LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON

Peptone pancréatique de caséine 2 gExtrait de levure 1 g Chlorure de sodium 5 gPhosphate monopotassique 0,3 gGlucose 10 g Bleu de Bromothymol 0,03 gAgar (gélose) 3 g ED qsp 1 L

Composition

Source de C et N

Source de C à rajouter

solidification du milieu gélose semi solide

Indicateur de pHVert pH basique ou neutre, jaune pH acide

Milieu aqueux

pH = 7,2

Source de C, N, minéraux et vitamines

Source de PÉquilibre ionique

Technique d’ ensemencement

1- Régénérer le tube 20 minutes au bain marie bouillant

2- Ajouter le volume de solution de glucose stérile dans le milieu en surfusion: à 45°C

3- A jouter trois gouttes de suspension bactérienne et refroidir immédiatement le tube sous l’eau froide.4- Ne pas visser le tube à fond

5- Incuber 24 heures à 37°C

lectureVirage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide.Il y a eu production d’acides lors de l’utilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence d’O2.Les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose.

Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide.Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d’ O2.

Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose.

Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement. Il n’y a pas de culture.Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose

Le milieu Citrate de Simmons

Sulfate de magnésium 0,2 g

Phosphate monopotassique 1 g Phosphate bipotassique 1 gCitrate de sodium 2 gNaCl 5 g Bleu de Bromothymol 0,08 gAgar (gélose) 15 g ED qsp 1 L

Composition

Equilibre osmotique

Indicateur de pHVert pH basique ou neutre, jaune pH acide

pH = 6,8

Sources minérales

Seule source de C

6 7,6

Ensemencement

Faire une strie centrale avec une suspension en eau physiologique ou directement à partir d’une colonieNe pas visser le bouchon à fondIncuber 24 h à 37°C

Milieu de Clark et Lubs

Peptone trypsique ou polypeptone 5 à 7 gGlucose 5 gPhosphate bipotassique 5 gED qsp 1 L

Composition

Source de C

pH = 7

Sources minérales

Source minérale

Ensemencement

Ensemencer avec 5 à 10 gouttes de suspension bactérienne.Ne pas visser le bouchon à fondIncuber 24 h à 37°C

Test RM

Après incubation, prélever 2 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse.Ajouter 1 à 2 gouttes de rouge de méthyle.Observer. 4,5 6,8

Test VP

Après incubation, prélever 1 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse.Ajouter 0,5 mL d’-naphtol et 0,5 mL de soude. Mélanger et incliner le tube.Faire la lecture après 10 à 15 min de contact.

Milieu de Kligler Hajna

Extrait de viande de boeuf 3 gExtrait de levure 3 g Peptone 20 gChlorure de sodium 5 gCitrate ferrique 0,3 gThiosulfate de sodium 0,3 gLactose 10 gGlucose 1 g Rouge de phénol 0,05 gAgar (gélose) 12 g ED qsp 1 L

Source de C et N

Composition

Equilibre osmotiqueMise en évidence de la formation H1 SSource de soufre, témoin d’oxydo-rédcution

Source glucidique majoritaire

Source glucidique minoritaire

Indicateur de pH

6,5 8,2

pH = 7,4

Ensemencement

2) Piqûre centrale dans le culotFil droit ou pipette boutonnée

1) Stries serrées sur la penteÖse ou pipette boutonnée

Milieu mannitol mobilité nitraté

peptone 20 gNitrate de potassium 2 gMannitol 2 gRouge de phénol à 1 % 4 mLgélose 4 gED qsp 1 L

Composition

Source de C

pH = 8

Sources de C et N

Indicateur de pH

Ensemencement

Apport de nitrates

Piqûre centrale avec le fil droit

Lecture des milieux

Citrate de Simmons

1ère lecture possible

Le milieu ne présente aucune culture.Les bactéries n’utilisent pas le citrate comme source de carbone : CITRATE -

2nde lecture possible

Le milieu présente une culture, l’indicateur de pH a viré au bleu le milieu est devenu basique.Les bactéries ont utilisé le citrate comme source de carbone en produisant des composés alcalinisant le milieu: CITRATE +

Clarck et Lubs

1ère lecture possible

Le milieu est devenu rouge le pH est acide . Il y a eu formation de composés acides par les bactéries au cours de la fermentation du glucose.Les bactéries utilisent la voie des acides mixtes : RM +.

2nde lecture possible

1- Test RM

Le milieu est devenu jaune le pH est basique .Les bactéries n’utilisent pas la voie des acides mixtes lors de la fermentation du glucose : RM -.

2- Test VP

1ère lecture possible

2nde lecture possible

Formation d’une coloration rouge en surface . Il y a formation d’acétoïne et de butanediol dans le milieu lors de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie du butanediol : VP +.

Pas de modification du milieu .Les bactéries n’utilisent pas la voie du butanediol lors de la fermentation du glucose : VP -.

Mannitol mobilité

1ère lecture possible

Le milieu est resté rouge le pH est neutre ou basique .Les bactéries ne fermentent pas le mannitol : MANNITOL -.

2nde lecture possible

1- Utilisation du mannitol

Le milieu est devenu jaune le pH est acide .Les bactéries fermentent le mannitol et produisent des acides qui acidifient le milieu : MANNITOL +.

2- Mobilité

1ère lecture possible

Observation d’une culture dans tout le tube.Les bactéries ont diffusé dans tout le milieu : elles sont MOBILES.

Culture uniquement au niveau de la piqûre centrale.Les bactéries sont IMMOBILES.

2nde lecture possible

Kligler Hajna

1- lecture de la production d’H2 S

Précipité noir de sulfure ferrique

Production d’H2S par les bactéries ! H2S+

Pas de précipité noirbactéries ! H2S-

2- lecture de la production de gaz

Présence de bulles dans la géloseLes bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2) au cours de leur fermentation : GAZ +

Pas de bulle dans la gélosebactéries ! GAZ -

3- Lecture de l’utilisation du lactose

Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE -

Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +

Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE +

Le milieu reste orangé. Les bactéries n’utilisent pas le glucose et le lactose.GLC - et LAC -

Pente jaune

Culot rouge

Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif

Recherche de la -galactosidase

Elle s’effectue sur un tube de Kligler LAC -

1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente

2) Ajouter stérilement un disque ONPG

3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes

1) Le tube reste incolore. absence de la -galactosidase : ONPG -

2) La suspension est colorée en jaune présence de la -galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase.

Kligler Hajna

1- lecture de la production d’H2 S

Précipité noir de sulfure ferrique

Production d’H2S par les bactéries ! H2S+

Pas de précipité noirbactéries ! H2S-

2- lecture de la production de gaz

Présence de bulles dans la géloseLes bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2 a)u cours de leur fermentation : GAZ +

Pas de bulle dans la gélosebactéries ! GAZ -

3- Lecture de l’utilisation du lactose

Pente rouge

Culot jaune

Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE -

Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +

Tube jaune

Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE +

Tube orange

GLC - et LAC -

Pente jaune

Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif

Culot rouge