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LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX
HEPATITES VIRALES
bDNA
Plusieurs sondes de détection par cible
Ajouter sondes et ADN branché
TMA
Copies(ARN)
Ajouter primers et enzymes
1 sonde de détection par copie
Ajouter primers et enzymes
PCR
Copies (ADN)
1 sonde de détection par copie amplifiée
Cible ARN ou ADN Virus
1° - Les techniques de quantification virale
Détection en point final Détection en temps réel
TMA:
Avantages et inconvénientsAvantages:
Amplification d’ADN ou d’ARN
Permet l’amplification simultanée de plusieurs cibles
Production d’amplicons ARN
Réalisée dans un tube unique
Jusqu’à 100 résultats obtenus en 4 heures
Inconvénients:
Technique en grande partie manuelle
sensibilité / contaminations
bDNA
Pré-amplificateur*
Microplaque
ARN cible
Label Extender*(LE)
CaptureExtender(CE) Sonde de Capture
Sondes* marquées hybridées à l’Amplificateur*
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
3’UT3’UT5’UT5’UT C E1 E2/NS NS2 NS3 NS4 NS5StructuralStructural Non-StructuralNon-Structural
HCV RNAHCV RNA
1 18 129 214 297 392 487 578 658 7531 18 129 214 297 392 487 578 658 753
Spacer (SP)Spacer (SP)
Capture Extender (CE)Capture Extender (CE)
Label Extender (LE)Label Extender (LE)17 sondes de capture permettant une quantification Équivalente de tous les génotypes
Versant HCV-RNA (bDNA3.0)
bDNA
Caractéristiques Versant HCV RNA
bDNA
5 Standards
Gamme d’étalonnage externe
Phage recombinant
Contrôles
1 Positif Fort
1 Positif faible
1 Négatif (simple)
Linéarité3.200 – 40.106 copies/ml
615 – 7,7.106 UI/ml
Type ÉchantillonPlasma ou sérum
Volume échantillon50 µl
InstrumentationSystème 340 ou 440
bDNA
Technique automatisée
Excellente reproductibilité
Permet la quantification de l’ARN VHC avec une bonne linéarité
prise d’essai faible : 50 μl
Inconvénients
bDNAAvantages
84 résultats peuvent être rendus après 2 demi-journées sur 2 jours de manipulation
séries minimum de 24 échantillons
Sensibilité relativement faible : seuil de détection à 615 UI/l
PCR en point final
Amplicor Roche ou LCx Abbott Détection colorimétrique ou fluorimétrique en point final
PCR en point final
• Amplicor HCV 2.0 Roche– Linéarité :600 à 500000 UI/ml– Sensibilité 50 UI/ml en
qualitatif, 600 en Monitor
• Abbott LCx– Linéarité jusqu’à 23
millions IU/ml– Sensibilité 23 UI/ml
Hépatite C
PCR en temps réel
Gamme de linéarité
PCR en temps réel
Ct
Log C0
Droite standard
108 copies
10 copies
PCR en temps réel
SYBR® Green TaqMan ®
Sondes d’hybridation
MGB TaqMan ®
Molecular beacon, Scorpions...
PCR en temps réel
Principaux types de fluorophores
PCR en temps réel
Principe du FRET : Fluorescence resonance Energy Transfert
Transfert d’énergie sans transfert de photons (non radiatif)
λ d’excitation
quencherreporter
PCR en temps réel
Technologie TaqMan®
PCR en temps réel
Technologie FRET par sondes spécifiques
Cobas TaqMan 48
CTM 48 et AL 3.1 station
de pilotage
Extraction automatisée
cobas AmpliPrep
AbbottReal Time
Extraction
Chargement des tubes primaires
Préparation de la réaction de
PCR
Amplification et Détection
3h
15mn
1h30
Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie de capture sur billes de silice
Lyse, stabilisation et déprotéinisation Capture
Casse des Virus et des cellulesLibération des acides nucléiques
Virus ou Cellule
Cible ADN
ou
Cible ARN (Virus)
Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la surface des Magnetic Particle (Billes)
ParticleMagnetic(Billes) coatées à la silice
37°C
Libération des acides Nucléiques à partir des billes
Elution
80°C
Lavage
TA
• Une grande sensibilité
• Une gamme très étendue de linéarité
• Détection simultanée de plusieurs cibles (standard interne de quantification)
• Possibilité de Multiplex
PCR en temps réel
Les avantages
Inconvénients
• Prise d’essai importante d’environ 1ml
• Appareillage spécifique
Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
CAP/CTM TaqMan HCV :
Linéarité : 43 UI/ml à 69 millions UI/ml
Sensibilité : 15 UI/ml
Spécificité : 99,99%
Génotype : 1 à 6 ? : sous-estimation des génotypes 4
Abbott Real Time HCV
ART HCV :
Linéarité : 12 UI/ml à 50 millions UI/ml
Sensibilité : 12 UI/ml
Spécificité : >99%
Génotype : 1 à 6 : pas de dépendance au génotype
PCR en temps réel
L’hépatite C
CAP/CTM TaqMan HBV:
•Linéarité : 54 - 110 millions UI/ml
•Sensibilité : 12 UI/ml
•Spécificité : 99,50%
•Génotype : A à G,
mutants pré-core
Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
ART HBV :Linéarité : 1.16 log c/ml à 9.16 log c/ml
Sensibilité : 10 UI/ml
Spécificité : 100%
Génotype : A, B, C, D, E, F, G et H détectés
Abbott Real Time HCV
PCR en temps réel
L’hépatite B
2° - Les techniques de détection des génotypes et des mutants
ChromogèneChromogène(NBT/BCIP)
Précipité VioletPrécipité Violet
Cible ARN ou ADN Virus
LIPA SEQUENCAGE
ChromogèneChromogène(NBT/BCIP) Précipité VioletPrécipité Violet
VERSANT HCV LiPA 2.0
VERSANT HCV LiPA 2.0
3
1817
15
19
20
21
23. AC
Marker
CC
AC
4
8
7
5
6
9
10
11
12
13
14
25. 1 a
26. 1 b
24. 6 c-l
16
2b 3a 4b 6a1b 7-91aBand
positions
HCV RNA regions
5’ UT
Core
E 1
E 2
NS2
NS3
NS4
NS5A
NS5B
3’ UT
Core Region23 Amp Control24 6 c-l25 1a26 1b
5’ UT RegionSame band configuration as current LiPA
VERSANT HCV LiPA 2.0
• Extension du menu de génotypage– GT 1à 6 c-l
• 5’NCR GT 1-6• Core GT 1a/1b et GT 6 c-l
• Amélioration du soustypage – Meilleure Spécificité entre 1a et 1b
• Nouveau design des bandelettes• Toujours 1 bandelette /1 résultat• Marqué CE• Une boite d’amplification comprenant tous les réactifs
nécessaires• Plusieurs méthodes d’extraction testées et validées
TRUGENE HCV 5’NC
Autres protocolesAmplicor HCV Monitor
- Purification
CLIP™ Sequencing / TRUGENETM HCV 5 ’NC
Long-Read Tower™ GeneObjects™
Gene Objects™ / GeneLibrarian™
Rapport de génotypage
TRUGENETM HCV 5 ’NC (Type/Soustype/Isolat/accession number)
Détection du séquençage
Analyse de séquence
Preparation échantillons
Réaction de séquençage
3h
0h
5 ’NC Amplicon
TRUGENE HCV 5’NC
Génotypage HCV
• LIPA– Possibilité de grandes
séries avec détection automatisable
– Détection des doubles populations
– Lipa 1 sur amplicons Roche
mais– Lipa 1 : mauvaise
discrimination des sous-types 1, pas de 6
– Lipa 2 : mise en œuvre nécessitant une amplification spécifique
• TRUGENE– ++ pour épidémiologie
(comparaison de souches)– Meilleure discrimination des
sous-types
mais– Petites séries uniquement– Difficulté de mee de doubles
populations
Avantages et inconvénients des deux techniques
Mutants HBV : rappels
• Génome du virus B
Mutants précore :•Sur le gène précore mutation stop entraînant l’arrêt de la synthèse de l’Ag Hbe
•Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur la régulation du gène core
Mutants YMDD :•Sur le gène de la polymérase, site d’action des analogues nucléosidiques (lamivudine)
• Mutants précore :– Lien avec l’évolution de la maladie ?
– Lien avec la réponse au traitement ?
• Mutants de la polymérase :– Adaptation du ou des traitements :
• Apparition quasi systématique en cas de tt prolongé à la lamivudine seule
• Certaines mutations pourraient compromettre les traitements ultérieurs par d’autres molécules
• Arrêt du tt (sans risque) ou changement de molécule
Mutants HBV : rappelsInterêt de leur détection
• Même technologie que pour l’HCV
• Intérêt clinique : différences de pronostic d’évolution spontanée et sous traitement des génotypes :– Occident : A > D (plus sensible à l’interféron)
(Erhardt et al, Gut,2005, 54 : 1009-1013)
– Asie : B >C (moins d’activité inflammatoire et d’évolution vers la cirrhose; meilleure réponse au tt)
TRUGENE HBV GENOTYPING
TRUGENETM HBV assay
preS1 preS2
RNase HTP
HBsAg
SPACER RT
F A B C D E
110 279
101 237
~500pb
SA Mutations*145R
RT Mutations**173L180M/V204I/V (YMDD)207I
236T***
I169T, M250V****T184S/A and S202G****
* Carman et al. 1990 The Lancet, 336, 325-329** Pillay et al. 1998 International Antiviral News, 6:9*** Angus et al. 2003 Gastroenterology, 125, 292-297**** Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478
Lamivudine
Adefovir
Entecavir
TRUGENE HBV
Analyse des séquences
GeneObjects ™ / GeneLibrarian ™
TRUGENE™ HBV Report
Préparation de l’échantillon Extraction de l’ADN génomique Qiagen Blood DNA
Extraction Kit
PCR Réaction PCR 1.2 kb fragment
MutationsGenotype (A to G)
Réaction de séquençage
Sequencing Reaction CLIP sequencing (520 pb)
Détection desséquences
Long-Read Tower ™GeneObjects ™
GO 3.2
GeneLibrarian™ HBV Module:
Genotyping report (1): Genotype
séquence consensus la plus proche
HBV genotype
List of Mutations in SA and Pol (RT)
- Published substitutions
- Silent mutations (all positions)
- Substitution not at published sites
- Unpublished coding changes
GeneLibrarian™ HBV Module:
Genotyping report (2) : Mutation Profile
DETECTION DES MUTANTS HBV
technique LIPA par Innogenetics
Mutants précore Mutants YMDD
LIPA
Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas d’appareillage
Non
OUI
OUI
Non
TRUGENE HBV
automatisé, facile à interpréter, standardisé
OUI
OUI
OUI
OUI
Format
Genotype viral (A-G) Mutations RT Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur RT & SA
Mutants et génotypes HBV
Comparaison des deux techniques
Remerciements à
Catherine Lemagne, société Bayer
Nicolas Gautier, société Roche
Christine Murigneux, société Abbott
pour l’aide apportée dans l’iconographie