METODICHE TRADIZIONALI

E

TECNOLOGIE INNOVATIVE

IN MICOBATTERIOLOGIA

Anna Camaggi TSLB

S.C. Laboratorio di Microbiologia e Virologia

A. O. U. Maggiore della Carità - Novara

annacamaggi@libero.it

GLaTeLab

Gruppo di Lavoro per lo Sviluppo Prof. Continuo dei Tecnici di Laboratorio

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA….

•ELEVATO LIVELLO DI QUALITA’ DIAGNOSTICA

•TAT

• COSTI

DOTATO: PERSONALE QUALIFICATO, ESPERTO E AGGIORNATO

UTILIZZA: STANDARD DIAGNOSTICI, DI SICUREZZA E ORGANIZZATIVI

METODICHE TRADIZIONALI

E

TECNOLOGIE INNOVATIVE

CARATTERISTICHE GENERALI DEI MICOBATTERI

CLASSIFICAZIONE: Regno Bacteria

Tipo Actinobacteria Classe Actinobacteridae Ordine Actinomycetales Sottordine Corynebacterineae Famiglia Micobacteriaceae

Principali target genetici degli studi tassonomici 16S rDNA 23S rDNA hsp65 ITS rpoB

Sono bacilli immobili, non sporigeni, aerobi obbligati, delle dimensioni di 0.2-0.6 x 1-10 μm, caratterizzati dalla lenta crescita, da una parete ricca di acidi micolici e da un DNA con elevato contenuto di guanina e citosina (60-70%).

ALL’INTERNO DELLE SPECIE RICONOSCIUTE: Specie a crescita rapida 53% Specie a crescita lenta 47% Specie non cromogene 51% Specie scotocromogene 46% Specie fotocromogene 3% Specie patogene 61% Specie isolate esclusivamente dall’ambiente 17% Specie isolate dall’uomo ma non patogene 16% Specie isolate esclusivamente da animali 6%

NUOVE SPECIE!! Oggi..~ 170 NTM

70% negli ultimi 15 anni

(~3 nuove specie ogni anno)

Non dimentichiamo ……

La tubercolosi, che oggi, accanto all’AIDS ed alla

malaria, è una delle malattie più diffuse, va

conosciuta da tutti, specie da coloro che operando

in Sanità nei Paesi ove questa è poco diffusa

l’hanno dimenticata

(F. Mandler – MICOBATTERIOLOGIA CLINICA)

I MICOBATTERI OGGI…

QUINDI…..

M. tuberculosis complex

M. leprae

micobatteri non tubercolari o MNT (o NTM)

Ridotta incidenza di tubercolosi nei paesi industrializzati = Ridotta familiarità e competenza con i micobatteri Aumento della TB farmaco-resistente Aumento del numero di specie patogene alcune delle quali di difficile identificazione Nuova tipologia di paziente: anziano, oncologico, cardiopatico, trapiantato

Differiscono dal M. tuberculosis complex per:

Habitat

Virulenza

Contagiosità

Sensibilità ai farmaci

FASE PRE-ANALITICA

NON CORRETTA

= REFERTO ERRATO

INUTILE

DANNOSO

Non dimentichiamo ……

Essential laboratory tests for tuberculosis control

MMWR – November 4, 2005/ Vol.54 N. RR -12

TEST TAT

Microscopia per BAAR 24 h

Amplificazione per M. tuberculosis complex 48 h

Esame colturale positivo 14 giorni

Identificazione 21 giorni

Test di sensibilità ai farmaci di prima scelta 30 giorni

Test di sensibilità ai farmaci di seconda scelta

28 giorni dalla

richiesta

L’WHO ha approvato attraverso il suo gruppo di consulenza tecnica un

piano globale di azione costantemente aggiornato per fermare la tb

2015

The Global Plan to Stop TB 2006–2015 The Global Plan to Stop TB 2015-2035

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

Preparazione dei campioni….

Dati del Lab. Novara

Poster ESM - Lubecca 2011

Percentage of contaminated samples

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Esame microscopico Colorazioni

•Ziehl-Nielsen (carbolfucsina a caldo)

•Kinyoun (carbolfucsina a freddo)

•Auramina (fluorescenza)

Ziehl-Neelsen, Kinyoun

Colorazione con Auramina

•Economico

•Eccellente specificità di genere

•Forte correlazione con l’infettività

•Bassa sensibilità (104 ufc)

•Esperienza dell’operatore

•Tempo di osservazione

•Nessuna informazione sulla vitalità nel 2010 l’WHO

consiglia l’utilizzo della

microscopia LED

economica e più sensibile

della microscopia ottica

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Esame colturale

Osservazione: 60 giorni a 37°C

tempo medio di crescita: 18-25 giorni TERRENI

SOLIDI:

TERRENI

LIQUIDI:

Osservazione: 42 giorni a 37°C

tempo medio di crescita: 5-14 giorni

Sensibilità 10-100 UFC

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Test di Amplificazione dell’Acido Nucleico - NAATs MMWR2009; 58:7-10

Consentono il simultaneo rilevamento ed identificazione

M. tuberculosis complex direttamente dai campioni clinici

Sono indicati per tutti i pazienti nei quali la TB è fortemente

sospetta, ma non ancora accertata

Non possono sostituire, ma affiancano i metodi convenzionali.

Real-time

Sistema E-MTD LPA HAIN ProbeTec

Metodo TMA LPA SDA

Target rRNA rpoBTUB IS 6110

Lettura

Chemilumine-

scenza

cromogeno Fluorimetria

Automazione Assente ibridizzazione Amplificazione

e lettura

Estrazione Lisi Lisi Lisi

Non Real-time

Sistema Real Art

MTB PCR

MTB Q PCR Alert

COBAS TaqMan

Xpert

MTB/RIF

Metodo qRT-PCR

RT-PCR RT-PCR

H-nested

RT-PCR

Target 16S

rDNA IS 6110

16S rDNA

rpoB (192 bp)

Sonda TaqMan TaqMan TaqMan Molecular

beacon

Automa-zione

Amplific. e lettura

Amplific.

e lettura

Amplific.

e lettura Completa

Estrazione Lisi-

cattura Lisi-

cattura Lisi

Lisi-cattura

Test di amplificazione diretta,

qualche esempio….

Xpert® MTB/RIF

LoD= n°piu basso delle unità formanti colonie (CFU) per campione che possono essere riproducibilmente distinte da campioni negativi con intervallo di confidenza del 95%.

Espettorato diretto: LoD= 131 cfu/ml (IC 95%)

Sedimenti: LoD= 297 cfu/ml (IC 95%)

SENSIBILITA’ ANALITICA

I dati di letteratura su Xpert MTB/RIF sono

numerosi e mostrano la buona performance

del test sia sui campioni respiratori (per i

quali è stato validato dal produttore) che su

quelli extrapolmonari, con una particolare

nota di merito per alcuni materiali

notoriamente ostici, quali liquido cefalo

rachidiano ed asp. gastrico

PERFORMANCE

Circa 2 ore

Sensibilità >102 UFC

GeneXpert Omni

DNA STRIP®-Technology…. Circa 4 ore

AFB

reading

m.o.

samples

TRCReady-

80 reaction

time

+ 12 7’30”

++ 11 5’28”

+++ 17 4’26”

TRC is one of NAAT

・Target nucleic acid is RNA

・Rapid real-time detection

Transcription Reverse transcription Concerted Reaction

TRCReady-80

AFB direct test vs TRCReady-80

TRCReady® -80

TRCR®

MB-Lysis reagent*2

TRCR®

Purification Kit*3 TRCReady® MTB Specimen*1

(MTB)

*1) Decontaminated Specimen (NALC-NaOH treated) *2) TRCR MB-Lysis reagent is the dedicated reagent used for lysis of Mycobacteria *3) TRCR Purification kit is dedicated for purification of RNA from specimen, common reagent.

Circa 50 minuti

TOSOH

The simultaneous detection, Screening of MTB, MDR-TB and XDR-TB on Real-time PCR

Circa 3 ore

Innovative real-time PCR method:

READ (Real Amplicon Detection) PCR

combined with Seegene's proprietary

DPO™ technology (Dual Priming

Oligonucleotide).

TEST MOLECOLARI DIRETTI

DI …”IERI” E DI… “OGGI”

Riproducibilità, sensibilità, specificità e

precisione nettamente aumentate

Riduzione TAT (2-3 ore)

Riduzione delle contaminazioni

Maggiore automazione=standardizzazione

Costi più elevati

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Test biochimico-colturali

NAP-test (p-nitro-α-acetilammino-β-idrossipropiofenone)

Risultati utili:

>7 giorni

Identificazione, ieri….

INNO LiPA

~6 ORE

SEQUENZIAMENTO

Identificazione, oggi…..

GenoType CM/ AS

~ 5 ORE

anche da campione DK+

COLTURA S/L POSITIVA PER BAAR

Test immunocromatografico

Mtbc vs. NTM

10-15 min.

DNA Probe

ibridiz. fase liquida

SONDE AccuProbe

~ 2 ORE

DNA Probe

Ibrid. fase solida

MICROARRAY

5 ORE

DNA-Probe

Ibridizzazione in fase liquida

Bersaglio: rRNA 16S

Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente dalle colonie

Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA)

Specificità:

M. tuberculosis complex

MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente

M. kansasii

M. gordonae

Limiti:

test a cascata

limitato a poche specie di NTM

Circa 2 ore

L’ANALISI E’ COMPOSTA DA TRE FASI

RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione tramite ibridazione inversa

ESTRAZIONE dell’acido nucleico

AMPLIFICAZIONE

Identificazione contemporanea del genere Mycobacterium e di : •16 diverse specie di micobatteri test INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 •14+16 diverse specie di micobatteri test GenoType® Mycobacterium CM e AS

Risultato utile: < 6 ore dalla positività della coltura

DNA-Probe

Ibridizzazione inversa, fase solida

Microarray………..

Circa 5 ore

Sequenziamento

Scelta della regione da sequenziare

16S rDNA

Internal transcribed spacer

23S rDNA

hsp65

rpoB

Sequenziamento

Confronto della sequenza con quelle presenti in un database (chiunque può confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank)

Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

INNO LiPA

GenoType CM o AS

NEL NOSTRO LAB. DI MICOBATTERIOLOGIA…

COLTURA S/L POSITIVA PER

BAAR

MALDI-TOF MS ID

CONFERMA ID CON SONDE AccuProbe

CONFERMA ID CON DNA STRIP TECHNOLOGY

Le identificazioni con MALDI-TOF sono in fase sperimentale,

devono pertanto essere confermate da test diagnostici validati

Attualmente….

SEQUENZIAMENTO

~ 2 ore da coltura liquida,

1 ora da coltura solida

DATABASE APERTO

Identificazione con MALDI-TOF MS….?

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

METODI FENOTIPICI (valutazione della crescita in terreno solido/liquido in presenza del farmaco):

Costo-efficace

Semplice da eseguire, più complessa da standardizzare

Risultati disponibili in settimane/mesi

METODI MOLECOLARI (identificazione delle mutazioni responsabili di resistenza):

Risultati disponibili in ore

Non richiedono ceppo vitale, indip. da inquinamento del campione

Generalmente costosi

Difficoltà di esecuzione, limitati ad alcuni targets

Test di sensibilità per M. tub. complex

Utilizzando terreni liquidi circa 7-10 giorni dalla positività della coltura

Utilizzando terreni solidi circa 14-18 giorni dalla positività della coltura

Caratteristiche BACTEC

460TB

MGIT 960 VersaTREK BacTAlert

Formato semiautom

atico

automatico automatico automatico

Radiometria SI NO NO NO

Rilevamento 14CO2 fluorimetrico pressometrico colorimetrico

Volume dell'

inoculo (mL)

0,5 0,5 0,5-1,0 0,5

Volume del

terreno (mL)

4 7 12,5 10

Gestione dati NO SI SI SI

Antibiogramma SI SI SI SI *

Tempi medi di

detection (gg.)

11-14 11-13 11-15 13-17

Test di sensibilità fenotipici per MTB disponibili in Italia

* non approvato dalla US-FDA

MGIT utilizzato per eseguire DST:

confronto della crescita dei micobatteri con e senza

l'aggiunta di farmaci. Il sistema usa un algoritmo, basato

sul principio del metodo delle proporzioni, per comparare

le cinetiche di crescita in assenza ed in presenza di

farmaco e per interpretarle in termini di S e di R

Dr. Scarparo

Test di sensibilità fenotipico per MTB e NTM

con microdiluizione in brodo

La microdiluizione in brodo, che

permette la determinazione delle

concentrazioni minime inibenti

(MIC), si esegue utilizzando

piastre microtiter nei cui pozzetti

sono presenti diluizioni per

raddoppio dei singoli antibiotici.

MYCOTB RAPMYCO SLOMYCO

LE RESISTENZE DEL M. tuberculosis complex….

resistenza primaria, quando è già presente nel ceppo

responsabile dell’infezione

resistenza secondaria quando insorge durante la terapia

le resistenze sono dovute esclusivamente a mutazioni

cromosomiche

sono state trovate una o più mutazioni associate alla

resistenza nei confronti dei singoli farmaci anti-TB

Giugno 1998

Microbiology 148, 2967-2973, 2002

Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv J. C. Camus, et al.

+ 82 geni

Nature 393, 537-544, 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence S. T. Cole, et al.

Geni coinvolti nella resistenza ai

maggiori anti-tuberculari Drug Gene Gene product Mutations

Streptomycin rpsL 12S ribosomal protein Coding region (60%)

rrs 16S rRNA Reg. 530 and reg. 915 (8%)

Isoniazid katG Catalase-peroxidase coding region (cod. 315 - 60-80%)

inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site - 15%); coding region

ndh NADH dehydrogenase coding region

ahpC-OxyR regulon (controls katG and several other genes) promoter region (mutations relatively rare)

Rifampin rpoB RNA pol (β subunit) hot spot region (cod. from 508 to 535 - 98%); N-term region

Ethambutol embB Arabinosyl transferase ERDR (cod. 306 - 70%)

embC Arabinosyl transferase coding region

Ethionamide inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site); coding region

ethA Monooxygenase coding region

ethR Monooxygenase repressor coding region

ndh NADH dehydrogenase coding region

Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase coding region (70%)

Fluoroquinolones gyrA DNA gyrase (sub. A) QRDR (70%)

gyrB DNA gyrase (sub. B) QRDR

Rifabutin rpoB RNA pol (β subunit) coding region

Capreomycin rrs 16S rRNA coding region

tlyA rRNA methyltransferase coding region

Viomycin rrs 16S rRNA coding region

Kanamycin rrs 16S rRNA coding region

Amikacin rrs 16S rRNA coding region

D-Cycloserine alr D-Ala racemase promoter region

Para-salicylic acid thyA Thymidylate synthase coding region

Specificity

Mutations

(control: wt)

Probes repeated at

least twice

Aragón et al. J Antimicrob Chemother (2006) 57:825-831

TB-Biochip oligonucleotide microarray system for

rapid detection of rifampin resistance in

Mycobacterium tuberculosis

Test genotipici per la farmacoresistenza LPAs

Hain

Lifescience

INNO-LiPA-Rif.TB

•ESTRAZIONE dell’acido nucleico

•AMPLIFICAZIONE multiplex mediante primers biotinilati

•RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione tramite

ibridazione inversa

Innogenetics

NEL NOSTRO SETTORE DI

MICOBATTERIOLOGIA…

SPECIMENT SMEAR +

1

DAT MTBC

+

DNA STRIP MDRplus/sl

2

DAT MTBC

-

DNA STRIP CM/AS

Esempio 1:

Paziente forte sospetto tb,

probabile ceppo DR TAT:

48/72 h Esempio 2:

Paziente sospetto tb,

ricoverato,

in isolamento

DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…

Caso: B.M. forte sospetto riattivazione TB in paziente ucraino già trattato per TB, non DR, nel 2013. Xpert MTB/RIF eseguito in giornata, da campione

80-95% dei ceppi resistenti alla RIF risultano essere resistenti anche a INH

1/2

DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…

Caso: B.M. 2^ giornata da campione decontaminato DK negativo, si esegue test genetico molecolare MTBDRplus Si rilevano mutazioni che conferiscono resistenza a rifampicina e isoniazide. MDR o ….?

RMP = R

INH= R

3^ giornata dallo stesso estratto si esegue MTBDRsl

FLQ = R

AG/CP= R

In 3^ giornata il ceppo risulta: XDR

2/2

DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…. Caso: P.R. Paziente indiana, 8° mese di

gravidanza, ricoverata in ginecologia,

sospetto tb, DK neg, DAT (Xpert

MTB/RIF) MTBC+, RIF S

MTBDRplus:

RIF e INH = S

1/2

DST GENETICO MOLECOLARE, QUANDO…

Caso: P.R. Dopo 8 giorni MGIT pos, in

9^ giornata ATB MGIT960,

in 13^ sospetto DR, si

ripete test genetico

molecolare MTBDRplus

MTBDRplus: INH = R

Metodo fenotipico: in 19^ ATB MIGIT960 I=R,

2/2

L’ANTIBIOGRAMMA TRADIZIONALE….

SI CONFERMA ESSERE

IL GOLD STANDARD

PER LA RILEVAZIONE

DELLE RESISTENZE IN MTC

In attesa di cosa vedere cosa accadrà con

le tecniche di nuova generazione…. (Next Generation Sequencing) –NGS…

Quindi…….

Preparazione dei campioni (NALC-NaOH)

Esame microscopico

Esame colturale

Test di amplificazione diretta

Identificazione

Test di sensibilità

Epidemiologia

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA

Epidemiologia molecolare

della tubercolosi…. PERCHE’?

La rapida identificazione di un episodio epidemico di tubercolosi permette

la tempestiva attuazione di adeguate misure di controllo e il rapido inizio di

una corretta terapia antitubercolare.

INOLTRE, CONSENTE…..

COME: Sequenza d’inserzione IS6110

RFLP (Restriction-Fragment-Length Polymorphism)

Spoligotyping (PCR)

MIRU (mycobacterial interspersed repetitive unit) (PCR)

Delezioni genomiche e micro-arrays

Conferma dei sospetti di microepidemie

Valutazione dei sospetti di contaminazione di laboratorio

Valutazione delle recidive di tubercolosi

Screening sistematico e sorveglianza epidemiologica

Patogenesi, virulenza e trasmissibilità

IL SETTORE DI MICOBATTERIOLOGIA….

•ELEVATO LIVELLO DI QUALITA’ DIAGNOSTICA

•TAT

• COSTI

DOTATO: PERSONALE QUALIFICATO, ESPERTO E AGGIORNATO

UTILIZZA: STANDARD DIAGNOSTICI, DI SICUREZZA E ORGANIZZATIVI

Aggiornamento continuo Monitoraggio continuo delle innovazioni tecnologiche Adeguamento rapido ai cambiamenti

Per saperne di più..

For more information please go to www.who.int/tb <http://who.us8.list-manage.com/track/click?u=f093a7c38a3780cd9504f8d9d&amp;id=c21673c1e5&amp;e=1f55c04a80>

MICOBATTERIOLOGIA

sito con contenuti scientifici relativi ai micobatteri, a cura di Enrico Tortoli

http://mycobactoscana.it/index.html

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evento formativo di 4 giornate:

“ CORSO DI AGGIORNAMENTO TEORICO/PRATICO

PER TECNICI DI LABORATORIO

BIOMEDICO”

Gruppo di Lavoro per lo Sviluppo Professionale Continuo dei Tecnici di Laboratorio

(GLaTeLab)

AOSTA

SETTEMBRE 2016

ISIP—IST. TECNICO E

PROFESSIONALE REGIONALE

“C. Gex.”