LABORATUVAR MATEMATİĞİ

Dr. Zafer KÜÇÜKODACIGATA HEH Patoloji Servisi

22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ7 Kasım 2012

Manavgat

2.3. DNA extraction by boiling :Total DNA was extracted by a boiling method (Bell et al., 1998). Strains

were grown overnight at 37°C on blood sheep agar plates(BioMe´rieux, France). Three to five colonies of each sample werescraped from the surface of the agar plates and resuspended in 1 mL ofsterile distilled water. The cell suspension was heated for 15 min at100°C and was then centrifuged at 15,000 g for 10 min. Thesupernatant containing DNA was stored at 20°C until used astemplate for PCR reactions.

2.4. PCR amplification:Multiplex PCR (MPCR) assays were all directly performed from the

supernatant obtained after the rapid DNA extraction method describedabove. An aliquot of 20 µL of this supernatant was added to 80 µL of aPCR mixture consisting of: 1x reaction buffer [16 mM (NH4)2SO4, 67mM Tris-HCl (pH 8.8)], 0.2 mM concentration of each of the fourdeoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP)(Promega Corp., Madison, WI), 2.5 mM MgCl2, 50 pmol of each Vanprimer and 4 pmol of each Ent primer, and 1.2 u of TaqDNApolymerase (Bioline, UK)…………

After PCR amplification, 5 µL were removed and subjected to agarose gel electrophoresis (1.5% agarose, 1x TBE, 100V) to estimate the size of the amplified products by comparison with a 100-bp molecular size standard ladder (Roche Diagnostics, Germany).

Claverie-Martin F et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002;42:273-7

AMAÇ

Laboratuvar matematiği 15000 g

50 pmol

%1.5 agaroz jel

16 mM (NH4)2SO4

1x buffer

Santrifügasyon

Ölçü birimleri

Molarite kavramı

Konsantrasyon

x faktörü

AMAÇ

1. Santrifugasyon birimlerini birbirine dönüştürme (rpm g)

2. Ölçü birimlerini birbirine dönüştürme (M μM)3. Liyofilize maddeden istenilen konsantrasyonda

hazırlama (primer)4. Yüksek konsantrasyonlu çözeltiden düşük

konsantrasyonlu kullanma (MgCl2)5. Konsantre çözeltilerin sulandırılması (10X X)

Komponent Volüm/reaksiyon Final konsantrasyon10X PCR Buffer ? 1X25mM MgCI2 ? 2.5 mMdNTPs (10 mM) ? 200 MPrimer A(liyofilize 855 g )

? 0.2 M

Primer B(liyofilize 424 g )

? 0.2 M

DNA Polym(d=5U/L)

? 2.5U/reaksiyon

Template DNA(d=2ng/L)

? 20ng

ddH20Toplam volüm 50 L

Santrifügasyon Yerçekimi etkisi yaratılarak maddelerin

çökertilmesi Farklı kütleye sahip maddelerin ayrımı

Santrifügasyon Hız: RPM (Revolution per minute) RCF = Relative centrifugal forces = g

RCF= (1.118 x 10-6) (rpm)2 r

RCF: Relative centrifugal forces (g)rpm: Revolution per minuter: Rotor yarıçapı

Nomogram

Laboratuvar matematiği 15000 g

50 pmol

Santrifügasyon

Ölçü birimleri

Ölçü birimleri Uzunluk = metre(m) Kütle = kilogram(kg) Madde birimi = mol(mol) Zaman = saniye(s) Elektrik akımı = amper(A) Isı = kelvin(K) Işık yoğunluğu = kandela(cd)

International System of Units (SI)

Ölçü birimleri Mol: Bir maddenin avogadro sayısı (6,02x1023)

kadar molekül içeren miktarı Metre: Işığın bir vakum içerisinde saniyenin

1/299 792 458’sinde kat ettiği mesafedir. Kilogram: Kenarları 1 desimetre uzunluğunda

olan bir küpün içerisindeki suyun kütlesidir.

Litre: Kenarları 1 desimetre uzunluğunda olan bir küpün içerisindeki suyun hacmidir.

Yotta Y 1024

Zetta Z 1021

Exa E 1018

Peta P 1015

Tera T 1012

Giga G 109

Mega M 106

Kilo k 103

Hekto h 102

Deka da 101

Desi d 10-1

Santi c 10-2

Mili m 10-3

Mikro μ 10-6

Nano n 10-9

Piko p 10-12

Femto f 10-15

Atto a 10-18

Zepto z 10-21

Yocto y 10-24

Metrik önekler

Örnek 1 dL = 10-1 L 1 L = 103 mL = 106 μl = 109 nL 1 μg = 10-6 g 1 g = 103 mg = 106 μg 1 mol = 1012 pmol

1 g/L = 100 mg/dL 1 mol/L = 103 nmol/μL

Laboratuvar matematiği 15000 g

50 pmol

%1.5 agaroz jel

Santrifügasyon

Ölçü birimleri

Konsantrasyon

Konsantrasyon Bir çözeltinin konsantrasyonu, çözeltinin belirli

bir volümü içinde çözünmüş olan madde miktarıdır.

Çözücü (solvent) denen dağıtıcı bir faz ile bir veya birçok dağıtılmış fazdan (çözünen, solüt) kurulan sıvı bir örnek durum çözelti (solüsyon) olarak tanımlanır

Konsantrasyon birimleri Formalite Molarite Molalite Normalite Mol kesri Yüzde Binde (ppt) Milyonda (ppm) Milyarda (ppb)

Yüzde miktar Total hacim içerisindeki miktar % olarak ifade

edilmektedir. %W/V : Suda çözünen katılar için kullanılır.

50 mL %2’lik agaroz hazırlanması %V/V : Dilüe edilen solüsyonlar için kullanılır.

500 mL %70’lik etil alkol hazırlanması

Çözünen madde kütlesiHacim ağırlıkça yüzde = X100

Çözeltinin toplam hacmi

Örnek: 500 mL %70’lik etil alkol nasıl hazırlanır?

100 mL’de 70 mL500 mL’de ? mL? = 500x70 / 100 = 350 mL

350 mL etil alkol 150 mL su eklenerek 500mL’ ye tamamlanır.

%70 = Çözünen madde hacmi / 500 mL? = 0.70 x 500 mL? = 350 mL

Örnek: 50 mL %2’lik agaroz nasıl hazırlanır?

100 mL’de 2 g50 mL’de ? g? = 2x50 / 100 = 1 g

50 mL sıvı içerisinde 1 g agaroz çözdürülür.

%2 = Çözünen madde kütlesi (m) / 50 mLm = 0.02 g/mL x 50 mLm = 1 g

Laboratuvar matematiği 15000 g

50 pmol

%1.5 agaroz jel

16 mM (NH4)2SO4

Santrifügasyon

Ölçü birimleri

Molarite kavramı

Konsantrasyon

Molarite Bir litre çözelti içerisindeki çözünen maddenin

mol sayısıdır M ile gösterilir

Molarite =Çözünen madde mol sayısı

Toplam hacim (L)

Molarite Çözünenin gram ağırlığının moleküler

ağırlığına bölünmesine bir mol denir

Bir çözeltinin molaritesi 3 kısım içerir Maddenin gram ağırlığı Maddenin moleküler ağırlığı Çözücü miktarı

ELEMENTLERİN ATOMİK AĞIRLIKLARIElement Sembolü Atomik ağırlığıAliminyum Al 27.0Baryum Ba 137.3Demir Fe 55.9Fosfor P 31.0Hidrojen H 1.0Kalsiyum Ca 40.1Karbon C 12.0Klorür Cl 35.5Magnezyum Mg 24.3Oksijen O 16.0Sodyum Na 23.0Potasyum K 39.1

Örnek: 500 mL 0.1M NaOH çözeltisi nasıl hazırlanır?

M = 0.1V = 500 mL = 0.5 litreM = Çözünen(mol) / Çözelti(litre)

0.1 = Çözünen / 0.5 LÇözünen = 0.1 X 0.5 = 0.05 mol veya0.05 X 40 = 2g NaOH

2g NaOH tartılır. 500mL’lik balon jojeye konur. Az miktarda suda çözdükten sonra hacim çizgisine kadar saf su ile doldurulur

Örnek: 3,6 nmol miktarındaki oligonükleotitten 50 pmol/L konsantrasyonda olacak şekilde sulandırınız

1 L’de 50 pmol? L’de 3,6 nmol

3,6x103 pmol / 50 pmol = 72 L

M = Mol / Hacim (V) M = 50 pmol/L mol = 3.6 nmol V = ?V = mol / MV = 3,6x10-9 mol / 5x10-11mol/L V= 72 L

Değişen konsantrasyon hesaplamaları

Yüksek konsantrasyolu bir çözeltiden düşük konsantrasyonlu bir çözelti hazırlanmak istendiğinde

C1 X V1 = C2 X V2 formülü kullanılır

Örnek: %70’lik alkolden, 100 mL %40’lık alkol nasıl hazırlanır?

Çözeltiyi hazırlayabilmek için 57.14 mL %70’lik alkol alınır ve saf su ile 100 mL’ye tamamlanır

C1 x V1 = C2 x V2

%70 x V1 = %40 x 100 mLV1 = %40 x 100 / %70V1 = 57.14 mL

Örnek: 10mM kontrasyonundaki dNTP miks solüsyonundan ne kadar konursa 50 µL master miks içerisinde 200 M final konsantrasyona ulaşılır?

C1 x V1 = C2 x V2

10 mM x V1 = 200 M x 50 LV1 = 0,2 mM x 50 L / 10 mM V1 = 1 L

Laboratuvar matematiği 15000 g

50 pmol

%1.5 agaroz jel

16 mM (NH4)2SO4

1X buffer

Santrifügasyon

Ölçü birimleri

Molarite kavramı

Konsantrasyon

X faktörü

X faktörü 10x, 5x, 20x konsantre solüsyonlar Kullanım öncesi, çalışma konsantrasyonuna

dilüe edilir.

Komponent Volüm/reaksiyon Final konsantrasyon10x PCR Buffer ? 1X25mM MgCI2 ? 2.5 mMdNTPs (10 mM) ? 200 MPrimer A(liyofilize 855 g )

? 0.2 M

Primer B(liyofilize 424 g )

? 0.2 M

DNA Polym(d=5U/L)

? 2.5U/reaksiyon

Template DNA(2ng/L)

? 20ng

ddH20Toplam volüm 50 L

5 L5 L1 L

10 pmol0.062 g10 pmol0.061 g

0.5 L

10 L