LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA II

PENENTUAN POLA KROMATOGRAM DENGAN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) / KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

Laboratorium PNA, 23 April 2013

DISUSUN OLEH :

KELOMPOK IV FARMASI 4B

ANNISA NURUL AZ-ZAHRA 1111102000029

ATHIYAH 1111102000031

TIARA APRILIA 11111020000

HARDI MOZER 1111102000049

ARINI EKA PRATIWI 1111102000051

HAPPY RAHMA YULIN 11111020000

SONIA ULFAH 1111102000116

NURKHAYATI INDRIYANI P. 1111102000

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANG

Dalam analisis senyawa pada suatu tumbuhan, mahasiswa dapat melakukan berbagai

pengujian dengan berbagai parameter, salah satunya dengan pengujian parameter pola

kromatogram. Pola kromatogram dapat didapatkan setelah kita melakukan pemisahan dengan

metode kromatografi, diantaranya: kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi

sentrifugal, kromatografi kolom, dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Metode KCKT merupakan metode yang memberikan sensifitas dan spesifitas yang

tinggi, dapat memberikan hasil kualitatif maupun kuantitatif, sehingga pada praktikum ini

kami akan melakukan pengujian parameter pola kromatogram dengan menggunakan KCKT.

Kromatografi kinerja tinggi adalah perkembangan teknologi dari metode-metode

kromatografi yang telah ada sebelumnya. Memiliki prinsip pemisahan zat-zat terlarut terpisah

berdasarkan perbedaan kecepatan elusi. Dibandingkan metode lainnya KCKT memiliki

berbagai kelebihan, antara lain: mampun memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran,

mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan tinggi, dapat dihindari terjadinya

dekomposisi/ kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik, dapat digunakan

bermacam-macam detektor, kolom dapat digunakan kembali, dan mudah melakukan sampel

recovery.

Kegunaan umu KCKT adalah untuk pemisahan senyawa organik, anorganik, maupun

senyawa biologis, analisis ketidakmurnian, analisis senyawa yang tidak mudah menguap,

penentuan molekul netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi pemurnian senyawa, pemisahan

senyawa-senyawa dalam jumlah banyak, dan dalam skla proses industri.

1.2. TUJUAN

Mahasiswa dapat melakukan pengujian parameter pola kromatogram dengan

menggunakan KCKT

1.3. MANFAAT

Mahasiswa dapat melakukan pengujian menggunakan KCKT.

Mahasiswa mendapatkan pola kromatogram dari sampel yang digunakan.

BAB II

LANDASAN TEORI

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan tipe kromatografi

cair yang digunakan untuk pamisahan dan analisa kuantitatif suatu bahan yang terlarut dalam

suatu larutan. HPLC digunakan untuk menentukan kada senyawa katif dan spesifik dalam

suatu larutan. HPLC dan kromatografi cair lainnya menggunakan prinsip dimana larutan

sampel akan berinteraksi dengan fase cair kedua atau fase padat, dan zat terlarut yang

berbeda-beda dalam larutan sampel akan berinteraksi dengan fase diam. Perbedaan interaksi

antara sampel dengan kolom akan membantu memisahkan komponen sampel yang berbeda-

beda satu sama lain.

Prinsip dari kromatografi adalah :

1. Retensi

Retensi suatu senyawa dengan fase gerak disebut sebagai waktu retensi (Rt) atau

retensi volume. Volume retensi atau elusi adalah kuantitas fase gerak yang diperlukan

untuk menarik sampel melalui kolom. Waktu retensi didefinisikan berapa lama

sampel tersebut berada dalam kolom fase diam relative terhadap waktu dan fase

geraknya. Retensi tersebut digambarkan sebagai perbandingan kapasitas kolom yang

dapat mengevaluasi efisiensi kolom. Semakin lama sampel berada dalam kolom,maka

akan semakin besar faktor kapasitasnya.

2. Resolusi

Resolusi adalah kemampuan kolom dalam memisahkan sampel menjadi bentuk peak

yang terukur pada kromatogram dalam bentuk puncak.

3. Sensitivitas

Ukuran terkecil komponen yang dapat dipisahkan dengan metode kromatografi.

Sistem yang digunakan dalam kromatografi sering dikelompokkan ke dalam salah

satu dari empat jenis berdasarkan mekanisme kerja, adsorbsi, partisi, pertukaran ion dan

ukuran eksklusi. Adsorbsi kromatografi muncul dari interaksia antara zat terlarut dengan

permukaan fase diam. Kromatografi partisi melibatkan fase diam berbentuk cair yang

bercampur dengan pelarut dan dilapisi oleh suatu bahan yang inert. Kromatografi pertukaran

ion memiliki fase diam ionic yang berbeda dengan ion pada sampel. Teknik yang digunakan

itu berdasarkan pada ionisasi sampel tersebut. Semakin kuat muatan sampel,akan semakin

kuat pula daya tarik pada fase diamnya sehingga akan memerlukan waktu lebih lama untuk

mengelusi sampel tersebut dari kolom. Ukuran eksklusi adalah yang paling sederhana, seperti

skrining sampel berdasarkan ukuran molekul. Fase diam terbuat dari bahan yang ukuran

porinya sudah terkontrol dengan baik. Partikel yang berukuran kecil akan terperangkap dalam

kolom dan waktu elusinya akan lebih lambat dibandingkan dengan perikel yang berukuran

besar.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

Analisis ketidakmurnian (impurities)

Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)

Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion

Isolasi dan pemurnian senyawa

Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip

Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

Komponen KCKT

Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya

yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan

perangkat komponen pendukung lainnya.

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini

dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus

dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas

pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis. 

Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat

kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade).

Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.

Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat

mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut

yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT

ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen

dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:

1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah

selama percobaan kromatografi

2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah

selama masa kromatografi

Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta

kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-

pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi

isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni,

namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba

tentu tidak mudah dilakukan.Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya,

fase gerak dibedakan menjadi:

1. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan

meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.

2. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan

elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.

Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah

campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal

sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi

atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.

Pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat

terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.Pompa yang digunakan

sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:

1. Pompa dengan tekanan konstan

2. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.

Kolom

Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak

dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

Detektor

Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat

universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan

tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan

spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan

elektrokimia.

Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:

Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible

Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang

sangat kecil

Stabil dalam pengoperasiannya

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom

mikrobar.

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang

luas

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada

beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada

persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti

biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena

hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda

dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan

menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam

untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan

pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram

zat terlarut.

Detektor Spektrofotometri

Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya,

spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan

memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut

dengan sensitivitas yang sangat baik.

Detektor fluorometri

Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

Detektor elektrokimia

Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan

tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga,

dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer,

integrator dan rekorder.

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. TEMPAT DAN TANGGAL

Laboratorium PNA, 23 April 2013.

3.2. ALAT DAN BAHAN

o Seperangkat alat HPLC

o Erlenmeyer

o Vial

o Pipet tetes

o Beker Glass

o Penyaring Membran

o Alat suntik

o Spatula

o Ekstrak sereh

o Methanol

3.3. CARA KERJA

1) Penentuan kondisi alat HPLC: kolom, fase gerak, laju alir, detector, volume

penyuntikan.

2) Sedikit ekstrak dimasukan ke dalam erlenmeyer untuk pengenceran, tambahkan

methanol ±25 ml, kocok hingga ekstrak larut dalam methanol.

3) Siapkan alat suntik yang telah dipasang penyaring membrane, masukan ekstrak yang

telah diencerkan ke dalam vial yang sebelumnya sudah dibilas dengan cairan ekstrak

tersebut. Tutup vial, beri tanda.

4) Tempatkan vial pada alat HPLC. Jalankan alat.

5) Analisis pola kromatogram senyawa sampel.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HASIL

Dilampirkan.

4.2. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kandunan ekstrak sereh

dengan menggunakan metode HPLC (high performance liquid

chromatography). Prinsip kerja HPLC sebenarnya sama dengan prinsip

kerja kromatografi lainnya yaitu memisahkan suatu senyawa dari suatu

campuran. Cara kerja HPLC : Dengan bantuan pompa fasa gerak cair

dialirkan melalui kolom ke detector. Kemudian cuplikan dimasukkan

ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom

terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan

kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut

yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari

kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi

dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom

dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram

kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak

menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat

digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan

serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

HPLC memiliki dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak

yang digunakan yaitu methanol, karena methanol mempunyai kepolaran

yang tinggi sehingga diharapkan mampu menarik senyawa yang

terkandung dalam ekstrak tersebut. Fasa diam yang digunakan berupa

kolom, yang di dalamnya berisi silica yang telah dibuat menjadi bersifat

non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada

permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.

Karena silica yang digunkan bersifat non polar sehingga senyawa yang

terelusi lebih dahulu yaitu senyawa yang polar sedangkan senyawa yang

non polar akan keluar lebih lama melalui kolom karena berinteraksi

dahulu dengan silica, adanya gaya tarik menarik dengan gugus

hidrokarbon pada silica karena adanya gaya van der waals.

Sebelum pengukuran dan identifikasi dilakukan dahulu penyiapan

larutan baku dari ekstrak sereh. Pada pembuatan larutan baku ekstrak

sereh, dibuat dengan melarutkan ekstrak sereh dengan menggunakan

pelarut metanol. Diencerkan baku tersebut dengan konsentrasi 100 ppm.

Setelah itu masukkan kedalam vial volumenya 20 µl seharusnya sebelum

dimasukkan kedalam vial disaring terlebih dahulu dengan penyaring

membrane 0,45µm.

Digunakan detektor UV-Vis, detektor ini mampu memberikan

kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang

berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu

kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat

ditampilkan. Waktu yang kita guneakan untuk HPLC yaitu 30 menit.

Panjang gelombang yang kami gunakan yaitu dicari berdasarkan

literature yaitu 254 nm dan 280 nm. Ketika menggunakan panjang

gelombang 254 hasil kromatogram yang didapatkan jelek yaitu ada peak

yang menurun. Ketika digunakan panjang gelombang 280 didapatkan

satu senyawa namun waktu retensinya tidak terdeteksi karena

kemungkinan kadar senyawa tersebut sangat kecil. Karena banyak

kemungkinan-kemungkinan kesalahan yang terjadi. Diantaranya :

Pada saat mengencerkan larutan baku tidak sesuai dengan

seharusnya yaitu 100 ppm. Sehingga detektor tidak dapat membaca

atau mengetahui kandungan apa saja yang ada di dalam ekstrak sereh

tersebut (human error).

Setelah dilakukan pengenceran seharusnya disaring terlebih dahulu

sebelum memasukkannya kedalam vial. Tetapi kami tidak melakukan

penyaringan dan langsung dimasukkan kedalam vial. Sehingga banyak

pengotor yang masih tersisa didalam vial tersebut dan banyaknya

pengotor yang terdeteksi didalamnya.

Kurangnya pengetahuan tentang panjang gelombang yang seharusnya

digunakan untuk mendeteksi kandungan sereh sehingga banyak

senyawa-senyawa yang tidak terdeteksi.

BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

5.1. Saran

DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Gholib.2007. Kimia Farmasi Analisa. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Kupiec, Tom. 2004. Quality-Control Analytical Method : High Performance Liquid

Chromatography. International Journal of Pharmaceytical Compounding Vol. 8.

Oklahoma City

Sastrohamidjojo, Harjono. 2005. Kromatografi.Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.