiştir. Buna karşın, Özcan ve ark. (2001)

kazlarda bir tüberküloz olgusu raporlamış ve iç organlarda nodüler lezyonları

gözlemlemişlerdir.

Bıldırcınlar M. avium etkenlerine çok duyarlı bulunmuştur. Deneysel olarak oral

ve intravenöz yolla yapılan çalışmalarda mikobakteriyozis infeksiyonu yaygın bir

şekilde gelişmiştir. Oysa tavuklardaki infeksiyonlar sadece intravenöz yolla

sağlanmıştır. Oral yolla M. avium infeksiyonunu takiben bıldırcınlardan yapılan

örneklemede % 75 oranında etken izole edilirken, tavuklarda bu oran % 13’e

düşmüştür. M. avium bıldırcınlarda % 25 oranında kültüre edilirken, tavuklarda oral

yolla infeksiyon sonrası etken kültüre edilememiştir. Araştırıcılar kanatlılar arasında

M. avium’a karşı oluşan humoral cevap farklılığını ELISA ile ölçmüşlerdir. Bunun

yanında sülünler de M. avium etkenlerine yüksek duyarlılık göstermektedirler. İki ayı

aşan bir periyotta infeksiyonun klinik formu %25 oranında görülürken, %50’sinde

ölüm şekillenmektedir (Gross ve ark.,1989; Morita ve ark., 1999).

11

1.6. Cinsiyet ve Yaş Erkek ve dişi hayvanlarda mikobakteriyel infeksiyonlara duyarlılık eşit oranda

bulunmuştur (Keymer ve ark., 1982; Cromie ve ark., 1991). Ancak M. avium

inokulasyonundan sonra dişi hindilerde erkek hindilere oranla duyarlılık daha fazla

görülmüştür (Hejlicek ve Tremel, 1995). Ayrıca 2 çalışmada papağan, muhabbet

kuşları ve serçegillerde infeksiyon az farkla da olsa dişilerde erkeklerden daha fazla

saptanmıştır. (Panigraphy ve ark., 1983; Hoop ve ark., 1993). Mikobakteriyozis genç

kanatlılardan çok yaşlılarda daha sık görülmektedir. (Mutalib ve Riddel, 1988;

Cromie ve ark., 1991).

Retrospektif bir çalışmada, kuğulardan yapılan örneklemelerde, erişkin

kuğularda ölüm %33 oranında görülürken, yavru kuğularda %4 oranında görülmüş,

yeni tüylenmeye başlamış olan kuğularda ise görülmediği gözlenmiştir. Yaşlı ve

genç hayvanlar arasında duyarlılık farkından çok infeksiyonun kronik bir seyir

göstermesi ve sinsi bir şekilde seyretmesi bulguları önemli hale getirmektedir (Tell

ve ark., 2001).

1.7. Ekonomik Önem Kanatlı mikobakteriyozisi direkt ve indirekt ekonomik kayıplara yol açabilir. Direkt

kayıplar mortalite veya yumurta üretiminin azalması ile üretimde azalma, kanatlı

itlafının gerekliliği (Bennett ve ark., 1999; Chevrier ve ark., 1999) ve kontrol

programlarının maliyetidir (Örn. hijyen ölçümleri yenileme ve bakım araçları, itlaf

ve yeniden üretim izleme, gözlem programları). Direkt ekonomik kayıplar küçük

işletmelerde daha çeşitli olabilir. Mutalib ve Riddell (1988), batı Kanada’daki küçük

kanatlı sürülerinde bir araştırma yapmış ve çiftliklerdeki ölüm oranının %80’lere

vardığını tespit etmişlerdir.

İndirekt kayıplar daha az gözlemlenir ancak daha hızlı gelişir. Bu durum

yetiştirme programındaki beyaz kanatlı ördek gibi değerli, nadir bulunan veya nesli

12

tükenen türlerde daha sık görülür. Hastalık vahşi yaşam bölgelerinde turizm

açısından da tehlike yaratabilir. Örneğin, Kenya’daki Bogoria ve Nakuru göllerinde,

flamingolarda (Phoenicopierus minor) meydana gelen bir salgın, 1993’de üç aylık

bir zaman periyodunda 18.500’ün üzerinde hayvanın ölümüyle sonuçlanmıştır (Kock

ve ark., 1999).

1.8. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Bulaşma ve Patogenezi Tavukları da içeren tüm infekte kanatlı türlerinde infeksiyon ağız yoluyla bulaşır.

(Tell ve ark., 2001). Bununla birlikte, nadiren aerojenik akciğer infeksiyonunun

ortaya çıkması (Thorel ve ark., 2001) ve infeksiyonun ve/veya MAA’nın yumurtalar

vasıtasıyla bulaşması da bildirilmiştir. Kanatlılarda bağırsak kanalında oluşan ilk

infeksiyon, genellikle patojenin ağız yoluyla tekrarlayan alımı ile oluşur (Thoen,

1994; Özcan ve ark., 2001).

Atipik mikobakteriyel infeksiyonun patogenezi genellikle klasik tüberkülozla

benzerdir (Morita ve ark., 1999). Bununla birlikte patojenitelerinde farklılık içerirler;

M. avium, pH 2.2’ ye kadar midedeki asidik ortama hem artan hem de sabit fazlarda

daha dirençlidir ve M. avium öncelikle enterositlerle intestinal mukozayı istila

ederken (Bermudez, 1994), M. bovis BCG ve M. avium subsp. paratuberculosis

intestinal mukozaya M hücreleri olarak adlandırılan Peyer Plaklarını çevreleyen

özelleşmiş hücreleri kullanır. Teorik olarak, mikobakteriyel infeksiyon konakçı

immun sistemi lokal veya genel olarak bozulduğunda ortaya çıkar. Mikobakteriyozis

öncelikli olarak granulomların şekillenmesiyle başlar ve ilerlemiş durumlarda bu

granulomlar sıklıkla tüberkül denilen tümör-benzeri kümeler şeklinde görülene dek

genişler (Mutalib ve Riddell, 1988; Morita ve ark., 1999; Dvorska ve ark., 2007).

13

1.9. Klinik Belirtiler 1.9.1. Ante-Mortem Bulgular Kanatlılarda mikobakteriyozis genellikle fekal-oral yolla yayılan kronik bir

hastalıktır ve ilerleyen kondisyon kaybına neden olmasıyla karakterizedir. Kanatlılar

normal gıda alımları sürmesine rağmen vücut ağırlıklarını kaybederler. Klasik

tanımıyla; aylar sonra ölümle sonuçlanan kronik zayıflık hastalığıdır. Etkilenen

kanatlılar zayıflamış, uyuşuk ve halsizdir. Derileri kötü durumdadır ve civcivlerde

ibik soluklaşır veya bazı durumlarda siyanotik bir hal alır (Panigraphy ve ark., 1983;

Mutalib ve Riddell, 1988; Gonzalez ve ark., 2002). Karaciğer kolaylıkla palpe

edilebilir (hem karın kaslarının atrofisi hem de karaciğer büyümesi sonucu) ve çeşitli

bağırsak lezyonlarıyla kalınlaşmış bağırsak lobları zayıf kuşlarda elle tutulabilir

(VanderHeyden, 1997a).

Mutalib ve Riddell (1988), görünüşte sağlıklı tavuklarda mikobakteriyozis ile ani

ölümlerin hepatik ruptur ve abdominal kavitedeki kan akımının engellenmesinin

sonucu olduğunu bildirmişlerdir. Kronik veya aralıklı diyare mikobakteriyozisli

kuşlarda ortak bir bulgudur. Bu bulgu, kanatlılarda doğal şekillenen

mikobakteriyozis olaylarındaki bulaşmada ağız-dışkı yolun tipik olduğunu kolaylıkla

açıklar ve bağırsak yolu büyük veya mikroskobik lezyonlar için ortak yerleşim

yeridir (Van der Heyden, 1997a; Mutalib ve Riddell, 1988).

Ortak olarak az görülen ancak sıklıkla rapor edilen bulgular kutanöz, subkutanöz

veya oküler granülamatöz lezyonlardır (Bowes, 1993; Morita ve ark., 1994a; Pocknel

ve ark., 1996; Washko ve ark., 1998). Hastalık kanatlılarda sıklıkla akciğer ile ilişkili

olmadığı için dispne ve diğer solunum belirtileri daha az görülür (Hoop ve ark.,

1993, Portales ve ark., 1996).

İnfraorbital sinüslerde, orofarenks veya tracheada glukamatöz kümeler ile

hırıltılı dispne birkaç klinik veya nekropsi olayında rapor edilmiştir (Tell ve ark.,

14

2001). Sinirsel bulgular, vertebral veya merkezi sinir sistemi ilişkisi sonucunda

nadiren bildirilir (Odiawo ve Mukurira, 1988). Mikobakteriyozis, etkilenen kanatlılar

klinik olarak normal gözüktüğü için çiftlik veya kümeste sinsi bir problem olabilir

(Davis ve ark., 1984; Painter, 1997). Çok çeşitli salgınlar bildirilmiş olsa da

(Gonzalez ve ark., 2002), kronik hastalık veya bir iki kuşun periyodik ölümleri daha

yaygındır (Mutalib ve Riddell, 1988).

1.9.2.-Post-Mortem Bulgular Kanatlı türlerinde kanatlı mikobakteriyozis lezyonları, sıklıkla karaciğer, dalak ve

bağırsaklarda görülen zaman zaman da farklı bir dokuyu etkileyebilen farklı

karakteristik özellik sergilerler. Doku tercihi, lezyonun tabiatı ve etkilenen kanatlı

türlerinin tür dirençliliği, mikobakteri türü, etkilenen kuşun bağışıklık durumu ve

bunun gibi çeşitli faktörlerle ile ilişkili de olabilir.

Nekropside kanatlılarda zayıflama, göğüs kası atrofisi ve iç yağın çok azalması

dikkati çeker. Karaciğer, dalak, bağırsaklar ve kemikiliği beyazdan griye değişen

çeşitli büyüklüklerde kazeöz nodüller (tüberkel) içerebilir. Tüberkeller bağırsak

kanalının iç serozasına dağılmış olabilir ve genellikle tüm bağırsak yüzeyi ile

ilişkilidir (Mutalib ve Riddell, 1988). Bir tüberkel ile bağırsak kanalının ülserasyonu

Mycobacterium spp.’nin bağırsak lumenine dökülmesine ve dışkıda bulunmasını

sağlar. Karaciğer en çok etkilenen organ iken bunu dalak ve bağırsaklar izler.

Yapılan iki çalışmada karaciğer, dalak, bağırsaklar ve kemikiliği civcivlerde de en

sık etkilenen organlardır (Robert ve Porter, 1998).

15

1.10. Hastalığın Teşhisi

1.10.1. Klinik Bulguları Mikobakteriyozisin ante-mortem tanısı, hastalığın teşhisi için yeterli değildir. Klinik

olarak ortaya çıkışı çok çeşitlidir, bununla birlikte pratikte tanı araçları oldukça

hassastır ve tüm kanatlı türlerine spesifite göstermemektedir. Hastalığın klasik tanısı

aylar süren kronik bir hastalık sonrası ölüm şeklindedir. Dispne ve diğer solunum

belirtileri, muhtemelen hastalık kanatlılarda sıklıkla akciğer ilişkili olmadığı için,

daha az görülür (Mutalib ve Riddell, 1988; Hoop ve ark., 1993; Portales ve ark.,

1996).

Evcil sürülerde hematolojik ve immunolojik değişiklikler sistemik

mikobakteriyozisde kullanışlı bir tanı aracı olabilir (Hawkey ve ark., 1990; Cromie

ve ark., 1993). Deri içi tuberkulin testi kanatlı sektöründe yıllardır sıklıkla

kullanılmaktadır, tam kan veya serumdan hemaglutinasyon testleri de

mikobakteriyozisli kanatlıların ayrımında kullanılmaktadır. Bununla birlikte,

komplement fikzasyon titreleri ve ELISA birkaç kanatlı türünde mikobakteriyel

infeksiyonun ayrımı için geliştirilen testlerdir (Başkaya ve ark., 1983; Cromie ve

ark., 1993).

1.10.2. Makroskobik Bulgular Tavuk ve hindilerde tüberküloz vücut ağırlığının azalması, tüylerin kabarması,

iştahsızlık, kemiklerde deformasyon gibi klinik belirtiler göstermektedir. Kanatlı

türlerinde kanatlı mikobakteriyozisi lezyonları, sıklıkla karaciğer, dalak ve

bağırsaklarda görülen zaman zaman da farklı bir dokuyu etkileyebilen farklı

karakteristik özellik sergilerler. Doku tercihi, lezyonun tabiatı ve etkilenen kanatlı

türlerinin tür dirençliliği, mikobakteri türü, etkilenen kanatlının bağışıklık durumu ve

bunun gibi çeşitli faktörlerle ile ilişkili de olabilir. Karaciğer en çok etkilenen organ

iken bunu dalak ve bağırsaklar izler (Tell ve ark., 2001).

16

Yapılan iki çalışmada karaciğer, dalak, bağırsaklar ve kemik iliği civcivlerde de

en sık etkilenen organlardır (Tantaş ve ark., 1990; Morita ve ark., 1994a; Beytut ve

ark., 2001). Tüberkülozlu tavuklar üzerinde yapılan nekropsi bulguları Shitaye ve

ark. (2008), tarafından değerlendirilmiş, bu araştırıcılar karaciğer, dalak, akciğer,

bağırsak, böbrek, kalp ve kemik iliğinde tüberküloz lezyonlarına rastladıklarını rapor

etmişlerdir. Tadesse ve ark. (2004), 5 tüberkülozlu tavukta lezyonların %33.3

karaciğer, %83.3 dalak, %83.3 bağırsak ve %16.7 kemik iliği oranında saptadıklarını

bildirmişlerdir. Tüberkülozlu hindiler üzerinde nekropsi bulguları Ghani (1968) ve

Akay (1980) tarafından değerlendirilmiş, bu araştırıcılar karaciğer, dalak, akciğer,

bağırsak ve kemik iliğinde tüberküloz lezyonlarına rastladıklarını rapor etmişlerdir.

Akay (1980), 22 tüberkülozlu hindinin yapılan nekropsilerinde, tüberküloz

lezyonlarının %81.8 karaciğer, %77.2 dalak, %50 akciğer, %22.7 bağırsak, %9.0

böbrek ve %4.5 oranında bezli mide ve kalpte bulunduğunu saptamış ve hindilerde

lezyonların en fazla lokalize olduğu organı karaciğer olarak belirlemiştir.

Klinik ve nekropsi bulgularına bakılarak hastalığın kesin tanısını koymak

mümkün değildir. Bu bakımdan infeksiyonla karışabilecek hastalıkların göz önüne

getirilmesi gerekmektedir. Kanatlı mikobakteriyozisi; aspergillozis, koligranuloma,

intestinal koksidiozis, lenfoid leukozis, Marek hastalığı, tifo ve neoplastik

hastalıklarla karışmaktadır. Bu sayılan infeksiyonlardan ayrımı bakteriyolojik

yoklamalarla kolaylıkla yapılabilir. Mikobakterilerin asido-resiztans bir özelliği

olmasına karşın, diğer bakteriyel etkenler bu özelliğe sahip değillerdir, lezyonlardan

yapılan frotilerde bol miktarda ve kümeler halinde mikobakteri görmek mümkündür

(Akay, 1999).

1.10.3. Mikroskobik Değerlendirme Mikobakteriler sporsuz, hareketsiz çomaklardır. Kompleks lipidden zengin hücre

duvarı ve kalın mikolik tabaka organizmaya aside dirençlilik (asido-rezistans)

özelliği verir. Bu durum dilue asitle muamele edildikten sonra fuksin gibi aril-metan

boyalarla tespit edildiğini gösterir. Biyopsi veya dışkı materyalinden etkenin tespiti

17

için kullanılan metot Ziehl-Neelsen (karbol-fuksin) boyama tekniğidir.

Mikobakteriler çomak şekillidir; M. avium pleomorfik eğilimli olduğu için kokoid

veya uzun boncuk şeklinde görülebilir (Aranaz, 1997; Chaskes, 2008). İnfeksiyonun

süre veya şiddetine bağlı olarak, bu asido-rezistans organizmalar klinik örneklerde

intrasellüler (doku makrofaj veya epiteloid hücre içlerinde) veya ekstrasellüler

bulunabilirler. Ziehl-Neelsen gibi asid-fast boya kullanımında çomaklar pembe-

kırmızı renklidir. Eğer rutin boyalar kullanılırsa boya almayan (‘hayalet’) çomaklar

intrasellüler olarak görülebilir (Huebner ve ark., 1993; VanderHeyden, 1997a).

1.10.4. Kültür Kültür, kanatlılarda mikobakteriyel infeksiyonu doğrulamanın kesin yoludur,

bununla birlikte bu tekniğin pratikte bazı sınırları mevcuttur. Kanatlılar için patojen

mikobakteriler en az 15 saatlik replikasyon süresine ihtiyaç duyan, yavaş üreyen

organizmalardır. Gözle görülür koloniler iki ile dört hafta arasında besiyerinde ortaya

çıkarlar ve bazı M. avium suş kolonileri altı ayda identifiye edilebilirler.

Mikobakteriler özel kültür besi yerlerine ihtiyaç duyar ve gelişmeleri için besin,

sıcaklık ve oksijen ihtiyaçları türlere göre oldukça değişiklik gösterir (Atlas, 2004).

Tüberküloz yönünden lezyonlu organlardan kültürel yoklamanın yapılabilmesi

için özel bir işlem uygulanması gerekmektedir (Petroff yöntemi). Bu amaçla en çok

kullanılanı %4 NaOH metodudur. Mycobacterium avium complex en iyi

Lowenstein–Jensen, Herrold’s besi yeri, Middlebrook 7H10 ve 7H11 veya %1

sodyum piruvat katılmış Coletsos gibi besi yerlerinde ürer. Bazen M.

paratuberculosis ve M. silvaticum izolasyonu için mikobaktin ilavesi de gerekebilir.

Kültürler en az sekiz hafta inkube edilmelidir. Tipik olarak M. avium ‘smooth’

koloniler oluşturur, 2-4 haftada kabaca değişikliklikler şekillenebilir. Daha kısa

inkubasyon süreleri BACTEC sıvı kültür sistemi kullanılarak elde edilebilir (Benson

ve Ellner, 1993; Atlas, 2004).

18

Bu nedenle örnekler laboratuvara gönderilerek organizmaların kültürü

yapılmalıdır. Kültüre edilen mikobakterilerde uygun protokol ve besiyeri

kullanılmasına rağmen sıklıkla herhangi bir gelişme meydana gelmeyebilir (Grange

ve ark., 1996). Bir kanatlıda Z-N boyama ile doğrulanan tipik mikobakteriyozis

lezyonları olabilir ancak, iyi kültüre edilemediğinden yanlış negatif sonuçlar

alınabilir. Mikobakteriyel kültür özellikle dışkı materyali kullanıldıysa, genellikle

düşük sensitiveye sahiptir. M. genavense için katkı maddesi olmadan pH 6.0 ve

düşük oksijen basınçlı BACTEC sistemi tavsiye edilmektedir (Realini ve ark., 1997;

Realini ve ark., 1998).

Mycobacterium avium complex üyelerinde üreme, genelde, yavaş bir şekildedir

ve bir haftadan on iki haftaya kadar sürebilir. L-J, Middlebrook 7H9 ve Middlebrook

7H10 besiyerleri 37ºC de inkube edilmelidir. Bu amaçla gliserin içeren L-J besiyeri,

ADC içeren Middlebrook 7H9 buyyon ve OADC içeren Middlebrook 7H10 agar

kullanılmıştır. Mikobakterilerin identifikasyonu koloni ve mikroskobik

morfolojilerine göre yapılır. Makroskobik (koloni morfolojisi) ve mikroskobik

özellikleri belirlenen koloniler, Z-N boyama yöntemiden yaralanılarak identifiye

edilir. Besiyerinde şekillenen koloniler, üreme hızı, durumu, şekli, ön yüzeyindedeki

pigmentasyon özellikleri dikkate alınarak makroskobik olarak kayıt edilir.

Mikroskobik muayenede ise, kültürden hazırlanan preparatlar Z-N boyama yöntemi

ile mikroskopta incelenir (Brown, 2001; Atlas, 2004).

Aranaz ve ark. (1997), kanatlı mikobakteriyozisinin teşhisinde, klinik bulguların,

materyalin direkt mikroskopi sonuçlarının, koloni görünümlerinin, mikroskobik

morfolojisi ve varsa etkenin özel karakterlerinin tümünün dikkate alınmasının yaralı

olacağını bildirmişlerdir.

Stager ve ark.(1991), L-J, zenginleştirilmiş Middlebrook 7H11 agarın

mikobakteriyozis teşhisinde etkinliklerini karşılaştırmak amacıyla 1184 tüberküloz

şüpheli materyali inceledikleri çalışmalarda; Middlebrook 7H (%91.7) besiyerinin L-

J (%83.3)’e göre daha iyi sonuçlar verdiğini ortaya koymuşlardır. Ayrıca

19

mikobakteri türlerinin identifikasyonu amacıyla, Wilson ve ark. (1995), L-J ve

Middlebrook 7H-selektif besiyerlerini kullanmışlardır. Karşılaştırmak amacıyla 580

mikobakteri izolatından yaptıkları ekimlerde; Middlebrook 7H (%81) besiyerinin L-J

(%40)’e göre daha iyi sonuç verdiğini bildirmişlerdir.

1.10.5. Moleküler Tanı Son yıllarda, gelişen moleküler teşhis ve tiplendirme yöntemleri kanatlı patojeni

M.avium’larla ilgili olarak yapılan araştırmalarda sıklıkla kullanılmıştır. Spesifik

DNA bölgesinin çoğaltılarak tanımlanmasını sağlayan Polimeraz Zincir Reaksiyonu

(PCR) ve ilgili teknikler mikobakterinin tanısında yaygınlık kazanmaktadır. Konuyla

ilgili bir çok teknik olmasına karşın temel prosedür mikobakteriyel nükleik asitlerin

elde edilmesi, PCR veya farklı bir teknik kullanarak spesifik genin amplifikasyonu,

hedef antijen veya gen sekansının identifikasyonudur (Telenti ve ark., 1993; Tell ve

ark., 2003a). Bu teknikler besiyerinde üreyen organizmalara, klinik materyale (dışkı,

biyopsi veya nekropside alınan doku örnekleri) ve hatta formalinle tespit edilmiş,

parafine gömülmüş kısımlara uygulanabilir (Bascunana ve Katinka, 1996; Aranaz ve

ark., 1997; Ikonomopoulos ve ark., 2009).

Çeşitli konvansiyonel PCR protokolleri kanatlı örneklerinde Mikobakteriyel

DNA’yı tespit etmek için kullanılmıştır. Kullanılan tanı tekniklerinden daha hızlı

sonuç vermesinin yanında (bir ile üç gün arası) diğer avantajları, mikobakterilerin

örnekte çok az sayıda bulunduğu durumlarda da tespit edebilme yeteneği ve

mikobakteriyel türlerin doğru identifikasyonudur (Hoop ve ark., 1996; Tell ve ark.,

2003a). Mycobacterium avium complex ile ilgili çalışmalarda farklı yöntemler

kullanılmaktadır. Bu yöntemler arasında PCR ve RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphisms) tekniklerinin daha hızlı olduğu belirlenmiştir (Kunze ve

ark., 1992; Pavlik ve ark.,2000; Dvorska ve ark., 2003).

Hoop ve ark. (1996) yaptıkları çalışmada, klinik materyallerden PCR ile kanatlı

mikobakteriyozisi varlığını saptamayı amaçlamışlardır. Hayvanlardan aldıkları

20

karaciğer, dalak ve bağırsak örneklerinden 16S-rRNA genine spesifik primer

kullanarak M.avium complex, M. genavense, M. tuberculosis, M.gordonae,

M.fortuitum ve M. nonchromogenicum türlerine spesifik DNA’ları hızlı ve etkili bir

biçimde saptamışlar ve bu çalışmanın kanatlılardaki en sık görülen

mikobakteriyozisin varlığını belirlemede yararlı olduğunu bildirmişlerdir.

Tell ve ark.(2003b), kanatlı örneklerinden real-time PCR yöntemi ile

Mycobacterium avium complex ve M.genavense saptamışlardır. Bu çalışmada real-

time PCR bulguları, konvansiyonel PCR bulgularına göre çok daha avantajlı

bulunmuştur.

Shitaye ve ark. (2008), 330 hasta tavuk örneğinden 124 M.avium subsp. avium

(MAA) serotip 2 ve genotip IS901+ ve IS1245+ PCR pozitifliğini tanımlamışlardır.

Hayvanlardan aldıkları 288 dokudan 103 MAA ve 21 dışkı örneklerinden 9 MAA

izolasyonu bildirmişlerdir. Benzer bir çalışmada Ikonomopoulos ve ark. (2009),

sağlıklı tavuk dokularından kanatlı mikobakteriyozisini PCR ile tespit etmişlerdir.

Hayvanlardan karaciğer, dalak ve gonad dokularından 16S-rRNA (Mycobacterium

spp. için), IS1245 (M.avium complex için) ve IS901 (MAA için) genine spesifik

primerler kullanarak spesifik DNA’ları saptamışlardır.

1.11. Kanatlılarda Mikobakteriyozisin Tedavisi Mikobakteriyel infeksiyonlarda antimikrobiyel tedaviye dair bilgi kısıtlı ve sıklıkla

insanlar ve klinik çalışmalar gibi in vitro çalışmalara yöneliktir. Terapötik sonuçları

etkileyebilen faktörler, kanatlının bağışıklık ve genel sağlık durumu, mikobakteriyel

yük, türlerin varlığı, önceki ilaç tedavisi ve ilaç duyarlılığını içerir. Kanatlı

mikobakteriyozisinin tedavisi tartışmalı ve aslında uygunsuzdur. Kombinasyonda

potansiyel zoonotik risk ile antimikobakteriyel ilaçların kuşlarda tedavi amacıyla

kullanımının önüne geçilmelidir. Mycobacterium avium antimikobakteriyel ilaçlara

karşı oldukça dirençlidir (Van der Heyden, 1997b; Tell ve ark., 2001).

21

Hasta insanlardan izole edilen Mycobacterium avium complex organizmaları in

vitro ortamda rifampicin, rifabutin, ethambutol, amikacin, azithromycin,

clarithromycin, clofazimine ve ciprofloxacin’e karşı duyarlıyken, isoniazid ve

pyrazinamide’e karşı dirençli bulunmuştur. Kanatlılarda bu ilaçların çoğunun

farmakokinetiği bilinmemektedir. Bununla birlikte kuşlarda yapılan tedavinin

başarılı olduğunu gösteren çalışmalar vardır. Kuşlarda mikobakteriyozisin başlangıç

tedavisi olarak rifabutin (56mg/kg/gün), ethambutol (56-85mg/kg/gün), veya

azithromycin (43mg/kg/gün) yada clarithromycin (85mg/kg/gün) kombinasyonunu

önerilmektedir (Van der Heyden, 1997b).

1.12. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Kontrolü Kanatlı endüstrisinde mikobakteriyozis için yönetim uygulaması çevredeki kuşların

kontrol altına alınarak hastalığı elimine etmeyi amaçlar. Bu uygulamalar başlıca iki

maddeye dayanır.

a) İdentifikasyon ve eliminasyon veya infekte kanatlıların kalıcı olarak sürüden

ayrılması

b) Katı hijyen uygulamaları ile dışkı, toprak ve diğer potansiyel kontamine

materyalin kanatlılarla temasını en aza indirmek.

Bu prensipler mikobakteriyozisin etkili kontrolü için pet kuşları, özel ve ticari

kuşhaneler ve zoolojik topluluklar için uygulanabilir (Gill ve Blandy, 1986; Thorel

ve ark., 1997).

Kanatlı tüberkülozunu kontrol altına almak için genelde kabul edilen metotlar

tuberkulin testi kullanılması, kontamine barınak ve ekipmanın değiştirilmesi ve

kontamine çevreden yeni sürünün izole edilmesi ile infekte kanatlıların

identifikasyon ve eradikasyonunu içerir. Kalabalıktan ve diğer stres faktörlerinden

kanatlıları uzak tutma ile dengeli ve yeterli beslenmelerinin sağlanması da bu

hastalığın etkisini ve insidensini en aza indirmek için önemlidir. Temas halinde olan

kuşlar en az on iki ay boyunca ayrı tutulmalı ve düzenli olarak test edilmelidirler.

Klinik veya bakteriyolojik infeksiyon belirtileri gösteren kuşlar grubun geri

22

kalanından ayrı tutulmalıdır. İyi bakım koşulları da mikobakteriyozisin kontrolünde

oldukça etkilidir (Gill ve Blandy, 1986; Mutalib ve Riddell, 1988; Hoop, 1997).

Kafesler ile tüm su ve yem kapları günlük olarak temizlenerek dezenfekte

edilmelidir. Kontamine olmuş dışkı, çöp, bitki materyalleri ve organik atıklar

kafesten hemen uzaklaştırılmalı, yakılmalı veya dezenfekte edilmelidir. İnfekte

kümeslerde toprağın üst kısmı uzaklaştırılmalı, bu toprak ve altı pH’sı M. avium’un

üremeyeceği düzeye inene kadar kireçlenmelidir. Personel infekte kanatlılar için

uygun önlemleri alabilecek ve infekte kuşlardan kontamine materyalin yayılmasını

engelleyebilecek durumda olmalıdır. Stratejik olarak yerleştirilmiş dezenfektanlı

ayak banyoları kontamine materyalin bir bölgeden diğerine yayılımını engellemeye

yardımcı olabilir. Sandıklar, tekerler, fıçılar gibi diğer potansiyel fomitler de

gözönünde bulundurulmalıdır (Gill ve Blandy, 1986; Tell ve ark., 2001).

1.12.1. Dezenfeksiyon Mikobakteriler biyositlere (dezenfektan) karşı diğer sporsuz bakterilerden çok daha

fazla dirençlidir ve hastalığın eliminasyonunda en büyük problem etkenin toprakta

yaşayabiliyor olmasıdır.

Aşağıdaki bileşenlerin antimikobakteriyel aktivitesi vardır:

- alkoller

- aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, succinaldehit ve glyoxal)

- halojenler

- peroksijenler

- fenoller

- Kemosterilize gazlar (etilen oksit ve betapropiyolakton) (Russell, 1996;

Thorel ve ark., 1997).

Bununla birlikte yüksek konsantrasyonlarda olmasına rağmen klorheksidin ve

kuaternar amonyum bileşenleri sadece mikobakteriyostatiktir. Herhangi bir biyositle,

antimikrobiyel aktivite konsantrasyon ve sıcaklıkla birlikte arttırılır. Yine de, iyi etki

23

için uzun sure temas gerekebilir. Klorheksidin ve kuaternar amonyum bileşenleri

organik maddede en az etkili olanlardır (Russell, 1996).

1.12.2. Aşılama Deneysel çalışmalarda kullanılan aşılar BCG (M. tuberculosis için insan aşısı)

bakımından test edilen ve M. avium’un ölü veya inaktive edilmiş suşlarını içeren

aşılardır. Kuşlarda aşı etkinliğini arttırmak için yeni doz ve zamanlama denemeleri

sürmektedir. Ölü Mycobacterium vaccae Cairinini’yi (tünek ördeği) kanatlı

tüberkülozundan korumuş (p<0.02) fakat istatistik olarak diğer taksonomik gruplarda

belirgin koruma elde edilememiştir (Cromie, ve ark., 2000). Şu anda kanatlılarda

mikobakterilere karşı hiçbir ticari aşı kullanılmamaktadır.

Bu çalışmanın amacı, tavuk ve hindi sürülerine ait iç organ ve dışkı örneklerinden

kanatlı tipi tüberküloz etkenlerinin varlığının izolasyon ve moleküler yöntemle

(PCR) teşhisidir.

24

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Gereç 2.1.1. Standart Suş Referans suş olarak Mycobacterium genusuna ait olan Mycobacterium avium subsp.

avium kullanıldı. [(DSM-No. 44156) tavuk izolatı, German Collection of

Microorganisms and Cell Cultures-DSMZ; InhoffenstraBe 7B, 38124,

Braunschweig, Almanya].

2.1.2. Örneklerin Toplanması Bu çalışmada, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim

Dalı’na rutin muayene amacıyla getirilen 53 kanatlı (45 adet 18 aylıktan büyük

yumurtacı tavuk ve 8 adet 18 aylıktan büyük hindi) ile mezbahada kesilen 50

kanatlıya (40 adet 18 aylıktan büyük yumurtacı tavuk ve 10 adet 18 aylıktan büyük

hindi) ait toplam 103 kanatlının organ (karaciğer, dalak, bağırsak, kalp, akciğer ve

gonad) ve dışkı örnekleri mikobakteriyozis varlığı yönünden incelendi. Çalışmada

toplam 385 organ ve 103 dışkı materyali kullanıldı (Çizelge 2.1.). Örnekler 50 farklı

kanatlı işletmesinden sağlandı. Mezbahalarda tavuklar ve hindiler her bir kümes için

tesadüfi örnekleme metoduyla sorumlu veteriner hekim ve sahiplerinin bilgileri

eşliğinde klinik olarak sağlıklı ve hasta kanatlılar arasından seçildi. Materyal toplama

işlemi Haziran 2008 ile Şubat 2009 tarihleri arasında yapıldı. Her bir kanatlıya ait organ örneği 20 ml’lik vida kapaklı ve polietilen kaplarda

tutuldu, laboratuvara 4°C’de muhafaza edilerek getirildi. Örnekler −18°C’de

donduruldu ve işleme aşamasına kadar bu şekilde saklandı. Aynı kanatlılardan

25

toplanan taze dışkı materyalleri 5 ml’lik tüplerde 1 ml fosfat tampon tuzu (PBS)

solüsyonu içerisinde muhafaza edildi (Tell ve ark., 2003a; Portales ve ark., 1996).

Çizelge 2.1. Materyal kaynakları ve alınan örnek sayıları

Örnekler

Materyal kaynakları

Tavuk sayısı

Organ örnekleri Dışkı örnekleri Toplam

Ticari Tavukçuluk

40 153 40 193

Köy Tavukçuluğu

45

160

45

205

Toplam

85

313

85

398

Ticari Hindiler

10

40

10

50

Köy Hindileri

8

32

8

40

Toplam

18

72

18

90

2.1.3. Kullanılan Besiyerleri ve Boyalar Löwenstein-Jensen Medium Base (Merck, KGaA 64271) Besiyeri Bileşeni (g/litre) Asparajin…..........................................................................3.6 g

Monopotasyum Fosfat …… ................................................2.5 g

Magnezyum Sülfat… ..........................................................0.24 g

Magnezyum Sitrat.. .............................................................0.6 g

Patates Unu .......................................................................30.0 g

Malaşit Yeşili.......................................................................0.4 g

Ticari olarak temin edilen besiyerinden 37.4 g alınarak, 600 ml distile su ve 12

ml gliserol ilave edildi. Sterilizasyon amacıyla 121°C’de 15 dakika otoklavda

tutuldu. Besiyeri 50°C’ye kadar soğutularak aseptik olarak yumurta katıldı. Hava

kabarcıkları oluşmasına izin vermeden yumurta karıştırıldı. Besiyeri uygun steril

26

vida kapaklı tüplere bölündü. Yatay pozisyonda 85°C’de 45 dakika bekletildi.

Koagülasyon olduktan sonra tüpleri buzdolabında saklandı.

Middlebrook 7H10 Agar (Difco) (900 ml için): Amonyum Sülfat ................................................... 0.5 g

Monopotasyum Fosfat .............................................. 1.5 g

Di-sodyum Fosfat..................................................... 1.5 g

Sodyum Sitrat............................................................ 0.4 g

Magnezyum Sülfat....................................................25.0 mg

Kalsiyum Klorür ........................................................0.5 mg

Çinko Sülfat .............................................................. 1.0 mg

Bakır Sülfat ............................................................... 1.0 mg

L-Glutamik Asid (sodyum tuzu) .............................. 0.5 g

Demir Amonyum Sitrat .............................................0.04 g

Piridoksin Hidroklorid............................................... 1.0 mg

Biyotin ...................................................................... 0.5 mg

Malaşit Yeşili..........................................................250.0 µg

Agar ......................................................................... 15.0 g

Middlebrook OADC Enrichment (BBL) (1 Litre için): Sodyum Klorür......................................................... 8.5 g

Dekstroz....................................................................20.0 g

Bovine Albumin (Fraksiyon V) ................................ 5.0 g

Katalaz ...................................................................... 0.03 g

Oleik Asit .................................................................. 0.6 ml

50 - 55 °C’ ye kadar soğuduğunda aseptik olarak 100 ml Middlebrook OADC

Enrichment eklendi.

Middlebrook 7H9 Broth (Difco) (900ml için): Amonyum Sülfat ...................................................... 0.5 g

L-Glutamic Asid .......................................................... 0.5 g

27

Sodyum Sitrat................................................................0.1 g

Piridoksin ..................................................................... 1.0 mg

Biyotin ......................................................................... 0.5 mg

Di-sodyum Fosfat.................................................. ….. 2.5 g

Mono-potasyum Fosfat..................................................1.0 g

Demir Amonyum Sitrat................................................. 0.04 g

Magnezyum Sülfat..................................................... ...0.05 g

Kalsiyum Klorür....................................................... … 0.5 mg

Çinko Sülfat.................................................................. 1.0 mg

Bakır Sülfat................................................................. ..1.0 mg

Middlebrook ADC Enrichment (BBL) (1 litre için): Sodyum Klorür..................................................................8.5 g

Bovine Albumin (Fraksiyon V) ..................................... 50.0 g

Dekstroz...........................................................................20.0 g

Katalaz...............................................................................0.03 g

45°C’ye kadar soğuduğunda aseptik olarak 100 ml Middlebrook ADC

Enrichment eklendi.

Sabouraud Dekstroz Agar (SDA), Merck, VM259638 Dekstroz ………………………………………………..40 g.

Pepton…………………………………………………. 10 g.

Agar …………………………………………………….15 g.

Distile su……………………………………………. 1000 ml

28

Kristal violet içermeyen MacConkey agar (Difco) (1 litre için)

Pepton......................................................................................20.0g

Laktoz......................................................................................10.0g

Safra tuzları................................................................................5.0g

Sodyum klorür............................................................................5.0g

Agar.........................................................................................12g

Neutral red.................................................................................0.05g

Yukarıdaki besiyerlerinin ticari karışım 1000 ml distile su ile karıştırılıp

eritildikten sonra 121°C’de 15 dakika otoklavda steril edildikten sonra kullanıldı.

Ziehl-Neelsen Boyama Bileşenleri • Konsantre Karbol Fuksin Fuksin………………………………………………..1.0 g

Etanol % 95 (v/v)……………………………...........10.0 ml

Fenol ………………………………………………..5.0 g

D.S ……………………………………………….100.0 ml

• Metilen Mavisi Metilen mavisi……………………………………...…8.0 g

Etanol % 95 (v/v)……………………………………300.0 ml

Potasyum hidroksit…………………………………... 0.13 g

D.S……………………………...…………………1300.0 ml

• Asit- Alkol (Dekolarizasyon) Konsantre HCl asit...………………………………….8.0 ml

Ethanol % 95...............................................................97.0 ml

29

2.1.4. Bakteriyolojik Muayenelerde Kullanılan Cihazlar

• Etüv (EN120, Nüve, Türkiye)

• Fırın ( Fu-Berlin, Almanya)

• Mikroskop (Olympus-CX21, Japonya)

• Otoklav (Medexport-TK-100-2, Rusya)

• Santrifüj (JANETZKI-T30, Almanya)

• Vortex (FISONS, İngiltere)

2.1.5. Primerler Primerler The Midland Şirketinin (A.B.D) ürünlerini pazarlayan Bio-Kim Group

firmasının Ankara temsilciliğinden alındı. Primerlerin açık formulü aşağıda

verilmiştir (Çizelge 2.2).

Çizelge 2.2. Çalışmada kullanılan primerler

Çalışmada kullanılan primerler

Bakteri türleri Primer isimleri Primers sekansları (5´------------3´) Ürün Kaynak Boyutu(bp) Makale Mycobacterium spp. 16SrRNA F,25-mer 5´-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3´ 543 Huard

R,28-mer 5´-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3´ ve ark.2003 M. avium complex IS1245 F,19-mer 5´-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3´ 427 Guerrero ve

R,18-mer 5´-GCCGCCGAAACGATCTAC-3´ ark. 1995

M. avium avium IS901(nested-PCR) NP1, 20-mer 5´-TTAACACGATGAGTCATGCG-3´ 509 Pavlik ve NP2, 20-mer 5´-GCTTATCGATGTCCTTGATC-3´ ark. 2000 NP3, 19-mer 5´-GTACCCGGCGAAGACCTGG-3´ 376 NP4, 19-mer 5´-AAGTCCAGCAGCCGTGCTG-3´

2.1.6. PCR testinde Kullanılan Cihazlar ve Ekipmanlar DNA Thermal Cycler (Biyometra, Almanya)

Elektroforez Tankı ve Güç Kaynağı (Wealtec elite 3000 plus, A.B.D.)

30

UV Transillüminatörlü Bilgisayarlı Jel Dokümantasyon Sistemi (Gene Genius, Bio

Imaging System, İngiltere)

Biyogüvenlik Kabini (Bioair Instruments, Aura 2000, MAC, İtalya)

Soğutmalı Santrifüj (Hettich, Almanya)

Vortex (Fine Vorex, Kore)

Hassas Terazi (Scaltec sbc41, Almanya)

Mikrodalga Fırın (AKAI, MW-GS0923DP, Çin Halk Cumhuriyeti)

pHmeter model 420A (Orion, A.B.D.)

Dry Block Heating Thermostat (Life Sciences, TDB-100, A.B.D.) 2.2. Yöntem 2.2.1. Nekropsi Mikobakteri izolasyonu için tavuk ve hindilerden sağlanan 385 organ materyali

kullanıldı. Tavuk ve hindilerin nekropsi işlemlerinden sonra karaciğer, akciğer,

dalak, kalp, bağırsak ve gonad aseptik koşullarda alındı ve lezyonların varlığı

yönünden incelendi. Organlardan preparatlar hazırlandı ve asido-rezistans

mikroorganizmaların varlığını incelemek için Z-N boyama yapıldı. Tüm organlardan

hazırlanan inokulumlar gliserinli L-J, Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H9

besiyerlerine ekildi ve 37°C’de inkubasyonda tutuldu.

2.2.2. Ziehl-Neelsen Boyama Örneklerden yapılan preparatların incelenmesinde ve izole edilen suşların ve

pasajları yapılan kültürlerin saflık kontrollerinde Ziehl-Neelsen boyama yöntemi

uygulandı. Hazırlanan preparatların alt yüzü alevin mavi kısmına yukarıdan aşağıya

doğru hareket ettirildi, bu işlem birkaç kez tekrarlandı ve sonra soğutuldu. Preparatın

üzerine fenollü bazik fuksin döküldü, alttan kaynamayacak şekilde ısıtıldı. Su ile

31

yıkandıktan sonra asit ve alkol içinde 1 dakika renksizleştirme yapıldı. Tekrar su ile

yıkandı ve metilen mavisi ile 2 dakika muamele edildi. Preparat su ile yıkandı,

kurutulduktan sonra immersiyon objektif ile incelendi. Bu boyama yömtemi ile aside

dirençli bakteriler koyu parlak kırmızı renkte ve diğer bakteriler mavi renkte boyandı

(Goldman and Green, 2009).

2.2.3. Standart Suşların Aktivasyonu M. avium subsp. avium (DSM-No. 44156) suşu gliserollü Lowenstein-Jensen

Medium’ (Merck, KGaA 64271), Middlebrook 7H10 Agar (Difco) ve Middlebrook

OADC Enrichment (BBL) ile Middlebrook 7H9 Broth (Difco) ve Middlebrook ADC

Enrichment (BBL) besiyerlerine ekildi. İki ile 4 hafta süre ile 37ºC’de

gerçekleştirilen inkubasyon sonrası, Ziehl-Neelsen (Z-N) boyama yöntemi ile

boyanarak ışık mikroskobunda asido-rezistans bakteri varlığı incelendi. Bakteri

kültürleri tüplere bölünerek, steril distile su ile süspanse edildi (Brown, 2001; Atlas,

2004). DNA ekstraksiyonu için bir öze dolusu bakteri kültürü 200-300 µl distile su

ile karıştırıldı, 98ºC’de 30 dakika kaynatıldı ve 12000 rpm’de 10 dakika santrifüj

işleminden sonra, 2 µl supernatant template DNA olarak PCR’da kullanıldı (Hoop ve

ark., 1993).

2.2.4. İzolasyon ve İdentifikasyon

2.2.4.1. Organ Örnekleri

Mikobakterilerin izolasyon ve identifikasyonu için tekniğe uygun olarak hazırlanan

organ örnekleri kullanıldı. Bu amaçla, 1-2 g organ örneği 10-15 ml PBS (pH 7.2)

içerisinde homojenize edilerek inokulum hazırlandı. İnokulum steril gazlı bez ile

filtre edilerek, homojenizasyondan sonra 50ml’lik plastik tüplere transfer edildi.

Dekontaminasyon amacıyla eşit hacimde 1N %4’lük NaOH solüsyonu ile 10-20

32

dakika muamelesi yapıldı. Nötralizasyon amacıyla 1.25 N HCL veya yeterli miktarda

fenol kırmızısı (40mg/litre, sarı renk oluşuncaya kadar) (kırmızı rengin görülmesi

nötralizasyonun tamamlandığını gösterir) ile birlikte %14’lük monopotasyum fosfat

(KH2PO4) ile muamele edildi. 3000- 4000xg’de 20-30 dakika santrifüj sonrası

peletlere 1ml Middlebrook buyyon veya 1 ml distile su ilave edildi. İki tüp gliserinli

Lowenstein-Jensen besiyeri, 2 tüp Middlebrook 7H10 agar ve 2 tüp Middlebrook

7H9 buyyon (Middlebrook OADC Enrichment BBL ve Middlebrook ADC

Enrichment BBL ilave edilerek) besiyerlerine inokule edildi ( Salfinger ve Kafader,

1987; Grange ve ark., 1996; Manarolla ve ark., 2007 ). Katı ve sıvı besiyerleri

37°C’de inkube edilerek ve ilk 48 saat sonunda kontaminasyon varlığı yönünden

incelendi. Besiyerleri haftada 1 kez olmak üzere 12 hafta boyunca mikobakteri

kolonileri yönünden kontrol edildi (Quinn, ve ark., 1999).

Lezyonlu organlardan mikotik etkenler yönünden ayırım amacıyla Sabaroud

Dextrose Agar (SDA)’a ekim yapıldı. İnokulasyon öncesi, Ziehl-Neelsen boyama

yöntemi uygulandı ve ışık mikroskobu altında ARB varlığı yönünden araştırıldı.

2.2.4.2. Dışkı Örnekleri Dışkı örneklerinde mikobakteri varlığını saptamak için, 1-3 g fekal örnek 10 ml

distile su ile süspanse edildi. Otuz dakika karıştırılarak, oda ısında 30-60 dakika

bekletildi. Beklemenin ardından 5 ml supernatant alınarak, üzerine eşit hacimde

%4’lük NaOH eklendi ve dekontaminasyonun tamamlanması için 15 dakika

inkubasyona bırakıldı. Tüpler 3000xg 15 dakika santrifüj edildi ve supernatant atıldı.

Dipte kalan sediment 1ml Middlebrook 7H9 buyyon içerisinde süspanse edildi ve

bütün besiyerlerine inokule edildi. Örneklerden smear hazırlanması işlemi yapıldı ve

Z-N boyama yöntemi ile ARB varlığı yönünden incelendi. Bu işlemi takiben, 0.1-0.2

ml olarak Lowenstein-Jensen yatık besiyeri, Middlebrook 7H10 agar, Middlebrook

7H9 buyyon’una inokulasyonları yapıldı (Salfinger ve Kafader, 1987; Tanaka ve

ark., 2005).

33

2.2.5. İdentifikasyon Lowenstein-Jensen besiyerinde üreyen Mycobacterium spp. yönünden şüpheli

koloniler inkubasyondan 48 saat sonra diğer mikroorganizmaların kontaminasyonu

(üreme veya diskolorizasyon) yönünden incelendi. Kontamine olan besiyerleri

atılarak değerlendirme dışı bırakıldı. Besiyerleri her hafta olmak üzere, 12. haftanın

sonuna kadar değerlendirildi. Üreyen koloniler Ziehl-Neelsen boyama yöntemiyle

boyanarak ARB yönünden mikroskobik olarak incelendi (Chaskes, 2008).

Mikobakteriyel üremenin karakterizasyonu için inkubasyon periyodu, üreme

ısısı (37°C ve 42°C), pigmentasyonun varlığı, koloni morfolojisi ve bazı

biyokimyasal testler yönünden değerlendirildi (Wayne ve ark.,1974; Levy-Frebault

ve Portales,1992; Quinn ve ark., 1999).

2.2.5.1. Kristal Violet İçermeyen MacConkey Agar’da Üreme İzole edilen suşlardan bir öze dolusu mikobakteri sıvı kültürüne alındı ve agarın

ortasından başlayarak spiral şekilde agar etrafına doğru ekim yapıldı. Pleytler 37°C’

de 5 ile 11 gün inkübasyona bırakıldı. Saprofitik türler genellikle inhibe olurken,

patojen mikobakteriler genellikle 5 ile 11 günde üreme gösterirler. Bu süre sonunda

üreme olması pozitif olarak değerlendirildi (Quinn ve ark., 1999).

2.2.5.2. İnhibisyon ve Tolerans Testi Mikobakteri izolatlarının identifikasyonunu sağlamak amacıyla %5 NaCl içeren L-J

medium içeren tüplerde üreme olup olmadığına bakıldı. Bu test Wayne ve ark.

(1974), Conville ve Witebsky (1998), ve Quinn ve ark. (1999)’na göre

gerçekleştirildi. Her bir izolattan 100 µl kadar süspansiyon üreme kontrolü için biri

%5 NaCl içeren, diğeri normal L-J olan 2 set besiyerine inokule edildi. Her iki

besiyeri haftalık üreme durumu kontrol edilerek 37°C’de 4 hafta inkübasyona

34

bırakıldı. Kontrol besiyerinde çok sayıda koloni varsa ve %5 NaCl içeren besiyerinde

50’den fazla koloni bulunuyorsa tuz tolerans testi pozitif olarak değerlendirildi. Buna

karşın, kontrol besiyerinde 37ºC’de 4 haftalık inkübasyondan sonra üreme

görülmemesi negatif sonuç olarak kaydedildi.

Lowenstein-Jensen besiyerinde yapılan direnç testinde, isoniazid (1µg/ml) ve

thiophen-2-carboxylic hydrazide (TCH, 1µg/ml) son konsantrasyonları kullanıldı.

Bunun yanısıra, L-J besiyerinin direnç testi için hazırlanması aşamasında isoniazid

ve TCH koagülasyon öncesinde eklendi. İzole edilen suşların kolonileri distile suda

süpanse edilip L-J besiyerine 100µl ekildi. Dört hafta süre ile 37°C’de

inkubasyondan sonra üreme sonuçları değerlendirildi. Ayrıca, kontrol olarak aynı

suşlar isoniazid ve TCH içermeyen L-J besiyerine ekildi (Levy-Frebault ve Portales,

1992).

2.2.6. PCR Tekniği PCR yöntemi Mycobacterium spp. için 16SrRNA geni, (Huard ve ark., 2003), M.

avium complex için IS1245 (Guerrero ve ark., 1995) ve M.avium subsp. avium için

IS901 (Pavlik ve ark., 2000) genleri hedeflenerek uygulandı (Çizelge 2.2). Bu

amaçla, aşağıda bildirilen çalışmalar yapıldı.

2.2.6.1. DNA Eldesi (Ekstraksiyon) Katı besiyerinde, üreyen kolonilerden öze ile şüpheli olanlar alınarak 200 µl distile

su ile süspanse edildi ve 98°C’de 30 dakika kaynatma işlemi uygulandı. Bu işlemin

sonunda 5 dakika 13000 rpm’de santrifüj edildi. Sonuç olarak 2 µl supernatant

PCR’da template DNA olarak (Hoop ve ark. 1993; Tortoli ve ark. 2001).

35

2.2.6.2. PCR Amplifikasyonu PCR testlerinde mikobakterileri cins düzeyinde saptamak amacıyla 16SrRNA geni,

Mycobacterium avium complex suşlarının saptanmasında IS1245 geni,

Mycobacterium avium subsp. avium suşlarının moleküler identifikasyonunda ise

IS901 geni hedeflendi. IS901 genine yönelik PCR testleri iki aşamadan (aynı genin

509 bp’lik porsiyonunu çoğaltan NP1 ve NP’ primerleri ile PCR-1 ve bunun

amplikonlarının template DNA olarak kullanıldığı, 376 bp’lik porsiyonunu çoğaltan

NP3 ve NP4 primerleri ile PCR-2) oluşan Nested-PCR tekniği uygulanarak

gerçekleştirildi (Çizelge 2.2.).

PCR amplifikasyonu için 200µl’lik tüplerde ve GeneAmp PCR System 9700

thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA., A.B.D.) kullanılarak

hazırlandı. Her tüpte 25 µl final hacimde 2 µl DNA kullanıldı. İki mikrolitre DNA

her reaksiyon tüpüne eklendi. PCR karışımı (25 µl), 17.25 µl distile su, 2.5 µl 10x

PCR Buffer, 1.5 µl MgCl2, 0.5 µl 10mM Deoksinükleosid trifosfataz karışımı, her bir

primerden 0.25 µl ve 0.25 µl Taq polymerase’dan hazırlandı.

PCR amplifikasyon koşulları; 94ºC’de 4 dk’lık ön denatürasyon aşamasını

takiben, 35 siklusluk, 94ºC’de 1 dk denaturasyon, 65ºC’de 1 dk primer bağlanması,

ve 72ºC’de 1 dk polimerizasyon ve 72ºC’de 7 dk’lık final polimerizasyon

aşamalarından oluştu. PCR amplifikasyon ürününün bant büyüklüğü ise 543bp

olarak belirlendi. IS1245 primerlerinin kullanıldığı PCR aşamasında; denatürasyon 4

dakikada 94ºC, 30 siklusta 1 dakikada 94ºC, 1 dakikada 65ºC, ve 1 dakikada 72ºC,

final ekstensiyon aşaması 10 dakikada 72ºC olarak uygulandı. Bu PCR aşamasında

amplifikasyon ürünü 427bp’dir. IS901 (nested) (Kunze, ve ark. 1992; Pavlik, ve ark.,

2000 ; Ikonomopoulos, ve ark., 2009). PCR’da 30 siklus 30 saniye 94ºC, 30 saniye

65ºC, ve 150 saniye 72ºC ve final ekstensiyon aşaması 300 saniye 72ºC ve amplifiye

olan birinci ürünün bant büyüklüğü 509 bp (NP1 ve NP2) ve ikinci ürünün ise 693bp

(NP3 ve NP4) olarak tanımlandı (Pavlik, ve ark., 2000). Tüm PCR ürünleri %2’lik

agaroz jelde ve etidium bromide kullanılarak analiz edildi. Tüm reaksiyonlarda,

36

pozitif kontrol olarak ekstrakte edilen M. avium subsp. avium DNA’sı ve negatif

kontrol olarak steril su kullanıldı.

2.2.6.3. Elektroforez Her 200 ml TBE buffer’da 3g agaroz çözeltisi hazırlandı, mikrodalga fırında önce 1

dk tutuldu. Fırından çıkartılıp karıştırıldı ve 45 saniye daha fırına sokularak

kaynatıldı. Jel çıktıktan 1-2 dk sonra 8 µl ethidium bromide eklendi, bilek

hareketleriyle karıştırıldı ve elektroforez tablasına döküldü. İlk göze 100 bp ağırlık

markerı, ikinci göze negatif kontrol sonrakilere ise test örnekleri olacak şekilde 10 µl

örnek eklendi. Örnek başına 2 µl 6xLoading dye ile karıştırıldı. Elektroforez 180

V’ta 60 dk koşturuldu. Sonuçlar UV-transilluminator’da incelenerek Genius marka

(Syngene) görüntüleme ünitesinde fotoğraflandı.

2.2.7. İstatistiksel Değerlendirme İncelenen hayvanlardan izole edilen pozitif kültürlerdeki toplam mikobakteriler

yüzde oran olarak tanımlandı. Ticari ve köy tavuklarından elde edilen izolasyon

oranı chi-square testi ile analiz edilerek karşılaştırıldı ( Field, 2009 ).

37

3. BUGULAR

Bu çalışmada, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim

Dalı’na rutin muayene amacıyla getirilen 53 kanatlı (45 tavuk ve 8 hindi) ile

mezbahada kesilen 50 kanatlıya (40 tavuk ve 10 hindi) ait toplam 103 kanatlının

organ (karaciğer, dalak, bağırsak, kalp, akciğer ve gonad) ve dışkı örnekleri

mikobakteriyozis varlığı yönünden incelendi. Çalışmada toplam 385 organ ve 103

dışkı materyali kullanıldı.

3.1. Nekropsi ve Ziehl-Neelsen Boyama Bulguları Toplam 103 kanatlıdan (tavuk ve hindi) 8’inde tüberküloz lezyonları görüldü. Bu

hayvanların nekropsisinde rastlanan 20 tüberküloz lezyonunun organlara göre

dağılımı sırasıyla, %40 karaciğer , %20 dalak, %20 akciğer, %10 bağırsaklar, %5

kalp ve %5 gonadlar olarak saptandı (Şekil 3.1, 3.2, 3.3, 3.4.).

Kanatlılarda lezyonların en fazla lokalize olduğu organ karaciğer olarak

belirlendi. Karaciğerin büyümüş ve üzerinde mercimekten fasulye büyüklüğüne

kadar nodüllerin olduğu gözlendi. Ayrıca, splenomegali, akciğer ve kalpte nodüler

formda lezyonlar saptandı. Bağırsaklar ve gonadlarda da farklı büyüklüklerde

nodüller belirlendi. Organlardaki nodüler lezyonların beyaz renkte olduğu görüldü.

Kesit yapıldığında kalsifikasyona rastlanmadı. Toplanan organ ve dışkılardan

hazılanan preparatlar Z-N boyama yöntemi ile boyandı ve mikroskopik bakıda 45

örnekte asido-rezistans bakteri saptandı (Çizelge 3.1.).

Nekropsisi yapılan 45 köy tavuğundan 4 (%8.9) tavukta özellikle, göğüs

kaslarında atrofi ile seyreden kaşeksi görüldü. Bu tavuklardan, toplanan 160

organdan 12’sinde (%7.5) tipik tüberküloz lezyonu saptandı. Hazırlanan

preparatların 24’ünde (%11.7) mikroskobik bakıda ARB pozitif sonuç bulundu

(Şekil 3.5.ve Çizelge 3.1).

38

Bu çalışmada, 40 ticari tavuğun 3’ünde tipik tüberküloz lezyonları görüldü.

Bunlardan 2 tavukta kaşeksi ve kas atrofisine rastlandı. Toplanan 153 organdan

7’sinde (%4.6) tipik lezyonlar belirlendi. Örneklerden hazırlanan preparatlarda Z-N

boyama yöntemi ile 15 ARB pozitif örnek saptandı (Çizelge 3.1.).

On sekiz köy hindisi ve ticari hindinin yapılan nekropsisinde bir hayvanda tipik

lezyon bulundu. Hindilerden toplanan 72 organ örneğinin birinde (%1.4)

tüberkülozlu karaciğere rastlandı. Hazırlanan preparatlar Z-N boyama yöntemi ile

boyandı ve mikroskopik bakıda tipik ARB görüldü İzolasyon yapılan toplam 8

kanatlının 7’sinde (6 tavuk ve 1 hindi) nekropside lezyon görülmesine karşın 1

tavukta lezyona rastlanmadı. (Şekil 3.3. ve Çizelge 3.1).

Şekil 3.1. Dalak, splenomegali, multifokal noduler granülomlar

39

Şekil 3.2. Karaciğer kesitinde çoklu tüberküloz görünümü

Şekil 3.3. Karaciğerin Z-N boyası ile hazırlanan preparatında ARB görünümü (x100)

40

Şekil 3.4. Akciğerlerde çoklu tüberküloz görünümü

Şekil 3.5. Z-N boyama yapılan preparatta Mikobakterilerin asido-rezistans (ARB) görünümü (x100)

41

Şekil 3.6. Kalpte beyaz tüberküloz nodülleri

Çizelge 3.1. İncelenen doku ve dışkı preparatlarında Z-N bulguları

Örnek kaynağı

Doku örnekleri (Z-N stain)

Örnek Kaynağı

Dışkı örnekleri (Z-N stain)

Z-N Pozitif

(%)

Z-N Negatif (%)

Z-NPozitif

(%)

Z-N Negatif

(%)

Ticari

Tavuk

(n:153)

13(%8.5)

140(%91.5)

Ticari

Tavuk

(n:40) 2 (%5)

38 (%95)

Köy

Tavuğu

(n:160)

19

(%11.9)

141(%88.1)

Köy

Tavuğu

(n:45)

5(%11.1)

40(%88.9)

Ticari Hindi (n:40)

1(%2.5)

39 (%97.5)

Ticari

Hindi

(n:10)

0 (%0.0)

10 (%100)

Köy Hindisi (n:32)

3 (%9.4) 29(%90.6) Köy Hindisi (n:8)

2 (%25) 6 (%75)

Toplam (n:385)

36 (%9.4) 359(%90.6) Toplam (n:103)

9 (%8.7) 94(%91.3)

42

3.2. İzolasyon ve İdentifikasyon Bulguları Direkt mikroskobik incelemede, çalışmada kullanılan toplam 488 materyalin (organ

ve dışkı) 45’inde (%9.2) asido-rezistans bakteri saptandı. Pozitif 45 materyalin

yapılan kültürü sonucunda 17’sinden (% 37.8) ARB izolasyonu gerçekleştirildi.

Direkt mikroskopide pozitif olarak tespit edilen 28 (% 62.2) materyalin kültürü

sonucunda ise mikobakteriyozis yönünden herhangi bir üreme görülmedi. Direkt

mikroskopisinde ARB rastlanmayan 2 (%0.04) materyalin kültürü sonucunda üreme

saptandı. Hem mikroskopi hem de kültür ile 469 (% 96) örnek mikobakteriyozis

yönünden negatif saptandı.

Değerlendirilen 488 örneğe ait homojenatın üç besiyerine (gliserinli L-J,

Middlebrook 7H10 agar ve Middlebrook buyyon) ekimleri sonucunda 19 suş izole

edildi. Gliserinli L-J besiyerinde Middlebrook 7H10 agara göre daha fazla sayıda

izolasyon gerçekleştirildi (Şekil 3.7, 3.8).

Kolonilerin gliserinli L-J besiyerinde üreme şekli incelendiğinde, besiyeri

yüzeyinde ilk üç haftada tek tek ve bundan sonra ise yaygın üreme belirlendi.

Kolonilerin mukoid karakterde ve gri-beyaz ile açık sarı renkte oldukları, buna karşın

bazı kolonilerin Middlebrook 7H10 agar’da krem-beyaz oldukları gözlendi (Şekil

3.8. ve Şekil 3.9.). Üremeler Middlebrook 7H9 besiyerinde hafif bulanıklık şeklinde

meydana geldi ve tüpün dibinde tortu oluşturdu ( Şekil 3.10.).

Örneklerden üreyen 19 ARB suşundan tamamı (%100) gliserinli L-J besiyeri,

14 (%73.7)’ü Middlebrook 7H10 agar ve 16 (%84)’sı Middlebrook 7H9

buyyon’unda üreme gösterdi. Köy tavuklarından üreyen 13 ARB suşundan tamamı

(%100) gliserinli L-J besiyerinde, 11 (%85)’i middlebrook 7H10 agarda ve 11

(%85)’i middlebrook 7H9 buyyonda üredi. Ticari tavuklardan ise 5’i hem L-J

besiyeri hem de Middlebrook 7H10 agar’da üreme gösterdi. Köy hindisinden sadece

bir suş L-J besiyerinde üredi (Çizelge 3.2. ve Çizelge 3.3.). Kanatlı

43

mikobakteriyozisi ve mantar infeksiyonları arasında ayırt etme amacıyla kullanılan

Saboroud Dekstroz Agar’da üreme görülmedi.

Şekil 3.7. L-J Besiyerinde Mycobacterium spp. üremesi

Şekil 3.8. L-J Besiyerinde küçük pigmentsiz koloniler.

1 2 3 4

44

Şekil 3.9. Middlebrook (7H10) agar’da farklı koloni morfolojileri

-ve +ve

Şekil 3.10. Middlebrook (7H9) buyyon’unda üreme

45

Nekropsisi yapılan 45 köy tavuğundan 4’ünde (%8.9), 40 ticari tavuktan 3’ünde

(%7.5) ve 8 köy hindisinden 1’inde (%12.5) M.avium subsp. avium izole edildi.

İzolasyon yapılan köy tavuklarında organlar dikkate alınarak yapılan

değerlendirmede; 13 organın 4’ünde (%30.7) karaciğerden, 3’ünde (%23) dalaktan,

3’ünde (%23) akciğerden, 1’inde (%7.7) bağırsaktan, 1’inde (%7.7) kalpten ve

1’inde (%7.7) gonadlardan, ticari tavuklarda ise; 5 mikobakteri suşunun 3’ünde

(%60) karaciğerden, 1’inde (%20) dalaktan ve 1’inde (%20) akciğerden M. avium

subsp. avium izole edildi (Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3). Bir köy tavuğunun dışkısından

ARB izole edildi ancak, subkültürde üreme olmadı. Ticari ve köy tavuklarında

mikobakteri izolasyonu oranları arasında istatistiksel bir önem saptanamadı (chi

square testi, p<0.05).

Çizelge 3.2. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan üç ticari tavuğun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması

TL, Tüberkel lezyonu; DY, Değişiklik yok ; B, Büyüme; KB, Kalın bağırsak. Z-N boyama: -, ARB yok; + ile +++ birden çok fazla ARB. L-J besiyerinde: -, üreme yok; +≤ 10 koloni; ++, 10-20 koloni; +++ ile ++++> 30 koloni. 7H10 besiyerinde: -, üreme yok; +≤ 10 koloni; ++, 10-20 koloni; +++ ile ++++> 30 koloni. 7H9 boyununda: -, üreme yok; + üreme var. MAA genotipi: 16SrRNA (Genus spesifik) PCR (+), MAC spesifik (IS1245) PCR (+), ve MAA spesifik (IS901) nested PCR (+).

46

Çiz

elge

3.3

. M

AA

’ya

bağlı m

ikob

akte

riyoz

is y

önün

den

pozi

tif b

ulun

an d

ört k

öy ta

vuğu

nun

mak

rosk

obik

gör

ünüm

, Z-

N b

oyam

a, k

ültü

r ve

PCR

bul

gula

rının

karşı

laştırı

lması

Köy

tavuğu

1

Köy

tavuğu

2

Köy

tavuğu

3

Köy

tavuğu

4

Num

une

Kay

naği

O.E

A

RB

L-

J 7H

10

7H9

PCR

O

.E

AR

B

L-J

7H10

7H

9 PC

R

O.E

A

RB

L-J

7H10

7H

9 PC

R O

.E

AR

B

L-J

7H10

7H

9 PC

R

Kar

a ciğe

r B

&TL

++

+ ++

+ ++

+ +

IS90

1+

TL

+++

++++

++

+

IS90

1+

TL

+++

++

+++

+ IS

901+

TL

++

++

++

+++

+ IS

901+

Dal

ak

B&

TL

+++

- -

- -

TL

+++

+++

+++

+ IS

901+

TL

-

++

- +

IS90

1+

TL

+++

+++

+++

+ IS

901+

Ak

ciğe

r B

&TL

++

-

- -

- D

Y

+ ++

++

+

IS90

1+

DY

+ ++

+ +

+ IS

901+

TL

+

++

+ +

IS90

1+

Bağır

sak

KB

+

- -

- -

DY

+

- -

- -

DY

- -

- -

- K

B ++

++

++

-

IS90

1+

Kal

p TL

++

-

- -

- D

Y

+ -

- -

- D

Y

+ ++

+ -

+ 16

S-

rRN

A+

DY

-

- -

- -

Yum

urta

lık

TL

+ -

- -

- D

Y

+ ++

++

+

IS90

1+

DY

- -

- -

- B

-

- -

- -

O.E

, org

anla

rda

efek

tler

TL, t

über

kel l

ezyo

nu; D

Y, D

eğiş

iklik

yok

; B

, Büy

üme;

KB

, Kalın

bağırs

ak.

Z-N

boy

ama:

-, A

RB

yok;

+ il

e ++

+ bi

rden

fazl

a A

RB.

L-J b

esiy

erin

de: -

, üre

me

yok;

+≤

10 k

olon

i; ++

, 10-

20 k

olon

i; ++

+ ile

+++

+> 3

0 ko

loni

. 7H

10 b

esiy

erin

de: -

, üre

me

yok;

+≤

10 k

olon

i; ++

, 10-

20 k

olon

i; ++

+ ile

+++

+> 3

0 ko

loni

. 7H

9 bu

yyon

unda

: -, ü

rem

e yo

k; +

üre

me

var.

MA

A g

enot

ipi:

16Sr

RNA

(Gen

us sp

esifi

k) P

CR

(+),

MA

C sp

esifi

k (I

S124

5) P

CR (+

), ve

MA

A sp

esifi

k (I

S901

) nes

ted

PCR

(+).

46

47

Yapılan biyokimyasal testlerde, izole edilen suşların hiçbiri MacConkey

besiyerinde (Kristal viyoletsiz) üremedi, bunun yanında, % 5 NaCl’de üreme

görülmezken, suşlar 25°C’de ve 42°C’de farklı sayıda koloni oluşturdular. İzole

edilen suşların tamamı isoniazid (1µg/ml) ve thiophene-2-carboxylic acid (1µg/ml)

katkılı Löwenstein-Jensen besiyerinde üreme gösterdi (Çizelge 3.4.).

Çizelge 3.4. İzole edilen suşların bazı identifikasyon testleri

Suş No.

25-42°C’de Üreme aralığı

Üreme hızı Y=yavaş H=hızlı

Pigmentasyon Varlığı

MacConkey’de üreme

%5NaCl L-J’de üreme

TCH(µg/ml) üreme

İsoniazid’de (1µg/ml) üreme

KT.KC.1 F. Üreme

Y Pigmentsiz Üremedi

Üremedi

Üredi

Üredi

KT.KC.2

Üredi Y Pigmentsiz // // + +

KT.D.2

// Y Pigmentsiz // // + +

KT.AC.2 // Y Pigmentsiz

(azpigmentli)

// // + +

KT.Y.2 // Y Pigmentsiz // // + + KT.K.3

F.Üreme Y Pigmentsiz // // + +

KT.D.3 Üredi Y Pigmentsiz // // + +

KT.AC.3 // Y Pigmentsiz // // + + KT.K.3 // Y Pigmentsiz // // + + KT.K.4 // Y Pigmentsiz // // + + KT.D.4 // Y Pigmentsiz // // + + KT.AC.4 // Y Pigmentsiz

(azpigmentli)

// // + +

KT.B.4 // Y Pigmentsiz // // + + TT.KC.1

F.Üreme Y Pigmentsiz // // + + TT.D.1 Üredi Y Pigmentsiz // // + + TT.KC.2 // Y Pigmentsiz // // + + TT.AC.2 // Y Pigmentsiz // // + + TT.KC.3 // Y Pigmentsiz // // + + KH.KC.1 // Y Pigmentsiz // // + + KT= köy tavuğu, TT= ticari tavuğu, KH= köy hindisi, F= farklı., KC=karaciğr, D=dalak, AC=

akciğer, Y= yumurtalık, B= bağırsak, K= kalp .

48

3.3. PCR Bulguları Sekiz kanatlıdan izole edilen toplam 19 mikobakteriyel izolata PCR uygulandı ve

543 bp’lık spesifik fragment saptandı (Şekil 3.11.). Bunlardan sadece 16S-rRNA’ya

pozitif tepki veren istisnai bir örnek dışında (%5.3), 18’i (%94.7) Mycobacterium

avium complex (16S-rRNA & IS1245) olarak ve Mycobacterium avium subsp.

avium (16S-rRNA, IS1245, ve IS901) olarak tespit edildi (Şekil .3.12-3.13.).

Yukarıdaki yüzde oranlar sırasıyla şu şekilde formüle edilmiştir: Toplam örneklerin

% 3.9 (19/488)’u Mycobacterium cinsi, %3.7 (18/488) MAC ve MAA.

Mycobacterium avium subsp. avium genotip IS901 infekte 8 tavuğun örneklerinde

izole edildi. Köy tavuklarından dördü, üç ticari tavuk ve bir köy hindisi IS901 genine

karşı pozitif reaksiyon verdi.

Şekil.3.11. İzole edilen Mycobacterium genusunun izolatlarında16S-rRNA (543 bp) PCR bulguları.

(M; Moleküler ağırlık marker (Gene Ruler TM 100 bp ,DNA Ladder Plus, Fermantas,

Litvanya)

1;Pozitif Kontrol M.avium subsp. avium DSM-No. 44156), 2-8; Mikobakteri izolatları, K

Negatif Kontrol).

49

Şekil.3.12. İzole edilen M. avium complex izolatlarında IS1245 (427 bp) PCR bulguları.

(M; Moleküler ağırlık marker, 1;Pozitif Kontrol (M.avium subsp. avium DSM-No. 44156), 2-8; Mikobakteri izolatları M.avium subsp. avium), K-; Negatif Kontrol).

Şekil.3.13. İzole edilen M. avium subsp.avium izolatlarında (376 bp) (IS901) nested-PCR bulguları. (M; Moleküler ağırlık marker, 1;Pozitif Kontrol(DSM-No. 44156), 2-13 ; Mikobakteri izolatları (M.avium subsp. avium), K-; Negatif Kontrol).

50

4. TARTIŞMA

Kanatlı mikobakteriyozisi kanatlılarda sıklıkla görülmektedir. Birçok mikobakteri

türü ve bunların neden olduğu klinik hastalık pek çok kanatlı türünde görülen

infeksiyonlarda rapor edilmiştir; ticari ve köy tavukçuluğu ile hindilerde en sık izole

edilen türler M. genavense ve M. avium complex (MAC)’te bulunan

mikobakterilerdir. Bu çalışmada tavuk ve hindilerin organ ve dışkı örneklerinden

kanatlı mikobakteriyozisinin teşhisi hedeflenmiştir.

Bu çalışmada, kullanılan toplam 103 kanatlıdan (tavuk ve hindi) 8’inde (%7.8)

tüberküloz lezyonları görüldü. Bunlardan 95 tavuğun mikobakteri yönünden yapılan

değerlendirmesinde 7 (%7.4)’i pozitif bulundu. Konuyla ilgili olarak, köy

tavuklarında yapılan çalışmalarda Shitaye ve ark. (2008), klinik şüpheli 21 tavuğun

7’sinde (% 33) tüberküloz lezyonları belirlemiştir. Coles ve ark. (2007) ’nın

Arjantin’de yaptıkları bir çalışmada 20 hayvandan alınan materyal, kanatlı

mikobakteriyozisi yönünden incelenmiş ve sonuçta 3 (% 15) hayvanda tüberküloz

lezyonları varlığı saptanmıştır. İspanya’da yapılan başka bir çalışmada ise klinik

şüpheli 8 tavuk kanatlı tüberkülozis yönünden incelenmiş ve 3 (%37.5) tavukta

tüberküloz lezyonları bulunmuştur.(Gonzalez ve ark., 2002). Etiyopya’da yapılan

çalışmada, Tadesse ve ark. (2004), kanatlı mikobakteriyozisi şüpheli 95 tavuktan,

5’inde (%5.3) visceral organlarda tüberküloz lezyonları bildirmişlerdir. Ticari

tavuklarda yapılan çalışmalarda ise, Gonzalez ve ark. (2002), yaptıkları 8 tavuğun

6’sında ( %75); Tantaş ve ark. (1990), şüpheli 13 tavuktan tüberküloz lezyonları

belirlemiştir. Bu çalışmadaki %7.4’lük infekte hayvan oranı diğer araştırmalardaki

sonuçlar ile karşılaştırıldığında, Tadesse ve ark. (2004)’nın bulgularına yakın

bulunmuştur. Bu çalışma sonuçlarındaki farklılık alınan materyallerin ait olduğu

kanatlı sayısı, türü (tavuk/hindi), yetiştirme tipi (ev/ticari) ve materyal sayısı ile

açıklanabilir.

Ayrıca, çalışmada hayvanların nekropsisinde rastlanan 20 tüberküloz

lezyonunun dağılımı sırasıyla, %40 karaciğer, %25 dalak, %15 akciğer, %10

bağırsaklar, %5 kalp ve %5 gonadlar olarak saptandı. Tüberkülozlu hayvanlarda

51

lezyonlar genellikle karaciğer, dalak, bağırsak, kemik iliği, akciğer, yumurtalık ve

böbrek gibi organlara lokalize olduğu belirlenmiştir (Mutalib ve Riddell 1988;

Tantaş ve ark. 1990; Thorel ve ark. 1997; Yardımcı, 2006). Ayrıca farklı

çalışmalarda yapılan nekropside bezli mide ve kalpte tüberküloz lezyonlarının

bulunduğu saptanmıştır (Akay, 1980; Shitaye ve ark. 2008). Konuyla ilgili olarak,

Akay, (1980), deneysel bir çalışmada, tüberküloz lezyonlarının sırası ile %95

karaciğer, % 90-95 dalak, % 70-80 bağırsak, %90 kemik ilği, %6 böbrek ve % 50

oranında akciğerlerde görüldüğünü bildirmektedir. Bu çalışmada elde edilen

lezyonların dağılımı, genel olarak literatür sonuçlarına benzerlik göstermektedir.

Bu çalışmada bağırsak lezyonu olan 3 tavuktan 1’inde dışkıdan Z-N boyama ve

izolasyonda mikobakteri varlığı pozitif olarak saptandı. Toplanan diğer dışkı

örneklerinde de pozitif bulguya rastlanmadı. Mikobakteri izole edilen ve

bağırsaklarında lezyon görülen hayvanların dışkılarında etkene rastlanmamasının

nedeninin tüberkellerin gelişim periyoduyla ilgili olabileceği düşünüldü.

Bu çalışmada, toplam 18 köy hindisi ve ticari hindiden toplanan 72 organ

örneğinin 1’inde (%1.4) tüberkülozlu karaciğere rastlandı. Hindilerde bozuklukların

en fazla lokalize olduğu organ karaciğer olarak belirlenmiştir (Ghani, 1968;

Gümüşsoy ve ark. 2006). Konuyla ilgili olarak Akay (1980), yaptığı çalışmada 22

hindide lezyonların %81.8’ini karaciğerde olduğunu belirlemiştir. Gümüşsoy ve ark.

(2006), inceledikleri 2 hindide nekropside karaciğerde tüberküloz lezyonları

gözlemişlerdir. Bu çalışmada da hindilere ait tüberküloz lezyonları karaciğerde

görülmüştür. Bu çalışmada toplanan 103 kanatlının organ ve dışkılarından hazılanan

preparatlarda 8 (%7.8) hayvanda Z-N pozitif bulundu. Ayrıca, hazırlanan toplam 488

preparat Z-N boyama yöntemi ile boyandı ve mikroskopik bakıda 45 (%9.2) örnekte

ARB saptandı. Kanatlılardan sağlanan materyallerden Z-N boyama ile ilgili yapılan

çalışmalarda; Shitaye ve ark. (2008), 330 materyalden 15 (% 4.5); Coles ve ark.

(2007), 80 örnekten 12 (%15) ARB pozitif sonuç elde etmiştir. Bu çalışmada elde

edilen Z-N boyama bulguları ile diğer araştırmalardaki tüberküloz lezyonları oranları

52

karşılaştırıldığında, sonuçların Shitaye ve ark. (2008)’nın bulgularından yüksek,

diğer araştırıcıların bulgularından düşük olduğu görüldü. Sonuçlardaki farklılıkların

yukarıda bildirilen kanatlı sayısı, türü (tavuk/hindi), yetiştirme tipi (köy/ticari) ve

materyal sayısı, örnekleme şekli gibi nedenlerden ileri geldiği düşünüldü.

Bu çalışmada incelenen materyallerin orijinleri dikkate alınarak yapılan

değerlendirmede, 45 köy tavuğunun 4’ünde (%8.9) tipik lezyon görüldü. Bu

hayvanlara ait 160 organın 12’sinde (% 7.5) tipik tüberküloz lezyonu saptandı. Aynı

hayvanlardan Toplanan 205 örnekten (organ ve dışkı) hazırlanan preparatların

24’ünde (%11.7) mikroskopik bakıda Z-N boyama ile ARB pozitif sonuç bulundu.

Köy tavuklarından sağlanan materyallerden tüberküloz lezyonu ve ARB pozitif

sonuç verenlerle yapılan çalışmalarda; Shitaye ve ark. (2008), 21 klinik şüpheli

tavuktan 7’sinde (% 33) tüberküloz lezyonları belirlemiştir. Aynı çalışmada 330

materyalin (dışkı ve organ) 15’inde (%4.5) ARB pozitif olarak saptanmıştır.; Tadesse

ve ark. (2004), kanatlı mikobakeriyozis şüpheli 95 tavuktan, 5’inde (%5.3); Coles ve

ark. (2007) 20 tavuktan 3’ünde (%15) iç organlarda tüberküloz lezyonları ve ARB

pozitif sonuç belirlemiştir. Bu çalışmada elde edilen bulgular Shitaye ve ark (2008)

ve Tadesse ve ark’nın (2004) sonuçları ile benzerlik göstermektedir.

Bu çalışmada, 40 ticari tavuğun 3’ünde (%7.5) tipik lezyonlar görüldü.

Toplanan 154 organdan 7’sinde (%4.6) tipik lezyonlar belirlendi. Hazırlanan

preparatların 15’inde (%7.8) Z-N boyama yöntemi ile mikroskopik bakıda ARB

pozitif sonuç bulundu. Kanatlı tüberkülozisi şüpheli tavuklarda yapılan çalışmalarda,

ticari sürülerle yapılan çalışmalarda Gonzalez ve ark. (2002), 8 şüpheli tavuktan 6;

Tantaş ve ark. (1990) ise sekiz bin tavukluk bir sürüde şüpheli 13 tavukta tipik

tüberküloz lezyonu bildirmişlerdir. Bu çalışmada tipik tüberküloz lezyonlu tavuk

sayısı, diğer çalışmalarda elde edilen tipik lezyonlu hayvan sayılarına göre düşük

bulundu. Bunun nedeni şüpheli hayvanların seçim kriteri, hayvanların yaşı ve kümes

hijyeni olabilir.

53

Bu çalışmada kültür amacıyla 103 hindi ve tavuktan alınan toplam 488

materyalin 19 (%3.9) ’undan mikobakteri izolasyonu yapıldı. Konuyla ilgili olarak,

Ertürk ve Pamukçu (1974), farklı tavuklardan aldıkları 531 materyalin 18 (%3.4)’ini

mikobakteriyozis yönünden pozitif olarak saptamışlardır. Hoop ve ark. (1996)

İsviçre’de yaptığı bir çalışmada ise, 5345 hayvandan alınan materyal,

mikobakteriyozis yönünden incelenmiş ve sonuçta 204 (%3.8) örnekte hastalık

varlığı tespit edilmiştir. Keymer ve ark. (1982), 5177 hayvandan alınan materyal;

kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelenmiş ve sonuçta 112 (%2.2) hayvanda

kanatlı mikobakteriyozisi varlığı saptanmıştır. Hollanda’da yapılan başka bir

çalışmada ise 11662 hayvan kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelenmiş ve 82

(% 0.7) düzeyinde kanatlı mikobakteriyozisi bulunmuştur (Smit ve ark., 1987).

A.B.D.’de yapılan çalışmalarda, Tell ve ark. (2003a), kanatlı mikobakteriyozisi

şüpheli 32 materyalde, % 12.5 oranında mikobakteri izolasyonu bildirmişlerdir.

Yunanistan’da yapılan bir çalışmada, Ikonomopoulos ve ark. (2009), 500 tavuktan

alınan materyali, kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelemişler ve %10 düzeyinde

pozitiflik bulmuşlardır. Bu çalışmada elde edilen izolasyon oranları ile diğer

araştırmalardaki izolasyon oranları karşılaştırıldığında, bulunan oranlar

Ikonomopoulos ve ark. (2009) ve Tell ve ark. (2003a)’nın bulgularına göre daha

düşük olup diğer araştırıcıların bulgularına benzerlik göstermektedir.

Bu çalışmada, incelenen 45 köy tavuğunun 4’ünde (% 8.9 ) kanatlı

mikobakteriyozisi saptandı. Köy tavuklarından sağlanan materyallerden mikobakteri

izolasyonu ile ilgili yapılan çalışmalarda; Beytut ve ark. (2001), bir köy tavuğundan;

Tadesse ve ark. (2004), 95 köy tavuğundan 6 (%6.3); Shitaye ve ark. (2008), 21

şüpheli tavuktan 16 (%76.2); Coles ve ark. (2007), 20 şüpheli tavuktan 3’ünde (%15)

izolasyon gerçekleştirmişlerdir. Araştırmalarda elde edilen farklı sonuçlar diğer

araştırıcıların kullandıkları besiyerleri ve toplanan tavuk materyallerinin

çoğunluğunun tüberküloz şüpheli hayvanlardan alınan lezyonlu organlardan olması

ile açıklanabilir. Bu çalışmada incelenen 40 ticari tavuğun 3’ünde (%7.5) kanatlı MAA izole

edildi. İncelenen materyallerin orijinleri dikkate alınarak yapılan değerlendirmede,

54

incelenen 153 ticari tavuk materyalinin, 5’inde (%3.3) mikobakteriyozis belirlendi.

Ticari tavuklardan M. avium izolasyonu farklı ülkelerden bildirilmiştir. Kanada’da,

Mutalib ve Riddell (1988), tavuklarda tüberküloz salgınını tanımlamıştır; İspanya’da

Gonzalez ve ark. (2002), ticari tavuklarda kanatlı mikobakteriyozis salgınını

bildirmişlerdir; Türkiye’de, Tantaş ve ark. (1990), diyette protein miktarını

dengelemek için kullanılan kontamine et ürününde kanatlı mikobakteriyozis

olgusunu bildirmişlerdir. Kanatlı mikobakteryozisine, ticari olarak beslenen

tavuklarda sık olarak rastlanmamaktadır, çünkü bu hayvanlar çok genç yaşlarda

kesime sevkedilmekte, işletme yönetimi ve biyogüvenlik uygulamaları yeterli

düzeyde yapılmaktadır (Mutalib ve Riddell, 1988; Porter, 1998; Gonzalez ve ark.

2002). Bu çalışmada izolasyon oranı olarak düşük düzeyde MAA izole edilmesi

diğer araştırıcıların bulguları ile benzerlik gösterdi.

Bu çalışmada incelenen 18 ticari hindi ve köy hindisinin 1’inde (%5.5) MAA

izolasyonu saptandı. Konuyla ilgili olarak; Ghani, (1968), Clarke ve ark. (2006),

Akay, (1980), Gümüşsoy ve ark. (2006), Mycobacterium avium’u yalnız hindilerin

iç organlarından izole etmişlerdir. Bu çalışmada, evde beslenen bir hindide istisna

olarak karaciğerde granülomlar görüldü ve bir izolasyon yapıldı. MAA, hindilerin

dışkı ve diğer örneklerinde görülmedi. Ticari hindilerde MAA izolasyonunun

olmaması; hayvanların kısa süre içerisinde kesilmesi (4.5-5 ay) ve bu sure içerisinde

infeksiyon gelişememesi şeklinde açıklanabilir.

Bu çalışmada izolasyon amacıyla L-J, 7H10 ve 7H9 besiyerleri kullanıldı. L-

J besiyerlerinde, Middlebrook 7H10’a göre daha fazla sayıda mikobakteri izole

edilmesi nedeni ile bu besiyerinin rutin kullanımının relatif olarak daha uygun

olduğu sonucuna varıldı. Tell ve ark. (2003a), kanatlı mikobakteriyozisinde L-J

besiyerinin kısa sürede fazla sayıda mikobakteri izolasyonunu sağladığını rapor

etmişlerdir. Middlebrook agarda koloni morfolojisi, kontaminantların azlığı gibi

avantajlar sağlamaktadır (Anargyros ve ark. 1990; Stager ve ark. 1991; Wilson ve

ark. 1995). Bu çalışmada elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulgularına

benzemektedir.

55

Çeşitli hayvan türlerinden izole edilen mikobakteri suşlarının biyokimyasal

testleri bir çok araştırıcı tarafından incelenmiştir. Wayne ve ark. (1974), Levy-

Frebault ve Portales (1992), Quinn ve ark. (1999), M.avium suşların, isoniazid

(1µg/ml) ve TCH (10µg/ml) L-J besiyerinin pozitif sonuç verdiğini ortaya

koymuşlardır. Konu ile ilgili olarak, Thorel ve ark. (1990), M.avium suşlarının 25°C

ve 42°C’de farklı decerede üreme, pigmentasyon oluşturmamasını saptanmıştır.

Diğer araştırcıların yaptıkları çalışmalarda, M.avium suşlarının, %5 NaCl ve Kristal

violet içermeyen MacConkey agar’da üremediğini bildirmişlerdir (Wayne ve ark.,

1974; Levy-Frebault ve Portales, 1992). Bu çalışmada, izole edilen suşların,

isoniazid içeren L-J ve TCH içeren L-J besiyerinde ürediği, 25°C ve 42°C’de farklı

üreme gösterdiği, %5 NaCl ve Kristal violet içermeyen MacConkey agar’da

üremediği belirlendi. Bu sonuçlar diğer araştırıcıların bildirdiği bulgulara uygunluk

göstermektedir.

Bu çalışmada izole edilen etkenlerin mikobakteri olduğu PCR testiyle

doğrulandı. PCR testi sonucunda 16S-rRNA genine spesifik 543 bp büyüklüğünde

bantlar görüldü. Guerrero ve ark. (1995) yaptıkları çalışmada F, 19-mer ve R, 18-mer

primer setini kullanılarak MAC türlere spesifik bantları 427 bp’de elde edilmiştir.

Bu çalışmada izole edilen mikobakteri türleri için elde edilen bulgular,

Ikonomonopoulos ve ark. (2009) bulgularını destekler niteliktedir. Konu ile ilgili

yapılan diğer çalışmalarda tür spesifik nested-PCR çalışmaları da gerçekleştirilmiştir

(Huard ve ark. 2003; Guerrero ve ark. 1995 ; Pavlik ve ark. 2000). Ayrıca moleküler

temelli tekniklerin kullanıldığı çalışmalar da bulunmaktadır (Telenti ve ark. 1993;

Tell ve ark. 2003a). Bu çalışmada elde edilen bulgular, diğer çalışma bulguları ile

birlikte değerlendirildiğinde, PCR tekniğinin özellikle kanatlı mikobakteriyozisi

etkenlerinin rutin teşhisinde yararlı olacağı sonucuna varıldı.

56

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu çalışmada, toplam 103 kanatlıdan (tavuk ve hindi) 8’inde (%7.8) mikobakteri

izole edildi. Kanatlı mikobakteriyozisi boyama, kültür ve PCR yöntemiyle araştırıldı.

Çalışmada alınan sonuçlar aşağıda verilmiştir.

• Yumurtacı tavuklar ve hindilerden alınan toplam 448 örnekte, 19 mikobakteri

etkeni teşhis edildi.

• 45 köy tavuğundan 4’ünde ve 40 ticari tavuğun 3’ünde olmak üzere toplam

85 tavuğun 7’sinde Mycobacterium avium subsp. avium izole edildi. Kanatlı

mikobakteriyozisinin köy tavuklarında olduğu gibi ticari tavuklarda da

dikkate alınması gerekliliği ortaya konuldu.

• İnfeksiyon hem ticari hem de köy tavuklarında ergin hayvanlarda (18 aylıktan

büyük) belirlendi.

• Toplam 18 hindi’den 1’inde Mycobacterium avium subsp. avium izole

edilmiştir. Bu durum hindi yetiştiriciliğinde de etkenin dikkate alınması

gerekliliğini ortaya koymaktadır.

• Her iki materyal tipinde de, gliserinle zenginleştirilmiş L-J besiyerinde

middlebrook 7H10 agara göre ilk izolasyonda daha fazla pozitif kültür elde

edildi. İnkubasyon süresinin daha kısa olduğu saptandı.

• İzolatların pasajlanarak subkültürlerinin elde edilmesi sırasında L-J

besiyerine göre Middlebrook 7H10 agar ile daha az kontaminant içeren

koloniler elde edildi.

• Kanatlı izolatlarının identifikasyonunda PCR tekniğinin kullanılması suşların

Mycobacterium avium subsp. avium olduğunun doğrulanmasında son derece

hızlı (yaklaşık 4 saat) sonuç verdi.

Bu çalışma kanatlı mikobakteriyozisinin halk sağlığı da düşünülerek gerek

ticari ve gerekse köy tavuğu sürülerinde dikkate alınması gerekliliğini ortaya

koymuştur. Ayrıca, hastalık özellikle yumurtacı sürülerde ve hastalığa duyarlı

diğer tür hayvancılık işletmeleri için ciddi ekonomik kayıplara neden olacak bir

57

tehdit olmaya devam etmektedir. Ayrıca, küçük kanatlı işletmeleri için de gerekli

hijyen uygulamaları ve halk sağlığı eğitimi yaygınlaştırılmalıdır.

58

ÖZET

Kuş Tipi Mikobakteriyozisin Tavuk ve Hindi Sürülerinde Kültür ve PCR Teknikleri ile Teşhisi

Yumurtacı tavuk ve hindi sürülerinde Mycobacterium avium complex (MAC) tarafından oluşturulan kanatlı mikobakteriyozisinin tanısı zordur. Bu çalışmada kanatlılardan alınan organ ve dışkı örnekleri kültür ve Ziehl Neelsen boyama (Z-N) ile asido-rezistans organizmaların tanısı yapılarak değerlendirildi. İzole edilen etkenlerin kuş tipi Mycobacterium avium subsp. avium olduğu Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR) ile doğrulandı. Kültür için 3 farklı besiyeri (Gliserollü Lowenstein-Jensen , ADC ile zenginleştirilmiş Middlebrook 7H9 buyyon ve OADC içeren Middlebrook 7H10 agar) kullanılarak, bunların mikobakterileri izole etmekte de başarısı test edildi. Aside-dirençli boyama metodu olarak Z-N tekniği uygulandı. Mikobakteri izolatlarında M. avium subsp. avium’un moleküler identifikasyonu için IS901 genine spesifik primerler ile yapılan PCR testi kullanıldı. Bu çalışma kapsamında toplam 103 tavuk ve hindi kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelendi. Toplam 103 hayvanın 8’inde (%7.8) Mycobacterium avium subsp. avium izole edildi. İzolasyon yapılan toplam 8 kanatlının 7’sinde (6 tavuk ve 1 hindi) nekropside lezyon görülmesine karşın 1 tavukta lezyona rastlanmadı. İncelenen materyallerde, mikobakteri izolasyon oranları 40 ticari tavukta 3 (% 7.5), 45 köy tavuğunda 4 (%8.9) ve 18 hindide 1 (% 5.5) olarak belirlendi. Toplam 385 doku örneğinin 20’sinde (%5.19) tipik tüberküloz lezyonları görüldü. Direkt mikroskobik muayene ile 488 örneğin 45’inde (% 9.2) asido-rezistans bakteriler (ARB) görüldü. Kültür “Gold standart” test olarak kabul edildi. Diğer besiyerleriyle karşılaştırıldığında L-J besiyeri ile daha fazla sayıda pozitif kültür elde edildi. Mikobakteri izolatlarının PCR testi ile değerlendirmesi sonucunda, 18 (% 4.67) izolatın Mycobacterium avium subsp. avium, 1 izolatın ise Mycobacterium spp. olduğu saptandı. Bu çalışmada elde edilen bulgular açısından ticari ve köy kanatlı sürüleri arasında önemli farklılıklar bulunmadı (p>0.05). Sonuç olarak, kanatlı mikobakteriyozisi şüphesiyle getirilen tavuk ve hindilerden M. avium subsp. avium üredi ve izolasyon amacıyla L-J’in Middlebrook 7H10 agar’a göre daha etkin olduğu saptandı. İzole edilen suşların doğrulanmasında moleküler tekniklerin teşhiste kullanılabilirliği ortaya konuldu. M. avium subsp. avium’ un kanatlı yetiştiriciliği ve halk sağlığı yönünden dikkate alınması gerektiği sonucuna varıldı.

Anahtar Sözcükler: hindi, Mikobakteri, PCR, yumurtacı tavuk,

59

SUMMARY

Diagnosis of Avian Mycobacteriosis in Layers and Turkey Flocks by Culture and PCR Techniques Diagnosis of avian mycobacteriosis in layer hens and turkeys, caused by Mycobacterium avium complex (MAC), is problematic. In this study, culture and Ziehl-Neelsen stain (Z-N) were used to detect acid-fast orgamisms in tissue and fecal samples. The isolates were confirmed using Polymerase chain reaction (PCR). Three different culture media (Lowentein-Jensen [L-J] with glycerol, Middlebrook 7H9 broth supplemented with ADC and Middlebrook 7H10 agar with OADC were tested to determine which medium had the greatest success in isolating mycobacteria. Acid-fast staining method included Ziehl-Neelsen (Z-N) technique was applied. The PCR assay was applied to identificate M. avium subsp. avium from mycobacterium isolates using specific primers to IS901 gene. Mycobacterium avium subsp. avium was cultured from 8 (7.8%) of 103 layer hens and turkeys. From a total of 8 nekropsied birds, 7 (6 layer hens and 1 turkey) birds with tuberculous lesions and 1 bird without lesions showed growth on mycobacterial medium. Considering to the origins of materials examined, mycobacteria were detected in 3 (7.5%) from 40 commercial, in 4 (8.9%) from 45 backyard hens, and in 1 (5.5 %) of 18 turkeys. Typical tuberclous lesions were observed in 20 (5.19%) samples out of 385 organs. Acid-fast bacilli (AFB) were detected in 45 (% 9.2) out of 488 samples following direct microscopic examination. Culture was considered the gold standard. Compared with other culture media, L-J yielded more positive cultures and greater numbers of colonies on positive tubes, and incubation times were shorter. From a total of 19 isolates 18 were found belonging to Mycobacterium avium subsp. avium, and only 1 was identified as Mycobacterium spp. From the results of this study, no significant differences were detected between commercial and backyard poultry flocks (p>0.05). In conclusion, M. avium subsp. avium was isolated from mycobacteriosis suspected hens and turkeys and L-J medium was determined to be more effective than Middlebrook 7H10 agar concerning bacterial isolations. The feasibility of molecular techniques for confirmation of laboratory diagnosis of isolated strains had been stated. Key words: layer hens, Mycobacterium, PCR, turkeys.

60

KAYNAKLAR

AKAY, Ö. (1980). Hindi Tüberküloz Etkenlerinin İzolasyon, İdentifikasyon, Tiplendirilmesi ile Deneysel Hindi Tüberkülozisinde Allerjik ve Serolojik Yöntemlerin Uygulanmsı Üzerinde Araştırmalar. Doçentlik Tezi. Ankara Üniv. Vet. Fak., Ankara. AKAY, Ö. (1999). Aside-Dirençli Bakteriler. In.: Özel Mikrobiyoloji. Arda, M., Minbay, A., Leloğlu, N., Aydın, N., Kahraman, M., Akay, Ö., İlgaz, A., İzgür, M., Diker, K.S. Medisan Yayınevi. 4. baskı. Ankara, s.: 180-202. AKAY, Ö. (2002). Tüberkülozis. In:Kanatlı Hayvan Hastalıkları. Ed.: M. İzgür, M. Akan. Medisan Yayınevi. 1. baskı. Ankara, s.: 101-104. ANARGYROS, P., DAVID, S.J., LIM. I.S.L. (1990). Comparison of improved BACTEC and Lowenstein-Jensen Media for Culture of Mycobacteria from Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 28: 1288-1291. ARANAZ, A., LIEBANA, E., MATEOS, A., DOMINGUEZ, L. (1997). Laboratory Diagnosis of Avian Mycobacteriosis. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 9-17. ATLAS, R.M. (2004). Handbook of Microbiological Media. 3rd. Ed. CRC Press, A.D.B., p.: 942-943. BASCUNANA, C.R., KATINKA, B.K. (1996). Detection and Identification of Mycobacteria in Formalin-Fixed, Paraffin-embedded Tissues by Nested-PCR and Restriction Enzyme Analysis. J. Clin. Microbiol. 34: 2351-2355. BAŞKAYA, H., AYDIN, N., AKAY, Ö. (1983). Kanatlı Tüberkulozisinin Teşhisinde Allerjik ve Serolojik Yöntemlerin Karşılaştırılması Üzerine Bir Araştırma. A. Ü.. Vet. Fak. Derg. 30: 440-448. BENNETT, R.M., CHRISTIANSEN, K., CLIFTON, R.S. (1999). Direct costs of endemic diseases of farm animals in Great Britain. Vet. Record. 145: 376- 377.

BENSON, C.A., ELLNER, J.J. (1993). Mycobacterium avium complex infection and AIDS: advances in theory and practice. Clin. Infect. Dis. 17:7-20.

BERMUDEZ, L. (1994). Immunobiology of Mycobacterium avium. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13: 1000-1006. BEYTUT, E., ATABAY, H.İ., AKÇA, A.(2001). Tuberculosis and Sarcosporidiosis in the Periorbital location in a hen. Kafkas Üniv. Vet. Fak. Derg. 7: 213-217.

61

BIET, F., BOSCHIROLI, M.L., THOREL, M.F., GULLOTEAU, L.A. (2005). Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC). Vet. Res. 36: 411-136. BOTTGER, E.C., TESKE, A., KIRSCHNER, P., BOST, S., CHANG, H.R., BEER, V., HIRSCHEL,B.(1992). Disseminated Mycobacterium genavense infection in patients with AIDS. Lancet. 340: 76-80. BOWES, V. (1993). Avian tuberculosis in ostrich. Can. Vet. J. 34: 758. BRENNAN, P.J., NIKAIDO, H. (1995). The envelope of Mycobacteria. Annu. Rev. Biochem. 64: 29-63. BROWN, A. E. (2001). Acid-Fast Staining: Ziehl-Neelsen Method. In: Microbiological Applications (Laboratory Manual in General Microbiology 8th. Ed. McGrow-Hill Companies, A. B. D., p.:69. CHASKES, S. (2008). Stains for light Microscopy. In.: Practical Handbook of Microbiology. Ed.: E.GOLDMAN, L.H. GREEN. 2nd ed. CRC PRESS, A.B.D. p.: 41-42. CHEVRIER, D., OPRISAN, G., MARESCA, A., MATSIOTA-BERNARD, P., GUESDON, J. (1999). Isolation of a specific DNA fragment and development of a PCR-based method for the detection of Mycobacterium genavense. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23: 243-252. CLARKE, K.R.; FIRLGERALD, S.D.; HATTEY, J.A.; BOLIN, C.A.; BERRY,

D.E.; CHURCH, S.V.; REED, W.M. (2006). Experimental inoculation of wild turkeys (Meleagris gallopavo) with Mycobacterium bovis. Avian Diseases. 50: 131-134.

COLES, C., CICUTA, M.E., ZUMARRAGA, M., ETCHETCHOURY, I., LERTORA, J., RAMIRAZ, G.V. (2007). Avian Mycobacteriosis in chickens from a rural area of Argentina. Rev. Vet. 18: 72-77. COLLINS, P., MATTHEWS, P., MCDIARMID, A., BROWN, A. (1983). The pathogenicity of Mycobacterium avium and related mycobacteria for experimental animals. J. Med. Microbiol. 16: 27-35. CONVILLE, P.S., WITEBSKY, F.G. (1998). Variable Affecting Results of Sodium Chloride Tolerance Test for Identification of Rapidly Growing Mycobacetria. J. Clin. Microbiol. 36: 1555-1559. CROMIE, R.L., BROWN, M.J., PRICE, D.J., STANFORD, J.L. (1991). Susceptibility of captive wildfowl to avian tuberculosis: the importance of genetic and environmental factors. Tubercle. 72: 105-109.

62

CROMIE, R.L., BROWNI, M.J., FORBES, N.A., MORGANS, J., STANFORD, J.L. (1993). A comparison and evaluation of techniques for diagnosis of avian tuberculosis in wildfowl. Avian Pathol. 22: 617-630. CROMIE, R.L., ASH, .N.J., BROWN, J.M., STANFORD, J.L. (2000). Avian immune responses to Mycobacterium avium: the wildfowl example. Develop. Comp. Immunol. 24: 169-185. DAVIS, G.B., WATSON, P.R., BILLING, A.E. (1984). Tuberculosis in a kiwi (Apteryx mantelli). N. Z. Vet. J. 32: 3-30. DONELEY, R.T.J., GIBSON, J.A., THONE, D., COUSINS, D.V. (1999). Mycobacterial infection in an ostrich. Aust. Vet. J. 77: 368-370. DVORSKA, L., BULL, T.J., BARTOS, M., MATLOVA, L., AVASTOVA, P.,

WESTON, R.T., KINTR, J., PARMOVA, I., VAN, S.D., PAVLIK, I. (2003). A standardised restriction fragment length polymerasim (RFLP) method for typing Mycobacterium avium isolates links IS901 with virulence for birds.J. Microbiol. Methods. 55: 11-27.

DVORSKA, L., MALTOVA, W.Y., AYELE, L., FISCHER, O.A., AMEMORI, T.,

WESTON, R.T., ALVAREZ, J., BERAN, V., MORAVKOVA, M., PAVLIK, I. (2007). Avian tuberculosis in naturally infected captive water birds of the Ardeideae and Threskiornithidae families studied by serotyping,IS901 RFLP typing, and virulence for poultry. Vet. Mic. 119: 366-374.

ERTÜRK, E., PAMUKÇU, A.M. (1974). 1933-1975 Yılları Arasında Ankara ve

Yöresinde Kanatlı Hayvanlarda Rastlanan Hastalık ve Tümör Olayları. A. Ü. Vet. Fak. Derg. 21: 13-20.

FALKINHAM, J.O., GEORGE, K.L., PARKER, B.C., GRUFT, H. (1984). In vitro

susceptibility of human and environmental isolates of Mycobacterium avium, M. intracellulare, and M. scrofulaceum to heavy-metal salts and oxyanions. Antimicrob Agents Chemother. 25: 137–139.

FERGUSON, S.H., WALLACE, L.J., DUNBAR, F., CACCIATORE, R. (1969). Mycobacterium intracellulare (Battey bacillus) infection in a Florida wood duck (Aix sponsa). Am. Rev. Resp. Dis. 100: 876-879. FIELD, A. (2009). Discovering Statisitics Using SPSS. SAGE Publication Ltd. 3. ed. London. p.687-688. GHANI, Z.G.A. (1968). The diagnosis of Avian Tuberculosis in a turkey in Iraq. Vet. Rec. 16: 508. GILL, I.J., BLANDY, M.L. (1986). Control of avian tuberculosis in a commercial poultry flock. Aust. Vet. J. 63: 422-423.

63

GOLDMAN, E., GREEN. L.H. (2009). Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2. ed. FL, ABD. pp. 41. GONZALEZ, M., BERTOS, A.R., GIMENO, I., FLORES, J.M., PZARRO, M. (2002). Outbreak of avian tuberculosis in 48-week old commercial layerhen flock. Avian Dis. 46: 1055-1061. GRANGE, J.M., YATES, D.M., BROUGHTON, E. (1990). A review: the tubercle bacillus and it’s relative. J. Appl. Bacteriol. 68: 411-431. GRANGE, J. M., YATES, M. Y., KANTOR, H, N. (1996). Emerging and other

Communicable Diseases, Surveillance and Control. 2nd ed. WHO/EMC/ZOO/96.4. p.: 1- 10.Erişim:(whqlibdoc.who.int/hq/1996/WHO_EMC_ZOO_96.4.pdf). Erişim tarihi: 10.04.2009.

GROSS, W.B., FALKINHAM, J.D., PAYEUR, J.B. (1989). Effect of environmental-genetic interactions on Mycobacterium avium challenge infection. Avian Dis. 33: 411-415. GUERRERO, C.C., BERNASCONI, D., BURKI, T., BODMER, T., TELENTI, A.

(1995). A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS1245, is a specific target for analysis of strain relatedness. J.Clin. Microbiol. 33: 304-307.

GÜMÜŞSOY, K.S., BEYAZ, L., AYDIN, F., ÖZCAN, M., ATASEVER, A. (2006). Avian tuberculosis in Kayseri zoo. Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg. 3: 25-28. HAWKEY, C., KOCK, R.A., HENDERSON, G.M., CINDERY, R.N. (1990). Haematological Changes in Domestic fowl (Gallus gallus) and Cranes (Gruiformes) with Mycobacterium avium infection. Avian Pathol. 19: 223- 234. HEJLICEK, K., TREMEL, F. (1995). Comparison of pathogenesis and epizootology signification of avian mycobacteriosis in different sorts of domestic and free living synanthropic fowl . Vet. Med-Czech. 40: 187-194. HOOP, R.K. (1997). Public health implications of exotic pet mycobacteriosis. Semin. Avian exot. Pet Med. 6: 3-8. HOOP, R.K. (2002). Mycobacterium tuberculosis Infection in a Canary (Serinus canaria L.) and a Blue-Fronted Amazon Parrot (Amazona amazona aestiva). Avian Dis. 46: 502-504. HOOP, R.K., BOTTGER, E.C., OSSENTS, P., SALFINGER, M. (1993). Mycobacteriosis due to Mycobacterium genavense in six pet birds. J. Clin. Microbiol. 31: 990-993.

64

HOOP, R.K., BOTTGER, E.C., PFYFFER, G.E. (1996). Etiological agents of Mycobacteriosis in pet birds between 1986 and 1995. J. Clin. Micrbiol. 34: 991-992. HUARD, R.C., LAZZARINI, C.O., BUTLER, W.R., VANSOOLINGEN, D., HO, J.L. (2003). PCR-based method to differentiate the subspecies of MTB on the basis of genomic deletions. J. Clin. Microbiol. 41: 1637-1650. HUEBNER, R.E., GOOD, R.C., TOKARS, J.I. (1993). Current Practices in Mycobacteriology: Results of a Survey of State Public Health Laboratories. J. Clin. Microbiol. 31: 771-775. IKONOMOPOULOS, J., FRAGKIADAKI, E., LIANDRIS, E., SOTIRAKOGLOU, K., XYLOOURI, E., GAZOULI, M. (2009). Estimation of the spread of pathogenic mycobacteria in organic broiler farms by the polymerase chain reaction. Veterinay Microbiology. 133: 278-282. KEYMER, I.F., JONES, D.M., PUGSLEY, S.L., WAFSWORTH, P.E. (1982). Asurvey of tuberculosis in birds in the Reagent’s Park Gardens of the Zoological Society of London. Avian Pathol. 11: 563-568. KOCK, N.D., KOCK, R.A., WAMBU, J., KAMAU, G.J., MOHAN, K. (1999). Mycobacterium avium-related epizootic in free-ranging lesser flamingos in Kenya. J. Wildl. Dis. 35: 297-300. KUL, O., TUNCA, R., HAZIROĞLU, R., DİKER, K.S., KAHRAMAN, S. (2005).

An out break of avian tuberculosis in peafowl (Pavo cristatus) and pheasants (Phasianus colchicus) in a zoological aviary in Turkey. Vet. Med.-Czech. 50: 446-450.

KUNZE, Z., PORTALES, M.F., MCFADDEN, J.J. (1992). Biologically distinct subtypes of Mycobacterium avium differ in possession of insertion sequence IS901. J. Clin. Microbiol. 30: 2366-2372. KUTSAL, O., SAĞLAM, M. (1988). Güvercinlerde Tüberküloz olgularının değerlendirilmesi. A. Ü. Vet. Fak. Derg. 35: 545-552. LEVY-FREBAULT, V.V., PORTALES, F. (1992). Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 315-323. MANAROLLA, G., LIANDRIS, E., PISONI, G., MORONI, P., PICCININI, R., RAMPIN, T. (2007). Mycobacterium genavense and avian polymavirus co- infection in a European Goldfinch (Carduelis carduelis). Avian Path. 36: 423- 426. MORITA, Y., ARIA, M., NOMURA, S., KATSUBE, Y. (1994b). Avian

tuberculosis which occurred in an imported pigeon and the pathogenicity of the isolates. J. Vet. Med. Sci. 56: 585-587.

65

MORITA, Y., MARUYAMA, S., KATSUBE, Y. (1994a). Pathogenicity of Mycobacterim avium serovar 1 isolated from swine in Japan for the first time. J.Vet. Med. Sci. 56: 77-81.

MORITA, Y., MARUYAMA, S., KATSUBE, Y. (1999). Pathogenicity of Mycobacterium avium complex serovar 9 isolated from painted quail (Excalfactoria chinensis). J. Vet. Med. Sci. 61: 1309-1312. MUTALIB, A.A., RIDDELL, C. (1988). Epizootiology and pathology of avian tuberculosis in chickens in Saskatchewan. Can. Vet. J. 29: 840-842. ODIAWO, G.O., MUKURIRA, J.M. (1988). Avian cerebral tuberculosis. Vet. Rec. 122: 279-280. ÖZCAN, K., BEYTUT, E., AYDIN, F., TUZCU, M. (2001). Tuberculosis in geese (Anser anser). Avian Dis. 45: 755-759. PAINTER, K.S. (1997). Avian tuberculosis caused by Mycobacterium avium serotype-3 in captive wildlife. Vet. Rec. 140: 457-458. PANIGRAPHY, B., CLATRK, E.D., HALL, C.F. (1983). Mycobacteriosis in psittacine birds. Avian Dis. 27: 1166-1168. PAVLIK, I., SVASTOVA, P., BARTL, J., DVORSKA, L., RYCHLIK, I. (2000). Relationship between IS901 in the Mycobacterium avium complex strains isolated from birds, animals, humans, and the environment and virulence for poultry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 212-217. POCKNEL, A.M., MILLER, B.J., NEUTFELD, J.L., GRAHN, B.H. (1996). Conjunctival mycobacteriosis in two emus (Dromaius novaehollandiae). Vet. Pathol. 33: 346-348. PORTALES, F.L., REALINI, L., BAUWENS, B., HIRSCHELS, W.M., MEYERS,

M., MEURICHY, W.M. (1996). Mycobacteriosis caused by Mycobacterium genavense in birds kept in a zoo: 11-year survey. J. Clin. Microbiol. 34: 319-323.

PORTER, R.E. (1998). Bacterial enteritides of poultry. Poultry Science. 77: 1159-

1165. PRIMM, T., LUCERO, P. CHRISTEI, A., FALKINHAM, J.O. (2004). Health impacts of environmental mycobacteria. Clin. Microbiol. Rev. 17: 98-106. QUINN, P.J., CARTER, M.E., MARKEY, M.E., CARTER, G.R. (1999). Clinical Veterinary Microbiology. MOSBY, London, U.K. p.: 161.

66

RASTOGI, N., BARROW, W.W. (1994). Cell envelope constituents and the multifaceted nature of Mycobacterium avium pathogenicity and drug resistance. Res. Microbiol. 145: 243-252. REALINI, L., RIDDER, K., PALMINO, J., HIRSCHEL, B., PORTALES, F. (1998). Microaeriphilic conditions promote growth of Mycobacterium genavense. J. Clin. Microbiol. 36: 2565-2570. REALINI, L., STUYTP, V., RIDDER, K., HIRSCHEL, B., PORTALES, F. (1997). Inhibitory effects of Polyoxyethylene staerate, PANTA, and neutral Phon growth of Mycobacterium genavense in BACTEC primary cultures. J. Clin. Microbiol. 35: 2791-1794. ROBERT, E., PORTER, J.R. (1998). Bacterial Enteritides of Poultry. Poultry Science. 77: 1159-1165. RUSSELL, A.D. (1996). Activity of biocides against mycobacteria. J. Appl. Bacteriol. 81: 87-101. SALFINGER, M., KAFADER, F.M. (1987). Comparisn of two pretreatment

methods for the detection of mycobacteria of BACTEC and Lowenstein-Jensen slants. J. Micrbiol. Mehtods. 6: 315-321.

SCHAEFER, W.B., BEER, J.V., WOOD, N.A., BOUGHTON, E., JENKINS, P.A., MARKS, J. (1973). A bacteriological study of endemic tuberculosis in birds. J. Hyg., Camb. 71: 549-557. SEZEN, İ.Y., ERER, H., ERGANİŞ, O. (1986). Bir güvercinde tüberküloz olgusu. Selçuk Üniv. Vet. Fak. Derg. 2: 163-166. SHINNICK, T.M., GOOD, R.C. (1994). Mycobacterial Taxonomy. Eur. J. Clin. Micribiol. Infect. Dis. 13: 884-901. SHITAYE, J.E., MALTOVA, L., HORVATHOVA, A., MORAVKOVA, M., BARTOSOVA, L., TREML, F., LAMKA, J., PAVLIK, I. (2008). Mycobacterium avium subsp. avium distribution studied in a naturally infected hen flock and in the environment by culture, serotyping and IS901 RFLP methods. Veterinary Microbiol. 127: 155-164. SINGBEIL, B.A., BICKFORD, A.A., STOLTZ, J.H. (1993). Isolation of Mycobacterium avium ringneck pheasants (Phasianus colchicus). Avian Dis. 37: 612-615. SMIT, T., EGER, A., HAAGSMA, J., BAKHUIZEN, T. (1987). Avian tuberculosis in Wild Birds in the Netherlands. J. Wildl. Dis. 23: 485-487. STAGER, C.E, LIBONATI, J.P., SIDDIQI, S.H., DAVIS, J.R., HOOPER, N.M., BAKER, J.F., CARTER, M.E. (1991). Role of Solid Media When Used in

67

Conjunction with the BACTEC System for Mycobacterial Isolation and Identification. J. Clin.Microbiol. 29: 154-157. SYKES, G.P. (1982). Tuberculosis in a red-tailed hawk (Buteo jamaicensis). J.

Wildl. Dis. 18: 495-499. TADESSE, S., WOLDEMESKEL, M., MOLLA, B., TIBBOS,M., KIDANE, D., MEDHIN, G., BRITTON, S. (2004). Avian Mycobacteriosis in Domestic Chickens from Selected Agro-climatic Regions in Ethiopia. J. Appl. Res. Vet. Med. 2: 17-25. TANAKA, C., MIYAZAWA, T., WARATAI, M., ISHIGURO, N. (2005).

Bacteriological Survey of Feces from Feral Pigeons in Japan. J. Vet. Med. Sci.67: 951-953.

TANTAŞ, A., AK, S., YILMAZ, H. (1990). A case of fowl tuberculosis in which are taken from a poultry farm. İstanbul Üniv. Vet. Fak. Derg. 16: 61-66. TELENTI, A., MARCHES, F., BALZ, M., BALLY, F., BOTTGER, E., BODMER, T. (1993). Rapid Identification of Mycobacteria to the Species Level by Polymerase Chain Reaction and Restriction Enzyme Analysis. J. Clin. Microbiol. 31: 175-178. TELL, L.A., FOLEY, J.M., NEEDHAM, L., WALKER, R.L. (2003a). Diagnosis of Avian Mycobacteriosis: Comparison of Culture, Acid-Fast Stains, and Polymerse Chain Reaction for the Identification of Mycobacterium avium in Experimentally Inoculated Japanese Quail (Cturnix coturnix japonica). Avian Dis. 47: 444-452. TELL, L.A., LEUTENEGGER, C.M., LARSEN,R.S., AGNEW, D.W., KEENER,

L., NEEDHAM, M.L., RIDEOUT, B. (2003b). Real-Time Polymerase Chain Reaction Testing for the Detection of Mycobacterium genavense and Mycobacterium avium complex species in Avian samples. Avian Dis. 47: 1406- 1415.

TELL, L.A., WOOD, L., CROMEI, R.L. (2001). Mycobacteriosis in birds. Rev. Sci. tech. Off. Int. Epiz. 20: 180-203. THOEN, C.O. (1994). Mycobacterium avium infections in animals. Res. Microbiol. 145: 173-177. THOREL, M.F., HUCHZERMEYER, H., MICHEL, A.L. (2001). Mycobacterium avium and Mycobacterium intercellulare infection in mammals. Rev. Sci. Technol. 20: 204-218.

68

THOREL, M.F., HUCHZERMEYER, H., WEISS, R., FONTAINE, J.J. (1997). Mycobacterium avium infections in animals. Literature review. Vet. Res. 28: 439-447. THOREL, M.F., KRICHESKY, M., LEVY, F.V.V. (1990). Numerical taxonomy of

Mycobactin-dependent Mycobacteria, emended description of Mycobacterium avium, and description of Mycobacterium avium subsp. avium nov., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nov., and Mycobacterium avium subsp. silvaticum. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 254-260.

TORTOLI, E., NANETTI, A., PIERSIMONI, C., CICHERO, P., FARINA, C., MUCIGNAT, G., SCARPARO, C., BARTOLINI, L., VALENTINI, R., NISTA, D., GESU, G., TOSI, C.P., CROVATTO, M., BRUSARROOCO, G. (2001). Performance Assessment of New Multiplex Probe Assay for Identification of Mycobacteria. J. Clin.Microbiol. 39: 1079-1084. VAN der HEYDEN, N. (1997a). Clinical Manifestations of Mycobacteriosis in pet birds. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 18-24. VAN der HEYDEN, N. (1997b). New Strategies in the Treatment of Avian Mycobacteriosis. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 25-33. WASHKO, R.M., HOEFER, H., KIEHN, T.E., ARMTRONG, D., DORSINVILLE, G., FRIDEN, T.R. (1998). Mycobacterium tuberculosis infection in a green- winged macaw (Ara chloroptera): report with public health implications. J. Clin. Microbiol. 36: 1101-1102. WAYNE, L.G., ENGBAEKH, H.C., NGELH, H.W.B., FROMANS, S., GROSS, W.,

HAWKINS, J,. KAPPLER,W., KARLSSON, A.G., KLEEBERG, H. H., KRASNOW, I., KUBICA,G. P., MCDURMONCT, C., NEEL, E.E., PA-ITYNS, S.R., SCHRODER, K.H., SHOWALTER, S., TARNOK, I., TSUKAMURMA, M., VERGMANN, B., WOLINSKY, E. (1974). Highly reproducible techniques for use in systematic bacteriology in the genus Mycobacterium: tests for pigment, urea, resistance to sodium chloride, hydrolysis of Tween 80 and P-galactosidase. Int. J. Syst. Bacteriol. 24: 41 2-4 19

WILSON, M.L., STONE, B.L., HILDRED, M.V., REVES, R.R. (1995). Comparison of Recovery Rates for Mycobacteria from BACTEC 12B Vials, Middlebrook 7H11- Selective 7H Biplates, and Lowentein-Jnensen Slants in a Public Health Mycobacteriology Laboratory. J. Clin. Microbiol. 33: 2416-2518. YARDIMCI, H. (2006). Mycobacterium İnfeksiyonları. In: Veteriner Mikrobiyoloji: Bakteriyel Hastalıklar. Ed.: N. Aydın, J. Paracıkoğlu. Medisan Yayınevi, Ankara, s.: 87-107.

69

YODER, S., ARGUETA, C., HOLTZMAN, A., AROSON, T., BERLIN, O.G. TOMASEK, P., GLOVER, N., FROMAN, S., STELMA, G (1999). PCR comparison of Mycobacterium avium isolates obtained from patients and foods. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2650-2653.

70

ÖZGEÇMİŞ

I. Bireysel Bilgiler

Adı : KHAIR ELSID

Soyadı : ABDALLA

Doğum yeri ve tarihi : SUDAN, 1970

Uyruğu : SUDAN

Medeni durumu : Bekar

İletişim adresi ve telefonu : khairo114@yahoo.com

0555 543 3881

II. Eğitimi

2005- Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doktora öğrencisi

1997-2000 Bağdad Üniversitesi Veteriner Fakültesi (MSc.), IRAK

1991-1995 Hartum Üniversitesi Veteriner Fakültesi (BSc.), SUDAN

1987-1990 Kosti Lisesi

1983-1986 Tendelti Ortaokulu

1977-1983 Tendelti İlkokulu

Yabancı dili : Türkçe ve İngilizce

III. Ünvanları

1995- Veteriner Hekim

1996- Araştırma Görevlisi

2000- Okutman

IV. Mesleki Deneyimi

Araş. Gör.

V. Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar

Sudan Veteriner Hekimleri Genel Derneği

Darfur Veteriner Hekimleri Derneği

Nyala Üniversitesi Meclisi

71

VI. Bilimsel İlgi Alanları

Yayınları:

1. ABDALLA, K., MOHAMED, T., KHALIFA, A.A., AL-IZZI, S. (2007).

Transfer of Rhodococcus equi Immunity in guinea pigs by means of

Sensitized Spleen Cells. J. Anim. Vet. Adv., 6: 223-233.

Posterler:

1.SAREYYUPOGLU, B., BABACAN, O., ABDALLA, K. (2009). Design

of Primers for Multiplex PCR Detection of Pathogenic Mycobacteria in Pet

Birds. XVI th. World Veterinary Poulty Congress, 8-12, Nov. 2009,

Marakesh, Morocco.

VII. Bilimsel Etkinlikleri

Tezler:

Transfer of Rhodococcus equi Immunity in guinea pigs by means of

Sensitized Spleen Cells. (2000). Master Tezi. Bağdad Üniv. Vet. Fak.,

Bağdad.

Seminerler:

1-Kazanılmış Genler

2-Atipik (Non-tüberküloz) Mikobakterileri İnfeksiyonlarının Tanı

Yöntemleri ve Zoonotik Önemi.

Katıldığı Kongreler

1- II. Ulusal NBC Sempozyumu (Uluslararası Katılımlı). 08-09 Kasım

2005, GATA-Ankara, Turkey.

2- VII. Ulusal Veteriner Mikrobiyoloji Kongresi (Uluslararsı Katılımlı).

26-28 Eylül 2006. Side-Antalya, Türkiye.