Embed Size (px)
DESCRIPTION
Autora: Alba Videla Ristol | Tutora: Núria Dalmau Homs | Tema: Leucèmia
Citation preview
Treball de recerca
LA LEUCÈMIA:
DE L’ANALÍTICA AL DIAGNÒSTIC
Alba Videla Ristol
Dirigit per: Núria Dalmau Homs
Institut Montserrat
2n Batxillerat 2
Novembre 2014
2
Agraïments
Vull agrair a totes aquelles persones que m’han
ajudat a fer possible aquest treball, en concret al
doctor Josep Nomdedéu per brindar-me
l’oportunitat de viure el dia a dia al seu laboratori.
A en Josep i la Rosa per la seva dedicació i
simpatia; a la meva tutora Núria per aconsellar-me
quan ho he necessitat; i als meus pares i a la meva
germana per la seva contínua predisposició i ajuda
i amb qui sempre puc comptar.
En especial al meu pare per la seva lluita, sense la
qual jo no estaria aquí.
3
“Sense laboratoris els homes de ciència
són com soldats sense armes”
Louis Pasteur
4
Índex
1. Presentació del treball ........................................................................................................................ 6
1.1. Tema .................................................................................................................................................... 6
1.2. Estructura ......................................................................................................................................... 6
2. Introducció ............................................................................................................................................... 8
2.1. La Sang i les Seves Cèl·lules ...................................................................................................... 8
2.2. El Càncer ......................................................................................................................................... 10
3. La Leucèmia........................................................................................................................................... 11
3.1. Història: Velpeau, Donné, Bennett i Virchow ............................................................... 11
3.2. Hemopoesi Normal.................................................................................................................... 14
3.3. Classificació de les Leucèmies .............................................................................................. 17
3.3.1. Leucèmia Aguda ................................................................................................................. 17
3.3.1.1. Leucèmia Mieloide Aguda ..................................................................................... 18
3.3.1.2. Leucèmia Limfoide Aguda ..................................................................................... 19
3.3.2. Leucèmia Crònica .............................................................................................................. 19
3.3.2.1. Leucèmia Mieloide Crònica .................................................................................. 20
3.3.2.2. Leucèmia Limfoide Crònica .................................................................................. 20
3.4. Etiologia i Epidemiologia........................................................................................................ 21
3.4.1. Etiologia.................................................................................................................................. 21
3.4.2. Epidemiologia ...................................................................................................................... 22
3.5. Tractaments Més Freqüents ................................................................................................. 23
4. De l’Analítica al Diagnòstic. Principis de diagnòstic de la leucèmia ........................... 27
4.1. Anàlisis de Sang i de Medul·la Òssia ................................................................................. 27
4.1.1. Hemogrames ........................................................................................................................ 28
4.1.2. Anàlisis Immunofenotípiques i Morfològiques. La citometria de flux ..... 34
4.1.3. Anàlisi Citogenètica .......................................................................................................... 44
5
4.2. Anàlisi molecular ........................................................................................................................ 45
5. Part pràctica .......................................................................................................................................... 50
5.1. Introducció .................................................................................................................................... 50
5.2. Un dia al laboratori .................................................................................................................... 50
6. Experiència personal ........................................................................................................................ 57
7. Conclusions............................................................................................................................................ 62
8. Bibliografia ............................................................................................................................................ 63
8.1. Llibres .............................................................................................................................................. 63
8.2. Pàgines web .................................................................................................................................. 63
6
1. Presentació del treball
1.1. Tema
Quan vaig haver d’escollir el tema a tractar pel treball de recerca em van venir diverses
idees al cap, la majoria relacionades amb les ciències de la salut; hi eren presents la
homeopatia, la musicoteràpia i la leucèmia, entre d’altres.
La que més em va cridar l’atenció va ser la leucèmia. Hi van haver dos motius principals
que em van fer inclinar per aquesta opció: l’interès per conèixer malalties i el fet que el
meu pare l’hagués patit quan era jove. A més, vaig poder contactar amb el cap
d’hematologia del laboratori de l’Hospital de Sant Pau, que em va donar l’oportunitat
d’anar a fer pràctiques al seu departament durant una setmana.
Així doncs, he enfocat el treball de recerca cap al procés de diagnòstic de la leucèmia,
des que arriba una analítica de sang fins al moment de donar un diagnòstic.
La hipòtesi d’aquest treball de recerca és que l’anàlisi immunofenotípica és la més
rellevant d’entre totes les tècniques citològiques1. Aquestes tècniques són l’eina
fonamental per poder arribar al diagnòstic de la leucèmia.
Per tant, l’objectiu d'aquest estudi és avaluar la importància de les tècniques
citològiques de les cèl·lules de la sang i de la medul·la òssia en el diagnòstic de la
leucèmia, i la seva implicació en el tractament d'aquesta malaltia neoplàsica.
1.2. Estructura
Per poder arribar a comprovar la hipòtesi he estructurat el treball de la següent
manera:
Els capítols segon i tercer d’aquesta memòria introdueixen el tema que s’està tractant.
El segon explica què és la sang i quines cèl·lules la componen, intenta aclarir per què es
1 Un estudi citològic és un anàlisi cel·lular emprat, generalment, per diagnosticar càncers i altres
patologies.
7
poden diagnosticar tants tipus diferents de leucèmies (tants com tipus de cèl·lules hi
ha a la sang) i introdueix el concepte de càncer. El tercer capítol pretén informar sobre
què s'entén per leucèmia; aporta informació sobre els diferents tipus, la seves causes i
amb quins tractaments es combat.
En el quart capítol s’assoleix l’objectiu d’aquest treball: s'explica com arribar al seu
diagnòstic, tot destacant la importància de l'estudi citològic.
El cinquè punt mostra un resum de la meva experiència al laboratori de l'Hospital de la
Santa Creu i Sant Pau, en concret, en la unitat on es duu a terme l'estudi
immunofenotípic.
En l’apartat sisè, he inclòs un “reportatge” en el qual s’expliquen les vivències d’un
pacient amb leucèmia i les de la seva família. Amb aquest capítol, he volgut mostrar un
aspecte de caire més humà que és present no tan sols en la leucèmia, sinó en totes les
malalties.
Per acabar, he fet una petita conclusió de la recerca, explicant què és el que m’ha
aportat aquest treball, si he pogut demostrar la hipòtesi formulada i si he assolit els
objectius proposats.
8
2. Introducció
2.1. La Sang i les Seves Cèl·lules
La sang és un fluid que trobem dispers pel cos humà
entre el cor i els vasos sanguinis. El volum de sang
(volèmia) en una persona adulta és de 5L i representa un
7-8% del seu pes total. La funció bàsica de la sang és el
transport d’O2 i CO2, de nutrients i productes del
metabolisme, cèl·lules, calor i informació2.
La sang consta de dues fraccions, el plasma sanguini,
una dissolució de proteïnes, lípids i glúcids, i els elements cel·lulars: glòbuls vermells,
també anomenats eritròcits o hematies, glòbuls blancs o leucòcits i plaquetes o
trombòcits.
·Els eritròcits són les cèl·lules més abundants de la sang: 5x10⁶/µL. Es caracteritzen per
la seva forma bicòncava, són anucleades i contenen una gran quantitat d’hemoglobina,
la molècula que dóna el color vermell a la cèl·lula i a la sang, i que permet el transport
de gasos (O2 i CO2) entre els pulmons i els teixits.
Tenen d’entre 100 i 120 dies de vida, i són fagocitats per la melsa, un òrgan situat a
l’abdomen, i en molta menys proporció pels ronyons o per la mateixa medul·la òssia.
·Els leucòcits són els que s’encarreguen del mecanisme de defensa del cos contra les
infeccions de patògens externs. Són les cèl·lules menys nombroses de la sang: entre
4500 i 10000/µL. Es classifiquen segons la sèrie a la qual pertanyen: la mieloide o la
limfoide. A la primera (sèrie mieloide) hi són inclosos els hematies, els trombòcits, i dos
tipus de leucòcits: els monòcits (que més tard són transformats en macròfags) i els
granulòcits (anomenats així perquè tenen granulacions de colors en el seu citoplasma),
subdividits en: neutròfils, eosinòfils i basòfils, cadascun diferenciat per la seva
morfologia i per la funció que duu a terme i amb una vida mitjana aproximada de 6
hores. La sèrie limfoide es divideix en els limfòcits T i B i les cèl·lules NK (“Natural
2 MEZQUITA. Fisiología Médica. Del Razionamiento Fisiológico al Razonamiento Clínico.
1. Mostra de sang centrifugada.
9
Killer”, de l’anglès: assassins naturals), les quals maten cèl·lules canceroses o afectades
per un virus.
Totes les cèl·lules de la família dels leucòcits són una peça clau en el sistema
immunitari.
·Les plaquetes o trombòcits són fragments de citoplasma de les cèl·lules precursores
d’aquestes, els anomenats megacariòcits. El nombre de plaquetes en sang és de
150.000 – 450.000/µL. La vida mitjana d’aquestes és de 10 dies aproximadament.
Els trombòcits s’encarreguen de la coagulació de la sang.
2. Classificació de les cèl·lules hematològiques. (Leukemia & Lymphoma Society (LLS))
10
2.2. El Càncer
El terme càncer engloba tots els tipus de malalties causades per una divisió
descontrolada de cèl·lules anormals, de manera que poden envair teixits. 3
Tot ésser viu està format per milions cèl·lules, les estructures més petites amb vida
pròpia existents i amb capacitat de reproduir-se. Dins de cada cèl·lula hi ha un nucli, el
qual conté una informació genètica que programa la vida de cadascuna, l’ADN.
Quan hi ha una mutació en una seqüència de l’ADN, la cèl·lula normal es pot convertir
en una de cancerosa, de diferent aspecte i incapaç de dur a terme cap funció
fisiològica. Aquestes, anomenades cèl·lules neoplàsiques, tendeixen a reproduir-se
d’una manera ràpida, perden el control del seu creixement, acaben agrupant-se i
envaint òrgans, impedint que facin el seu treball.
La formació d’una cèl·lula anormal no en significa sempre una proliferació, sinó que en
la majoria de casos aquesta mor per apoptosi, l’anomenada mort cel·lular programada.
Es diferencien diversos tipus de càncer segons la zona del cos on s’ubiquen:
·Carcinoma. Càncer que comença a les cèl·lules epitelials, és a dir, les que recobreixen
els òrgans i formen la pell.
·Limfoma, mieloma i leucèmia. Els que tenen un inici a les cèl·lules hematopoètiques.
·Sarcoma. Comença als ossos, als músculs, al greix, entre d’altres.
·Càncers del sistema nerviós. Formats a les cèl·lules dels teixits cerebrals.
En la majoria de càncers esmentats, excepte en la leucèmia, tendeixen a formar-se
tumors, és a dir, un massa anormal d’un teixit.
3 · Què és el càncer?. http://cancer.gencat.cat/ca/ciutadans/el_cancer/que_es_el_cancer
· El cancer. http://www.cancer.gov/espanol/cancer/que-es
11
3. La Leucèmia
La leucèmia és una malaltia neoplàsica que afecta les cèl·lules de la sang. Generalment
és causada per la proliferació dels leucòcits, però, en alguns casos, també ho és pels
eritròcits o els trombòcits.
Aquesta reproducció descontrolada de cèl·lules anòmales provoca l’obstrucció de la
medul·la òssia, de manera que ocupa l’espai de les altres cèl·lules i impedeix la seva
reproducció, és a dir, es queda amb un nombre molt reduït de cèl·lules sanes. En
aquests casos es parla d’anèmia (falta d’eritròcits), leucopènia (escassetat de leucòcits
normals) o bé trombopènia (falta de plaquetes).
3.1. Història: Velpeau, Donné, Bennett i Virchow
Els primers indicis de la leucèmia daten de l’any 1827, quan el metge francès Alfred
Armand Louis Marie Velpeau (conegut, també, pel “vendatge de Velpeau” i la “malaltia
de Velpeau”, entre d’altres) visitava un dels seus pacients, conegut com a monsieur
Vernis, el qual presentava una sèrie de símptomes: febre, molta debilitat i un notable
creixement del fetge i de la melsa, l’encarregada de destruir les cèl·lules sanguínies
velles. Va prendre-li una mostra de sang i, en l’observar-la al microscopi, va veure que
hi havia un nombre elevat de “glòbuls de pus” i que la seva consistència era “semblant
a la d’una papilla”. 4
Dotze anys més tard, el doctor Alfred François Donné, un gran expert del microscopi,
va atendre una pacient que mostrava una espècie de tumor a l’abdomen, causat per
l’augment de mida d’un dels seus òrgans: la melsa. En l’observar una mostra de la seva
sang, va trobar que més de la meitat de les cèl·lules que la formaven eren els
anomenats glòbuls mocosos (glòbuls blancs), la qual cosa no concordava amb el
nombre habitual de cèl·lules sanguínies, classificades de més a menys abundància
4 ·Notas sobre la historia de la leucemia. http://www.medigraphic.com/pdfs/patrevlat/rlp-
2013/rlp131l.pdf
12
segons: les cèl·lules vermelles (les “essencials” a la sang), les blanques o mucoses i els
glòbuls petits.
Donné va informar sobre aquest cas l’any 1844 al seu llibre Course de Microscopie, on
també es troba informació de les classes de microscòpia que impartia i el nom d’algun
dels seus alumnes estrangers: Bennett.
John Hughes Bennett, després d’assistir al curs de Donné, va tornar al Regne Unit, el
seu país d’origen, on va ingressar a l’Edinburgh Royal Infirmary i va exercir-hi de
metge. Poc després, va visitar un dels seus pacients que presentava un “misteriós”
creixement del fetge i de la melsa, patia febre, sagnats, dolor abdominal i presentava
tumors al coll, a les aixelles i a les engonals. Al cap de vuit mesos el pacient va morir i
es va realitzar un estudi post mortem, en el qual es va trobar un creixement de la
melsa, del fetge i dels ganglis limfàtics. El doctor va veure que la sang estava formada
per una mescla de fibres coagulades i uns corpuscles incolors, semblants als de pus.
Bennett va pensar que aquelles característiques que presentava eren, tan sols, una
supuració espontània de la sang. Més tard, va anomenar al cas: “leucocitèmia”.
L’any 1845, el patòleg alemany Ludwig Karl Virchow
publicà un article anomenat Weisses Blut, en
alemany: sang blanca, on parlava sobre diferents
pacients que havien presentat símptomes
semblants: esplenomegàlia (creixement important
de la melsa), diarrees, epistaxis (hemorràgies
nasals), erupcions cutànies i pèrdua de força. Amb
els estudis post mortem realitzats es van poder
veure els òrgans d’un color pàl·lid, “punts blancs” al
fetge, etc.
Després d’observar mostres de sang al microscopi, Virchow no creia que aquelles
reaccions al cos fossin justificades per una transformació supurativa de la sang; va
veure que hi havia una connexió entre el creixement de la melsa, dels ganglis limfàtics i
la presència d’un elevat nombre de glòbuls blancs.
3. Article publicat l'any 1845 per Virchow
13
Va anomenar aquells casos: leukämie, del grec “Leukos”, blanc, i “aima”, sang.
Cap al 1849 es va fer la primera classificació d’aquesta malaltia: la de tipus limfàtica i
l’esplènica (la que correspondria a l’actual leucèmia mieloide).
Gràcies als estudis d’aquests científics es va descriure una nova malaltia, però cap
d’ells va ser capaç de descobrir quin era el seu mecanisme ni el seu origen. Alguns
pensaven que era una forma de paludisme (malària) i d’altres pensaven que era una
malaltia per se.
Un dels que pensaven que la leucèmia era una malaltia individual era el patòleg i
professor universitari francès Gabriel Andal, el qual va ser considerat fundador científic
de l’hematologia, ja que va ser el primer d’exigir als seus alumnes estudiar la sang a
tots els pacients i analitzar-la al microscopi.
Per diferents observacions i autòpsies realitzades en pacients leucèmics, Andral va
considerar que la leucèmia era una alteració pròpia de la sang i, des d’aleshores, la
leucèmia va començar a ser reconeguda mundialment com a tal.
S’ha de destacar la gran aportació sobre la leucèmia del científic Königsberg Neumann
quan, l’any 1869, estudiant fragments d’ossos, va demostrar que l’hematopoesi, és a
dir, el procés de “creació” de les cèl·lules de la sang, es duia a terme a la medul·la
òssia. Va ser ell el que va anomenar cèl·lules mare (Stammzelle) a les precursores
comunes de les cèl·lules.
Al llarg dels anys s’ha anat investigant més sobre la malaltia: s’han descrit dues
classificacions principals, s’han trobat diferents tractaments que poden combatre la
malaltia i, avui dia, molts dels pacients poden sobreviure-hi.
14
3.2. Hemopoesi Normal
El terme hemopoesi o hematopoesi fa referència al seguit de passos que es duen a
terme per a formar una cèl·lula sanguínia diferenciada.
El sistema hematopoètic es pot dividir segons la maduresa de les cèl·lules en formació
o segons els diferents llinatges cel·lulars que en deriven, que són el mieloide i el
limfoide.
D’acord amb el grau de maduresa de les cèl·lules que s’estan generant, es poden
distingir quatre compartiments.5
El primer compartiment fa referència a les cèl·lules troncals hematopoètiques (CTH),
caracteritzades per la seva capacitat d’auto-renovació (en dividir-se, algunes de les
cèl·lules filles conserven les característiques de la cèl·lula mare) i multi-potencialitat
(poden donar lloc als diferents llinatges hematopoètics).
Les cèl·lules troncals donen lloc a les cèl·lules precursores hematopoètiques (CPH), el
segon compartiment, les quals ja no són capaces d’auto-renovar-se, però conserven la
seva multi-potencialitat o, en molts casos, presenten “potencialitat restringida”, és a
dir, només poden diferenciar-se en un o dos llinatges.
El tercer compartiment pertany a les cèl·lules precursores immadures però
diferenciades. Aquestes conformen més del 90% de la cel·lularitat de la medul·la òssia.
Finalment, les cèl·lules del tercer compartiment maduren i donen lloc a les cèl·lules
hematopoètiques circulants (quart compartiment).
Com ja s’ha esmentat en el primer apartat del treball, les cèl·lules de la sang es
divideixen en dues sèries: la mieloide i la limfoide. La primera engloba els trombòcits,
eritròcits, monòcits i granulòcits (basòfils, eosinòfils i neutròfils), i la segona comprèn
els limfòcits B, limfòcits T i les cèl·lules NK.
Cada sèrie té el seu propi sistema hematopoètic: la mielopoesi i la limfopoesi, molt
relacionats entre ells.
5 ·Cancerología 2. MAYANI, H.
http://www.incan.org.mx/revistaincan/elementos/documentosPortada/1193426538.pdf
15
La mielopoesi parteix dels progenitors mieloides comuns (PMC), procedents de les
cèl·lules troncals hematopoètiques, els quals es diferencien en dos progenitors més
específics: els granulo-monocítics (PGM) i els progenitors eritro-megacariocítics (PEM),
ja incapaços d’auto-renovar-se però amb una identitat específica. Cadascun madura
sota el control de dos programes genètics diferenciats.
Els progenitors mieloides granulo-monocítics (PGM) o unitats formadores de colònies
granulo-monocítiques (en anglès CFU-GM) donen lloc a les unitats formadores de
colònies granulocítiques (CFU-G) i a les unitats formadores de colònies mielocítiques
(CFU-M). Les CFU-G inicien la diferenciació i donen origen als mieloblastes, després als
promielòcits, els mielòcits, els metamielòcits i les cèl·lules madures (neutròfils,
eosinòfils i basòfils). D’altra banda, les CFU-M es diferencien en monoblastes, pro-
monòcits, monòcits i finalment macròfags.
Dels progenitors eritroide-megacariocítics (PEM) se’n deriven les unitats formadores
de brot eritroide (BFU-E) i les cèl·lules formadores de brots megacariocítics (Meg-BFC).
Les unitats formadores de brot eritroide iniciaran la diferenciació cap a
proeritroblastes, per passar a tres fases d’eritroblastes que desembocaran en la
formació dels reticulòcits, i finalment les cèl·lules madures, els eritròcits. Les cèl·lules
formadores de brots megacariocítics donaran lloc a les cèl·lules formadores de
4. Esquema de la diferenciació dels progenitors granulo-monocítics (PGM).
16
colònies megacariocítiques (Meg-CFC), que originaran megacariòcits immadurs,
després madurs i, finalment, les plaquetes.
Pel que fa a la limfopoesi, els progenitors limfoides comuns, o PLCs poden seguir 3 vies
de diferenciació: cap a limfòcits B, passant primer per cèl·lules B primerenques, pro-B,
pre-BI, pre BII, B immadures i finalment B madures; cap a limfòcits T, començant pels
precursors tímics més precoços (és l’única part de l’hemopoesi post-naixement que es
produeix en la seva totalitat fora del moll de l’os, al timus), les cèl·lules pre-T, CD4
immadures, cèl·lules primerenques doble-positives i finalment els timòcits DP que
donaran lloc als limfòcits T madurs CD4 i CD8; i cap a les cèl·lules assassines naturals
(NK).
Per tal que aquests processos hemopoètics es puguin dur a bon terme, es requereix la
intervenció de factors genètics, múltiples citocines (molècules que regulen les
interaccions entre cèl·lules del sistema immunitari6), factors de transcripció, etc.
En les leucèmies, aquest procés d’hemopoesi queda alterat: es produeix una
proliferació de formes immadures (primer, segon o tercer compartiment) i una
insuficient producció de formes madures (quart compartiment).
6 ·Citoquinas. Medicina Molecular FIBAO. http://medmol.es/glosario/61/
5. Diferenciació dels progenitors eritroide-megacariocítics (PEM).
17
3.3. Classificació de les Leucèmies
Al llarg dels anys, gràcies a les innovacions i a la investigació científica, s’han pogut
descobrir diversos tipus i subtipus de leucèmia.
La manera general de classificar-les agrupa les leucèmies segons el seu període de
desenvolupament, és a dir, si el procés de proliferació de les cèl·lules canceroses és
ràpid, l’anomenarem leucèmia aguda, i si tenen un procés més lent, leucèmia crònica.
Dins d’aquesta divisió principal podem subdividir-les en el tipus mieloide o limfoide,
segons si les cèl·lules hematopoètiques afectades són d’un llinatge o de l’altre.
3.3.1. Leucèmia Aguda
En aquest tipus de leucèmia el procés cancerós es duu a terme molt ràpidament.
Es basa en una proliferació descontrolada de les cèl·lules mare hemopoètiques, de
manera que no tenen la capacitat de madurar i, conseqüentment, no poden realitzar
les seves funcions.
Aquestes cèl·lules immadures, anomenades blastòcits, es caracteritzen per tenir un
gran nucli amb un o més d’un nuclèol i una cromatina en forma laxa; acostumen a
“emmagatzemar-se” a la medul·la òssia, i molt poca quantitat d’aquestes es troben a
la sang perifèrica.
En dividir-se d’una manera tan ràpida i acumular-se a la medul·la, aquestes prenen el
lloc dels leucòcits normals, el mateix que passa amb els eritròcits i les plaquetes, de
manera que en fan reduir la reproducció i, en molts casos, donen lloc a malalties com
l’anèmia o la trombopènia.
LEUCÈMIA: Aguda Crònica
Limfoide Limfoide Aguda (LLA) Limfoide Crònica (LLC)
Mieloide Mieloide Aguda (LMA) Mieloide Crònica (LMC)
18
Els símptomes presentats en les leucèmies agudes són: ganglis limfàtics del coll o
aixelles inflamats, infeccions freqüents, debilitat, cansament, sagnats, pèrdua de pes,
dolor d’ossos i/o d’articulacions, febres i suors nocturnes, entre d’altres.
Dins la leucèmia aguda es distingeixen la mieloide i la limfoide.
3.3.1.1. Leucèmia Mieloide Aguda
Quan els blastòcits afectats són cèl·lules immadures de tipus mieloide es parla de la
leucèmia aguda mieloide i es subdivideix en 8 altres classes (M0-M7), segons la FAB
(unió franco-americana-britànica), depenent el tipus de cèl·lula hematopoètica i la
seva maduració7:
·M0: Leucèmia mieloide aguda indiferenciada. En tenir les cèl·lules tan mínimament
diferenciades, és difícil esbrinar si aquestes pertanyen a la sèrie mieloide o limfoide.
·M1: Leucèmia mieloide aguda sense maduració. Les cèl·lules són encara poc
diferenciades, però es pot arribar a definir la sèrie a la qual pertanyen (mieloide) ja que
tenen alguna granulació esporàdica al citoplasma.
·M2: Leucèmia mieloide aguda diferenciada o amb maduració. La granulació
citoplasmàtica és més clara; es diferencien fins a l’estadi de promielòcit.
·M3: Leucèmia promielocítica aguda. Les cèl·lules que proliferen són les precursores
dels neutròfils.
·M4: Leucèmia mielomonocítica aguda. Les cèl·lules afectades són les precursores dels
eosinòfils.
·M5: Leucèmia mieloide monocítica aguda. Proliferen els monòcits immadurs.
·M6: Eritroleucèmia. Aquí podem trobar mieloblasts, però hi predominen els
precursors eritroblàstics.
7 ·Fundació Josep Carreras. http://www.fcarreras.org/ca/leucemia-mieloide-aguda-de-l-adult_357088
19
·M7: Leucèmia megacarioblàstica aguda, on les cèl·lules anormals són les precursores
de les plaquetes, és a dir, els megacariòcits immadurs.
3.3.1.2. Leucèmia Limfoide Aguda
Aquesta classe de leucèmia és la més freqüent en nens. Afecta les cèl·lules limfoides.
També es poden classificar, segons la FAB, de la següent manera8:
·L1: Leucèmia limfoide típica. La més comuna d’entre les tres leucèmies de sèrie
limfàtica. És causada per la proliferació de les cèl·lules precursores dels limfòcits B.
·L2: Leucèmia limfoide atípica. Més freqüent en adults. Les cèl·lules afectades
pertanyen a la sèrie dels precursors dels limfòcits T.
·L3: Leucèmia de les cèl·lules de Burkitt. És molt poc freqüent. Presenta blasts amb un
citoplasma amb abundants vacúols i un gran nucli amb nombrosos i vistosos nuclèols.
3.3.2. Leucèmia Crònica
Les leucèmies cròniques, en comparació amb les agudes, tenen un procés de
desenvolupament molt més lent.
Aquestes, al tenir una propagació més lenta, són menys agressives. Generalment, i a
diferència de les agudes, són causades per l’augment descontrolat de cèl·lules
8 · Neoplasias del tejido hematopoyético y linfoide.
http://www.conganat.org/linfo.tortosa/conf/cap5/laguda.htm
6. Classificació de leucèmia mieloide aguda (LMA) segons la FAB. (Font: Fundació Josep Carreras)
20
hemopoètiques madures, ja que tenen temps suficient per completar tot el cicle de
diferenciació.
N’hi ha de dos tipus, la mieloide i la limfoide.
3.3.2.1. Leucèmia Mieloide Crònica
És el tipus de leucèmia més freqüent entre la gent d’entre 40 i 80 anys. Pot afectar
qualsevol de les cèl·lules hematopoètiques de defensa de tipus mieloide: neutròfils,
eosinòfils, monòcits o basòfils.9
Aquesta classe de leucèmia presenta tres fases d’evolució:
-Fase crònica, caracteritzada per anèmia i trombocitosi lleu.
-Fase accelerada, hi ha presència d’anèmia i un augment de blasts.
-Fase blàstica, anèmia moderada; nombre de blastòcits reduït.
3.3.2.2. Leucèmia Limfoide Crònica
En aquest subtipus de leucèmia hi ha un alt percentatge de cèl·lules limfoblàstiques B
o precursores d’aquestes a la sang perifèrica i a la medul·la òssia. No presenta anèmia.
Pot afectar el sistema limfàtic o fins i tot a altres òrgans com la melsa o el fetge.
La leucèmia limfoide crònica es considera una “síndrome limfoproliferativa crònica
(SLPC)10 amb expressió leucèmica”.
9 ·Conexión Cáncer. http://conexioncancer.es/tipos-de-cancer/informacion-general-sobre-la-
leucemia/informacion-general-sobre-la-leucemia-mielogena-cronica/fase-blastica/ 10 Una SLPC és una neoplàsia (massa anormal de teixit) originada en cèl·lules limfoides.
21
3.4. Etiologia i Epidemiologia
3.4.1. Etiologia
Les causes que provoquen la leucèmia, com moltes altres malalties neoplàsiques, no
són conegudes. Segons estudis científics, la probabilitat de patir aquest càncer és més
elevada en el sexe masculí que en el femení, i en els pacients de raça blanca que en els
de raça negra.
Tanmateix, se sap que hi ha diversos factors que poden ajudar a causar-la: genètics,
immunològics i ambientals.11
Els factors genètics es caracteritzen per mutacions de l’ADN, les quals, generalment
activen un gen anormal (oncogen), el qual o bé produeix la transformació d’una cèl·lula
normal en una de maligna o bé desactiva els gens supressors de tumors. Aquestes
mutacions acostumen a ser espontànies.
Les persones que pateixen trastorns genètics com la Síndrome de Down (la qual és
causada per una mutació genòmica, on el nombre de cromosomes habitual està
alterat: en comptes de tenir el cromosoma 21 duplicat, el tenen triplicat) tenen més
possibilitats de patir la malaltia, ja que presenten un cromosoma de més i, per tant, hi
haurà un excés de proteïnes sintetitzades.
Quan es té una immunodeficiència, és a dir, quan el sistema immunitari del pacient
està debilitat a causa d’administracions de quimioteràpia o fàrmacs immunosupres-
sors, s’és més susceptible per desenvolupar la leucèmia.
Els factors ambientals, com l’exposició a concentracions altes de radiació, l’exposició al
benzè i el tabaquisme, entre d’altres, augmenten el risc de patir algun tipus de
leucèmia.
11 ·National Cancer Institute. http://www.cancer.gov/espanol/tipos/necesita- saber/wyntk_leucemia_web.pdf ·Etiología. http://es.wikipedia.org/wiki/Leucemia#Etiolog.C3.ADa ·Leucemia en niños. http://www.cancer.org/espanol/cancer/leucemiaenninos/guiadetallada/leucemia-en-ninos-causes-what-causes
22
La relació entre les radiacions ionitzants i la leucèmia es va descobrir a partir
d’accidents nuclears com explosions o incidents en centrals nuclears, i també arran de
les explosions de les bombes atòmiques durant la Segona Guerra Mundial.
Altres factors que poden augmentar el risc de patir aquest càncer són: el consum
excessiu de carbohidrats refinats i la deficiència de ferro i de vitamines D i B12.
3.4.2. Epidemiologia
La incidència de la leucèmia és lleugerament major en els homes que en les dones, tot
i que les estadístiques varien segons el tipus de leucèmia. La més freqüent és la
limfoide aguda (80% del total), seguit per la mieloide aguda. Les leucèmies cròniques
són menys habituals (5%) i generalment són del tipus mieloide.12
Segons el Registre Espanyol de Leucèmies (REL) la incidència d’aquest càncer és de 12
homes i 8,6 dones per cada 100.000 habitants/any. La mitjana d’edat dels pacients de
leucèmia és 65 anys, aproximadament.
Espanya està per sobre de la incidència mitjana de la malaltia en la Unió Europea, la
qual, segons l’Organització Mundial de la Salut (OMS), es troba en una xifra de 8,6
homes i 5,5 dones per cada 100.000 habitants/any.
La leucèmia és el càncer més comú en nens i adolescents, corresponent al 35-40% dels
càncers en aquestes edats. La supervivència a cinc anys dels nens amb leucèmia
limfoide aguda és del 85% en la majoria de països europeus i als Estats Units.
Actualment, gràcies als tractaments existents, un 60% dels casos de leucèmia
aconsegueixen una curació permanent:
El 1997 la taxa de mortalitat a Espanya en homes era de 7,6 per 100.000 habitants i de
5,8 per 100.000 dones. En els nostres dies la taxa per població mundial és de 4,8
homes i 3,1 dones, ambdues per a cada 100.000 persones/any.
12
·Ministerio de Salud. http://web.minsal.cl/portal/url/item/7220fdc433e944a9e04001011f0113b9.pdf ·Instituto Nacinal de Cancerología. http://www.incan.org.mx/revistaincan/elementos/documentosPortada/1193426695.pdf
23
3.5. Tractaments Més Freqüents
Segons l’edat del pacient i el tipus de leucèmia que pateix, el malalt se sotmetrà a un
tractament o un altre. Els tractaments més utilitzats són: la quimioteràpia, la
radioteràpia, el transplantament de cèl·lules mare i la immunoteràpia.
Generalment, les persones amb leucèmia aguda necessiten ser tractades d’immediat,
per la qual cosa se’ls solen administrar altes dosis de medicaments ‘quimioterapèutics’
en un període curt de temps, per tal d’eliminar les cèl·lules leucèmiques de forma
ràpida (aquest procés és l’anomenat “inducció”) i, posteriorment, s’inicia un
tractament post-inducció. Normalment, aquest consisteix en més de cinc cicles de
quimioteràpia intensiva amb múltiples agents farmacològics, o bé transplantament de
cèl·lules mare.
En els casos de leucèmies cròniques, durant un llarg període de temps es pot
romandre asimptomàtic i sense tractament. Si la leucèmia es diagnostica aviat, és
aconsellable rebre teràpia per radiació.
La quimioteràpia13 consisteix en l’administració de medicaments per a combatre el
càncer, que actuen sobre les cèl·lules anòmales, n’impedeixen la reproducció i les
destrueixen. Tanmateix, les cèl·lules sanes també són atacades pels fàrmacs, la qual
cosa provoca efectes secundaris com: mielosupressió (disminució de l’activitat de la
medul·la òssia), immunosupressió (inhibició dels components del sistema immunitari,
provocada per la baixa activitat de la medul·la), mucositis (inflamació de les
membranes del revestiment digestiu) i alopècia (calvície).
Durant la quimioteràpia se solen patir nàusees i vòmits, diarrees o restrenyiments,
hemorràgies i, en alguns casos, esterilitat, entre d’altres.
Existeixen diferents tipus de quimioteràpia, classificats segons els medicaments
citotòxics emprats durant el tractament: la monoquimioteràpia (ús d’un sol fàrmac), la
poliquimioteràpia (combinació de diferents citotòxics a la vegada, n’existeixen més de
13 Quimioterapia. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002324.htm
24
100); o bé segons el moment de l’administració: quimioteràpia adjuvant (la que
s’administra, en molts casos, posteriorment a d’altres tractaments), quimioteràpia
neoadjuvant o d’inducció (el tractament inicial, que es duu a terme abans de començar
cap altra teràpia per a poder millorar els seus resultats) i quimiorradioteràpia (també
coneguda per quimioteràpia concomitant, ja que s’administra alhora amb la
radioteràpia).
Segons el tipus de leucèmia que pateixi el malalt, se li administrarà un tipus de fàrmac
citotòxic (quimioteràpic) o un altre.
Aquests medicaments poden rebre’s per diferents vies. Les més comunes són:
-La via intravenosa. És el mètode més comú. El
medicament se subministra directament per les venes
mitjançant un catèter (tub) fix a una vena ampla,
connectat sota la pell.
-La via oral, on els fàrmacs s’ingereixen en forma de
pastilles o càpsules.
-Pel líquid cefaloraquidi, en el cas que s’hagin trobat
cèl·lules malignes en mostres d’aquest. S’administra a
través d’un tipus especial de catèter.
La quimioteràpia s’aplica durant diferents “tandes” d’entre quatre i sis mesos de
durada i en intervals o cicles de setmanes o mesos. Aquests cicles varien depenent del
tipus de leucèmia, la resposta contra aquesta i l’estat general de salut del pacient.
La radioteràpia consisteix en l’ús de raigs d’alta energia per a destruir cèl·lules
canceroses en una zona específica (tractament local).
7. Catèter central d'inserció perifèrica a la subclàvia.
25
Aquest tractament utilitza radiacions ionitzants, que poden ser ones
electromagnètiques o partícules amb la capacitat de ionitzar la matèria que travessen.
Els més emprats són els raigs X, els raigs gamma i els electrons.14
Podem classificar aquesta teràpia segons on es localitza la font radioactiva: en
proximitat a la zona afectada (braquiteràpia) o a través d’un equip generador a
distància (teleteràpia). En alguns casos s’han de combinar ambdues tècniques.
Molts pacients leucèmics reben la radiació a partir d’una màquina gran dirigida a la
melsa, al cervell o a altres parts del cos on s’han acumulat les cèl·lules malignes.
Aquest tipus de teràpia té lloc durant 5 dies a la setmana i es repeteix al llarg de
diferents setmanes. Els pacients que la reben a tot el cos (irradiació total) se’ls radia
tan sols una o dues vegades en períodes molt curts de temps, normalment abans d’un
transplantament de cèl·lules mare.
Després de sotmetre’s a una radioteràpia es poden desenvolupar símptomes de fatiga,
alopècia i irritacions al cuir cabellut (en els casos de radioteràpies intracranials),
nàusees i vòmits, pèrdua de gana, etc. En la radioteràpia aplicada als òrgans genitals es
pot afectar la producció hormonal i el grau de fertilitat del malalt.
Com ja s’ha esmentat, la leucèmia és la reproducció anormal de cèl·lules derivades de
les cèl·lules mare hematopoètiques, les quals poden trobar-se a la medul·la òssia, a la
sang perifèrica i a la sang que conté el cordó umbilical. En molts casos, per tal d’aturar
aquesta proliferació, es fa un reemplaçament de les cèl·lules malignes per unes de
sanes; és l’anomenat transplantament de cèl·lules mare15 (també conegut per
transplantament de medul·la òssia, sang perifèrica o sang de cordó umbilical, segons
l’origen de les cèl·lules mare).
14 ·Radioterapia. http://www.cancer.org/espanol/servicios/tratamientosyefectossecundarios/radioterapia/radioterapia-una-guia-para-los-pacientes-y-sus-familias-intro 15
·Transplante de células madre (ASCO). http://www.cancer.net/es/desplazarse-por-atenci%C3%B3n-del-c%C3%A1ncer/tipos-de-tratamiento/%C2%BFqu%C3%A9-es-el-trasplante-de-c%C3%A9lulas-madrem%C3%A9dula-%C3%B3sea
26
Hi ha dos tipus de transplantament: l’al·logènic i l’autòleg. El primer consisteix en el
reemplaçament de cèl·lules d’un donant i el segon, de cèl·lules provinents del mateix
pacient.
Per realitzar un transplantament hematopoètic al·logènic, cal que el donant sigui
compatible amb el pacient, és a dir, que les cèl·lules del donant i del pacient puguin
conviure conjuntament. Aquest fet es produeix a causa de la presència d’antígens
localitzats a la membrana plasmàtica de les cèl·lules, els quals són acceptats o
rebutjats pels limfòcits, els encarregats de detectar la presència d’antígens diferents
als seus i destruir-los.
Un cop fet el transplantament, el pacient té un alt risc d’infeccions, ja que té el sistema
immunològic molt dèbil. Amb el temps, les cèl·lules mare trasplantades comencen a
fabricar glòbuls sanguinis sans.
La màxima probabilitat de trobar un donant compatible es produeix entre els germans
del pacient, amb un 25% de possibilitats, i en familiars de primer grau (pares o fills),
amb tan sols un 5% de casos. En cas de no trobar cap familiar compatible, s’ha de
localitzar un donant voluntari no emparentat que sigui compatible.
La immunoteràpia, teràpia biològica o bioteràpia és un tractament que utilitza el
sistema immunològic del cos per a combatre el càncer o per disminuir els efectes
secundaris que poden causar altres tractaments.
Un tipus de bioteràpia és l’ús d’anticossos monoclonals16, els quals s’uneixen a les
cèl·lules leucèmiques i les destrueixen o bé ajuden al sistema immunitari a destruir-les.
Una altra bioteràpia consisteix en l’administració d’un fàrmac anomenat interferó, el
qual s’injecta a la pell amb la funció d’alentir el creixement de cèl·lules canceroses.
Els efectes secundaris d’aquesta teràpia depenen del lloc on s’injecta el fàrmac i poden
causar erupcions i inflors. En alguns casos, també produeixen mal de cap, dolors
musculars, febre o debilitat.
16 Veure apartat citometria (4.1.2. Anàlisis Immunofenotípiques i Morfològiques)
27
4. De l’Analítica al Diagnòstic. Principis de
diagnòstic de la leucèmia
Arribar a diagnosticar una leucèmia és un procés complex i laboriós que comprèn
diferents passos. Des del moment en què es pren una mostra de sang d’un pacient fins
a saber quina patologia presenta, se li han de fer diversos estudis per a comprovar de
quina malaltia es tracta: hemograma, biòpsia i aspirat de medul·la òssia amb les seves
anàlisis morfològica, citoquímica i immunofenotípica, entre d’altres.
Fer un bon diagnòstic té unes implicacions molt importants pel futur del pacient, ja
que del diagnòstic en depèn el tipus de tractament i, implícitament, el pronòstic del
malalt (supervivència).
4.1. Anàlisis de Sang i de Medul·la Òssia
Aquests estudis es realitzen a partir de mostres de sang perifèrica o circulant i de la
medul·la òssia del pacient.
La medul·la òssia és un teixit esponjós que es troba a l’interior d’alguns ossos, com per
exemple: el crani, l’estèrnum, les vèrtebres, etc. És el lloc on es duu a terme
l’hemopoesi i, per tant, conté les cèl·lules mare hematològiques.
Quan s’observen anomalies en una mostra de sang perifèrica, s’acostuma a fer un
aspirat de medul·la òssia per a poder examinar amb precisió la zona on es produeixen
les cèl·lules afectades. Aquest procés es basa a extreure una petita quantitat d’aquest
teixit, la qual serà examinada sota un microscopi i analitzada per diferents tècniques
de diagnòstic.
28
4.1.1. Hemogrames
Un diagnòstic quantitatiu i qualitatiu dels elements de la sang és molt important per a
preveure anomalies dels seus components. Una tècnica molt comuna és l’hemograma
o hematomètria17, un tipus d’anàlisi de sang que consisteix a fer un recompte de les
cèl·lules sanguínies, a partir d’una veno-punció. Es determinen les tres sèries bàsiques
de la sang: els eritròcits, els leucòcits i les plaquetes, i se n’avaluen el nombre, la
morfologia, la mida, etc.
Avui dia existeixen diferents tipus d’hemogrames. A través del temps, l’hemograma ha
estat modificat pel que fa als paràmetres que el formen, els graus de precisió i
exactitud dels resultats i la manera d’interpretar-lo.
Les variacions en la metodologia utilitzada defineixen el tipus d’hemograma i,
actualment, se’n poden classificar sis.18 El primer, anomenat ‘Hemograma tipus I’, és
format pels paràmetres següents: hemoglobina, hematòcrit (percentatge del volum
total de la sang), recompte d’eritròcits, índexs eritrocitaris (mitjanes del volum i
hemoglobina corpusculars), recompte de leucòcits i morfologia dels corpuscles, tots
ells realitzats per mètodes manuals. Als hemogrames posteriors a aquest se’ls han anat
afegint diferents paràmetres al llarg del temps, com: el recompte de plaquetes i l’índex
plaquetari (volum mitjà plaquetari, plaquetòcrit (percentatge del volum de plaquetes
sobre el volum total de sang), etc.), recompte de reticulòcits (glòbuls vermells
immadurs), hemoglobina reticulocitaria (hemoglobina present als reticulòcits),
plaquetes reticulades (trombòcits immadurs) i, finalment, la incorporació de mètodes
automàtics electrònics.
L’hemograma està format per tres grups de paràmetres: l’eritrograma, el leucograma i
el trombograma.
L’eritrograma és l’anàlisi qualitativa i quantitativa de tots els paràmetres
relacionats amb els eritròcits a la sang perifèrica: l’hemoglobina, l’hematòcrit i els
índexs eritrocitaris, a més de noves incorporacions dels auto-analitzadors, com l’ample
17 ·Del hemograma manual al hemograma de cuarta generación. CAMPUZANO MAYA, G. http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2007/myl011-12b.pdf 18 Definits per la Societat Colombiana de Patologia Clínica
29
9. Càmera de Neubauer.
de distribució dels eritròcits i de l’hemoglobina (com estan distribuïts en l’espai) i el
recompte reticulocitari. A part dels paràmetres quantitatius, també en forma part
l’estudi morfològic dels hematies.
El recompte d’eritròcits consisteix a determinar la quantitat en sang perifèrica
d’aquests corpuscles per unitat de volum (normalment, per microlitre, µL). Depenent
de la metodologia disponible al laboratori, el recompte es durà a terme manualment o
electrònicament.
-El recompte manual, utilitzat en els hemogrames I i II, es realitza mitjançant una
pipeta de dilució per a eritròcits, una càmera de recompte Neubauer i un microscopi
convencional. El mètode manual és un procés que comporta un gran consum de temps
del professional que el realitza.
Per a fer un recompte cel·lular no fa falta extreure una gran quantitat de sang, tan sols
es necessiten uns 10mL. Aquesta mostra es deposita en un tub d’assaig, on s’afegeix
un anticoagulant per tal d’impedir la seva coagulació.
Aquest laboriós procés consisteix a, un cop obtinguda la mostra, aspirar la sang amb la
pipeta de dissolució fins la senyal 0’5 o 1, depenent de quant volem diluir-ne i, tot
seguit, omplim la pipeta fins la marca 101 (Fig. 8)
amb una solució diluent i ho agitem.
Seguidament, es prepara la càmera de recompte amb un cobreobjectes (Fig. 9), s’hi
recolza la pipeta a sobre formant un angle de 35º, i s’omple l’espai pla situat a sota del
cobreobjectes.
8. Pipetes de dilució. La de leucòcits (part superior) i la d'eritròcits (part inferior).
30
10. Quadrícula de la càmera de
Neubauer.
Quan ja tenim la càmera de recompte preparada amb la mostra diluïda, ho deixem
reposar dos minuts per tal que les cèl·lules sedimentin, i ho posem al microscopi amb
l’objectiu de 10 augments.
Les càmeres de recompte consten d’un vidre amb unes
plataformes centrals que presenten una quadrícula de
3x3mm. Els cinc quadres petits acolorits que hi ha
representats a la figura són les zones on es compta el
nombre d’eritròcits presents. (Fig. 10)
-El recompte electrònic es duu a terme mitjançant els
anomenats “autoanalitzadors d’hematologia”, basats en
la conductivitat elèctrica de les cèl·lules estudiades.
Els valors de referència pel recompte d’eritròcits són, segons l’edat i el sexe:
Edat i gènere Valors esperats
1 a 15 dies 6,5 a 7,3 milions per μL
16 a 31 dies 4,3 a 5,2 milions per μL
1 a 12 mesos 4,1 a 5,1 milions per μL
1 a 5 anys 4,2 a 5,2 milions per μL
6 a 14 anys 4,2 a 5,3 milions per μL
15 a 99 anys (dones) 4,2 a 5,4 milions per μL
15 a 99 anys (homes) 4,6 a 6,2 milions per μL
L’hematòcrit correspon al volum ocupat pels glòbuls vermells en
relació al volum total de la sang; s’expressa com un percentatge o,
d’acord amb el sistema internacional (SI), com una fracció decimal
on la unitat litre/litre està implícita.
11. Microhematòcrit després de la centrifugació.
31
Segons l’hemograma utilitzat, aquest volum pot ser calculat de diferents maneres:
l’hematòcrit manual (hemogrames I i II) s’obté a partir de centrifugacions, a diferència
de l’electrònic que es mesura mitjançant càlculs matemàtics que relacionen el
recompte d’eritròcits amb el volum corpuscular mitjà.
L’hemoglobina, la proteïna que es troba als eritròcits encarregada de transportar
l’oxigen, es pot trobar per la sang de diferents formes (oxihemoglobina,
carboxihemoglobina, etc.). Per a determinar la quantitat d’aquests tipus
d’hemoglobina, s’han de llisar els glòbuls vermells que la contenen, és a dir, provocar
el trencament de la seva membrana cel·lular i convertir-los en un compost estable per
a, més tard, poder ser mesurat amb un espectròmetre.
El volum corpuscular mitjà defineix la mida dels hematies, amb femtolitres (fL, 10¯¹⁵
litres) com a unitat de volum. Manualment es calcula a partir de la relació de
l’hematòcrit i el recompte manual d’eritròcits i, electrònicament, es calcula mitjançant
instruments automatitzats de biometria hemàtica.
El recompte de reticulòcits es duu a terme gràcies a l’acció d’un colorant capaç de
reconèixer aquests eritròcits immadurs, ja que conserven restes d’àcid ribonucleic,
ribosomes i mitocondris, i poden ser identificats per un colorant específic.
El leucograma és l’anàlisi dels paràmetres
relacionats amb els glòbuls blancs a la sang
perifèrica i l’estudi de la seva morfologia.
Igual que amb els eritròcits, el recompte de
leucòcits es pot realitzar manualment o
electrònicament. El procés és el mateix excepte el
tipus de pipeta utilitzat (Fig. 8) i la lectura de la
càmera de recompte. (Fig 12)
El recompte diferencial de leucòcits es basa a determinar la concentració de
subpoblacions de glòbuls blancs a la sang perifèrica.
12. Detall de la càmera de Neubauer. Hi ha acolorits els cinc quadres grans on s'hi fa el comptatge de leucòcits.
32
Les cinc poblacions leucocitàries són: els neutròfils, els eosinòfils, els basòfils (tots tres
polimorfonucleats, és a dir, amb presència d’una espècia de lòbuls a l’interior del
nucli), els monòcits i els limfòcits.
Manualment, aquest recompte es pot fer mitjançant la coloració panòptica de
Romanowsky (1891), basada en la utilització successiva de diferents substàncies
colorants neutres i, havent tenyit les cèl·lules, aquestes es fan passar pel microscopi
òptic fins a identificar unes 100 o 200 cèl·lules.
Aquest procés és poc precís i avui dia no se’n fa ús al laboratori, sinó que és més
freqüent la utilització d’auto-analitzadors d’hematologia (mètodes electrònics), els
quals recullen una mostra de sang, la classifiquen i dibuixen una distribució de les
diferents subpoblacions cel·lulars, mitjançant sistemes electrònics i òptics.
Els valors de referència del leucograma segons edat i gènere són:
Edat i gènere Leucòcits
per μL
Neutròfils per
μL
Eosinòfils
per μL
Basòfils
per μL
Limfòcits Monòcits
1 a 15 dies 9.000 a 30.000 1.000 a 12.000 40 a 500 0 a 50
16 a 31 dies 5.000 a 21.000 1.000 a 12.000 40 a 500 0 a 50
1 a 12 mesos 6.000 a 17.500 1.000 a 12.000 40 a 500 0 a 50 3.000 a 9.000 30 a 750
1 a 5 anys 5.500 a 15.500 1.700 a 7.500 40 a 500 0 a 50 3.000 a 9.000 30 a 750
6 a 14 anys 4.500 a 14.500 1.500 a 6.500 40 a 500 0 a 50 2.000 a 7.200
15 a 99 anys
(dones) 4.500 a 11.000 1.500 a 8.000 40 a 500 0 a 50 1.500 a 4.000 30 a 900
15 a 99 anys
(homes) 4.500 a 11.000 1.500 a 8.000 40 a 500 0 a 50 1.500 a 4.000 30 a 900
El trombograma és definit com l’anàlisi quantitatiu i qualitatiu dels paràmetres
relacionats amb els trombòcits (plaquetes) que es troben a la sang perifèrica.
Com ja s’ha esmentat als altres dos apartats, el recompte plaquetari es pot fer per
mètodes manuals o electrònics.
El valor de referència de les plaquetes és de 150.000 a 450.000 per μL.
Font: Del hemograma manual al hemograma de cuarta generación
al hemograma de cuarta generación
33
Manualment se segueix el mateix procés que amb els eritròcits i els leucòcits, excepte
a l’hora d’observar la mostra pel microscopi, ja que amb el recompte de trombòcits
ens hem de fixar en el requadre central colorit de la càmera de Neubauer. (Fig. 13)
S’anomena volum mitjà plaquetari la mida de les plaquetes, definit en femtolitres (fL,
10¯¹⁵ litres). Aquest paràmetre només és present en els hemogrames tipus IV, V i VI.
13. Detall de la càmera de Neubauer. El quadre central acolorit és on es fa el comptatge de les plaquetes.
34
4.1.2. Anàlisis Immunofenotípiques i Morfològiques.
La citometria de flux 19
En ocasions, realitzant un estudi dels hemogrames de sang perifèrica no podem arribar
a fer un diagnòstic cent per cent fiable, la qual cosa ens condueix a fer un altre estudi
més acurat per concretar l’alteració neoplàsica del pacient.
La tècnica principal per a estudiar paràmetres de la cèl·lula relacionats amb la seva
mida, la complexitat del nucli (morfologia) i el seu caràcter antigènic (immunologia) és
la CitoMetria de Flux (CMF), una anàlisi relativament recent que ha marcat un abans i
un després en les tècniques de diagnòstic del càncer.
INTRODUCCIÓ
Durant els segles XIX i XX, l’estudi de la cèl·lula es basava fonamentalment en l’ús del
microscopi òptic, l’estri principal als laboratoris. Més endavant, gràcies a les noves
tecnologies, es va associar el microscopi amb la computadora, de manera que sorgí el
microscopi electrònic, amb el qual es va poder investigar la unitat estructural dels
éssers vius amb molta més precisió.20
Al llarg del temps s’han anat inventant noves eines, la majoria d’elles capaces de fer un
estudi d’un nombre reduït de cèl·lules, la qual cosa va portar a la creació d’un aparell
amb la capacitat d’analitzar poblacions cel·lulars, és a dir, conjunt de milers de cèl·lules
de manera simultània: el citòmetre on, en comptes d’examinar-les sobre
portaobjectes com en estudis microscòpics, es feia a partir de suspensions de les
cèl·lules en un medi líquid (flux).
Aquesta tècnica va sorgir cap als anys 50, basada inicialment en el principi de Coulter
(comptatge de partícules en suspensió a partir de camps elèctrics), dissenyada per
Mack Fulwyler, l’inventor del precursor dels citòmetres de flux actuals.
19
Veure: Un dia al laboratori 20
·Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE) http://www.iibce.edu.uy/SECIF/quees.htm
35
Avui dia podem trobar diferents tipus especialitzats de citometria; el FACS
(Fluorescence Activated Cell Sorter), inventat per Leonard Herzenberg, és el més
important i té la funció de classificar les cèl·lules activades per fluorescència.
METODOLOGIA
La citometria de flux és una tècnica d’anàlisi cel·lular multi-paramètrica que ens
permet conèixer la mida i la complexitat dels diferents tipus de cèl·lules, el contingut
d’ADN i la presència d’antígens, entre d’altres.
Funciona mitjançant l’impacte d’un raig làser sobre cèl·lules suspeses en un fluid, per
tal que aquestes produeixin diversos senyals, corresponents, cadascun, a un paràmetre
diferent de la cèl·lula. Els senyals produïts són de dos tipus: de dispersió i de
fluorescència.
Els de dispersió resulten de l’impacte de la llum amb cada partícula, i fan canviar la
direcció del raig. Aquesta dispersió és causada per les característiques morfològiques
de cada cèl·lula.
La citometria mesura dues fraccions de
dispersió: la llum dispersada en un angle
petit d’entre 0 i 10º, anomenada FSC
(Forward Scatter, “dispersió cap
endavant”), la qual és proporcional a la
mida de la partícula, i la dispersada
formant un angle recte, anomenada SSC
(Side Scatter, dispersió lateral),
proporcional a la complexitat de l’estructura interna de la cèl·lula.
Els senyals de fluorescència funcionen amb l’ajuda de fluorocroms. Els fluorocroms són
molècules que absorbeixen la llum a una longitud d’ona i l’emeten a una longitud
superior. La citometria de flux permet detectar els senyals de fluorescència.
Tots aquests senyals són recaptats per uns detectors que envien la informació a un
ordinador per més tard poder ser analitzats.
14. Dibuix esquemàtic de l'impacte dels raigs sobre una cèl·lula al citòmetre.
36
El citòmetre és l’aparell encarregat de dur a terme
aquest procediment. Per a poder funcionar ha de
menester un sistema òptic, un d’electrònic i un de
fluids:
·El sistema òptic és el que origina i recull els impulsos
lumínics, treballant conjuntament amb els senyals de
dispersió i fluorescència.
Consta d’una font d’il·luminació excitant (un o dos raigs làsers dirigits cap a la mostra a
través d’un conjunt de lents) i d’uns detectors que recullen els senyals de llum emesa.
·El sistema electrònic és el responsable de convertir els senyals òptics en senyals
digitals electrònics per poder emmagatzemar-los a un ordinador.
·Per últim, el sistema de fluids té com a funció principal transportar les cèl·lules d’una
en una de forma alineada pel centre del làser per a evitar errors en definir les
poblacions de cèl·lules.
PREPARACIÓ DE LES MOSTRES
Les mostres utilitzades en citometria de flux poden ser de medul·la òssia, de sang
perifèrica, de ganglis, o de líquid cefaloraquidi. Totes han de ser convertides en una
suspensió cel·lular, és a dir, les cèl·lules han d’estar disperses en un medi líquid.21
Cada mostra ha d’anar identificada amb el nom del pacient, el recompte cel·lular i la
seva presumpció diagnòstica.
Per començar, es preparen els tubs necessaris per a les proves sol·licitades i es posa el
volum corresponent a 1x10⁶ cèl·lules a cadascun.
Abans de passar la mostra pel citòmetre, s’hi han d’afegir diferents marcadors i altres
substàncies químiques, a més de centrifugar-la i cultivar-la.
Anomenem marcadors els anticossos que afegim a les mostres, els quals prèviament
han estat conjugats amb un fluorocrom.
21 Informació extreta de documents cedits pel Departament d’Hematologia de l’Hospital de Sant Pau.
15. Citòmetre de flux.
37
Un anticòs és un tipus de proteïna (immunoglobulina) produïda per les cèl·lules
plasmàtiques, pertanyents al sistema immunitari. L’anticòs és capaç de combinar-se
específicament amb un antigen, el causant de la seva producció.
Consten de dues cadenes pesants i dues de lleugeres, unides per enllaços covalents
disulfur; totes elles tenen una regió constant i una de variable. La part variable de
l’anticòs és la que reconeix i s’uneix a l’antigen, una molècula adherida a les cèl·lules;
els antígens acostumen a ser proteïnes, lípids o bé glúcids.
Els anticossos utilitzats en citometria de flux són els monoclonals, és a dir, aquells que
són específics per a un sol antigen, utilitzats amb la finalitat de poder identificar
poblacions cel·lulars específiques. Són produïts per la fusió d’una cèl·lula plasmàtica
immortalitzada amb cèl·lules normals productores d’anticossos provinent d’un donant
immunitzat (ratolí):
Quan una proteïna d’un determinat organisme és introduïda en un altre organisme
d’una altra espècie, aquest últim el reconeix com a alguna cosa estranya i, com a
reacció, produeix anticossos en contra de la proteïna, concretament en contra de
certes regions de la superfície d’aquesta: els antígens. Cada tipus diferent d’anticòs
queda “encaixat” amb el seu respectiu antigen. (Fig. 16).
És aquesta, doncs, la resposta de l’organisme a la injecció de la proteïna desconeguda.
Se l’anomena policlonal, ja que la procedència dels anticossos és de limfòcits diversos i
la resposta de cada limfòcit diferent és considerada una resposta monoclonal.
Al laboratori es fa a partir de cèl·lules immunitzades de ratolins: s’injecta una proteïna
que sigui estranya per al rosegador, de manera que el sistema immunològic d’aquest
fabriqui anticossos contra ella. Seguidament s’extreu la melsa (òrgan principal del
sistema immunològic) del ratolí i es col·loca en una placa de Petri, on s’obté una
suspensió de cèl·lules immunitzades que fabriquen anticossos per a la proteïna
desconeguda, les quals seran mesclades en un tub amb cèl·lules de mieloma immortals
no reproductores d’anticossos, en un medi amb polietilenglicol, una substància que
permet que les cèl·lules es fusionin ‘permeabilitzant’ les seves membranes. (Fig. 17).
38
És així com es forma un hibridoma: la fusió d’un limfòcit
immunitzat i d’una cèl·lula de mieloma. Els hibridomes
tenen una gran capacitat de reproducció, ja que són fusió
de cèl·lules tumorals, les quals es multipliquen ràpidament.
Les mostres es cultiven en un medi HAT (d’Hipoxantina,
Aminopterina i Timidina), on se seleccionen els hibridomes.
Aquest medi fa que totes aquelles cèl·lules que no s’hagin
fusionat desapareguin i, més endavant, aquests hibridomes
es cultiven de manera que cadascun d’ells doni una colònia
de cèl·lules separada, per tal d’obtenir únicament un sol
tipus d’anticòs.
Posteriorment, es comprova que l’hibridoma produeixi els anticossos adequats contra
l’antigen utilitzat per a la immunització del ratolí. Això es fa mitjançant l’ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Assaig per Immune-absorció Lligat a Enzims),
un test utilitzat per seleccionar les cèl·lules i aïllar-les correctament. Funciona amb
anticossos enllaçats a un enzim capaç de generar canvis en un antigen específic
immobilitzat (com un canvi de color), per a poder-lo detectar.
16. Procés d’immunització d’una proteïna.
17. Extracció de la melsa immunitzada d’un ratolí.
18. Cultiu en un medi HAT.
39
19. Conjugat anticòs-fluorocrom.
Un cop s’ha comprovat que el clon segrega l’anticòs, es selecciona per a expandir-lo i
cultivar-lo.
Avui dia es poden produir anticossos sense la necessitat d’immunitzar animals. És
aleshores quan s’utilitza l’anomenada tecnologia d’anticossos recombinants.
Les noves tecnologies han permès desenvolupar tècniques de screening (“cribratge”)
d’anticossos monoclonals fora del cos humà.
Els anticossos monoclonals poden ser combinats amb
un fluorocrom i, aleshores, es forma l’anomenat
conjugat anticòs-fluorocrom. Aquestes dues molècules
s’uneixen mitjançant enllaços químics, sense perdre la
capacitat d’unir-se amb l’antigen que el reconeix.
Quan les cèl·lules són recobertes per
anticossos conjugats amb els fluorocroms i
són il·luminades pel feix de llum làser, cada
fluorocrom emet com a resposta llum d’una
determinada longitud d’ona, que més tard
ens servirà com a referència per a analitzar
les mostres pel citòmetre.
D’aquesta manera, cada tipus de proteïna queda marcada pel fluorocrom associat a
l’anticòs que la reconeix.
21. Representació de l'excitació dels fluorocroms d'un conjugat anticòs-fluorocrom a la cambra de flux.
20. Formació d'anticossos monoclonals amb fluorocroms.
40
Els fluorocroms són caracteritzats pels seus espectres d’emissió i absorció.
Hi ha diversos tipus de fluorocroms, però els més utilitzats en la citometria de flux
són22:
-L’isocianat de fluoresceïna (també conegut per les seves sigles angleses: FITC,
Fluorescein IsoTioCyanate). Té una excitació a 490nm i una emissió a 514nm.
-La Ficoeritrina (PE, PhycoErythrin), format per un complex proteic de pigment vermell.
S’excita a 495nm i emet a 576nm.
-La Proteïna clorofil·la peridinina, (PerCP, Peridinin Chlorophyll Protein), l’excitació de
la qual és de 488nm i l’emissió, de 675nm.
- Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5, PhycoErythrin and a Cyanine dye). Té una excitació de
480nm i una emissió de 675nm.
Aquests quatre fluorocroms poden funcionar simultàniament amb un làser de 488nm,
de manera que cadascun d’ells és capaç d’excitar-se, utilitzant un mateix feix de llum.
Els conjugats anticòs-fluorocrom, els anomenem “marcadors”, i són identificats per la
seva nomenclatura: “CD”; els podem trobar envasats en potets petits. N’hi ha de molts
tipus; els més importants són:
·El CD34, que detecta la presència de cèl·lules precursores mieloides i limfoides (els
blasts, cèl·lules hematològiques immadures).
·Els marcadors CD19, CD20, CD22 i CD23 (detectors de limfòcits B), el CD3 (limfòcits T) i
el marcador CD56 (de limfòcits NK) són els principals anticossos utilitzats per a veure
les subpoblacions de limfòcits. Emprant el CD45, es pot determinar la proporció
d’aquestes diferents poblacions sobre el total de cèl·lules.
·Els anomenats “Kappa” (K) i “Lambda” (λ); són immunoglobulines utilitzades per a
determinar poblacions B anormals.
22 Fluorocromos para Citometría de Flujo. http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/fluor.htm
41
MECANISME i FUNCIONAMENT del CITÒMETRE
Depositem cada mostra amb els seus reactius en tubs d’assaig de mida compatible
amb el tub del citòmetre que en recollirà una petita quantitat.
La quantitat de mostra (de
volum molt baix) és
“absorbida” per la màquina, la
qual és transportada pel
corrent del medi fins a la
cambra de flux a través de la
qual, cada cèl·lula marcada
amb l’anticòs monoclonal
passa d’una en una tallant el
raig làser al seu pas.
La cambra està formada per parets transparents a la llum del làser i a les emissions
dels fluorocroms, per tal de poder travessar-les i fer excitar els anticossos.
Després de passar a través dels conductes interns del citòmetre, cada cèl·lula queda
classificada en funció de les seves intensitats de dispersió frontal i lateral, de la
mateixa manera que també ho fa per la seva intensitat de fluorescència.
Totes les cèl·lules analitzades es converteixen en una sèrie de números, i poden ser
representades en un gràfic en què es confrontin dos d’aquests paràmetres, on
cadascuna d’elles simbolitza un punt de l’esquema.
Aquest sistema de representar les dades obtingudes és anomenat “Dot Plot” (dibuix de
punts), i ens situa les cèl·lules de la mateixa classe en posicions similars, formant
“núvols” de punts que definiran les diferents poblacions cel·lulars presents.
Existeixen citòmetres en els quals després de passar les cèl·lules a través de l’aparell es
poden recuperar de forma aïllada segons les característiques en citometria. Són els
anomenats sorter. En aquests tipus de màquines les cèl·lules es troben separades cada
22. Recorregut de les cèl·lules marcades pel citòmetre.
42
una en una gota, les quals es carreguen elèctricament en funció de la imatge de
citometria que presentin.
Cada gota passa a través d’un condensador que genera un camp elèctric i desvia les
gotes segons la seva càrrega.
D’aquesta manera, les gotes de líquid poden recollir-se en diferents tubs i s’aïllen així
les cèl·lules individualitzades:
1. Les cèl·lules són transportades en un flux laminar continu i uniforme.
Quan el circuit del citòmetre finalitza, les cèl·lules surten formant un raig.
2. El raig va perdent continuïtat i es va fragmentant en petites gotes que contenen
una cèl·lula cadascuna. Una vegada individualitzades, les gotes es carreguen
elèctricament i es separen per un camp elèctric en funció de la càrrega que
presentin.
3. Les carregades negativament són atretes pel pol positiu.
4. Les carregades positivament són atretes pel pol negatiu.
En alguns casos els antígens d’interès no estan presents a la superfície externa de les
cèl·lules, és a dir, es troben a l’espai intracel·lular. Aleshores, per a marcar aquests
antígens, s’ha de fer un pas previ (l’anomenat Intra-stain) abans de passar la mostra
pel citòmetre: fixar les cèl·lules i permeabilitzar-les, de manera que es puguin detectar
els antígens mantenint intactes l’estructura cel·lular, la dispersió de la llum i la
immuno-reactivitat de la superfície cel·lular.
En il·luminar amb llum làser les cèl·lules amb els anticossos portadors de fluorocroms
que s’han unit als antígens per als quals són específics, es produeix l’emissió de llum
fluorescent de longitud d’ona típica de cada un.
43
Tot seguit es pot veure la classificació de les poblacions cel·lulars en una mostra
normal (d’un pacient sa) en funció de la mida i la complexitat de les cèl·lules, és a dir,
segons la dispersió de la llum (SSC-FSC)
En aquest histograma (gràfic) hi ha representat en cada valor de “x” (intensitat de
fluorescència) el nombre de cèl·lules que emeten aquesta intensitat.
En aquest cas s’ha utilitzat el marcador CD3 (per a detectar els limfòcits T presents a la
mostra), conjugat amb el FITC (l’isocianat de fluoresceïna):
El camp d’aplicació d’aquest tipus d’instruments creix dia a dia ja que són nombroses
les àrees de la biologia i la medicina que es beneficien del seu ús, sobretot en l’estudi
de les leucèmies i els limfomes, perquè ens permet realitzar un diagnòstic molt més
precís.
44
4.1.3. Anàlisi Citogenètica
Dins la branca d’oncologia existeix una altra tècnica per a l’estudi i el diagnòstic de
malalties neoplàsiques: l’anàlisi citogenètica. Es duu a terme amb mostres de medul·la
òssia i de gangli limfàtic i, en casos comptats, amb sang perifèrica.23
L’anàlisi citogenètica consisteix en l’estudi dels
cromosomes de les cèl·lules quan es troben en
metafase (segona etapa compresa dins la mitosi
o fase M; quan els cromosomes es col·loquen de
forma equidistant als dos complexos centriolars,
a la meitat del fus mitòtic formant la placa
equatorial).
Les anomalies cromosòmiques poden deure’s a defectes en l’estructura o
modificacions en el nombre de cromosomes, i s’associen a diversos aspectes de la
patologia humana: alteracions de la morfogènesi, retard mental, infertilitat i patologies
neoplàsiques, entre elles: la leucèmia.
Una alteració dels cromosomes molt freqüent en
les leucèmies mieloides cròniques (LMC) és
l’anomenat cromosoma de Philadelphia, el qual
afecta els cromosomes 9 i 22: hi ha un intercanvi
d’un segment entre els dos cromosomes, fet
anomenat “translocació recíproca”.
El 90% dels pacients que tenen leucèmia mieloide crònica presenten aquesta
anormalitat. També es troben casos del cromosoma Philadelphia en leucèmies
limfàtiques agudes (entre un 25 i 30% en adults) i, molt puntualment, en leucèmies
mieloides agudes.
23 Biomodel. http://www2.uah.es/biomodel/citogene/dynacare/geninfo.htm
23. Cèl·lula durant el procés de la mitosi.
24. Alteració del cromosoma Philadelphia.
45
En una prova citogenètica convencional, generalment s’empra una mostra de medul·la
òssia, ja que és un procediment que permet cultivar les cèl·lules necessàries per a les
proves citogenètiques. Quan les cèl·lules estan en cultiu els cromosomes
s’individualitzen, de manera que es poden examinar amb més rigor. És una anàlisi
visual, és a dir, per a realitzar-lo, s’ha de menester un microscopi.
4.2. Anàlisi molecular
Les tècniques de biologia molecular en el camp del càncer se centren en l’estudi de
l’ADN, l’ARN i les proteïnes, és a dir, analitzen el genoma humà (la seqüència d’ADN
que conté 23 parells de cromosomes en el nucli de cada cèl·lula humana).
L’ADN de les cèl·lules d’un organisme conté la informació genètica necessària per a la
construcció de les seves proteïnes, que determinaran la funció biològica del gen o la
patologia de la malaltia.
L’ARN missatger (ARNm) és la còpia d’aquesta informació, la qual és codificada i
interpretada amb la finalitat de construir les proteïnes.
Per a observar les anomalies en el genoma, podem aplicar diferents tècniques
possibles per a estudiar-les. Les més utilitzades són:
Electroforesi en gel.24 Aquesta tècnica es basa en la separació d’àcids nucleics o
proteïnes segons la seva mida i la càrrega elèctrica. Es duu a terme sota l’acció
d’un camp elèctric:
Es col·loquen fragments de la
mostra que es vol analitzar sobre
un suport porós (gel) i s’hi aplica
un camp elèctric, de manera que
es produeix una migració
diferencial dels fragments a
través de porus. El gel es tenyeix amb una substància fluorescent que 24 OMS. http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf
25. Tècnica d'electroforesi en gel.
46
s’intercala amb la molècula d’ADN i, en exposar-ho a rajos ultraviolats, permet
observar el resultat de la migració, cosa ens indicarà la seva mida.
La tècnica d’electroforesi en gel ha de tenir una mostra control, és a dir, la
d’una persona sana, per tal de comparar-la amb la d’un pacient afectat i poder
identificar àcids nucleics d’agents infecciosos.
PCR (reacció en cadena de la polimerasa). Aquesta tècnica bio-molecular té
com a objectiu l’obtenció de llargues còpies d’un fragment específic d’ADN a
partir d’una petita quantitat d’aquest. Això és possible gràcies a l’enzim ADN-
polimerasa, l’encarregat de fer-ne la còpia.25
En el primer cicle es duplica el fragment d’interès de l’ADN, de manera que
serveix de motlle per a la síntesi d’una altra cadena. Així, a cada cicle augmenta
el nombre de cadenes formades; en tan sols 25 cicles de còpia, la PCR permet
obtenir milions de còpies del fragment emprat.
26. Reacció en cadena de polimerassa. Font: Principle of the PCR.
Aquest procés s’utilitza en aplicacions mèdiques que requereixin gran
concentració d’una fracció específica d’ADN, per a poder identificar anomalies
en la seqüència de nucleòtids amb més exactitud.
25 ·PCR. http://ca.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3_en_cadena_de_la_polimerasa
47
Seqüenciació de l’ADN.26 És un conjunt de mètodes amb la finalitat de
determinar l’ordre de les bases nitrogenades que formen les seqüències d’ADN
(Adenina, Citosina, Guanina, Timina i Uracil), mitjançant la incorporació de
molècules didesoxinucleòtids, nucleòtids que manquen del grup 3-hidroxil (-
OH), de manera que interrompen la replicació de l’ADN i fan possible una millor
lectura de la seva seqüència.
La transferència Southern (Southern Blot)27 és una tècnica utilitzada per a
detectar una seqüència determinada d’ADN.
Es duu a terme mitjançant l’electroforesi en gel (per a separar els fragments
d’ADN d’acord amb la seva longitud) i, un cop separades les dues cadenes
immerses al gel (les quals s’han desnaturalitzat, és a dir, han perdut la seva
estructura), es transfereixen a la superfície d’una membrana de nitrocel·lulosa
absorbent, de manera que al filtre queda representada una rèplica de la
disposició dels fragments d’ADN presents al gel.
A continuació, el filtre s’incuba durant un temps amb la sonda (cadena
monocatenaria d’ADN) marcada radioactivament o amb un fluorocrom, mentre
aquesta es va hibridant (combinant) amb les molècules d’ADN complementari.
Finalment, si s’exposa la mostra a raigs X, es pot visualitzar la cadena
monocatenaria unida al fragment d’ADN complementari.
D’aquesta manera, es pot quantificar la mida i l’abundància de seqüències
específiques d’ADN.
26
·http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm 27
·Universitat de Barcelona (UB). http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-bcfb-d75fd6b2ee9f
48
En el cas de l’ARN, la tècnica per a determinar la seva mida i abundància és:
La transferència Northern (Northern Blot). Per a realitzar-la es segueix el mateix
procediment que en el mètode de Southern Blot, però, en comptes de fer-ho
amb l’ADN, les molècules d’àcid nucleic de la mostra són d’ARN.
La transferència Western (Western Blot) és la tècnica emprada per a detectar
proteïnes específiques. Segueix els mateixos passos que en les dues
transferències esmentades, però en aquesta última, un cop s’ha transferit la
proteïna a la membrana absorbent, se li afegeixen anticossos específics contra
ella. Així doncs, es detecta una unió antigen-anticòs, en la qual, mitjançant
activitat enzimàtica i fluorescència, es pot estudiar la presència de la proteïna
en qüestió.
La citometria de flux també es considera una tècnica d’anàlisi molecular, ja que
pot determinar estructures cel·lulars com l’ADN i l’ARN, gràcies a la gran
capacitat de l’aparell amb què es realitza.
27. Esquema del procés del Southern Blot.
49
En un anàlisi molecular, la tècnica més utilitzada és la reacció en cadena de la
polimerasa (PCR), ja que és un procés ràpid i automatitzat que ens permet obtenir
grans concentracions de segments específics d’una cadena d’ADN i, per tant, poder
fer-ne un estudi amb molta més minuciositat i exactitud.
50
5. Part pràctica
5.1. Introducció
Per a realitzar aquest treball de recerca, he pogut trepitjar un laboratori i viure de
primera mà el seu funcionament diari, aplicant alguns dels coneixements adquirits en
la part teòrica del treball, concretament, els descrits en l’apartat 4.1.2. (anàlisis
immunofenotípiques i morfològiques).
Havent introduït les tècniques de diagnòstic, l’objectiu d’aquest punt és mostrar com
les he aplicat durant la meva estada al departament d’Hematologia de l’Hospital de
Sant Pau. Hi he estat treballant amb dos tècnics de laboratori del sector
d’immunofenotipatge, dirigit pel doctor Josep Nomdedéu, qui m’ha brindat
l’oportunitat de viure aquesta gran experiència.
Durant la meva estada he pogut comprovar que el diagnòstic d'una leucèmia se
sustenta, en gran part, en aquest tipus d’anàlisi.
El dia a dia al departament d’immunofenotipatge es centra bàsicament en la utilització
del citòmetre28 per a estudiar mostres de sang, de medul·la òssia o de líquid
cefaloraquidi, entre d’altres, i després analitzar-ne els resultats. D’aquesta manera, he
posat en pràctica la metodologia emprada en la tècnica de diagnòstic de la citometria
de flux.
5.2. Un dia al laboratori
El primer dia, en arribar a l’hospital vaig preguntar pel Dr. Nomdedéu, el metge amb
qui havia pogut contactar mesos abans i m’havia ofert l’estada al seu departament.
Per anar als laboratoris hi havia un control estricte de seguretat. Per poder-hi accedir,
el primer que havia de fer era identificar-me amb el carnet d’identitat al control de
28 Instrument que s’explica a l’apartat 4.1.2. d’anàlisis immunofenotípics.
51
seguretat de l’hospital, on un guarda recollia les
meves dades i em facilitava un “passi” d’entrada
per arribar als laboratoris.
Vaig dirigir-me al despatx del doctor, on em va
explicar quines serien les meves tasques durant
l’estada al laboratori: restaria al sector de
marcatge i immunofenotips amb un tècnic veterà de laboratori, en Josep Úbeda, que
porta més de vint-i-cinc anys treballant als laboratoris de l’Hospital de Sant Pau.
Per començar, em va fer una breu explicació del funcionament de la màquina
protagonista d’aquell sector: el citòmetre. També va fer alguns esquemes per a
explicar-me el procediment de preparació de les mostres i la funció dels seus reactius,
inclosos els diferents tipus de marcadors.
Tot seguit vàrem seure davant de l’ordinador, va obrir diferents carpetes on hi havia
arxivats els resultats proporcionats pel citòmetre dels últims cinc mesos i me’n va
mostrar un parell. Me’n va explicar la interpretació, i seguidament vam començar a
treballar.
La citometria és una tècnica monòtona i repetitiva, ja que cada dia segueix el mateix
procediment:
Les mostres arribaven al voltant de les 12:30, la majoria del mateix hospital, juntament
amb d’altres provinents de diversos centres mèdics d’arreu d’Espanya.
Les portaven al laboratori en pots de plàstic
identificades, cadascuna, amb el nom del
pacient, la seva edat i el seu origen (sang
perifèrica, gangli limfàtic, medul·la òssia,
etc.). Cada pot tenia assignat un número de
referència. 29. Mostres de sang rebudes al laboratori.
28. "Passi" d'entrada al laboratori.
52
Només arribar, els tècnics apuntaven aquestes dades en una llibreta de registres per
tal de tenir controlades les mostres que passaven per cada sector del laboratori, i
també hi anotaven els resultats obtinguts.
En funció del tipus de mostra, aplicàvem proves diferents. La majoria eren de pacients
anteriorment diagnosticats, dels quals fèiem un seguiment emprant uns marcadors
específics, però, quan arribaven mostres de pacients nous, havíem de fer l’anomenada
“bateria”, una prova on empràvem moltes combinacions de diversos marcadors i
fluorocroms amb la finalitat de definir la patologia del pacient.
Per començar, preparàvem els tubs d’assaig necessaris per a cada prova, apuntant
amb un retolador els marcadors que més tard afegiríem a cadascun.
Abans de preparar les mostres amb els marcadors i els reactius necessaris fèiem un
recompte cel·lular. Per a fer-ho, ho comptàvem amb una càmera de Neubauer29
(observant-ho al microscopi), o bé amb un analitzador automàtic.
Un cop havíem fet el comptatge de cada mostra, apuntàvem les
dades i agafàvem un volum corresponent a 1x10⁶ cèl·lules per a
cada tub necessari. Les quantitats eren molt petites, ja que amb
poc nombre de cèl·lules ja en podíem fer una anàlisi completa. Per
a fer-ho, utilitzàvem micro-pipetes (instrument que s’utilitza per a
transferir volums en dosis de microlitres (µL) de líquids) amb les
anomenades “puntes de plàstic”, les quals havíem de renovar per
a cada mostra diferent.
Totes les mostres eren de pacients amb malalties neoplàsiques, la majoria de
leucèmies (tant pediàtriques com d’adults) i de síndromes mielodisplàstiques (conjunt
de malalties que afecten les cèl·lules mare de la medul·la òssia, fabricant cèl·lules
anòmales).
29 Tècnica emprada en recomptes cel·lulars. Explicada a l’apartat 4.1.1. Hemogrames.
30. Micro-pipetes.
53
Per a marcar els antígens d’interès de les cèl·lules de la mostra seguíem dos
procediments diferents, depenent de si es trobaven a la superfície extracel·lular o
intracel·lular.
1. En els casos de marcatge de membrana (extracel·lular), posàvem els marcadors
(Immunoglobulines de ratolí) i els anticossos corresponents a les proves sol·licitades.
Abans d’afegir-los-hi, havíem de verificar si estaven en bon estat i mirar la seva data de
caducitat, la qual estava adscrita a les instruccions de la casa comercial de cada
marcador.
En cas que n’haguéssim trobat algun de caducat,
podríem haver pres com a control de marcatge
cèl·lules normals de reactivitat coneguda, però no va
ser el cas.
Aquests marcadors venien envasats en potets petits
de vidre, diferenciats pels colors dels taps i números
que els identificaven. Els tenien guardats en una
nevera per a mantenir-los freds i no fer-se malbé.
Un cop havíem afegit els marcadors deixàvem incubar els tubs, col·locats tots en una
mateixa gradeta, en un medi fosc; els guardàvem dins un calaix durant un quart
d’hora. Per a calcular el temps utilitzàvem cronòmetres.
31. Preparació dels tubs d'assaig amb els marcadors corresponents apuntats amb retolador.
32. Procés d'emplenar els tubs d'assaig amb micro-pipetes.
33. Potets de vidre classificats segons el tipus de marcador.
54
Havent passat els 15 minuts, les trèiem del calaix i les lisàvem: produíem el trencament
de la membrana cel·lular dels hematies. Per a fer-ho, afegíem 2mL de tampó lisi diluït
en aigua destil·lada i ho deixàvem incubar 5 minuts més en les mateixes condicions
(temperatura ambient i a les fosques).
Després de lisar els eritròcits col·locàvem els tubs a la centrifugadora i l’activàvem
durant 5 minuts entre 1500 i 1800 rpm (revolucions per minut).
En centrifugar-ho, obteníem una separació dels components de la mostra: a la part
inferior restaven els eritròcits i granulòcits (de densitat més elevada), juntament amb
els limfòcits i monòcits i, per sobre, quedaven les restes de cèl·lules mortes i el plasma
cel·lular.
Seguidament, tiràvem el sobrenedant, de manera que al tub hi quedava el “pellet”, és
a dir, el concentrat de cèl·lules de major densitat.
Rentàvem el pellet amb una solució tampó, també anomenada buffer: el PBS (de les
sigles angleses Phosphate Buffered Saline), amb la finalitat de mantenir el pH de les
solucions estable. Posteriorment ho tornàvem a centrifugar durant 5 minuts més.
Per acabar, decantàvem el sobrenedant, de manera
que el pellet era la mostra necessària per a
processar pel citòmetre.
2. Per altra banda, quan volíem marcar antígens
localitzats a l’interior de la cèl·lula, els passos a
seguir eren els mateixos, però, a més a més, hi
havíem d’afegir uns reactius (kit Intra-Stain).
Aquest “kit” tracta de fixar les cèl·lules en suspensió
per a mantenir la seva integritat i permeabilitzar-les formant porus a les membranes
cel·lulars per a permetre el pas dels anticossos i unir-se amb els antígens
corresponents sense variar-ne l’estructura cel·lular ni les funcions. Consta de dos
reactius: el fixador (reactiu Intrastain A) i el permeabilitzador (reactiu IntraStain B).
34. Centrifugadora.
55
Havíem d’afegir 100µL del tampó fixador (A) a cada
tub indicat. Ho agitàvem amb l’ajuda d’un aparell
(vòrtex) per tal de garantir que les cèl·lules
estiguessin en suspensió i ho incubàvem 15 minuts a
temperatura ambient.
Seguidament, tiràvem 5mL de solució de PBS, ho
centrifugàvem 5 minuts i després en decantàvem el
sobrenedant. Fèiem desprendre el pellet amb força i
afegíem a cada tub 100 µL de tampó de
permeabilització (B).
Per acabar, afegíem els marcadors i seguíem el
procediment anteriorment esmentat.
D’aquesta manera, els anticossos monoclonals
podien travessar la membrana cel·lular (gràcies a la
funció del reactiu de permeabilització) i “unir-se”
amb els antígens intracel·lulars.
Quan teníem tots els tubs d’assaig llestos, preparàvem el citòmetre. Per a activar-lo,
utilitzàvem el programa software de l’ordinador.
Alhora que posàvem en marxa l’aparell, escrivíem la plantilla de cada prova a
processar al programa, identificant-lo amb el número de referència de les mostres.
El citòmetre presenta una “boqueta”, l’orifici per
on introduíem el tub d’assaig.
El sistema de fluids és l’encarregat d’absorbir una
petita quantitat de la mostra i enviar-la fins a la
cambra de flux gràcies a un augment de pressió del
dipòsit del PBS, el líquid que recorre el sistema. Un
cop ha arribat a la cambra, es produeix un flux
laminar en interaccionar dos fluids, el de la mostra
35. Procés de fixació i permeabilització cel·lular (kit Intra-Stain).
36.. "Boqueta" del citòmetre.
56
i el de “l’envoltant” (PBS).
Les cèl·lules entren desordenades pel tub que connecta amb la mostra, però després
s’alineen fins quedar formant una fila, de manera que passen d’una en una per davant
del raig làser. El fet que les cèl·lules passin alineadament és essencial perquè se’ns
defineixin bé les poblacions i subpoblacions.
Com ja he explicat a la part teòrica del treball, a través dels sistemes òptic i electrònic
de l’aparell, els fluorocroms s’activen emetent senyals de llum, els quals són recaptats
per uns fotodetectors, i són convertits en senyals digitals per a “emmagatzemar” a la
computadora.
Un cop els resultats quedaven recollits a l’ordinador en forma de gràfics de punts (dot
plot), els enviàvem al Dr. Nomdedéu perquè més tard els analitzés i els anotés a la
llibreta de registres.
Finalment, els resultats de les mostres estudiades als diferents departaments
d’hematologia eren consultats amb els metges clínics i així en podien fer un seguiment
i comunicar-los als pacients.
57
6. Experiència personal
Com a epíleg del treball, he trobat interessant relatar l’experiència d’un pacient que ha
sobreviscut una leucèmia, explicant, també, les escenes viscudes amb els familiars i
amics, durant el dia a dia de la seva malaltia.
<<Això és una loteria on tothom hi participa però ningú vol guanyar>>30
Quan tenia 22 anys, a en Sebastià Videla, li van diagnosticar una leucèmia. Era
estudiant de medicina i pocs dies abans s’havia examinat d’hematologia; per tant,
tenia prou coneixement del que suposava aquell diagnòstic.
Una tarda de març del 1985, en tornar cap a casa carregat amb unes caixes, va notar
que no tenia força suficient per pujar les escales. Només arribar, ho va explicar a casa i,
pel seu propi peu, va dirigir-se a l’hospital de Sant Pau, on va comunicar-ho a la
doctora Salut Brunet. Aquella situació no li feia bona espina.
No va passar ni una setmana després de la visita que una trucada del laboratori va
alarmar la seva mare: “Ens agradaria que tornés el seu fill, hi ha alguna dificultat a la
seva analítica i s’hauria de tornar a repetir”.
El dia que li van donar el diagnòstic anava acompanyat de la seva xicota i, curiosament,
ells dos van ser els últims de rebre la notícia, ja que els companys del seu grup d’amics
de la carrera ja ho sabien des de feia 24 hores.
En rebre la notícia, la primera reacció va ser d’incredulitat, però, acte seguit, encara
recorda ara la seva parella la sensació de “buidor intensa, com si t’haguessin travessat
amb una llança”.
30 Paraules textuals del pacient entrevistat.
58
“Durant 24 hores llargues vaig estar preguntant-me perquè m’havia tocat a mi, fins
que vaig adonar-me que aquesta pregunta no tenia resposta. Ho vaig acceptar i vaig
començar a lluitar.”
El malalt, amb por de la reacció que tindrien els pares davant el diagnòstic, va demanar
a un professor i també amic de la facultat, que anés a casa seva a comunicar la notícia
als seus pares, de manera que ells poguessin fer-li les preguntes que volguessin.
El metge va acceptar l’encàrrec perquè apreciava molt l’afectat, però se li va fer molt
difícil, ja que era un metge de laboratori i no estava acostumat a donar “males
notícies”.
Tant els pares com els cinc germans van quedar trasbalsats, igual que la resta de la
família i amics. “No ens ho podíem creure”, explicava la mare.
Feia pocs dies que havia mort una veïna del barri de 26 anys per una leucèmia.
Estava en el seu quart any de carrera. Estudiava medicina a Sant Pau, hospital on
també s’hi tractava. En saber la notícia va sentir curiositat i va anar a la biblioteca per a
buscar informació sobre la malaltia i conèixer-la amb més precisió.
La seva leucèmia era una limfoblàstica aguda, segons la classificació d’aquella època
(l’actual leucèmia limfoide aguda). Els metges li van donar el pronòstic: la
supervivència global de la seva malaltia era d’un 8%, però el fet que fos jove jugava al
seu favor.
Tot i ser conscients que el pronòstic no era bo i que les probabilitats de sobreviure
eren baixes, tant en Sebas com la seva nòvia van creure des del primer moment que ell
passaria a formar part d’aquell 8%.
59
Als dos dies del diagnòstic definitiu ingressava a Sant Pau, on començà el primer cicle
de quimioteràpia. El primer mes va romandre a l’hospital amb certes mesures
d’aïllament a causa de la immunosupressió; es trobava en la fase d’inducció del
tractament.
Va reaccionar molt bé davant d’aquella primera tanda, de manera que als quaranta
dies va poder tornar a casa amb un catèter a la subclàvia col·locat des del primer dia
per tal de poder rebre el tractament endovenós.
Durant un cap de setmana a la muntanya, mentre estava amb els seus amics a la Vall
d’Aran, va perdre el catèter per la neu i això va fer que hagués de tornar a Barcelona
perquè li col·loquessin un de nou.
Va tenir l’oportunitat de fer-se un transplantament de medul·la òssia, gràcies a la
compatibilitat que presentava amb un dels seus germans. El pacient, de comú acord
amb la seva doctora, va decidir de tirar endavant sense el transplantament, donada la
bona resposta que havia tingut amb els diversos cicles de quimioteràpia.
Seguint el protocol vigent en aquella època, va rebre radioteràpia cranial, ja que el
cervell, juntament amb els testicles, és un dels dos santuaris on poden quedar
emmagatzemades cèl·lules canceroses que no són sensibles a la quimioteràpia.
37. Sebastià i amics abans de rebre la primera tanda de quimioteràpia.
60
Per a la radioteràpia li van haver de marcar el cap amb una tinta vermella per a definir
el camp de radiació. Ho va portar marcat al llarg de cinc o sis setmanes. Un dia, creuant
el carrer direcció a la universitat, un taxista parat a un semàfor es va girar i li va deixar
anar: “Hay que ver la joventud de hoy en día, lo que hace para llamar la atención”. En
Sebas, en sentir el comentari, s’ho va prendre bé i va riure de la situació.
Durant els dos anys i deu mesos que va durar el tractament no va abandonar els
estudis i no va perdre cap curs de la carrera, gràcies tant al seu esforç com a l’ajuda
dels companys i la comprensió dels professors, que en alguns casos van adaptar els
exàmens segons l’evolució de la malaltia.
Una nit d’estiu, en Sebastià i els seus companys de la universitat van anar a celebrar el
final de curs a una discoteca. Quan van arribar, el vigilant del club no el va deixar
entrar a causa “d’aquelles pintes que portava”.31
El grup sencer, en veure que no li permetien l’entrada, va marxar de la discoteca i va
anar a buscar un altre bar per a fer la celebració.
31 Paraules textuals utilitzades pel vigilant dirigides al Sebastià.
38. El pacient acompanyat dels seus pares (esquerra), la seva germana petita i la tieta (dreta).
61
“Vaig parlar sobre la mort amb infermeres i amics; sabia que era una possibilitat, però
no comptava que em toqués en aquell moment”. Mai va perdre les ganes de viure, de
manera que, molts dies, era ell el que animava aquells qui l’anaven a visitar a
l’hospital, sobretot els seus pares, que ho van passar pitjor.
En tot moment es va sentir molt acompanyat per part de la família, els amics, i també
per tot el personal mèdic, amb qui va establir una forta relació que encara perdura
avui dia.
El suport dels amics i els coneguts es va veure reflectit en l’allau de donacions al banc
de sang de l’hospital, on multitud de familiars i amics van mostrar la seva solidaritat
envers els malalts.
Va superar la malaltia amb èxit: la
resposta al tractament va ser
“anormalment bona”. L’única
infecció oportunista32 que va
presentar durant tot el procés va
ser una infecció fúngica33 de la
boca.
A dia d’avui, 29 anys després
d’aquell diagnòstic, en Sebastià
porta una vida totalment normal
amb un bon estat de salut. Des
d’aleshores, no ha patit cap
recaiguda ni cap altre tipus de
càncer.
32
Les infeccions oportunistes són aquelles que esdevenen durant el procés de la quimioteràpia degudes a la baixada de defenses de l’organisme. 33 Infecció produïda per fongs.
39. Sebastià i la seva parella dues setmanes després d'iniciar la quimioteràpia.
62
7. Conclusions
Abans de començar el treball no disposava de gaires coneixements sobre quins passos
es seguien per tal de determinar si un pacient tenia una leucèmia, però mitjançant
recerques a un gran ventall de pàgines web i llibres, he anat aprofundint en el
coneixement d’aquesta malaltia i descobrint, poc a poc, les diferents metodologies
emprades en el seu diagnòstic.
Durant el procés d’elaboració d’aquest treball i després de l’estada al laboratori, he
pogut comprovar que, tal i com havia plantejat en la meva hipòtesi, les anàlisis
immunofenotípiques són les més importants en el procés de diagnòstic d’una
leucèmia. Són les més utilitzades al laboratori a l’hora d’obtenir el diagnòstic, ja que, a
diferència d’altres proves citològiques, aquesta és capaç d’aportar-nos informació de
molts paràmetres cel·lulars de forma simultània.
He pogut constatar que el conjunt de tècniques citològiques són primordials per a una
classificació acurada dels diferents tipus de leucèmies i, tanmateix, per donar un
pronòstic complet i orientar cap al tractament més adient.
Hi ha hagut diversos aspectes que m’han semblat interessants i curiosos al llarg
d’aquest procés de recerca, entre ells, l’existència del cromosoma Philadelphia i el seu
valor pronòstic (alt percentatge d’associació amb leucèmia mieloide crònica); el
complex mecanisme de producció d’anticossos monoclonals utilitzats en la citometria
de flux; i l’experiència d’haver viscut durant una setmana la vida d’un laboratori d’un
gran hospital.
En aquest últim punt crec oportú fer constar que la realitat del dia a dia del laboratori
era diferent del que jo m’esperava, ja que, l’activitat diària al departament on vaig fer
les pràctiques era molt repetitiva. M’hauria agradat poder conèixer el funcionament
d’altres sectors del laboratori on hi destaqués la recerca de noves tècniques i/o
projectes d’investigació.
63
8. Bibliografia
8.1. Llibres
GARCÍA-CONDE, J. Hematología: citocinas, inmunoterapia y teràpia celular. Editorial:
Arán. 2001.
GARCÍA ESPINOSA, B. Hematología I. Editorial: Thomson Paraninfo. 2007.
GUYTON i HALL. Tratado de Fisiología médica. Editorial: El Sevier. 2011.
MEZQUITA. Fisiología Médica: del razonamiento fisiológico al razonamiento clínico.
Editorial: Panamericana. 2011.
RODÉS TEIXIDOR, J. Medicina Interna. Tomo I i II. Editorial: Masson. 1997.
THEML, H. Pocket Atlas of Hematology. Editorial: Thieme. 1985.
8.2. Pàgines web
Aplicación de las técnicas de biología molecular en oncologia. Scientific Electronic
Library Online (SciELO): http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0213-
12852010000400003&script=sci_arttext
Cancerología 2. MAYANI, H. Pàgines 96-101. Última visita: 26/10/14. Data
d’actualització: 2007.
http://www.incan.org.mx/revistaincan/elementos/documentosPortada/1193426538.p
df
Citogenética Básica. Biomodel. HERRÁEZ, A. Data d’actualització: 02/2008.
http://www2.uah.es/biomodel/citogene/dynacare/geninfo.htm
64
Del hemograma manual al hemograma de cuarta generación. Consultat el 04/10/2014.
http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2007/myl011-12b.pdf
El càncer. National Cancer Institute (NCI). Data d’actualització: 07/03/2014.
http://www.cancer.gov/espanol/cancer/que-es
Electroforesis en gel de agarosa. OMS. M. SOMMA, M., Querci. http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdfFase
Blástica. Conexión Cáncer. http://conexioncancer.es/tipos-de-cancer/informacion-
general-sobre-la-leucemia/informacion-general-sobre-la-leucemia-mielogena-
cronica/fase-blastica/
Etiología Leucemia. Última actualització: 23/10/2104
http://es.wikipedia.org/wiki/Leucemia#Etiolog.C3.ADa
Fluorocromos para Citometría de Flujo. Universitat de Lleida (UdL).
http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/fluor.htm
Fundació Josep Carreras. http://www.fcarreras.org/ca
Hibridación de los ácidos nucleicos. Consultat el 10/2014.
http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-bcfb-
d75fd6b2ee9f
Inmunología. Universidad de Navarra. Consultat el 16/02/2104
http://docentes.educacion.navarra.es/metayosa/bach2/2inmunocurio.html
Leucemia: Causas. Onmeda. SEGADO OBESSO, J. Data d’actualització: 19/03/2012.
http://www.onmeda.es/enfermedades/leucemia-causas-1424-5.html
Leucemias Agudas y Síndromes Mielodisplásicos. Servei de Patologia, Hospital Verge de
la Cinta de Tortosa. ÁLVARO, T., GARCÍA, B.
http://www.conganat.org/linfo.tortosa/conf/cap5/laguda.htm
65
Leucemia mieloide aguda en adultos. National Caner Institute. Data d’actualització:
09/04/2014. http://www.cancer.gov/espanol/pdq/tratamiento/leucemia-mieloide-
adultos/HealthProfessional/Page2#Section_185
Leucemia en Menores de 15 años. Data d’actualització: 2010.
http://web.minsal.cl/portal/url/item/7220fdc433e944a9e04001011f0113b9.pdf
Notas sobre la historia de la leucèmia. Consultat el 05/2014. Data d’actualització:
03/2013. http://www.medigraphic.com/pdfs/patrevlat/rlp-2013/rlp131l.pdf
Onco-Hematología. Centro Inmunológico Alicante.
http://www.cialab.com/oncohematologia.php
Qué es la Citometría de Flujo? Instituto de Investigaciones biològicas Clemente Estable
(IIBCE). http://www.iibce.edu.uy/SECIF/quees.htm
Qué es el transplante de médula ósea? Cancer.net. (American Society of Clinical
Oncology (ASCO)). http://www.cancer.net/es/desplazarse-por-atenci%C3%B3n-del-
c%C3%A1ncer/tipos-de-tratamiento/%C2%BFqu%C3%A9-es-el-trasplante-de-
c%C3%A9lulas-madrem%C3%A9dula-%C3%B3sea
Què és el càncer? Generalitat de Catalunya. Data d’actualització: 05/01/2010
http://cancer.gencat.cat/ca/ciutadans/el_cancer/que_es_el_cancer
Reacció en Cadena de Polimerasa (PCR). Viquipèdia. Data d’actualització: 09/06/2014.
http://ca.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3_en_cadena_de_la_polimerasa
