Universität Regensburg Abteilung Instrumentelle Analytik ... · HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 1 Universität Regensburg Abteilung Instrumentelle Analytik CH 32.1.05

HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 1

Universität Regensburg AbteilungInstrumentelle Analytik

CH 32.1.05

Chromatographie I

Einführendes Praktikum indie HPLC

Skript 2003/04

Dr. R. Vasold

Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04

Inhalt

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung............................................................. 4

I.2 Zielsetzung .......................................................... 4

I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase) .......................... 5

I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen ............................... 7

I.4 Die mobile Phase (Eluent) .................................. 7

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen ....... 7

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen ................................... 9

I.4.2.1 Die Isokratische-Elution.......................................... 10I.4.2.2 Die Gradienten-Elution ........................................... 10

I.5 Die Pumpen ....................................................... 11

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem.......................... 11

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme ....................................... 11

I.6 Die Injektionseinheit ......................................... 12

I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) ............. 12

I.6.2 Die manuelle Injektion ................................................... 12

I.7 Der Detektor....................................................... 13

I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 15

I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 16

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers..................................... 16

I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil ................... 18


II Experimenteller Teil

II.1 Einleitung ...........................................................19

II.2 Durchführung.....................................................20

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ........................ 20

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen........................ 20II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung................ 20II.2.1.2 Vorbereitung der Probenlösungen........................ 21

II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen ................................ 22

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung................................ 22II.2.2.2 Die Prammierung des Injektionsvolumens ............23II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung..................................... 23II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten....... 24II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter ............. 24II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers................. 25II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ........................ 25

II.2.3 Die quantitative Auswertung.......................................... 26

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis............................... 26II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ........................... 26II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes .............. 27

I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................28

III Auswertung Theoretischer Teil ....... 29

IV Auswertung Experimenteller Teil.... 30

Abgabe-Bogen.............................................. 31


Einführendes Praktikum in die HPLC

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung

Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine lei-

stungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatogra-

phischen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anor-

ganischen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbindungen, die

man in Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein chromatographi-

sches Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen trennen und an-

schließend qualitativ oder quantitativ bestimmen kann.

Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwen-

dung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems,

sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die

Eigenschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsy-

stem abschätzen können, man muss Mißerfolge bei der Trennung erklären

können und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz

erwerben.

I.2 Zielsetzung

Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung

in die HPLC zu geben.

In diesem Praktikum sollen u.a.

§ die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems

kennengelernt werden, wie

- die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h. rever-

sed phase-Phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule.

- die mobile Phase mit Eluentenversorgung,

- Pumpen und Einspritzventil (Autosampler),

- der Detektor,

- die Steuerungs- und Auswertesoftware;

§ die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt wer-

den;


§ wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durch-

bruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsge-

schwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.

§ die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen

Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.

Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems

näher beschrieben.

I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eineRP-Phase (reversed-phase-Phase)

RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von

denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP-

Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselge-

loberfläche (normal-phase-Phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Re-

ste (z.B. C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) un-

polar gemacht worden (sog. „endcapping“). Über die chemischen Einzelheiten

der Herstellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über

die Eigenschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakteri-

sierung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Her-

steller informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine

Reihe von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller

Trennungen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wieder-

verwendbarkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen

Einstellung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöh-

ten Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor al-

lem beim Gradientenbetrieb sehr wichtig.

O Si O Si O O Si O Si O Si O Si Si O O Si O Si O Si O Si O O Si O O

O

N C H 3 C H

3

N

Cl

C18-Ketten

Durch fast vollständiges „endcapping“ sindweniger Wechselwirkungen mit noch freienSilanolgruppen (SiOH) möglich.

Folge: „scharfe Peakform“

Abb. 1: Schematische Darstellung eines gut “endgecappten“ C18-Materials.


Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma Pheno-

menex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend „hydrophobem

Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen Sila-

nolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Hersteller

unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. Wegen der

schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser Restanteil

den somit nicht vollständig „endgecappten" RP-Phasen gewisse „Ionenaus-

tauscheigenschaften“.

Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Gelade-

ne Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert ihren La-

dungszustand ändern, z.B. saure Substanzen (z.B. Phenole) und besonders

basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen

"nicht vollständig endgecappten“ RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum

Tailing. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein,

dass man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es

heute viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen spezi-

ellen RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit

kürzeren organischen Resten (z.B. C12) möglichst vollständig modifiziert.

O Si O O Si O O O O O O O Si Si O O Si O O O O O Si O O Si O O

O

N C H 3 C H 3

N Cl

C18-Ketten

Verbindung interagiert mit noch„freien Silanolgruppen“

Folge: „Peaktailing“

Abb. 2: Schematische Darstellung eines nicht vollständig „endgecappten“

C18-Materials.

Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden

wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end-

gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig frei

ist von Schwermetallverunreinigungen (z.B. Merck: Purospher)


I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen

Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen

sind:

1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irre-

versibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub,

Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent.

Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des

Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns;

Säulenspülung mit geeignetem Eluenten.

2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer pH-Werte.

Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten"

3. Falsche Säulenaufbewahrung.

Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen !) und der Gefahr des Auskristallisie-

rens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in

Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung

von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril

gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich

eine Mischung aus 20% H2O und 80% Acetonitril.

I.4 Die mobile Phase (Eluent)

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilenPhasen

In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem

unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fäl-

len (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen

Mengen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder „Stärke“ der verschiedenen Elu-

enten wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert fest-

gehalten. Als Symbol dafür verwendet man E0 oder å0. Die so gefundene Rei-

henfolge von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man

die Eluotrope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität


geordnet sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) starker Eluent ist

polar, ein schwacher ist unpolar:

Eluent Polarität [E0] UV-Grenze [nm]

n-Hexan 0,00 190

Toluol 0,29 285

Chloroform 0,40 245

Dichlormethan 0,42 230

Aceton 0,56 330

Essigsäureethylester 0,58 260

Dimethylsulfoxid 0,62 270

Diethylamin 0,63 275

Acetonitril 0,65 190

Ethanol 0,88 210

Methanol 0,95 205

Wasser >1,11 <190

Tab. 1: Eluotrope Reihe (Auszug). Die angegebenen E0-Werte

gelten für Aluminiumoxid als Adsorbens, doch sind sie

für Silicagel nur um einen konstanten Faktor verschie-

den: E0 (SiO2) = 0,77 E0 (Al2O3). Die Lösungsmittelrei-

henfolge ändert sich also nicht, wenn man von Alumini-

umoxid auf Silicagel übergeht.

In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase

in der Mehrzahl der Fälle aus einem relativ polaren, mit Wasser mischbaren

organischen Lösungsmittel (meist Methanol oder Acetonitril), dem zur Erh -

hung der Polarität ein bestimmter Wasseranteil (evtl. mit Zusatz von Salzen:

Puffersysteme zur Einstellung eines erwünschten pH-Wertes) beigemischt wird.

Bei der Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels sind

viele Aspekte zu erwägen, auf die hier nicht eingegangen werden soll. Bei

Standardtrennungen ist meist Acetonitril die bessere Wahl (warum ?).

Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein und darf insbesondere keine

organischen Verunreinigungen enthalten (deshalb niemals Wasser verwenden,

das lediglich mit Ionenaustauschern entionisiert wurde). Solche Verunreinigun-

gen werden auf RP-Phasen zunächst stark retardiert (adsorbiert), und erschei-

nen dann oft unerwartet (besonders gegen Ende eines Gradientenlaufes) als

"Geisterpeaks" in einem Chromatogramm.


Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase

enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig

entgast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch:

Vakuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in

Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium

mischbar sind, ab).

Ganz wichtig ist auch, daß die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei von

Partikeln (z.B. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr

feinen Einlaßfritten (2 µm) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die

Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder

der Gebrauch von Einlaßfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist

bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es

muß sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wäs-

serige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Nie-

mals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach

Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pum-

pen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im

Laufe der Zeit auskristallisieren !

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen

Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem

Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < σ < 0,95). Dies ent-

spricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen

H2O im Verlauf der Trennung

Anmerkung:

Man muss sich leider damit abfinden, dass in allen HPLC-Büchern und Arbeits-

anweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben un-

ter Verwendung der definierten Gehaltsgröße ó "Volumenanteil", sondern oft

nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.B. oft: "Methanol/Wasser

50:50" oder "50% Wasser in Methanol" oder "Methanol 50 proz". Man kann

dann vermuten, dass damit wohl meist der Volumenanteil gemeint ist, weil das

der gängigen Arbeitsweise entspricht.

Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwei Arbeitswei-

sen: Die isokratische Elution und die sog. Gradientenelution.


I.4.2.1 Die Isokratische-Elution

Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung

nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis gemischt und entgast und

können dann von z.B. nur einer Pumpe gefördert werden.

- Vorteil: es wird nur einer Pumpe benötigt;

- Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennpro-

blemen oder in der Erprobungsphase eines neuen Eluen-

tensystems muss der Vorratsbehälter der mobilen Pase

häufig gewechselt werden. Erfahrung oder langwierige Er-

probungen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches Elu-

entengemisch zu optimieren (Zeitaufwendig !!).

I.4.2.2 Die Gradienten-Elution

Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung!

Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus zwei, von

ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw. vier Be-

standteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zusam-

mensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden. Auf

diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, konkav,

stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausreichend.

- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennpro-

blemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von

Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen;

- Nachteil: es werden oft zwei Pumpen (Hochdruckgradient) benötigt;

Erfahrungen im Gradientendesign sind nötig. So muß man

z.B. wissen, daß Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung

von Gradienten nicht optimal sind, weil die Mischungsreak-

tion stark exotherm ist, sowie eine Volumenverminderung

und eine Viskositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt.

Gemische aus Acetonitril und Wasser sind in dieser Hin-

sicht viel unproblematischer.


I.5 Die Pumpen

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem

Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der

Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wich-

tigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien ge-

nannt:

§ Es muß eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit ge-

währleistet werden.

Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und

damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig.

§ Es muß ein möglichst pulsationsfreier Fluß gewährleistet werden, weil

sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die

stationäre Phase schädigen können.

Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt,

dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung

durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmtem Wert

hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon würde der

Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen

der stationären Phase (< 5 µm) auch viel zu hoch werden. Deshalb erfolgen

LC-Trennungen im analytischen Maßstab (Trennsäulenlängen: bis 250 mm;

Durchmesser bis 4 mm) bei Fließgeschwindigkeiten im Bereich zwischen 1 und

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme

Hydraulik-Flüssigkeit

Membran

Kolben

Einlaßventil

Auslaßventil

Kolben

Abb. 3: Kolbenpumpe Abb. 4: Diaphragmapumpe


I.6 Die Injektionseinheit

I.6.1 Der automatische Probengeber (Auto-sampler)

Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Pro-

bengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen

Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der

außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges.

I.6.2 Die manuelle Injektion

Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, emp-

findliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Ver-

bindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten

Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die

technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionweise muss man sich in ge-

eigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines Auto-

samplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen sein,

seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beachtung

genannt:

§ Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen.

§ Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden.

Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe

dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet

werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt wer-

den.

§ Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-Stellung,

der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es

sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpak-

kung schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des ge-

samten Systems zum Ansprechen bringt.

§ Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen wer-

den, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.


I.7 Der Detektor

Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Die Wahl eines geeig-

neten Detektors ist abhängig von der Art der zu trennenden und zu bestimmen-

den Substanzen und von der Art der Begleitsubstanzen, deren eventuelle An-

wesenheit man erkennen will. Es gibt eine Vielzahl von Detektionsverfahren.

Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder sichtbarer Strahlung beruhen,

haben einen großen Einsatzbereich. Viele organische und anorganische Mole-

küle (Aromaten, Carbonylverbindungen, Komplexe) absorbieren im mittleren

UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen Absorptionskoeffizienten

(Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht ausreicht, kann man auch in das

kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann allerdings ist die Verwendung

von Eluenten mit Eigenabsorption ausgeschlossen. So muss man z.B. sehr

sauberes Acetonitril an Stelle von Methanol verwenden, um auch noch bei ei-

ner Wellenlänge von 190 nm messen zu können.

Spalt

Deuteriumlampe

Gitter

Flußzelle

Abb. 5: Schematische Darstellung eines Variablen-Wellenlängen-

Detektors (VWD-Detektor)

Anstelle eines gewöhnlichen VWD-Detektors (Abb. 5) kann auch ein spezielles,

computerunterstütztes Spektrophotometer, der Photodioden-Array-Detektor

(DAD) mit sog. „inverser Optik“ eingesetzt werden (siehe Abb. 6). Die Be-

zeichnung „inverse Optik“ bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, son-

dern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch

die Flußzelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale

Lichtfächer fällt dann auf das Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen

(100 - 1000) lichtempfindlichen Photodioden, welche nebeneinander angeord-

net sind. Diese Dioden werden elektronisch in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) kon-

tinuierlich ausgelesen und daraus eine Vielzahl von UV-Spektrum generiert.

Der DAD-Detektor ist somit in der Lage, während einer chromatographischen


Trennung die kompletten UV-Spektren der Peaks zu registrieren und abzuspei-

chern.

Dies ist besonders wichtig zur Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-

Purity-Check) und zur Ermittlung optimaler Detektionswellenlängen bei der

Untersuchung unbekannter Proben.

Deuteriumlampe

Gitter

Spalt Photodioden

Flußzelle

Abb. 6: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors

(DAD-Detektor)

Beim Einsatz eines UV-Detektors (bei anderen, komplizierteren Detektoren erst

recht) sind mehrere Punkte zu beachten, die hier nur kurz angesprochen wer-

den:

§ Lampenart (Hg, Wolfram, Deuterium), Wellenlängenbereich und Lebens-

dauer, feste Wellenlänge, variable Wellenlänge, DAD.

§ Volumen der Detektorzelle, das Peakvolumen und die Bandenverbreiterung:

- Als Peakvolumen wird das während der Elution des Peaks geförderte

Volumen bezeichnet. Es ist berechenbar aus der Basisbreite des Peaks

und der Fließgeschwindigkeit. Es ist einzusehen, dass das Volumen der

Detektorzelle viel kleiner sein muss als das Peakvolumen, denn sonst

würden sich (im Extremfall) bereits getrennte Peaks in der Detektorzelle

wieder vermischen. Zumindest kann ein zu großes Zellvolumen erheblich

zur Bandenverbreiterung beitragen.

- Das Peakvolumen steigt mit der Retentionszeit und dem k-Wert eines

Peaks (Substanz). Deshalb ist gerade für früh eluierende, schmale Pe-

aks mit kleinen Peakvolumina das Zellvolumen eine kritische Größe.


§ Die Empfindlichkeit eines Detektors hängt von Art, Typ und Hersteller ab

und kann meist in einem weiten Bereich eingestellt werden.

I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software

Bei neueren HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Proben-

aufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem Rech-

ner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Darstel-

lung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach Auf-

nahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Bear-

beitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen pas-

senden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei de-

nen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt, über-

nimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der Chro-

matogramme (heute nicht mehr gebräuchlich).

Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration)

wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Vorausset-

zung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen

Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie

konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlap-

pende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der

Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die

Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um

Störpeaks zu beseitigen.

Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog. Peak-

verarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus den

Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wich-

tigsten Peakverarbeitungsparameter sind:

- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der

ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten

interessierenden Peaks.

- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest (Peakerken-

nungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn) bzw.

negative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwan-

kungen der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur Peaker-

kennung durch die Software.


I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD)

In der HPLC ist es von großer Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen

Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Be-

dingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten er-

lauben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei ex-

akt symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herange-

zogen werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge

der zu analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der

Konzentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten ab-

hängig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Kon-

zentration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder

Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-

zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-

barer Korrekturfaktor verwendet werden.

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers

Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchen-

den Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den

sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard

eingesetzt werden soll, muß aber unbedingt einige wichtige Bedingungen er-

füllen:

§ sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-

kommen.

§ sie muß chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kom-

ponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der

Säule und der verwendeten mobilen Phase.

§ sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.

§ sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften

(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestim-

mende Substanz verfügen.

§ sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den

chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in ver-

gleichbarer Konzentration zugesetzt werden.

Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den

genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine

Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in


ähnlichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, läßt sich

für jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr

und fi nach folgenden Zusammenhängen ermitteln:

fi = i

i

ma fi = Response-Faktor der

Komponente i

ai = Fläche der Substanz i

mi = Masse der Komponente i

KFi = i

Tr

f

f = K

iKTr

KTr

Ki

am

am

⋅⋅ KFi = Kalibrierfaktor der

Komponente i

fTr = Response-Faktor

desTracers

miK = Masse der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

mTrK = Masse des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aTrK = Fläche des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aiK = Fläche der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

m xi = KFi ⋅⋅

xTr

xi

a

amTr

m xi = Masse der Komponente i in

der Probenlösung (X)

m xTr = Masse des Tracers in der

Probenlösung (X)

a xi = Fläche der Komponente i

a xTr = Fläche des Tracers

Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und glei-

cher Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus

der Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten

nach Formel (3) ermitteln.

(1)

(2)

(3)


I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil

1.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu

Normal-Phasen aufweisen.

2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.

3.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe ?

4) Welchem Ordnungsprinzip folgt die Eluotrope Reihe im Hinblick auf Po-

larität und Elutionskraft des Eluenten ?

5) Für welches Adsorbens gelten Eo-Werte ?

6) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?

7) Nennen Sie mindestens zwei mögliche Arten der Eluentenentgasung.

8) Worin betsteht der Unterschied zwischen einem binären und einem ter-

nären Gradienten ?

9) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer

aufweisen muß.

10) Wie ist der Kalibrierfaktor einer Komponente i definiert ?

11) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip

eines VWD-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläutern sie in diesem

Zusammenhang der Ausdruck: „Inverse Optik“.


II Experimenteller Teil

HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken(Kaffee und Energy-Drinks) mit der Metodedes Internen Standards

II.1 Einleitung

Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psycho-

pharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Sub-

stanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen

Krämpfe auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen,

die vorwiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.B. bei Coffein

diuretische, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Re-

gel keine bleibenden organische Schädigungen.

Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7-

Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und The-

obromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle drei

genannten Xanthinderivate kommen in Teeblättern

vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und in der

Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in Teeblät-

tern ist Coffein gegenüber den beiden anderen

Xanthinderivaten der Hauptbestandteil.

N

NN

N

O

O

CH3

CH3

CH3

Coffein

Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentra-

tionen von 85 - 250 mg/L enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach spezi-

ellen Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentra-

tion (ca. 350 mg/L) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2-

Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthal-

ten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" ver-

helfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksam-

keit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 mL Energy Drink

hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der

übrigen Bestandteile eher spekulativ.


II.2 Durchführung

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen

Coffein-Stammlösung (Lösung A):

10 mg Coffein (27600 Fluka � 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen

(Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysen-

systeme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend

wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkol-

ben überführt und mit H2O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der

Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird

beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml] ! ).

25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z

276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysensysteme

GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das

Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben über-

führt und mit Acetonitril (HPLC –Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt

Baker, D-64347 Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Mess-

kolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird be-

schriftet (Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml] ! ).

II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung

Herstellung der Eichlösung C:

Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany)

werden je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen

zusammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze

vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel ver-

schlossen und 10 s ultrabeschallt (Durchmischung) und beschriftet.

Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze

(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels

einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x

Tracer-Stammlösung (Lösung B):


11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die

Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach

oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil

Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Mache-

rey-Nagel, D-52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig !

durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst.

Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet

(Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentratio-

nen angeben !

II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen

Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1):

Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung wer-

den mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen

überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es

wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s ultrabeschallt. Filtration

analog Lösung C.

Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2):

700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden

mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s ultrabeschallt. Filtration analog Lösung C.

Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3):

700µl (Transfepette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden

mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s ultrabeschallt. Filtration analog Lösung (C).


II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen

Säule:

Phenomenex Luna© C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm

Vorbereitung:

Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H2O

[Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC –Ultra-Gradient-Grade

9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D-64347 Griesheim, Germany] bestückt wurde,

wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditio-

niert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingun-

gen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence

mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) ver-

messen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenom-

men, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard über-

haupt verwendet werden kann.

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung

A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein.

B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen).

C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte Gra-

dientenprogramm angeben 10% B → 95% B in 20 min.

B

C

A


II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens

D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein.

II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung

E : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein.

F : Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.

D

E

F


II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten

G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0°C ein.

II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter

H : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein.

I : Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.

G

H

I


II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers

J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die

Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abge-

arbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ).

Unter „Inj/Location“ ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeu-

tet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll.

Tragen sie unter der Rubrik „Sample Info“ die jeweiligen Vialkon-

zentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein.

II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence

K : Starten sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die Analysense-

quence, nachdem sie die Proben in den Probenteller des Auto-

samplers gestellt haben.

J

K


II.2.3 Die quantitative Auswertung

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis

L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter

dem Menüpunkt „Data Analysis“. Hier können u.a. die Integrations-

parameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als

auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot

etc.) durchgeführt werden.

II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle

M : Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie

die „Calibration Table“. Geben sie unter der Rubrik „Compound“

für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein.

N : Geben sie in der der Spalte „Amt (=Amount !)“ die Vialkonzentrati-

on der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in der Spalte

ISTD mit „YES“. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode drucken

sie mit „Print“ die Tabelle aus und schließen mit „OK“ ab.

L

NM


II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes(ISTD-Report)

O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben

(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme

der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes Chromato-

gramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen sie

den Menüpunkt „Specify Report“ aus. Im Fenster „Destination“

wählen sie „Printer“, im Fenster „Style“ wählen sie „Short“ aus.

Unter der Rubrik „Quantitative Results“ muss „ISTD“ aktiviert sein.

Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit dem

Kommando „Print Report“ kann danach jeweils der spezifische

quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie diesen

Report für jedes Chromatogramm aus.

O


II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil

1.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)

von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit tm des chromatographi-

schen Systems.

2.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen

Phase um in [cm/min].

3) Welche Geräteparameter tragen zur Beeinflussung der Durchbruchszeit

im Wesentlichen bei (nennen sie 2 Beispiele) ?

4) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie

das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.

5) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.

6) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen

Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.

7) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentrationen

an Coffein in [mg/ml] in den untersuchten Probenlösungen (Caffee-

8) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz

Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-

sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin.

9) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum

Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit).

10) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor ein-

schätzen (Begründung) ?

11) Was verstehen sie unter dem Ausdruck Isoplot ?


III Auswertung Theoretischer Teil


IV Auswertung Experimenteller Teil


Abgabe-Bogen / Gruppe

Name Vorname

Bemerkungen:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Testat erteilt am

durch

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Universität Regensburg Abteilung Instrumentelle Analytik ... · HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 1 Universität Regensburg Abteilung Instrumentelle Analytik CH 32.1.05