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104

Beuth Hochschule für Technik Berlin, Fachbereich II (Mathematik-Physik-Chemie) Studiengang Pharma- und Chemietechnik Prof. Dr. H. Hungerbühler Praktikum Physikalische Chemie Praktikumsordnung 1. Vorkolloquien/ Verhalten im Labor Am Versuchstag werden zum jeweiligen Ver-such stichpunktartig Fragen gestellt sowie die schriftlich zu beantwortenden Fragen im La-borjournal kontrolliert. Bei ungenügender Vor-bereitung wird der/die Studierende von diesem Versuch ausgeschlossen und hat einen Nach-holversuch. Das praktische Verhalten im Labor geht in die Vorbereitungsbeurteilung mit ein. 2. Laborjournal / Deckblatt / Testate Jede/r Studierende hat ein gebundenes und durchnummeriertes Laborjournal zu führen. Darin sind alle Messwerte eines Praktikums-versuches, sowie Berechnungen, Versuchs-aufbauten und zu beantwortende Fragen, von jedem Mitglied in der Gruppe zu notieren. Die Bewertung der Laborjournale geht in die Vor-bereitungsbeurteilung mit ein. Das ausgeteilte Deckblatt mit den aktuellen Messwerten wird nach Überprüfung der Messwerte und des Messplatzes testiert. 3. Protokolle (siehe im Netz: „Hinweise zum Protokoll“) Jede/r Studierende hat ein Protokoll pro Prak-tikum selbständig zu erstellen, die restlichen Versuche werden als Gruppenprotokolle ange-fertigt. Alle diese Dokumente beginnen mit dem testierten Deckblatt und sind am Ende mit Datum und Unterschrift/en zu versehen. Die Protokolle sind gemäß den Hinweisen zum Protokoll zu erstellen. Bei einer Wiedervorlage werden 0,3 Anteile von der Note abgezogen Die grundsätzliche Gliederung beinhaltet:

Deckblatt Inhaltsverzeichnis: Symbolverzeichnis Einleitung Grundlagen Versuchsaufbau und Methoden Ergebnisse und Diskussion Fehlerberechnung Zusammenfassung Literaturverzeichnis Optional: Anhang

Wichtiger Hinweis: Bereits existierende Berichte/Protokolle oder Textteile, die auf Datenträgern gespeichert sind, werden keinesfalls als selbstständig ver-fasste Arbeiten akzeptiert (Plagiate), sondern als Betrug zurückgewiesen und in schweren Betrugsfällen mit dem Praktikumsausschluss geahndet und kann bis zur Exmatrikulation führen. 4. Nachholtermin Bei einmaligem Fehlen an einem Praktikums-tag (Fachgespräch nicht bestanden oder Krankheit mit Beleg) wird ein Nachholtermin angeboten. 5. Bewertung und Abschlussklausur Die für alle Praktikumsteilnehmer einheitliche Labor-Abschlussklausur findet am Ende der Vorlesungszeit statt und kann nicht als Nach-klausur in das folgende Semester verschoben werden. Die Praktikumsnote ergibt sich durch arithmetrische Mittelung beider Teilnoten aus Summe Protokoll (30%), Gruppen-Protokolle (10%), Beantwortung von Fragen, Führung der Laborjournale und Verhalten im Labor (10%) und Klausur (50%). Zur Klausur darf nur ein Taschenrechner, ein Stift und eine handge-schriebene Formelsammlung im Umfang von maximal 4 Seiten (2 Blätter) verwendet wer-den. Die Zulassung zur Klausur ist an folgende Voraussetzungen geknüpft: 1.) Teilnahme an allen Praktikumsplätzen 2.) Die Beurteilung aller Protokolle muss je-

weils mindestens ein ausreichend (4,0) er-geben.

Ergibt die Gesamtnote aller Einzelleistungen kein ausreichend (4,0) muss das Praktikum im nächsten Jahr neu belegt werden. Sommersemester 2018. Stand: 27.03.2018

ATL – 1

1

Trennung einer Alkaloidmischung mit der Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)

1. Aufgabenstellung 1.1. Optimierung der Trennung eines wässerigen Coffein-Theobromin-Theophyllin-Gemisches über die

Eluentenzusammensetzung und deren Fließgeschwindigkeit

1.2. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Komponente über externe und interne Kalibrierung

2. Theoretische Grundlagen 2.1. Chromatographie

Chromatographie ist die allgemeine Bezeichnung für Trennmethoden, mit denen Substanzgemische

durch multiplikative Verteilungsvorgänge zwischen zwei nicht mischbare Phasen, einer ortsfesten

stationären Phase und einer strömenden mobilen Phase, in ihre Komponenten getrennt werden.

Das zu trennende Gemisch befindet sich zu Beginn der Chromatographie homogen gelöst in der

mobilen Phase. Eine mögliche Einteilung der unterschiedlichen chromatographischen Verfahren lässt

sich entsprechend der Aggregatzustände der Phasen vornehmen (Tab. 1).

Mobile Phase Stationäre Phase Verfahren Trennprinzip flüssig (liquid) fest (solid) LSC (liquid-solid-chrom.) Adsorption

flüssig (liquid) flüssig (liquid) LLC (liquid-liquid-chrom.) Verteilung

gasförmig (gaseous) fest (solid) GSC (gas-solid-chrom.) Adsorption

gasförmig (gaseous) flüssig (liquid) GLC (gas-liquid-chrom.) Verteilung

Tab. 1: Mögliche Einteilung chromatographischer Verfahren

Weitere Einteilungen richten sich nach den Ausführungstechniken wie Säulen-, Dünnschicht, Papier-

oder Kapillargaschromatographie oder andere nach den zugrunde liegenden physikalisch-chemischen

Vorgängen wie Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Affinitäts- oder Molekülausschluss-

chromatographie. Verteilungschromatographie meint hier im engeren Sinne die unterschiedliche

Verteilung der zu trennenden Komponenten zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen nach

dem NERNST`schen Verteilungsgesetz (in der GC auf der Basis des RAOULT und HENRY`schen

Gesetzes).

2.2. Physikalisch-chemische Grundlagen

In der Säulenchromatographie (HPLC) sind die physikalisch-chemischen Vorgänge hauptsächlich

Adsorption (Adsorptionschromatographie) an der Oberfläche einer festen stationären Phase und

Verteilung (Verteilungschromatographie) zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen. Diese

beiden Vorgänge treten allerdings nie in „reiner Form“ auf. Lösungs- oder Fließmittelmoleküle werden

ebenso wie die einzelnen zu trennenden Komponenten mehr oder weniger stark an der festen Phase

adsorbiert und bilden damit eine stationäre Flüssigkeit aus. Unabhängig von den physikalisch-

ATL – 1

2

chemischen Vorgängen, kommt es immer zu einer Verteilung der zu trennenden Stoffe zwischen

mobiler und stationärer Phase.

2.2.1. Adsorption

Adsorption ist die Anlagerung eines Stoffes aus der mobilen Phase an die Oberfläche der festen

stationären Phase. Man unterscheidet prinzipiell zwei unterschiedliche Adsorptionsvorgänge nach der

Stärke der Wechselwirkung: physikalische Adsorption = Physisorption mit Adsorptionsenthalpien

(freiwerde Bindungswärmen) zwischen 8 und 40 kJ/mol und chemische Adsorption = Chemisorption

mit Werten zwischen 80 und 600 kJ/mol. Vorraussetzung für den chromatographischen Prozess ist

natürlich die Reversibilität der Adsorption, d.h. die adsorbierten Stoffe müssen wieder unzersetzt

desorbiert werden können. Das Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht ist dabei eine Funktion der

Temperatur, der Konzentration des adsorbierten Stoffes und dem Verhältnis von adsorbierter Masse

zur Gesamtmasse an festem Adsorbens. Bei konstanter Temperatur sind diese beiden Adsorptions-

prozesse durch zwei Adsorptionsisothermen (1) und (2) beschreibbar und in Abb.1a grafisch darge-

stellt:

physikalische Adsorption nach FREUNDLICH: 1

nx= a c

m (1)

chemische Adsorption nach LANGMUIR: c

c b

max

x x=

m (2)

mit: m = Gesamtmasse an Adsorbens (stationäre Phase)

x = adsorbierte Masse

xmax = maximal adsorbierte Masse

c = Konzentration des Stoffes in der mobilen Phase

a,b,n = Konstanten, abhängig von Oberfläche, Eigenschaften adsorbierter Stoff, Lösemittel

Abb. 1: Y-Achse = stationäre Phase; x-Achse = mobile Phase; (a) Verlauf der Adsorptionsisothermen

nach FREUNDLICH und LANGMUIR; (b) Trennung zweier Komponenten A und B aufgrund unter-

schiedlicher Adsorptionsisothermen (aus Lit.1)

(a) (b)

ATL – 1

3

Konsequenzen für die chromatographische Praxis ergeben sich aus Abb.1:

1. Es muss im linearen Bereich der Adsorptionsisothermen gearbeitet werden, also bei kleinen

Stoffkonzentrationen in der mobilen Phase, weil sonst die stationäre Phase überladen wird.

2. Trennung ist nur möglich, wenn die Steigungen der Adsorptionsisothermen der jeweiligen Stoffe A

und B unterschiedlich groß sind. Bei steilem Kurvenverlauf hält sich die Komponente A vorwiegend in

der stationären Phase auf und erscheint im Chromatogramm später im Gegensatz zur Komponente B.

2.2.2. Verteilung

Die Grundlage bildet hier die unterschiedliche Löslichkeit von Stoffen in zwei miteinander nicht

mischbaren flüssigen Phasen (vgl. Scheidetrichter) und wird durch das NERNST`sche Verteilungs-

gesetz (3) beschrieben:

statx

mob

cK =

c oder xstat mobc = K c (3)

mit cstat = Konzentration (genauer Aktivität) des Stoffes x in der stationären Phase

cmob = Konzentration (genauer Aktivität) des Stoffes x in der mobilen Phase und

Kx = NERNST`scher Verteilungskoeffizient des Stoffes x

Die Verteilungsisothermen (T = konst.) zweier Stoffe A und B sind in Abb. 2 dargestellt. Ändert sich

die Temperatur, dann ändert sich natürlich der jeweilige Verteilungskoeffizient K. Eine Trennung der

beiden Stoffe A und B ist wie bei der Adorptionschromatographie nur möglich, wenn sich die

Verteilungskoeffizienten (Steigungen) von KA und KB unterscheiden. Bleibt K nicht konstant, dann

treten Abweichungen vom linearen Verhalten auf und die entsprechenden Peaks im Chromatogramm

werden unsymmetrisch (siehe Abb. 8b)

cmob

B

A

2.3. Chromatographischer Vorgang

Zur Optimierung der Trennung eines Stoffgemisches werden bei der Flüssigchromatographie die

mobile (Fließmittel) und die stationäre (Adsorbentien) Phase sowie die Fließgeschwindigkeit (Flow)

der mobilen Phase variiert. Die Temperatur wird hier konstant gehalten (im Gegensatz zu GC) Die

HPLC-Apparatur ist in Abb. 3 dargestellt. Zur Durchführung einer chromatographischen Trennung

muss die mobile Phase (Fließmittel mit homogen gelösten zu trennenden Komponenten) an der

stationären Phase vorbeibewegt werden. In der HPLC werden auf Grund der dicht gepackten Säulen

hierfür Pumpen verwendet mit Drücken bis 400 bar und Fließgeschwindigkeiten von 0,1 bis 10 mL/min

Das zu trennende Stoffgemisch wird im laufenden Fließvorgang über ein Sixportventil (Abb. 4) durch

Umlegen der mobilen Phase zugeführt.

Abb. 2: Verteilungsisothermen der

Stoffe A und B; Steigungen der

Geraden entsprechen den Vertei-

lungskoeffizienten KA und KB

ATL – 1

4

Abb. 3: HPLC-Apparatur mit Eluentenreservoir (1), Elektromagnetische Mischventile (2), Doppelkol-

benpumpe (3), RHEODYNE-Einspritzventil (4), Detektor (5), RP-Trennsäule (6), Fließmittelgradienten-

Controller (7), Integrator oder PC-Auswertesystem (8) und Abfallbehälter (9)

2.3.1. Stationäre Phasen (Adsorbentien)

Stationäre Phasen in der Adsorptionschromatographie reichen von Saccharose, Zellulose (Papier),

Magnesiumsilikat (Floresil), Magnesiumoxid, Aluminiumoxid usw. bis hin zu Kieselgel. Kieselgel ist

heute das am meisten verwendete Adsorbens und ist technisch in sphärischer Gestalt und enger

Korngrößenverteilung bis hin zu Korngrößen von 3 m Durchmesser verfügbar. Eine enge Verteilung,

hohe mechanische Stabilität und geringes Quellverhalten des Materials ist Vorraussetzung für eine

optimale Säulenpackung. Kieselgel wird aus Kieselsäure Si(OH)4 oder Natriumsilikat bei pH 4 durch

vorsichtige Dehydratisierung bei Temperaturen bis 300o C hergestellt, > 400o C Quarzbildung.

Normalphasiges Kieselgel ist porös und enthält viele polare OH-Gruppen an der Oberfläche. Werden

diese OH-Gruppen chemisch mit Alkyl-dimethyl-chlorsilanen umgesetzt, werden die polaren OH-

durch Alkyl-dimethyl-silan-Gruppen ersetzt und ergeben unpolare Adsorbentien, sogenannte

Umkehrphasen mit unterschiedlichen Alkylresten z.B. R = Methyl, Octyl oder Octadecyl:

R-Si(CH3)2-Cl + (Si-O-Si)x-OH (Si-O-Si)x-O-Si(CH3)2-R + HCl

Die Verwendung von Umkehrphasen (engl.: Reversed Phase) ermöglicht das Arbeiten mit wässerigen

und polaren Löse- und Fließmitteln und hat eine breite Anwendung für Trennungen in der Biochemie

und Pharmazie gefunden.

(a) (b) Abb. 4: 6-Wege-Probenaufgabe-

ventil (Sixportventil): (a) Füllen der

Probenschleife, Stellung LOAD; (b)

Überführung der Probe auf die

Säule, Stellung INJEKT (Injektion)

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5

2.3.2. Mobile Phasen (Fließ-, Lösungsmittel oder Eluenten)

Die Grundlage bildet hier die sogenannte eluotrope Reihe der Fließmittel in Abhängigkeit von der

stationären Phase auf der Basis der Adsorptionsisothermen. Wasser wird sehr gut an Kieselgel

(hydrophil) adsorbiert und besitzt daran eine hohe Elutionskraft (eluieren = auswaschen), an Kieslegel

mit Umkehrphase (hydrophob) dagegen wird Wasser abgewiesen. Die eluotrope Reihe an polarem

Al2O3 ist in Abb. 5 dargestellt, für RP-Adsorbentien dreht sich diese Reihe praktisch um.

2.3.3. Detektoren

Bei allen HPLC-Detektoren wird das Eluat nach dem Verlassen der Trennsäule durch eine

Durchflusszelle geleitet, in der die Änderungen einer physikalischen Eigenschaft bei Anwesenheit von

Komponenten im Fließmittel gemessen wird. Diese wird in Form eines elektrischen Signals an ein

Datenerfassungs- und Auswertesystem übertragen und als Chromatogramm aufgezeichnet. Man

unterscheidet zwischen selektiven und universellen Detektoren. Zu den selektiven gehören UV-,

Fluoreszenz-, elektrochemische und vor allem massenspektrometrische Detektoren, ein universeller

ist der Brechungsindex-Detektor. Der gebräuchlichste Detektor ist der UV-Detektor, der die

Lichtabsorption im Bereich von 200-400 nm misst. Ein Photodiodenarray-Detektor ist ein UV-Detektor,

der nicht nur die Absorption bei einer Wellenlänge misst, sondern gleichzeitig das gesamte UV-

Spektrum erfassen kann (siehe Abb. 6). Dieser Detektor eignet sich sehr gut zur Methoden-

entwicklung. Der empfindlichste Detektor ist der Fluoreszenz-Detektor.

Abb. 5: Eluotrope Reihe einiger

Fließ- und Lösungsmittel an

polarem Adsorbens Al2O3 mit

Dielektrizitätskonstanten , dynamische Viskositäten und

Oberflächenspannungen (in

mN/m

ATL – 1

6

2.3.4. Chromatogramme

Das Ergebnis einer chromatographischen Trennung wird als Chromatogramm dokumentiert (Abb. 7).

Abb. 8: (a) Symmetrischer GAUß-Peak mit den entsprechenden Daten und (b) asymmetrischer Peak

mit den Asymmetriefaktor- Berechnungsdaten in 10% Peakhöhe

Abb. 7: Chromatogramm mit symme-

trischen Peaks und den Retentions-

zeiten: Totzeit tm, Bruttretentionszeit tms

und Nettoretentionszeit ts (Index m =

mobil, s = stationär); Basisbreite W

(a)

(b)

Abb. 6: 3-Dimensionales Chroma-

togramm eines UV-Photodioden-

array-Detektors (aus Lit.1)

ATL – 1

7

Es bildet die Grundlage zur Auswertung der Trennung und Berechnung der chromatographischen

Kenngrößen: Retensionszeiten t, Peak-Basisbreiten W, Asymmetriefaktoren AF (Abb.8b), Kapazitäts-

faktoren k, Trennfaktoren r, Auflösung R, Trennstufenzahl N und Bodenhöhe H.

Die chromatographischen Kenngrößen berechnen sich aus dem Chromatogramm wie folgt:

Nettoretentionszeit t s: t s = t ms – t m (4)

Asymmetriefaktor AF: 0,1

0,1

bAF =

a (5)

mit AF > 1 (Tailing); AF = 1 (symmetrisch); AF < 1 (Fronting)

Kapazitätsfaktor k: s

m

tk =

t (6)

Trennfaktor r( ): s

s

t "k"r = =

k' t ' (mit k`` > k` ) (7)

Auflösung Rs zwischen 2 Peaks: ms ms s ss

0,1 0,1 0,5 0,5

t " - t ' t " - t 'R = 2 = 1,177

W " + W ' W " + W ' (8)

Theoretische/effektive Trennstufen- oder Bodenzahl N / Neff :

2 2

ms seff

0,1 0,1

t tN = 16 ; N = 16

W W (9)

Sind die Peaks asymmetrisch, wird folgende Gleichung verwendet:

2 2

ms seff

0,5 0,5

t tN = 5,54 ; N = 5,54

W W (10)

Trennstufen- oder Bodenhöhe H: effeff

L LH = bzw. H =

N N (11)

(L = Länge der Chromatographiesäule)

Asymmetrische Peaks führen zur Überlappungen und haben unterschiedliche Ursachen:

Stoffgemischkonzentration ist zu groß und damit Überladung der stationären Phase; langer Gebrauch

der Chromatographiesäule führt zur Veränderung und Abnutzung der stationären Phase; unvoll-

ständige homogene Lösung des Stoffgemisches in der mobilen Phase; Fließgeschwindigkeit der

mobilen Phase zu groß und Störung des Adsorpions-Desorptions- bzw. Verteilungsgleichgewichtes

(siehe Abb. 9).

ATL – 1

8

cm

(a)

(b)

(c)

cm

cs

cs

cs

cm

2.3.5. Dynamische Theorie

In der dynamischen Theorie wird der aus der Bodentheorie (fraktionierte Destillation) stammende

Begriff Boden- oder Trennstufenhöhe mit der Fleißgeschwindigkeit der mobilen Phase anschaulich zur

VAN DEEMTER-Gleichung verknüpft. Gleichung (12) stellt die einfachste Formulierung dar (Abb. 10):

B

H = A + + C uu

(12)

Die Konstante A ist von u unabhängig und berücksichtigt die Streudiffusion, welche zu einer

Peakverbreiterung führt. In A steckt der Partikeldurchmesser und eine Konstante, die die Unregel-

mäßigkeit der Säulenpackung berücksichtigt.

Der B-Term berücksichtigt die Molekulardiffusion in Längsrichtung der Trennstrecke und hängt vom

Diffusionskoeffizienten der mobilen Phase sowie vom sogenannten Labyrinthfaktor ab. Der C-Term

berücksichtigt Störungen der Gleichgewichtseinstellung zwischen mobiler und stationärer Phase,

Abb. 9: (a) symmetrischer Gauß-Peak;

(b) Tailing, Stoff hält sich vermehrt in

der mobilen Phase auf;

(c) Fronting, nun wechselwirkt der Stoff

verstärkt mit stationärer Phase (Lit.1)

Abb. 10: Grafische Darstellung der VAN

DEEMTER-Gleichung (12), zusammen mit

den einzelnen Term-Summanden;

Abhängigkeit der Bodenhöhe H (hier h) in

mm von der Fließgeschwindigkeit u in

cm/s: A bleibt konstant, B nimmt

hyperbolisch ab und C steigt linear an; die

optimale Fließgeschwindigkeit uopt (umin)

entspricht der kleinsten Bodenhöhe Hmin;

1. Ableitung der Gleichung (12):

dH/du = 0 ergibt: uopt = B/ C (aus Lit.1)

ATL – 1

9

sogenannter Massenübergangsterm. Hier spielt u.a. der Diffusionskoeffizient zwischen der mobilen

und stationären Phase eine große Rolle (Abb. 11).

Aus Gleichung (12) wird sofort ersichtlich, dass bei Erhöhung der Fließgeschwindigkeit der B-Term

hyperbolisch kleiner wird, jedoch der C-Term ungünstigerweise linear zunimmt. Die Optimierung einer

chromatographischen Trennung beinhaltet also auch die Bestimmung der optimalen

Fließgeschwindigkeit uopt d.h. Auffindung der kleinsten Bodenhöhe oder entsprechend Gleichung (11)

der größten Bodenzahl.

2.3.6. Quantitative Auswertung

Nach Zuordnung der einzelnen getrennten Peaks zu den jeweiligen Komponenten werden die Flächen

integriert und nach Kalibrierung über die erhaltene Kalibrierfunktion (Regressionsrechnung mit

EXCEL) z.B. y = ax + b in die Analysenfunktion x = y/a – b/a umgestellt mit y = Fläche F der

Einzelkomponente und x = Konzentration c. Diese Kalibrierung nennt man externe Kalibrierung, da

kein interner Standard zugemischt wurde. Bei Zumischung eines immer gleichkonzentrierten internen

Standards wird bei der Auswertung immer auf die Fläche Fis dieser internen Standardkomponente

bezogen und natürlich ebenso auf die Konzentration cis gemäß Gleichung (13). Durch diese interne

Kalibrierung wird man unabhängig vom aufgegebenen Probenvolumen.

Fi / Fis = f ( i / is ) (13)

mit Fi = Fläche der Komponente i; Fis = Fläche der internen Standardkomponente; i =

Massenkonzentration der Komponente i; is = Massenkonzentration der internen

Standardkomponente, f = Steigung der Kalibriergeraden (Responsefaktor).

Die Analysenfunktion wird dann nach i umgestellt und ergibt die gesuchte Konzentration der

unbekannten Probe nach Bestimmung der Flächen. Die Auswertung über die Höhen an Stelle der

Flächen wird heute eher selten durchgeführt.

Abb. 11: Schematische Darstellung der

Ursachen von Peakverbreiterungen, (a)

Streudiffusion durch Parikelbestandteile, A-

Term; (b) Molekulardiffusion in Längs-

richtung, B-Term; (c) Probenbestandteile

werden in der nahezu ruhenden mobilen

Phase von nicht-durchströmten Poren nicht

weitertransportiert und können nur durch

Diffusion wieder in die fließende mobile

Phase gelangen (aus Lit.1)

ATL – 1

10

2.4. Literaturhinweise (in der PC-Bibliothek vorhanden)

1) H. Naumer, W. Heller, Untersuchungsmethoden in der Chemie, Thieme Verlag 1990. 2. Auflage

2) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996

3) G. Aced, H. J. Möckel, Liquidchromatographie, VCH-Verlag, 1991

4) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995

5) K. K. Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1: Leitfaden für Anfänger und Praktiker, GIT Verlag 1989

2.5. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!)

1) Welche Zeiten beschreiben den Aufenthalt einer Komponente ausschließlich in der mobilen bzw. in

der stationären Phase ?

2) Wie kann man die Totzeit einer chromatographischen Anlage mit einer unpolaren bzw. polaren

stationären Phase am besten bestimmen? Warum ist die Bestimmung von tm immer unsicher?

3) Wie lassen sich einerseits Peakverbreiterungen und anderseits asymmetrische Peaks

beschreiben?

4) Formulieren Sie die Analysenfunktion der internen Kalibrierung.

5) Welcher Vorteil bietet der Kapazitätsfaktor k im Vergleich zur Nettoretentionszeit ts?

3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien

High-Pressure-Liquid-Chromatograph (MERCK-HITACHI; Nr. 655A)

UV-Detektor (MERCK-HITACHI; Nr. 655A-22);

Gradientensteuergerät (Controller) (MERCK-HITACHI, Nr. L-6200);

Rechnerauswertesystem Elite EZChrom

3 Maßkolben (1000 mL), 5 Maßkolben (100 mL), 3 Büretten (50 mL), 3 Stative mit Bürettenklammem,

1 Spritze (mL) für die HPLC Apparatur, 3 kleine Trichter

Anmerkung: Alle Chemikalien werden erst nach Rücksprache entsorgt.

Lösemittel: Bidest. Wasser;

Methanol-Lichrosolv (MERCK-Nr. 6007);

Substanzen:

Coffein, z.A. (MERCK-Nr. 2583); (Coffein) = 100 mg/L;

Theobromin z.A. (FLUKA-AG-Nr. 88304); (Theobromin) = 100 mg/L;

Theophyllin z.A. (ROTH-Nr. 3380); (Theophyllin) = 100 mg/L;

3.2. Vorbereitung der Messlösungen Aus den drei Stammlösungen, die jeweils 100 mg/L Alkaloid enthalten, werden 5 Kalibrierlösungen mit

Konzentrationen von 5 - 25 mg/L hergestellt. Als interner Standard wird eine der Stammlösungen mit

10 mg/L in jeden der 5 Kalibrierkolben pipettiert. Bevorzugt Theophyllin. Z.B. 5 mg/L Coffein, 5 mg/L

Theobromin und 10 mg/L Theophyllin für die erste Konzentration der Kalibrierreihe. Den

Kalibrierlösungen wird noch zusätzlich jeweils 5 ml einer 2 g/L Thioharnstofflösung zur Ermittlung der

Totzeit / Mobilzeit ( tm) hinzugesetzt. Anschließend werden die Maßkolben dann mit Chromatographie-

Wasser aufgefüllt.

ATL – 1

11

3.3. Inbetriebnahme der Geräte und Probenaufgabe Die Inbetriebnahme erfolgt in Gegenwart des Assistenten in folgender Reihenfolge:

1. UV-Detektor (Wellenlänge auf = 273 nm einstellen);

2. Chromatograph;

3. Gradientencontroller;

4. Rechneraufnahme- und Auswertesystem Elite EZChrom vom MERCK

3.3.1. Probenaufgabe

Die Probe wird mit der Spritze am RHEODYNE - Injektorblock (Stellung LOAD, vhl. Abb. 4) so

eingespritzt, dass die 20 μL - Schleife ausreichend gespült werden kann. Dann wird der Injektorhebel

auf INJEKT umgelegt. Wichtig ist ein schnelles Umlegen des Injektorhebels. Nach dem Umlegen des

Hebels auf Injekt, startet der angeschlossene Integrator bzw. das Rechnerauswertesystem

automatisch. Die Einstellungen am Integrator und am Rechner sind bereits voreingestellt und müssen

nur nach Bedarf verändert werden.

3.4. Erste Teilaufgabe: Trennoptimierung

Die Elutionsbedingungen werden über der MANUAL-Status am Controller eingegeben. Ein

Gradientenprogramm wird nicht erstellt, da im vorliegenden Fall isokratisch, d.h. mit konstanter

Eluentenzusammensetzung gearbeitet wird.

Die Durchflußrate wird bei einer Eluentenzusammensetzung von

A=50% (MeOH); B=50% (H2O); C=0% mit 0,7 mL/min bis 1,5 mL/min in 0,2 mL/min-Schritten

variiert.

Überlegen Sie sich zu Beginn, in welcher Reihenfolge die Alkaloide im Chromatogramm erscheinen

werden an Hand der Strukturformeln. Als Messlösung wird die Lösung eingesetzt, in welcher alle drei Alkaloide in der gleichen

Stoffmengenkonzentration vorliegen. (d.h. die Lösung mit je 10 mg/L für Theobromin, Theophyllin und

Coffein). Ist die HPLC-Apparatur messbereit, kann unter Anleitung des Assistenten bei einem Flow

von 0,7 mL/min das erste Chromatogramm gefahren werden. Die Messungen werden mit steigendem

Flow solange wiederholt, bis die einzelnen Peaks überlappen und nicht mehr getrennt sind.

3.3. Zweite Teilaufgabe: Kalibrierung Nach Rücksprache und Diskussion der HPLC-Chromatogramme aus der ersten Teilaufgabe ist der

optimale Flow einzustellen. Bei diesem Wert werden alle fünf Kalibrierlösungen unter isokratischen

Bedingungen, d.h. die Fließmittelzusammensetzung bleibt konstant, als Doppelbestimmung chromato-

graphiert. Messungen, bei denen die Peaks von Substanzen mit konstanten Mengen ganz vom Mittel

abweichen, sind zu wiederholen.

3.5. Dritte Teilaufgabe: quantitative Bestimmung einer unbekannten Probe (X-Probe)

Die unbekannte X-Probe ist mit Chromatographie-Wasser entsprechend aufzufüllen und im

Messprotokoll zu dokumentieren. Der X-Probe wurde ebenfalls zur Ermittlung der Totzeit tm 5 mL der

2 g/L konzentrierten Thioharnstoff-Lösung hinzugefügt. Im Chromatogramm erscheint der Thioharn-

stoff-Peak noch vor den drei Substanz-Peaks. Thioharnstoff geht mit der stationären Phase keine,

oder nur geringe Wechselwirkungen ein und fließt mit der mobilen Phase ungehindert durch die

HPLC-Apparatur. Das Absorptionsmaximum von Thioharnstoff liegt ebenfalls bei ca. 273 nm.

ATL – 1

12

4. Auswertung 4.1. Bestimmung der chromatographischen Kenngrößen

Aus dem optimierten Chromatogramm sind für jede der drei Alkaloidkomponenten folgende

Messgrößen zu ermitteln (vgl. Abbn. 7 und 8):

tms = Bruttoretentionzeit

tm = Totzeit, Durchbruchzeit

ts = Nettoretentionszeit

h = Peakhöhe

W 0.1 = Basisbreite der Peaks bei 0,134 h

W 0.5 = Basisbreite der Peaks bei 0,5 h

a 0,1 ; b 0,1 = Asymmetrieabschnitte bei 0,134 h

und daraus nach Abschnitt 2.3.4 die folgenden chromatographischen Kenngrößen zu berechnen:

k = Kapazitätsfaktor

AF = Asymmetriefaktor

r () = Trennfaktor

R = Auflösung

N = Trennstufenzahl (theoretisch)

H = Bodenhöhe (theoretisch);

4.2. Anwendung der VAN DEEMTER-Gleichung

Aus den Optimierungsversuchen 3.4 sind von allen drei Alkaloiden bei den fünf Fließgeschwindig-

keiten die grafische Darstellung –Bodenhöhe H gegen Flow u in mL/min- (vgl. Abb. 10) in einer

Abbildung für alle drei Komponenten anzufertigen, Die optimale Bodenhöhe Hopt und die optimale

Fließgeschwindigkeit uopt ist für jede Komponente anzugeben, gemittelt ergibt sich uopt für die

Mischung.

4.3. Quantitative Bestimmung

4.3.1. Methode des externen Standards

Für jede einzelne Alkaloidkomponente wird bei den 5 Konzentrationen eine Regressionsrechnung mit

EXCEL durchgeführt: Flächen Fi gegen Konzentrationen i. Die jeweilige Geradengleichung ist die

Kalibrierfunktion. Die Fläche der X-Probe Fx wird in die entsprechende Analysenfunktion eingesetzt

und x berechnet (vgl. Kapitel 2.3.6).

4.3.2. Methode des internen Standards

Auswertung wie zuvor, nur wird jetzt jeweils auf die Fläche Fis und Konzentration is bezogen gemäß

Gleichung (13). Nach Umstellung in die entsprechende Analysenfunktion werden die Flächen Fi und

Fis sowie i eingesetzt und x wird berechnet.

4.4. Diskussion der Ergebnisse

- War Ihre im Labor getroffene Entscheidung zur Wahl optimalen Betriebsbedingungen für das

untersuchte System richtig?

- Wie weichen die Ergebnisse der quantitativen Bestimmungen voneinander ab?

- Welche Bestimmungsmethode ist aufgrund der Versuchsergebnisse vorzuziehen?

- Welche weiteren Möglichkeiten und Auswertemethoden für die quantitative Analyse sind in der

Chromatographie noch gebräuchlich?

Stand: 10.05.17

ATL – 2

1

Trennung und quantitative Bestimmung ausgewählter Kohlenwasserstoffe am Gaschromatographen

1. Aufgabenstellung 1.1. Optimierung der gaschromatographischen Trennung ausgewählter Kohlenwasserstoffe bei

verschiedenen Temperaturen an Hand aufgezeichneter Gaschromatogramme

1.2. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Komponente über interne Kalibrierung

2. Theoretische Grundlagen Eine allgemeine Einführung in die Chromatographie ist im Versuch ATL-1 unter Kapitel 2.1 gegeben.

2.1. Physikalisch-chemische Grundlagen

Im Gegensatz zur Flüssigchromatographie (ATL-1) liegt die mobile Phase hier im gasförmigen

Zustand vor, in Form des Trägergases zusammen mit den gasförmigen Komponenten. Das zu

trennende Probengemisch muss also möglichst unzersetzt verdampfbar sein. Die Wechselwirkung

zwischen den Molekülen des Trägergases und dem Dampf der Probenkomponenten, sowie zwischen

Trägergas und stationärer Phase sind vernachlässigbar klein. Das Trägergas besitzt also im

Gegensatz zu Fließmitteln bei der Flüssigchromatographie keinerlei Eluenskraft (eluieren = aus-

waschen). Eine gaschromatographische Trennung erfolgt praktisch ausschließlich durch Wechsel-

wirkung der Probenmoleküle mit der stationären Phase und wird durch Temperaturänderung

maßgeblich beeinflusst. Häufig verwendete Trägergase sind Helium, Stickstoff und Wasserstoff.

Wasserstoff hat hierbei die niedrigste Viskosität und erzielt schnellere Resultate als Stickstoff, aller-

dings ist Wasserstoff brennbar, Stickstoff dagegen preiswerter und nicht reaktiv.

2.1.1. Adsorption

Adsorption spielt in der Gaschromatographie hier als GSC (Gas Solid Chromatography) keine große

Rolle, da die Bindung der Probenmoleküle an die Oberfläche des festen Adsorbens alleine wirkt

(Trägergas wechselwirkt praktisch nicht) und die Desorption nur bei höherer Temperatur erfolgt. Die

GSC wird deshalb nur bei Permanentgasen eingesetzt (CO2, SO2, NO2, Edelgase usw.) und versagt

bei größeren d.h. höher siedenden Molekülen, die in der Regel dann nicht unzersetzt wieder

desorbiert werden können. Ansonsten gelten die Gesetze von FREUNDLICH und LANGMUIR auch

hier (vgl. ATL-1).

2.1.2. Verteilung

Die Verteilung der Probenmoleküle zwischen der Gasphase und der flüssigen Phase (polymere

Silikonöle ohne eigenen Dampfdruck) spielt in der Gaschromatographie die größte Rolle. Dabei lösen

sich die Probenmoleküle in der praktisch nicht verdampfbaren flüssigen stationären Phase. Die

physikalische Beschreibung des Verteilungsprozesses kann einerseits durch das RAOULT`sche

Gesetz Gleichung (1) erfolgen, hier wird eine ideale Lösung der flüchtigen Probenmoleküle in einer

nichtflüchtigen stationären Flüssigkeit angenommen (gleicher Substanzklasse). Anderseits lässt sich

die Verteilung auch durch das HENRY-DALTON-Gesetz Gleichung (2) beschreiben, hier wird eine

ideal verdünnte Lösung der Komponenten in der flüssigen Phase vorausgesetzt, was für Gase in

Flüssigkeiten in guter Näherung zutrifft.

ATL – 2

2

o

1 1 1p = p x (1)

mit p1 = Dampfdruck der Probenkomponente 1 über der idealen Lösung

p1o = Dampfdruck der reinen Probenkomponente 1

x1 = Stoffmengenanteil (Molenbruch) der Probenkomponente 1 in der idealen Lösung.

1 11p = K x (2)

mit p1 = Dampfdruck der Probenkomponente 1 über der ideal verdünnten Lösung

K1 = HENRY-Konstante der Probenkomponente 1

x1 = Stoffmengenanteil (Molenbruch) der Probenkomponente 1 in der ideal verdünnten Lösung.

Im Folgenden wird der Ansatz nach RAOULT weiter verwendet. Entstammen die Probenkomponente

1 und die flüssige stationäre Phase 3 nicht der gleichen Stoffklasse (nicht ideale Lösungen), dann

resultieren Wechselwirkungen, die durch den Aktivitätskoeffizienten 1,3 ausgedrückt werden und

entweder eine Erhöhung des Dampfdruckes durch Abstoßung (1,3 > 1) oder eine Erniedrigung durch

Anziehung (1,3 < 1) bewirken (Aktivität a = x1 1,3):

o1 1 1p = p x (3)

Damit wird die lineare Steigung des Verteilungskoeffizienten in Abhängigkeit des steigenden

Stoffmengenanteils x1 erhöht oder verringert, was im Gaschromatogramm als asymmetrische Peaks

gemäß Abb. 1 in Erscheinung tritt.

x1

x1

x1

p1

p1

p1

(a)

(b)

(c)

Gleichung (3) lässt sich umformulieren als Verhältnis des Partialdrucks der Komponente 1 bezogen

auf ihren Stoffmengenanteil in der stationären flüssigen Phase. Damit wird ersichtlich, je größer p1/x1

wird, desto größer ist auch die Geschwindigkeit, mit der Komponente 1 die Säule durchläuft.

Abb. 1: (a) symmetrischer Peak: 1,3 konst.,

bei 1,3 = 1 ideale Lösung; (b) Tailing: 1,3

nimmt mit x1 zu, Probenkomponente 1 wird

von stationärer flüssiger Phase 3

abgestoßen; (c) Fronting: 1,3 nimmt mit x1

ab, entsprechend Anziehung (aus Lit.1)

ATL – 2

3

o11

1

p= p

x (4)

Passieren unter gleichen Bedingungen die beiden zu trennenden Komponenten 1 und 2 (Temperatur

und stationäre Phase gleich), dann lässt sich nach HERINGTON für das Verhältnis der Netto-

retentionszeiten ts1/ts2 Beziehung (5) formulieren:

t

t~

1o

s1 1 1o

2s2 2

2

p

x p=

p p

x

(5)

Die Beziehung von HERINGTON zeigt die beiden prinzipiellen Möglichkeiten der GC auf:

a) Trennung von chemisch sehr ähnlichen Komponenten z.B. von Kohlenwasserstoffen, aber

unterschiedlichen Siedetemperaturen und damit über die Dampdfdrücke po;

b) Trennung von Komponenten gleicher Siedetemperatur aber unterschiedlichen chemischen

Eigenschaften und damit verschiedene Wechselwirkungen mit der stationären Phase über den

Aktivitätskoeffizienten .

Der wichtigste Parameter der GC ist im Gegensatz zur HPLC die Temperatur, da die jeweiligen

Dampfdrücke po der Komponenten über die CLAUSIUS-CLAPEYRON-Gleichung (6) temperatur-

abhängig sind (vgl. PCL1-3):

V

2R T

dlnp H=

dT (6)

Bei Erhöhung der Temperatur der GC-Säule nehmen damit die Dampfdrücke der einzelnen

Komponenten zu, befinden sich damit in höherem Anteil in der mobilen Phase und passieren die

Säule schneller. Bei zu hohen Temperaturen würden sich alle Komponenten in der mobilen Phase

aufhalten und eine Trennung wäre nicht mehr möglich.

2.2. Gaschromatographisches System

Zur Optimierung der Trennung eines Stoffgemisches werden bei der Gaschromatographie die

stationäre (polymere Silikonöle, siehe auch ATL1) Phase sowie die Temperatur der Säule variiert, die

Veränderung des Trägergasdruckes (Flow der mobilen Phase) spielt eine ungeordnete Rolle. Die GC-

Apparatur ist in Abb. 2 dargestellt. Zur Durchführung einer chromatographischen Trennung wird die

mobile Phase (Trägergas mit dem Dampf der zu trennenden Komponenten) durch eingestellten

Trägergasdruck an der stationären Phase vorbeibewegt. Das zu trennende Stoffgemisch wird dem

Trägergas über einen heizbaren Injektorblock durch Einspritzung zugeführt.

ATL – 2

4

Ein komplettes GC-System besteht aus vier Hauptbestandteilen:

Injektor: Damit wird die vollständige Überführung der Probe auf die

Trennsäule gewährleistet. (Probenaufgabe-System) Trennsäule: Dient zur chromatographischen Trennung der Substanzgemische.

Detektor: Eigentliche analytische Messapparatur, die kontinuierlich eine physikalische

Eigenschaft der vorbeifließenden Gasmischung als Messgröße erkennt.

Datenerfassung: (Schreiber, Integrator, Laborrechner): Zeitabhängige Registrierung und

Aufzeichnung des vom Detektor gelieferten elektrischen Signals der

Messgröße (Aufzeichnung des Chromatogramms).

Abb. 2: Blockschema einer gaschromatographischen Apparatur Als Trägergas werden in der Gaschromatographie Stickstoff (N2); Wasserstoff (H2) oder Helium (He)

verwendet. Dieses wird aus einer Druckflasche über eine Regeleinheit bezogen (Druckminderer an

der Stahlflasche & Feinregulierung im Gaschromatographen). Injektoren sind entweder nach der

Gasführungsart oder nach ihrer Heiztemperaturregelung einteilbar. Injektoren nach der

Gasführungsart sind die SPLIT-/SPLITLESS- und ON-COLUMN-Injektoren. Nach der

Temperaturführung eingeteilt, handelt es sich bei den beiden am meisten eingesetzten Injektortypen.

"verdampfende" Injektoren oder um "Kaltaufgabesysteme". Die erstgenannten sollen die Probe

schlagartig verdampfen, so dass die Probe in gasförmigem Zustand schnell und gleichmäßig vom

Trägergas in die Trennsäule transportiert wird. Bei Kaltaufgabesystemen übernimmt die Verdampfung

der GC-Ofen oder ein programmierbares Heizsystem im Injektor. Eine wichtige Voraussetzung für die

GC ist also die Verdampfbarkeit der zu messenden Stoffe. Hochmolekulare, anorganische oder

polymere Stoffe, die selten unzersetzt oder gar nicht in die Gasphase übergehen, können daher nicht

einer GC-Analyse unterzogen werden.

Als Trennsäulen werden heute bevorzugt die sogenannten Kapillarsäulen verwendet. Kapillarsäulen

zeichnen sich durch eine extrem hohe Trennleistung aus, haben einen inneren Durchmesser von 0,1

bis 0,4 mm und sind in den meisten Fällen zwischen 10 und 50 m lang. Sie bestehen aus Glas oder

Kieselglas mit einzelnen OH-Gruppen, an die die flüssige stationäre Phase (Trennflüssigkeit) auf der

Innenwand als Film kovalent gebunden ist. Die Filmdicken bewegen sich zwischen 0,05 –10 m. Die

große Anzahl an Trennflüssigkeiten bestehen aus Polymeren wie z.B. die am häufigsten verwendeten

unpolaren Methylsilikone (-O-Si(Me)2-O-Si(Me)2-)x mit wechselnden polareren Anteilen an Phenyl-,

Cyanoethyl-, oder Trifluorpropyl-Gruppen oder polaren Polyethylenglykolen. Die Trennsäule befindet

sich im Säulenofen. Ist das zu analysierende Stoffgemisch auf der Trennsäule im GC-Ofen getrennt,

so müssen die einzelnen Substanzen das Ende der Trennstrecke erreichen, um in den dort

ATL – 2

5

installierten Detektor analysiert zu werden. Zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Substanzen

werden die verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Komponenten benutzt.

Die wichtigsten hiervon sind: Wärmeleitfähigkeit, Ionisierbarkeit, Elektronenaffinität und spektrosko-

pische Eigenschaften (MS; FT-IR; Flammenphotometrie).

GC-Detektoren sind Messinstrumente, die Eigenschaftsunterschiede zwischen Probenkomponenten

und Trägergas messen und dieser Informationen in elektrische Signale umwandeln. Detektoren

müssen bestimmte Eigenschaften erfüllen, damit sie in der praktischen Gaschromatographie

einsetzbar sind. Man unterscheidet Detektoren auch danach, ob sie die Probemoleküle ohne

Zerstörung oder durch Zerstörung detektieren:

- Destruktive Detektoren sind der Flammenionisationsdetektor (FID), der Phosphor-Stickstoff-

Detektor (PND), der Flammenphotometrische Detektor (FPD) und der Massendetektor (MSD).

Alle destruktiv detektierenden Detektoren arbeiten als massenregistrierende Detektoren d.h. sie

registrieren die, bei der Destruktion entstandenen Teilchen (zumeist Ionen).

- Nicht-destruktive Detektoren sind der Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD), der Photoionisations-

detektor (PID) und der Infrarotdetektor (IRD). Alle Nicht-destruktiven Detektoren sind arbeiten

konzentrationsabhängig. Bei diesen Detektoren ist das Volumen der Detektionszelle von großer

Bedeutung. Bei den meisten heute üblichen Detektoren handelt es sich um Differential - Detektoren. Wenn reines

Trägergas diesen Detektortyp durchströmt, wird das erhaltene Signal kompensiert. Kommt neben dem

Trägergas eine Probenkomponente in den Detektor, dann wird der Unterschied zum reinen Trägergas

- Signal als Probensignal ausgegeben. Im Prinzip lässt sich jede Messsonde als Detektor nutzen, die

auf solche Unterschiede anspricht. Die Signale aus dem Detektor werden verstärkt, auf einem

Schreiber ausgegeben oder in einem Computer - Integrator weiterverarbeitet. Besonders bei der

Schreiberauswertung muss die Ausgangsverstärkung des Detektors groß genug sein, damit alle

Peaks messbar sind. In der wissenschaftlichen Literatur sind heute rund 100 verschiedene Detektoren

beschrieben. Nur rund 10 davon spielen eine Rolle, der WLD und FID sollen hier kurz besprochen

werden. Wärmeleitfähigkeitsdetektor WLD

Dieser Detektor besteht aus einem gut thermostatisierten Metallblock mit vier gleichen Zellen. Zwei

Zellen (Messzellen) werden vom Trägergas aus der Trennsäule durchströmt, zwei (Vergleichszellen)

vom reinen Trägergas. In allen vier Zellen befinden sich Platin- oder Wolfram-Heizwendeln, die zu

einer WHEATSTONE`schen-Brückenschaltung zusammengeschlossen sind.

Abb. 3: Wärmeleitfähigkeitsdetektor WLD und Messprinzip, MZ=Messzelle, VZ=Vergleichszelle

ATL – 2

6

Alle Heizdrähte werden von elektrischem Strom durchflossen und dadurch erwärmt. Die Temperatur

der Drähte, und damit ihr Widerstand hängt von der Wärmeleitfähigkeit der Gase ab, die die Zellen

durchströmen. Veränderungen in der Zusammensetzung des Gases, das die Messzellen durchströmt,

verursachen Temperaturänderungen und damit Widerstandsänderungen der Drähte in den Mess-

zellen. Da alle Zellen zu einer WHEATSTONE`schen Brücke zusammengeschaltet sind, gerät die

Schaltung aus dem Gleichgewicht, sobald eine Komponente (mit schlechterer Wärmeleitfähigkeit als

das Trägergas) aus der Trennsäule in die Messzelle strömt. Die Temperatur der Heizdrähte in den

Messzellen stabilisiert sich durch die Wärmeabfuhr auf einem höheren Niveau. Die Temperatur der

Heizdrähte in den Vergleichszellen ändert sich nicht. Diese Temperaturdifferenz der Heizdrähte in

Mess- und Vergleichszellen bewirkt einen Spannungsunterschied, der verstärkt auf ein Ausgabegerät

gegeben wird. Die Signale sind der Probenkonzentration im Trägergas proportional.

Der WLD ist grundsätzlich für alle Substanzen verwendbar, die ihn nicht durch Korrosion zerstören.

Man sollte den Brückenstrom nicht einschalten, bevor die Heizdrähte vom Trägergas umspült und

dadurch gekühlt werden. Überhitzung kann die Drähte durchbrennen lassen.

Flammenionisationsdetektor FID

Beim Flammenionisationsdetektor (FID) wird dem Trägergas am Säulenende Wasserstoff als

Brenngas beigemischt. Gleichzeitig wird synthetische Luft so in den Detektor eingeleitet, dass der

Wasserstoff an einer feinen Düse verbrennen kann. Alle Substanzen, die vom Trägergas eluiert

werden, verbrennen in der Wasserstoffflamme. Das Detektorsignal beruht auf der Ionenbildung bei

der Verbrennung von Substanzen mit C-C und C-H Bindungen. Die Wasserstoffflamme selbst ist

kaum ionisiert. Gelangen aber Verbindungen in die Flamme, so werden über eine Radikalreaktion

CH + O ----> CHO+ + e-

Ionen und Elektronen gebildet, die durch das elektrische Feld der Sammelelektrode aufgefangen

werden können. Die Düse, an der Trägergas und Wasserstoff in den Luftstrom eintreten und

verbrennen, besitzt ein negatives Potential. Positive Ionen werden dadurch neutralisiert, während die

freigesetzten Elektronen an der positiven Sammelelektrode eingefangen werden und den Signalstrom

liefern. Damit ein FID einwandfrei arbeitet, müssen Brenngas-, Luft- und Trägergas-Strömung richtig

eingestellt werden. (Angaben finden sich in den Gerätehandbücher). Ferner dürfen die Elektroden

nicht durch Korrosion oder durch Siliziumdioxidablagerungen aus verbrannten Silikonphasen

verschmutzt sein. Damit der FID nicht durch Kondenswasser geschädigt wird, darf die Brennerflamme

erst gezündet werden, wenn der Detektor wärmer als 100 °C ist. Der Flammenionisationsdetektor ist

für organische Verbindungen verwendbar. Er spricht auf viele anorganische Verbindungen nicht an,

z.B. H2O, CO2, SO2, NH3, CO.

Abb. 4: Flammenionisationsdetektor FID

ATL – 2

7

Die von der Datenerfassung aufgezeichneten Chromatogramme (Abb. 5) werden wie bei der

Flüssigchromatographie ausgewertet (vgl. ATL1, Kapitel 2.3.4, Abb. 7 und 8).

Die chromatographischen Kenngrößen berechnen sich aus dem Chromatogramm wie folgt:

Nettoretentionszeit t s: t s = t ms – t m (7)

Asymmetriefaktor AF: 0,1

0,1

bAF =

a (8)

Kapazitätsfaktor k: s

m

tk =

t (9)

Trennfaktor r( ): s

s

t "k"r = =

k' t ' (mit k`` > k` ) (10)

Abb. 5: GC-Chromatogramme des selben Kohlenwasserstoffgemisches (a) isotherm bei 150 °C

mit unvollständiger Trennung und asym-metrischen Peaks; (b) mit Temperarurgradient von

50 – 250 °C mit einer Rate von 8 °C/min: basis-liniengetrennte symmetrische Peaks in deutlich

kürzerer Zeit; (a) gegenüber (b) 16 mal verstärkt

(a)

(b)

ATL – 2

8

Auflösung Rs zwischen 2 Peaks: ms ms s ss

0,1 0,1 0,5 0,5

t " - t ' t " - t 'R = 2 = 1,177

W " + W ' W " + W ' (11)

Theoretische/effektive Trennstufen- oder Bodenzahl N / Neff :

2 2

ms seff

0,1 0,1

t tN = 16 ; N = 16

W W (12)

Sind die Peaks asymmetrisch, wird folgende Gleichung verwendet:

2 2

ms seff

0,5 0,5

t tN = 5,54 ; N = 5,54

W W (13)

Trennstufen- oder Bodenhöhe H: effeff

L LH = bzw. H =

N N (14)

(L = Länge der Chromatographiesäule)

Dynamische Theorie

Die VAN DEEMTER-Gleichung der dynamischen Theorie (vgl. ATL-1, Kapitel 2.3.5) gilt auch in der

Gaschromatographie und wurde sogar zuerst an Hand der GSC abgeleitet. In der Kapillar-GC ist der

A-Term gleich Null, da keine, durch Partikel verursachte Streudiffusion vorliegt. Durch unterschied-

liche Trägergasdrücke lässt sich hier der optimale Flow ermitteln.

Quantitative Auswertung

Nach Zuordnung der einzelnen getrennten Peaks zu den jeweiligen Komponenten werden die Flächen

integriert und nach Kalibrierung über die erhaltene Kalibrierfunktion (Regressionsrechnung mit

EXCEL) z.B. y = ax + b in die Analysenfunktion x = y/a – b/a umgestellt mit y = Fläche F der

Einzelkomponente und x = Volumen V. Diese Kalibrierung nennt man externe Kalibrierung wenn kein

interner Standard zugemischt wurde. Bei Zumischung eines immer gleichkonzentrierten internen

Standards wird bei der Auswertung immer auf die Fläche Fis dieser internen Standardkomponente

bezogen und natürlich ebenso auf die Volumen Vis gemäß Gleichung (15). Durch diese interne

Kalibrierung ist man unabhängig vom aufgegebenen Probenvolumen. Die interne Kalibrierung wird in

der GC wegen Unsicherheiten bei der Probenzufuhr gegenüber der externen bevorzugt.

Fi / Fis = f ( Vi / Vis ) (15)

mit Fi = Fläche der Komponente i; Fis = Fläche der internen Standardkomponente; Vi = Volumen der

Komponente i im Gesamtvolumen; Vis = Volumen der internen Standardkomponente im

Gesamtvolumen, f = Steigung der Kalibriergeraden (Responsefaktor).

ATL – 2

9

Die Analysenfunktion wird dann nach Vi umgestellt und ergibt das gesuchte Volumen der unbekannten

Probe nach Bestimmung der Flächen. 2.3. Literaturhinweise (in der PC-Bibliothek vorhanden)

1) H. Naumer, W. Heller, Untersuchungsmethoden in der Chemie, Thieme Verlag 1990. 2. Auflage

2) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996

3) G. Schomburg, Gaschromatographie, VCH-Verlag, 2. Auflage 1987

4) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995

5) J. Böcker, Chromatographie, Vogel Buchverlag, 1997

2.4. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!)

1) Welche Parameter werden in der GC zur Optimierung einer Trennung varriert und welche Gesetz-

mäßigkeiten kommen zur Anwendung?

2) Wie kann man die Totzeit in der GC mit einem FID bestimmen?

3) Warum sind asymmetrische Peaks unerwünscht und wie lassen sich diese vermeiden?

4) Wie sehen die beiden GC-Chromatogramme an derselben unpolaren stationären Phase aus, a)

wenn Sie 2 Kohlenwasserstoffe mit unterschiedlichen Siedepunkten und b), wenn Sie 2

Komponenten mit dem gleichen Siedepunkt, aber unterschiedlichen Polaritäten trennen wollen?

3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien

Hewlett Packard 5890A Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor (FID), Autosampler und PC-Auswertesystem HP 3365 – ChemStation – Series II

Dünnfilm-Quarzkapillarsäule "Permaphase" Rtx-5 (OV-5), Länge 30 m,

Innendurchmesser 0.32 mm, Filmdicke 0.3 μm,

EPPENDORF Mikroliterpipette ( 100-1000 µL )

5 Maßkolben (10 mL) enthalten die 2 Komponenten und den internen Standard für die Kalibrierreihe

1 Maßkolben (10 mL) Test-Probe: Enthält alle Komponenten 1:10 gelöst in n-Hexan

(je 0,5 mL/10 mL)

1 Maßkolben (10 mL) X-Probe. Enthält die beiden ausgewählten Komponenten aus der Kalibrierreihe

in unbekannter Konzentration und den internen Standard mit 0,5 mL

Kohlenwasserstoffe (Komponenten: Toluol, Cumol, o-Xylol, p-Xylol, Mesitylen, iso-Octan 1:10 gelöst

in n-Hexan

3.1.1.Geräteeinstellungen:

Die Einstellungen für die Ofen-, Injektor- und Detektortemperatur, sowie die Analysezeiten werden

automatisch vom Rechnersystem an den Gaschromatographen übermittelt.

Injektionsvolumen: 0,1 - 0,5 μL wird im Programm eingestellt.

Injektortemperatur: 250 °C wird im Programm eingestellt

Detektortemperatur: 250 °C wird im Programm eingestellt

Optimale Ofen-Temperatur: wird während des Praktikums bestimmt.

3.2. Vorbereitung der Messlösungen: 3.2.1.Kalibrierlösungen

Es stehen 5 Kalibrierlösungen bereit, in denen sind jeweils zwei der 7 Stammkomponenten von 0,1 bis

0.9 mL in 0,2 mL Intervallen (siehe dazu 3.1) enthalten. Als internen Standard wird aus den

ATL – 2

10

Stammlösungen noch eine dritte Komponente mit konstant 0,5 mL hinzugesetzt. Aufgefüllt wurde mit

n-Hexan. Die Kalibrierlösungen, die Test-Probe sowie die X-Probe (siehe 3.1) sollen mit

Pasteurpipetten in Vials überführt und verschlossen werden. Die Vials sind entsprechend zu

kennzeichnen.

3.3. Durchführung:

3.3.1. Das Einschalten des GC und eine Einweisung erfolgt während des Praktikums

3.3.2. Temperatureinflüsse / Temperaturprogramm

Injektorblock-Temperatur Die Einspritzzone sollte heiß genug sein, um die Probe so schnell zu verdampfen, dass keine

Substanzverluste aufgrund der Einspritztechnik entstehen. Bei zu rascher Aufheizung der

Spritzennadel verdampft das meist leichter siedende Lösemittel schneller, so dass hochsiedende

Komponenten in der Kanüle zurückbleiben und auskristallisieren (Diskriminierung). Als Faustregel gilt:

Die Injektorblocktemperatur ist ca. 50 K höher zu wählen als der höchste Siedetemperatur unter

Berücksichtigung der vom Gerätehersteller angegebene Maximaltemperatur des Injektors bzw. seiner

Bestandteile (Septum etc.).

Detektor-Temperatur Der Detektor und die Verbindungen vom Säulenausgang zum Detektor sollten genügend hohe

Temperatur aufweisen, so dass Kondensationen mit Sicherheit vermieden werden; sie soll mindestens

so hoch sein wie im Injektor. Als Faustregel gilt auch hier das bereits beim Injektor gesagte.

Die Säulentemperatur wird während des Praktikums bestimmt.

3.3.3. Aufnahme der Chromatogramme

In diesen Teil der Durchführung wird isotherm gearbeitet, d.h. die Ofentemperatur bleibt während der

Analysenzeit konstant. Es werden jeweils Chromatogramme bei 3 verschiedenen Temperaturen

(90 °C / 120 °C / 150 °C) aufgenommen. Die Einstellungen am Gaschromatographen bzw. am

Rechnersystem erfolgen während des Praktikums unter Anleitung des Hochschullehrers oder des

Assistenten. Der Gaschromatograph ist messbereit wenn in der Anzeige am Gerät <Ready>

erscheint, oder im Rechnerprogramm <Ready> erscheint. Jetzt kann bei der entsprechenden

Säulenofentemperatur das erste Chromatogramm aufgenommen werden. Nach Analysenende wird

die Ofentemperatur am PC auf 120 °C erhöht und bei Temperaturkonstanz (<Ready> Signal) das

nächste Chromatogramm aufgenommen. Für das Chromatogramm bei 150 °C wird analog verfahren.

Die Temperatur, bei der die beste Trennung erfolgt d.h. basisliniengetrennte Peaks in möglichst kurzer

Zeit, wird zur quantitativen Analyse eingestellt. Auf einen Temperaturgradienten wird verzichtet. Es

soll aber diskutiert werden, wie über einen Temperaturgradienten die Trennung weiter optimiert

werden kann.

Bevor die quantitative Analyse nach der Methode des internen Standards beginnt, wird die Totzeit tm

durch Einspritzung von Stadtgas bestimmt.

4. Auswertung 4.1. Identifizierung der Substanzen

Anhand der Siedepunkte der einzelnen Kohlenwasserstoffe aus dem MERCK-Katalog. Warum?

ATL – 2

11

4.2. Bestimmung der chromatographischen Kenngrößen

Aus dem optimierten Chromatogramm sind für jede der sieben KW-Komponenten folgende Mess-

größen zu ermitteln (vgl. Abbn. 7 und 8, ATL-1):

tms = Bruttoretentionszeit

tm = Totzeit, Durchbruchzeit

ts = Nettoretentionszeit

h = Peakhöhe

W 0.1 = Basisbreite der Peaks bei 0,134 h

W 0.5 = Basisbreite der Peaks bei 0,5 h

a 0,1 ; b 0,1 = Asymmetrieabschnitte bei 0,134 h

und daraus nach Gln. 7 bis 14 die folgenden chromatographischen Kenngrößen zu berechnen:

k = Kapazitätsfaktor

AF = Asymmetriefaktor

r () = Trennfaktor

R = Auflösung

N, Neff = Trennstufenzahl (theoretisch, effektiv)

H, Heff = Bodenhöhe (theoretisch, effektiv); (Länge der Säule: 3000 cm)

4.3. Quantitative Bestimmung

4.3.1. Bestimmung der Responsefaktoren

Die Messlösungen enthalten einen inneren Standard, um eventuelle Ungenauigkeiten beim

Einspritzen auszugleichen. Mittels den Volumina und der gemessenen Peakflächen lassen sich die

Responsefaktoren für die verschiedenen Komponenten berechnen. Berechnung der

Responsefaktoren fi :

i is

iis i

F Vf =

F V (16)

mit fi = Responsefaktor der Komponente i, Fi = Peakfläche der Komponente i, Fis = Peakfläche des

inneren Standards, Vi = Volumen der Komponente i, Vis = Volumen des inneren Standards

Der Responsefaktor lässt sich auch graphisch ermitteln, indem man den Quotienten der Flächen über

den Quotienten der Volumina aufträgt und daraus die Steigung ermittelt gemäß (15):

Fi / Fis = f ( Vi / Vis ) (15)

4.3.2. Quantitative Bestimmung der unbekannten Probe cp

Mittels des Volumens des inneren Standards, den Peakflächen und den Responsefaktoren lassen

sich die Volumina der beiden unbekannten Probenkomponenten berechnen.

Berechnung des jeweiligen Volumens Vp in der Probe:

i is

Pis i

F VV =

F f

Alternativ wird für jede der beiden unbekannten Probenkomponenten eine grafische Auswertung über

EXCEL mit Gleichung (15) erstellt. Aus den sich ergebenden Geraden wird in die Analysenfunktion

umgestellt berechnet und das Ergebnis mit der rechnerischen Auswertung verglichen.

Stand: 11.03.14

Vp = Volumen der Komponente i in der Probe

Vis = 0,5 mL in der unbekannten Probe

ATL - 3

1

Spektralfluorimetrische Untersuchung von Natrium-Fluorescein 1. Aufgabenstellung 1.1. Aufnahme des Absorptions- und Emissionsspektrums von Natrium-Fluorescein: Bestimmung des

Maximums der Anregungs- und Emissionswellenlänge 1.2. Auffinden des linearen Bereichs der Fluoreszenz durch Auftragung der Fluoreszenz-Intensität in

Abhängigkeit von der Konzentration und Erstellung einer Kalibriergeraden und Funktionsgleichung für den Linearbereich

1.3. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Natrium-Fluoresceinprobe 2. Theoretische Grundlagen 2.1. Einführung in die Spektroskopie Die Energiezustände der Materie sind quantisiert (diskontinuierlich) und bestehen aus Coulomb-Wechselwirkungen zwischen Atomkernen und Elektronen, Bewegungsenergien der Elektronen und der Atomkerne sowie Wechselwirkungen magnetischer Momente (Kern- und Elektronenspins, Bahn-drehimpuls). Die Bewegungen der Elektronen und der Kerne sind nach der BORN-OPPENHEIMER-Näherung unabhängig voneinander. Die Gesamtenergie EGes setzt sich gemäß Gleichung (1) aus mehreren Anteilen zusammen: EGes = Eel + Evib + Erot + Etrans + Emagn (1) mit elektronischer Energie Eel (kinetische Energie der Elektronen und potentielle Energie der Elektronen/Kern-Anziehung und Kern/Kern sowie Elektron/Elektron-Abstoßung), Schwingungs-, Rotations- und Translationsenergie sowie Wechselwirkung mit externen Magnetfeldern Emagn und Eel > Evib > Erot > Etrans > Emagn. Alle Energiearten sind dabei quantisiert (Translation ist quasi-klassisch d.h. kontinuierlich) und die Anzahl möglicher Energieniveaus in Molekülen ist unterhalb der Ionisierungs-energie unbegrenzt. Der tiefstmögliche Energiezustand heisst Grundzustand (elektronischer Grundzu-stand und Nullpunktschwingungsenergie), alle anderen sind angeregte Zustände. Die möglichen Energiewerte (= Eigenwerte) lassen sich quantenmechanisch durch Lösen der SCHRÖDINGER-Gleichung berechnen über E mit HAMILTON-Operator , Wellenfunktion und Energie E.

E = ha

b

c

Abb.1.: Absorptions- und Emissionsspektren: a) Linienspektren bei Atomen; b) Molekülspektren mit

aufgelösten Schwingungsfeinstrukturen z.B. Moleküle in der Gasphase; c) Molekülspektren ohne Feinstruktur für Moleküle in Lösung

ATL - 3

2

Absolute Energien sind nicht messbar, wohl aber Energiedifferenzen E zwischen verschiedenen Energiezuständen. Das Prinzip der Spektroskopie ist in Abb. 1 dargestellt. Dabei muss als notwendige (aber nicht hinreichende) Bedingung die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung so gewählt werden, dass die Energie h der Energiedifferenz E zwischen zwei Energieniveaus entspricht (PLANCK Beziehung). Ist diese sogenannte Resonanzbedingung nicht erfüllt, wird keine Energie der elektromagnetischen Strahlung absorbiert. Diese Energiedifferenzen haben für die verschiedenartigen Wechselwirkungen unterschiedliche Größenordnungen, folglich unterschiedliche spektrale Bereiche, in unserem Versuch zur Elektronenanregung der UV-Vis Bereich 200-750 nm mit = 3x1014 bis 3x1016 Hz bzw. 105 bis 107 J/mol, für die NMR-Spektroskopie zum Umklappen von Kernspins reichen dagegen energieärmere Radiowellen mit = 3x106 bis 3x108 Hz bzw. 10-3 bis 10-1 J/mol aus. Das elektromagnetische Spektrum reicht von energiereichen -Strahlen über den UV-Vis-Bereich bis hin zu den Hörfrequenzen. Die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ist dabei direkt und die Wellenlänge indirekt proportional zur Energie einer elektromagnetischen Welle, der Zusammenhang zwischen Wellenlänge und Frequenz bildet die Lichtgeschwindigkeit c mit c = . Dabei ist die Licht- oder Wellenausbreitungsgeschwindigkeit c abhängig vom Ausbreitungsmedium mit co (Vakuum) > c (Medium mit Brechungsindex n > 1) und c = co/n. Der Brechungsindex n ist über das SNELLIUS Brechungsgesetz definiert und von der Wellenlänge abhängig (Dispersion, vgl. Prisma). Mono- bzw. polychromatisches Licht besitzt nur eine bzw. viele Wellenlängen, kohärentes Licht hat nur eine Phasenlage und polarisiertes Licht schwingt nur in einer Ebene (linear polarisiert) bzw. dreht sich gleichförmig um die Ausbreitungsrichtung (zirkular polarisiert). Experimentell zeigt sich, dass nicht alle denkbaren Übergänge zwischen Energieniveaus „erlaubt“ sind, es gibt quantenmechanisch „erlaubte“ und „verbotene“ Übergänge, die durch Auswahlregeln bestimmbar sind und sich häufig aus der Symmetrie der Wellenfunktionen ableiten lassen. Die quantenmechanische Formulierung sagt aus, dass das Übergangsmoment 1,2, das die Veränderung des Dipolmomentes während des Übergangs repräsentiert, ungleich Null sein muss. Z.B. ist es in der Mikrowellen- oder Rotationsspektroskopie notwendig, dass ein permanentes elektrisches Dipolmoment vorhanden ist und in der Infrarot- oder Schwingungsspektroskopie muss sich das Dipolmoment durch die Vibration ändern. Zur Anregung von Elektronen im UV-Vis-Bereich treten die elektromagnetischen Lichtwellen mit den bewegten Elektronen in Wechselwirkung, damit verändert sich ebenso das elektrische Dipolmoment des Moleküls. Die Oszillatorenstärke f ist hierbei ein Maß für die Stärke der Kopplung mit dem elektromagnetischen Feld des Lichtes. Die Lichtabsorption hängt von der Anzahl der „getroffenen“ Moleküle ab, also von der Schichtdicke und der Konzentration. Dabei verringert sich die Intensität (Amplitude) der absorbierten Lichtwelle beim Küvettendurchgang exponentiell und wird durch das LAMBERT-BEER Gesetz quantitativ beschrieben: = o10-cd oder = lg o/ = cd mit Extinktion (optische Dichte OD, engl.: absorbance A), molarer Extinktionskoeffizient , Konzentration c und Schichtdicke d. und sind auch wie der Brechungsindex eine Funktion der Wellenlänge. 2.2. UV-Vis-Absorption, Fluoreszenz und Phosphoreszenz Im UV-Vis-Bereich werden bei Molekülen neben Rotationen und Schwingungen bindende ( und ) und nichtbindende (n) Elektronen in antibindende Zustände (*) angeregt. Mögliche Übergänge bei Resonanz sind *, *, *, *, n* und n*, wobei aus Symmetriegründen die Übergänge * und n* sehr unwahrscheinlich und daher quantenmechanisch „verboten“ sind.) Bei konjugierten - und mesomeriestabilisierten n--Elektronensystemen wird die notwendige Anregungsenergie dieser Valenzelektronen immer geringer und die Absorptionsbanden verschieben sich immer weiter zu größeren Wellenlängen (Rotverschiebung oder bathochromer Effekt).

ATL - 3

3

SoSo

T1

S1

ISC

o1234

o

234

sD

1

A F

P

Abb.2.: JABLONSKI-Diagramm von gelöstem Anthracen (in Cyclohexan) mit den Schwingungszu-

ständen 1, 2, 3 und 4 im elektronischen Singulett-Grundzustand So und den beiden angereg-ten Zuständen Singulett S1 und Triplett T1 sowie den entsprechenden Absorptions- (gestrich-elt) und jeweils langwellig verschobenen Emissionsspektren; A. Absorption; sD: strahlungs-lose Desaktivierung; F: Fluoreszenz; ISC: Intersystem Crossing; P: Phosphoreszenz

Genauer betrachtet erfolgt die Anregung aus dem elektronischen Singulett-Grundzustand So im Schwingungsgrundzustand o (bei 25oC sind Schwingungen kaum angeregt) innerhalb von 10-15 s in den elektronisch ersten angeregten Singulettzustand S1 und dazugehörenden Schwingungszu-ständen. Diese Anregung ist ein „erlaubter“ Vorgang (großes ) im Gegensatz zur Anregung in den Triplettzustand T1, der quantenmechanisch „verboten“ ist (sehr kleines , Abb.2, oben). Bevor die angeregten Elektronen wieder in den Grundzustand So zurückkehren, erfolgt zunächst innerhalb von ca. 10-12 s eine strahlungslose Desaktivierung sD der höheren Schwingungszustände in den Schwin-gungsgrundzustand o des angeregten S1-Zustandes. Die Fluoreszenz F kann jetzt aus dem niedrigsten Schwingungszustand o in S1 zu verschiedenen Schwingungszuständen in So innerhalb von 10-8 bis 10-5 s erfolgen. Die Energiedifferenzen bei der Emission sind grundsätzlich kleiner als bei der Absorption und mit Ausnahme des (o,o)-Übergangs sind deshalb die Emissionsspektren im Vergleich zu den Anregungsspektren bathochrom verschoben. Infolge von Lösungsmitteleinflüssen fallen aber oft selbst die (o,o)-Banden im Spektrum nicht zusammen. Diese Verschiebung ist analytisch allerdings vorteilhaft, da sonst das Fluoreszenzlicht von anderen, nicht angeregten Molekülen der gleichen Substanz reabsorbiert werden würde. Der Übergang von S1 nach S0 erfolgt bei den meisten Molekülen allerdings unter Wärmeabgabe d.h. strahlungsloser Desaktivierung. Ist dieser Schwingungsvorgang jedoch behindert, dann kann Licht in

ATL - 3

4

Form von Fluoreszenz emittiert werden. Eine allgemeine Regel für die Erfüllung dieser Voraussetzung gibt es nicht. Günstig bei organischen Molekülen sind starre Gerüste wie z.B. kondensierte Aromaten, Chinin in Schweppes oder überbrückte Triphenylmethanfarbstoffe (Abb.3), da dann die Umwandlung der Elektronenanregungs- in Schwingungsenergie erschwert ist.

O OH

COONa

O OH

COONa

O

Abb.3: Vergleich zweier Triphenylmethanfarbstoffe im protonierten Zustand: Phenolphthalein (nicht

fluoreszierend, pKs 9,5) und Fluorescein (pKs 6,2) Absorption und Emission im Singulettzustand laufen ab, ohne dass sich die Spinrichtung des betreffenden Elektrons ändert (Abb.2). Außer in Radikalen und vielen Übergangsmetallkomplexen liegen in Molekülen nur gepaarte Elektronen vor, deren entgegengesetzte Spins und magnetische Momente sich aufheben, d.h. sie sind diamagnetisch und der Gesamtspin S des Moleküls ist Null. Übergänge unter Spinumkehr sind quantenmechanisch sehr unwahrscheinlich und damit verboten. Manchmal, vor allem bei tiefer Temperatur in festen Stoffen, wird vom Singulettzustand S1 her unter Wärmeabgabe und Spinumkehr ein energetisch niedrigerer Triplettzustand T1 erreicht, in der Fachsprache Inter System Crossing (ISC) genannt. Auf Grund der beiden gleichgerichteten Spins der beiden ungepaarten Elektronen ist der Gesamtspin S = 1, d.h. das Molekül ist jetzt paramagnetisch. Zur Beschreibung elektronischer Zustände von Molekülen eignet sich die Multiplizität M = 2 S + 1, d.h. bei S = 0 liegt ein Singulett- bzw. bei S = 1 ein Triplettzustand mit den Multiplizitäten M = 1 bzw. M = 3 vor. Ein Radikal ist also elektronisch betrachtet ein Dublettzustand mit S = ½ und M = 2. Der Triplettzustand ist längerlebig, da der Übergang von T1So eine erneute Spinumkehr erfordert. Findet dieser T1So Übergang unter Lichtaussendung statt, so dauert die Emission nach dem Abschalten der Erregerstrahlung noch einige Zeit an, u.U. mehr als 10 s. Ein solcher Emissionsprozess heißt Phosphoreszenz. In der Praxis ist der Mechanismus der Emission oft unbekannt. Man spricht dann von Phosphoreszenz statt Fluoreszenz, wenn nach dem Abschalten des Erregerlichts die Lichtaussendung länger als 10-4 s andauert. 2.3. Herleitung der Auswerteformeln Der gesuchten Konzentration c proportional ist die Intensität IF des emittierten Fluoreszenzlichtes. IF kann höchstens so groß sein wie die zuvor von der Substanz absorbierte Intensität Iabs:

F abs F absI I und I K' I , K' 1.wobei (2)

Ist I0, die Intensität des eingestrahlten Erregerlichtes (Primärlichtes) und I die von der Probe durchge-lassene, d.h. nicht absorbierte Intensität, so ist Iabs = I0 - I. Der absorbierte relative Anteil von I0 ist dann nach Gleichung (3):

ATL - 3

5

abs 0

0 0 0

I I - I I 1 - I I I

(3)

Für den Ausdruck (I / I0) gilt aber nach dem LAMBERT-BEER Gesetz:

0

0

II - c d 10 oder E log c dI I

(4)

Daraus folgt:

Fabs

0 0

F 0

II K' 1 - 10 ,I I

- c dI K' I (1 - 10 )

c d

(5)

Die Fluoreszenzintänsität hängt also nicht linear von der Konzentration ab und strebt mit wachsendem c einem konstanten Endwert 0K' I zu gemäß Abb. 4.

Abb. 4. Graphische Darstellung von Gleichung 5

Entwickelt man die Gleichung (5) in eine Taylor-Reihe, so kann man diese für kleine Werte von . c . d mit genügender Näherung nach dem 1. Glied abbrechen und erhält eine lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von kleinen Konzentrationen c gemäß Gleichung (6): F 0I K I c d mit K = K' 2,303 (6) Im Bereich genügend kleiner Konzentrationen steigt IF also annähernd linear mit c. Um trotz kleiner Werte von c eine gut messbar hohe Intensität IF zu erhalten, macht man I0 groß. Man verwendet also eine möglichst intensive Lichtquelle. Das in den inneren Bereichen der Probe emittierte Fluoreszenz-licht kann auf seinem Weg nach außen von dem fluoreszenzfähigen Stoff selbst wieder reabsorbiert werden. Die aus der Küvette austretende Intensität IF wird dadurch verringert und zwar um so stärker, je höher die Konzentration ist. Der Vorgang entspricht der Selbstabsorption in der Flammenphotometrie und führt zu einer zusätzlichen Krümmung der fluorimetrischen Kalibrierkurve.

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6

2.4. Literaturhinweise (Lit. 1+2 in der PC-Bibliothek vorhanden) 1) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996 2) W. Schmidt, Optische Spektroskopie, Wiley-VCH-Verlag, 2. Auflage 2000 3) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995 4) G. Schwedt, Fluorimetrische Analyse, Methoden und Anwendungen, Verlag Chemie, 1981 2.5. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!) 1) Warum ist die Lebensdauer der Phosphoreszenz im Vergleich zur Fluoreszenz deutlich größer? 2) Welche Eigenschaften haben elektronische Dublett-Zustände? 3) Wodurch unterscheidet sich ein Spektrofluorimeter von einem UV-Vis-Spektralphotometer? 4) Weshalb wird die Na-Fluorescein-Lösung bei pH 7 gepuffert? 3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien

Analysenwaage Maßkolben Pipetten Wägeschiff Spritzflasche

3.2. Vorbeitung der Messlösungen Ansetzen des Puffers nach SÖRENSEN 1/15 mol/L Na2HPO4 = 11,86 g/L 1/15 mol/L KH2PO4 = 9,073 g/L Bei einen pH-Bereich von 7,0 bis 7,1 beträgt das Volumenmischungsverhältnis nach HENDERSON-HASSELBALCH mit pKs(H2PO4- , 25 °C) = 7,21: 61,1 Vol-% 1/15 mol/L Na2HPO4 und 38,9 Vol-% 1/15 mol/L KH2PO4 (nur bei 20 oC) Scanbereich: Anregungspektrum 400 bis 600 nm; Emissionsspektrum von 400 bis 650 nm

Herstellung der Na-Fluorescein-Stammlösung:.

C(Na-Fluorescein) = 10 -3 mol/L mit der Pufferlösung auf 1 L aufgefüllt.

Durch Aliquotieren von 10 mL der Stammlösung und Auffüllen auf 100 mL mit Phosphatpuffer wird

eine 10fach verdünnte Lösung hergestellt. Es soll so eine Verdünnungsreihe von 10-4 – 10-9 mol/L bei

Na-Fluorescein (insgesamt 6 Proben) aufgestellt werden.

3.3. Durchführung Die Anregung muss in einem Spektralbereich erfolgen, in dem die Substanz das Licht absorbiert, d.h. in dem sie einen endlichen Extinktionskoeffizienten hat. Hält man die Messwellenlänge am Emissionsmonochromator konstant (Abb. 5) und verändert die Anregungswellenlänge am Excitations-

Shimadzu RF 1501 Spektrofluorometer Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Di-Natriumfluorescein Quarzglasküvette (QS)

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monochromator, so ergibt sich das Anregungsspektrum. Es entspricht näherungsweise dem photometrisch gemessenen Absorptionsspektrum der fluoreszenzfähigen Substanz. Bei konstanter Anregungswellenlänge und Veränderung des Emissionsmonochromators misst man die spektrale Verteilung des emittierten Lichtes, das Fluoreszenz- oder Emissionsspektrum.

Bestimmung der maximalen Anregungs –und Emissionswellenlänge: Im Hauptmenü, (Abb. 6) die 1 drücken um ins Spektrum-Menü (Abb. 7.) zu gelangen. Im Spektrum Menü kann über die 1 zwischen Anregung (EX) oder Emissionsspectrum (EM). Zunächst jedoch sollte das Anregungsspektrum (EX) aufgenommen werden. Mit der 2 für (EX) bzw. 3 für (EM) den Scanbereich auf 400 – 600 nm festlegen. Alle Eingaben müssen immer mit der ENTER – Taste bestätigt werden. Die Scangeschwindigkeit mit der 4 auf schnell einstellen. Über die 5 werden nun noch die Werte des ordinaten Maximums und Minimums eingegeben. Für Max. 1000 für Min. 0. Über die Taste F4 in das Instrument Menü (Abb. 8.) wechseln. Dann für die einzelnen Punkte folgende Einstellungen vornehmen: Bandbreite EX/EM 10 nm, Response Auto, Empfindlichkeit hoch, Auto Shutter EIN. Mit der Return Taste zum Spektrum Menü (Abb. 7.) zurückkehren. Einmal die Auto Zero-Taste für den Nullabgleich drücken. Probe zur Bestimmung der maximalen Anregungs- und Emissionswellenlänge (10-6 mol/l) in den Probenaufnahmeraum stellen. Durch Drücken der Start/Stop Taste (Abb. 11.) wird der Scanvorgang begonnen. Sollte der max. Ordinatenwert eventuell verändert werden, kann der Wert im Spektrum Menü verändert und anschließend der Scanvorgang wiederholt werden. Über die F3-Taste (DatBearb) wählen sie die Peak-Pick. (1) Die Maxima werden angezeigt und können mit der Copy-Taste direkt ausgedruckt werden. Mit Return kehren sie zum DatBearb zurück und wählen Daten Drucken (3). Wählen sie die Anfangs- und Endwellenlänge so, dass ein Bereich von ca. 50 nm vor und hinter dem Maximum erfasst wird. Als Intervall ist 1 nm einzustellen. Der Ausdruck der Daten erfolgt nach der letzten Eingabebestätigung automatisch. Diese Prozedur wird für das Emissionsspektrum analog durchgeführt. Die maximale Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge werden aus dem Fluoreszenzspektrum entnommen. Dabei muss beachtet werden, daß die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge möglichst weit auseinander liegen sollten (sonst Streuung 1. Ordnung und keine Fluoreszenz). Kehren sie nun mit Return zum Hauptmenü zurück und wählen Quantitativ (2) (Abb. 6.) Geben sie nun die Anzahl der Standards, die vorher ermittelte Anregungs- und Emissionswellenlänge, die Einheit µM/l und als Wiederholungen 1 ein. Über die Taste-F2 (neue Eichkurve), gelangen sie nun in ein Tabellenmenü (Abb. 10.). Tragen sie dort die entsprechenden Konzentrationseinheiten z.B. 10-6 Mol/l = 1 µM/l usw. ein. Jetzt können sie erste Kalibrierlösung in die Quarzküvette füllen und in den Probenraum stellen. Die korrekte Konzentrationsreihenfolge ist unbedingt einzuhalten. Die Messung beginnt, indem die 2

Abb.5: Schematischer Aufbau eines Spektralfluorimeters: senkrechte Anordnung der Anregungs- und Emissionsstrahlung

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gefolgt von Start/Stop gedrückt wird. Die erste Messung wird nun durchgeführt. Nächste Kalibrierlösung einfüllen, einstellen und mit Start/Stop fortfahren usw. bis alle Konzentrationen gemessen wurden. Die Datentabelle kann dann über Copy ausgedruckt werden. Mit Hilfe der Daten der Verdünnungsreihe wird nun der Linearbereich der Fluoreszenz ermittelt indem die Messwerte entsprechend aufgetragen werden. Überlegen sie wie am Besten und warum !!! Innerhalb des ermittelten Linearbereiches wird eine eigene Konzentrationsreihe angefertigt, aus der dann die Kalibriergerade erstellt wird. Es wird dann analog verfahren wie zur Bestimmung des Linearbereichs.

Eingabefeld des RF 1501 Spektrofluometer (Fa. Shimadzu):

Abb. 6. Hauptmenü Abb. 7. Spektrum Menü

Abb. 8. Instrument Menü Abb. 9. Quantitativ Menü

Abb. 10. Tabellen Menü

ATL - 3

9

Abb. 11. Eingabefeld RF 1501 1 = Copy Taste - Ausdruck des LCD Schirms auf einen Drucker

(Screencopy) 2 = EX Goto Taste - Eingabe der Anregungswellenlänge 3 = Auto Zero Taste - Nullstellen der Fluoerszenzanzeige (Auto Zero) 4 = Return Taste - Rückkehrtaste – mit dieser Taste ist eine Rückkehr zum

letzen Menü möglich - Auch als Abbruchtaste verwendbar 5 = Shutter Key Taste - Durch Betätigen diese Taste kann der Verschluss

manuell bedient werden 6 = EM Goto - Eingabe der Emissionswellenlänge 7 = Start/Stop - Startet und beendet den Messvorgang 8 = F1 bis F4 Tasten - Funktionstasten zum LCD Bildschirm 9 = Zifferntasten 0 bis 9 - Eingabe von Zahlen 10 = Dezimalpunkt-Taste 11 = CE Taste - Löscht falsch eingegebene Zahlenwerte 12 = Cursor links/rechts Taste – Bewegen des Cursors nach links oder

rechts ; - die linke Cursor-Taste dient gleichzeitig als negativ (-) Eingabetaste 13 = Enter Taste - Übernimmt eingegebene Zahlenwerte in den

Arbeitsspeicher 4. Auswertung 4.1 Aufnahme des Absorptions- und Emissionsspektrums von Natrium-Fluorescein: Bestimmung des

Maximums der Anregungs- und Emissionswellenlänge Die Spektren sind jeweils in EXCEL grafisch darzustellen. Die beiden Maxima werden für die folgende Aufgabe benötigt und am Spektrofluorimeter eingegeben. 4.2 Auffinden des linearen Bereichs der Fluoreszenz

ATL - 3

10

Doppeltlogarithmische Auftragung (warum?) der Fluoreszenz-Intensität lg IF in Abhängigkeit von der Konzentration lg c von 10-4 bis 10-9 mol/L in EXCEL. Der lineare Bereich wird bestimmt. 4.3 Erstellung einer Kalibriergeraden und Funktionsgleichung für den Linearbereich Die Konzentrationen der Kalibrierung des linearen Bereichs sind herzustellen und zu vermessen. Die lineare Auftragung IF gegen c in EXCEL sollte eine Gerade ergeben. Die Kalibriergleichung wird in die Analysengleichung umgestellt d.h. nach c aufgelöst. 4.4 Quantitative Bestimmung einer unbekannten Natrium-Fluoresceinprobe Die unbekannte Probe muss im Kalibrierbereich liegen. Ist sie zu konzentriert, muss entsprechend verdünnt werden. Die gemessene Fluoreszenzintensität wird in die Analysengleichung eingesetzt und c berechnet. Diese Berechnung wird an der Kalibriergeraden grafisch überprüft. Stand: 17.03.15