Lezione 4 alloimmunizzazione eritrocitaria dic 2010

Richiamo delle puntate

precedenti…..

1. Gli antigeni ABH sono composti da:

a. Carboidrati

b. Proteine

c. Lipidi

2. L’antigene H si ottiene:

a. Mediante l’aggiunta di uno zucchero all’antigene 0

b. Mediante l’aggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore

c. Mediante la trasformazione dell’antigene A ad opera di una

trasferasi

3. Il gene B codifica:

a. un enzima che aggiunge D-galattosio allo zucchero terminale

della sostanza H

b. Un polipetide transmembrana con un epitopo molto

immunogeno

c. un enzima che aggiunge N-acetilgalattosammina allo zucchero

terminale della sostanza H

4. Il gene Se:

a. Codifica per la presenza degli antigeni A e B nella saliva

b. È presente sul cromosoma 9 e l’allele amorfo è se

c. Codifica lo stato di secretore, ovvero la presenza di antigene H

nelle secrezioni biologiche c

5. La progenie di genitori entrambi di genotipo A0:

a. Può essere solo A0

b. Può essere A0, AA o 00

c. Sarà solo AA o A0 ma non 00

6. La quantità di sostanza H sulla superficie dei globuli rossi varia nel

seguente modo:

a. A2B >A1B > A1 > 0 >A2>B

b. B>A1>A1B>0> A2 >A2B

c. 0>A2>B>A2B>A1>A1B

7. Il sistema Rh è particolarmente importante poiché:

a. Tutti i soggetti D negativi presentano anticorpi anti-D

b. Gli antigeni D sono molto immunogeni

c. Gli anticorpi anti-D sono la principale causa di emolisi

intravascolare

8. I più importanti antigeni del sistema Rh sono:

a. Cw, Ew, e, CE

b. D, C, E, c, e

c. D, d, C, c, E, e

9. Il sistema Rh e trapianti di organi solidi:

a. Il sistema Rh non gioca un ruolo nei trapianti d’organo in

quanto gli antigeni Rh sono espressi solo sui globuli rossi

b. Il sistema Rh gioca un ruolo nei trapianti di rene poiché

l’antigene D è espresso sulle cellule endoteliali

c. E’ sconsigliato trapiantare un organo solido in un ricevente con

anti-D poiché è a maggior rischio di rigetto iper-acuto

10. Un donatore di sangue con espressione debole dell’antigene D:

a. Va considerato come Du

b. Va classificato come D positivo poiché è potenzialmente in

grado di immunizzare un ricevente D negativo

c. Va considerato come D negativo poiché non è in grado di

immunizzare un ricevente D negativo

11. Un ricevente di sangue con la variante DVI:

a. Non dovrebbe ricevere sangue da donatori D+ poiché potrebbe

produrre anticorpi anti-D

b. Può ricevere sangue solo da soggetti D+ poiché altrimenti si

immunizzerà contro gli antigeni d, c ed e

c. Può ricevere sangue solo da donatori DVI

12. La compatibilità trasfusionale nell’ambito del sistema Rh:

a. Prevede che nel modo più categorico NON si possa

trasfondere globuli rossi di donatori D+ a pazienti D-

b. Va sempre garantita la trasfusione di sangue D- a donne D- in

età fertile e ovviamente a tutti i soggetti con anticorpi anti-D

c. Poiché non esistono anticorpi D ‘naturali’ si può tranquillamente

trasfondere sangue D+ a tutti i soggetti D-

Risposte

• a

• b

• a

• c

• b

• c

• b

• b

• a

• b

• a

• b

• La membrana dei globuli rossi (come altre membrane cellulari) è un insieme di molecole lipidiche e proteiche. • I lipidi costituiscono circa il 50% della massa della membrana e sono suddivisi in fosfolipidi (60%), colesterolo (30%) e glicolipidi (10%). • Le proteine presentano un differente livello di espressione. Infatti, a fianco di proteine espresse con 200.000 copie/GR vi sono altre espresse in misura molto inferiore (50.000 copie/GR). • Le funzioni delle proteine presenti sulla membrana dei GR: recettori per le chemokine, molecole di adesione, proteine di trasporto, enzimi, controllo del complemento.

Membrana eritrocitaria

• Gli antigeni eritrocitari sono caratteristiche strutturali ereditate e polimorfiche, localizzate su proteine, glicoproteine e glicolipidi che si affacciano all’esterno della membrana dei globuli rossi.

• Per definizione gli antigeni sono immunogenici e possono portare alla produzione di allo-anticorpi specifici se introdotti nella circolazione di soggetti le cui cellule non presentano quel particolare antigene.

• Hanno importanza non solo nella trasfusione ma anche nell’ambito della compatibilità materno-fetale in quanto l’alloimmunizzazione verso antigeni presentati dalle cellule fetali può risultare nella malattia emolitica del neonato.

Antigeni eritrocitari

esterno

interno

• Quando una serie di antigeni presenti sulla superficie dei GR si eredita indipendentemente da un’altra serie, gli antigeni appartengono a diversi sistemi di gruppo sanguigno.

• Ad oggi sono noti 29 sistemi di gruppo sanguigno codificati da 39 geni che presentano 1000 alleli

• N. antigeni: 400

DISTRIBUZIONE DEGLI ANTIGENI (Ag) • Gli Ag che sono rappresentati nella quasi totalità degli individui sono indicati come ag ad alta frequenza

• Gli Ag presenti solo in poche persone sono definiti con il termine di Ag a bassa frequenza

• L’incidenza di questi ag ad alta o a bassa frequenza può anche essere diversa dei differenti gruppi etnici

• Gli Ag che descriveremo sono sono stati identificati, per la prima volta, dall’individuazione in un siero, del loro anticorpo specifico

A PROPOSITO DELLA DISTRIBUZIONE DISTRIBUZIONE DEGLI Ag IN DIVERSI GRUPPI ETNICI

• La glicoproteina Duffy è nota per essere un recettore per il parassita Plasmodium vivax, un agente patogeno della malaria • Nell’Africa Occidentale dove la malaria è endemica, il fenotipo eritrocitario Fy(a-b-), che è estremamente raro tra i bianchi, presenta una frequenza > 80%


Carboidrati • AB0 • P • Le • H • I

Proteine • MNS • Rh • Lu • K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co • LW

• Kx • Ge • Cr • Kn • In • Ok • Raph • JMH • GIL

Principali antigeni eritrocitari rilevanti ai fini trasfusionali


Proteine • MNS • Rh • Lu • K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co

• LW


Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition


SISTEMA MNSs ed U

• Sistema complesso, costituito da oltre 40 Ag • Ag presenti su 2 molecole glicoproteiche • M, N, S, s, U sono gli Ag principali

Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition Tratto da Technical Manual AABB. 15th Edition

SISTEMA MNSs ed U

• I GR privi di S e s possono essere negativi per l’Ag ad alta frequenza U; i soggetti privi di U possono produrre l’anticorpo anti-U, quando esposti a emazie U+




SISTEMA Kell

• Gli Ag del sistema Kell sono espressi con bassa densità sulla membrana eritrocitaria • Vengono indeboliti o completamente distrutti dal trattamento delle emazie con agenti riducenti o con acidi • Sono portati da una proteina e sono codificati da un singolo gene


SISTEMA Kell

• Identificato il primo anti-K nel 1946, causa di una MEFN • L’allele responsabile di K è presente nel 9% dei soggetti caucasici e 2% dei soggetti di origine africana • Kpa espresso in modo predominante nei bianchi, Jsa nei neri


NULL


SISTEMA Duffy

• Gli Ag Duffy sono codificati da un paio di alleli codominanti nel lcus Fy situato sul cromosoma 1 • Ci sono 4 fenotipi (di cui 1 assente nei caucasici) • La glicoproteina espressa dal gene Duffy è espressa anche in altri tessuti: cervello, rene, milza, cuore e polmone



esterno

interno


SISTEMA Kidd

• Gli Ag Jka e Jkb sono localizzati sulla proteina di trasporto dell’urea, codificata dal gene HUT1 (cromosoma 18) • il fenotipo Jk(a-b-) è estremamente raro



esterno

interno

• La rilevanza clinica di un sistema di gruppo sanguigno dipende:

dalla frequenza con cui si osservano alloanticorpi dalla caratteristica degli alloanticorpi (classe Ig, se IgG

sottoclasse, range termico, capacità di fissare il complemento, titolo)

determinano la capacità dell’anticorpo di distruggere i globuli rossi e di passare la placenta e causare MEN

Alloimmunizzazione eritrocitaria

antigeni anticorpi

Risposta alloimmune

cellulare

Epitopi differenti

Risposta Alloimmune

•alloimmunizzazione eritrocitaria

• rigetto acuto trapianti di organi solidi

• eventi sensibilizzanti: gravidanze, trasfusioni, trapianti

• Cellula effetrice: linfocita T citotossico

• responsabile per rigetto acuto trapianti solidi, GVHD, GVL

Risposta alloimmune

innata

Risposta alloimmune

umorale



Proteine • MNS • Rh • Lu • K • Fy • Jk • Di • Yt • Xg • Sc • Do • Co • LW


Alloanticorpi eritrocitari

Naturali • prevalentemente IgM, ma possono essere in parte IgG (IgG2 e IgG4) • raramente solo IgG

Definizione: anticorpi che si riscontrano in soggetti che non sono mai stati trasfusi, che non hanno avuto gravidanze o ai quali non siano mai stati iniettati GR con il relativo Ag. CROSSREATTIVITA’ (Ag

batterici)

Immuni • prevalentemente IgG (IgG1 e IgG3) • possono essere IgM • a volte una miscela di IgG e IgM

Formazione alloanticorpi eritrocitari

Indipendente da linfociti T • stimolazione dei linfociti B direttamente, senza l’aiuto di linfociti T

• IgM anti-A o anti-B • solo IgM in quanto

l’assenza dei linfociti T non consente lo switching isotipico

Dipendente da linfociti T • antigeni proteici

• anti-D è il principale esempio • RhD: è l’antigene più

immunogeno (dopo AB0)

Numero antigeni del sistema Rh 49. I più significativi: D,C,E,c,e

Molecole presentanti gli antigeni Proteine RhD e RhCE attraversano

la membrana cellulare a più riprese

(transmembrane, multipass).

Funzione non nota (forse trasporto

CO2 o NH4)

Base molecolare 2 geni: RHD e RHCE. Delezione

del gene RHD è responsabile del

fenotipo Rh negativo (d).

Frequenza degli antigeni Rh nei

caucasici

D 85%, C68%, E 29%, c 80%, e

98%

Aplotipo Rh più frequente nei

caucasici

DCe (42%)

Antigeni del Sistema di Gruppo Sanguigno Rh

Tipologia Prevalentemente di tipo IgG (misura molto

minore anche IgM)

Reattività Provocano emolisi. Raramente attivano il

complemento. Si legano ai GR ‘marcandoli’

per essere distrutti nella milza (emolisi

extravascolare)

Reazioni trasfusionali SI. Tipicamente reazioni ritardate, severe,

extravascolari.

MEN SI. Sono gli anticorpi più comunemente

implicati.

Anti-D circa il 50% MEN

Anti-D e anti-c forme severe

Anti-C, E, e forme moderate o lievi

Anticorpi prodotti contro gli antigeni del Sistema Rh

• Una percentuale di globuli rossi trasfusi non sarà vitale (in funzione dell’età dell’unità) • Queste cellule vecchie si frammentano mentre passano attraverso la milza, e molte proteine solubili di origine del donatore, vengono riversate nel sangue • I B-linfociti sorvegliano costantemente il sangue alla ricerca di proteine non-self, e quando incontrano proteine specifiche per il loro sito, si legano a loro.

Meccanismo DIRETTO di riconoscimento

• Il legame antigene-immunoglobulina manda un segnale alla cellula per internalizzare il recettore Ig, mediante un processo chiamato endocitosi • Una volta all’interno del linfocita B, l’antigene viene degradato in piccoli peptidi, alcuni dei quali si legano alle molecole MHC di Classe II.

• Le molecole MHC II con il loro peptide specifico vengono quindi portate in superficie dove incontreranno il T-cell receptor specifico dei Linfociti CD4 Helper

• L’interazione MHC-peptide-co-receptor stimola la produzione di Il-1, Il-2, Il-4, che danno il segnale ai linfociti B di proliferare e differenziarsi in plasmacellule e produrre anticorpi specifici per l’antigene presentato ai CD4.

• La classe anticorpale prodotta inizialmente è IgM, ma eventualmente si verifica uno switching ed inizia ad essere prodotto Ab di classe IgG.

• Nei laboratori di immunoematologia, l’anticorpo viene evidenziato mediante lo screening anticorpale oppure tramite il crossmatch indicando che l’alloimmunizzazione post-trasfusionale è avvenuta.

• Il secondo meccanismo di alloimmunizzazione prevede che le vecchie cellule trasfuse siano fagocitate da macrofagi della milza o fegato.

Meccanismo INDIRETTO di riconoscimento

• Una volta fagocitate, le proteine (alcune delle quali rappresentano gruppi sanguigni) vengono ‘digerite’ in molti diversi piccoli peptidi.

• I peptidi vengono trasportati sulla superficie delle cellule (APC) nell’ambito delle proteine MHC di classe II, pronti a essere presentati ai linfociti T helper (CD4)

• Il TCR in combinazione con le proteine CD4, riconosce le proteine ‘estranee’ e manda segnali all’interno della cellula affinché si producano e si secernano Il-2 e Il-4.

• queste citochine inviano segnali ai B-linfociti nelle vicinanze che abbiano riconosciuto lo stesso antigene, di proliferare e produrre anticorpi della medesima specificità

• Il meccanismo DIRETTO entra in gioco principalmente quando il carico antigenico non è eccessivo, come ad esempio nell’alloimmunizzazione materno-fetale

• Il meccanismo INDIRETTO invece, è implicato ad esempio in corso di trasfusione, quando lo stimolo antigenico è più rilevante

Meccanismo DIRETTO vs. INDIRETTO

• Una analisi su 159.262 pazienti ha dimostrato che complessivamente, solo il 2,9% dei pazienti trasfusi ha sviluppato anticorpi (G Hoeltge Arch Pathol Lab Med 1995)

• Uno studio più piccolo, su 2940 pazienti trasfusi, evidenzia una % di immunizzati pari a 2,6% (NM Heddle, BJH 1995)

Alloimmunizzazione eritrocitaria: la dimensione del problema

ricerca anticorpi 2003-2007

TS NEG

105960 (97,3%)

TS POS;

1948 (1,8%)TS senza risultato

979 (0,9%)

IDENTIFICAZIONI 2003-2007

anti-N; 4; 0%

anti-H; 4; 0%

anti-A1; 8; 1%AUTO-PAN TL; 9; 1%

PAN Coombs; 15; 1%

IMPILAMENTO; 10;

1%

anti-Kp a; 27; 2%

anti-Jk b; 5; 0%

ASPECIFICO; 86; 6%

anti-Fy a; 18; 1%

anti-Fy b; 1; 0%

anti-Jk a; 41; 3%

anti-KEL; 220; 15%

anti-Lu a; 24; 2%anti-Lu b; 1; 0%

anti-Lewis a; 58; 4%

anti-Lewis b; 19; 1%

anti-I; 35; 2%

AUTO-PAN Coombs;

35; 2%

anti-M; 72; 5%

anti-S; 21; 1%

anti-P1; 15; 1%

anti-C; 60; 4%

anti-E; 196; 14%

anti-D; 334; 23%

anti-c; 64; 4%

anti-Cw; 34; 2%

anti-e; 12; 1%

Ospedale San Gerardo, Monza

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

9,5

20-nov 22-nov 24-nov 25-nov 26-nov 27-nov 28-nov 30-nov 01-dic 02-dic 03-dic 04-dic

0

5

10

15

20

25

30

Hb

Bil

CD IgG+

TS=neg CD IgG+

TS=neg CD IgG+,

C3d++

TS=neg

CD IgG+,

C3d++

TS=pos,

anti Jka

Caso B.D., ematologia adulti: probabile reazione emolitica ritardata da anti-Jka

36949* 27890 Jka+ 28395 37048 73015 Jka+ 28891 Jka+

Paziente di 68 anni affetto da Linfoma di

Hodgkin, stadio IV, infiltrato midollare.

Recidivato in aprile ’08 dopo 5 anni

- TAC no lesioni focali

- Eco addome: fango e calcoli biliari

- Epatite cronica attiva HBV correlata

- Coombs diretto da IgG e C3d nel 2000;

eluato panagglutinante

Anamnesi trasfusionale positiva

28891 Jka-

* Unità di sangue trasfuse: in nero, tipizzazione Jka non nota, in rosso unità JKa positive e in verde, unità JKa negative

04-12-08

E

m

o

g

l

o

b

i

n

a

B

i

l

i

r

u

b

i

n

a

20 pazienti, 200 controlli

Responder vs. non-responder

Quali caratteristiche dei pazienti sono predittive

dell’alloimmunizzazione eritrocitaria?

Conoscere le condizioni cliniche che predispongono

all’alloimmunizzazione è importante per 2 motivi:

- consente una migliore gestione trasfusionale del paziente

(ad esempio somministrare trasfusioni più compatibili)

- migliora la conoscenza sulla eziologia di questa reazione

trasfusionale

Disegno dello studio: la scelta dei pazienti e dei controlli

Bauer et al. Transfusion 2007

Alloimmunizzazione: riscontro di un NUOVO alloanticorpo contro Ag eritrocitari al di fuori del

D e AB0. Solo le alloimmunizzazioni primarie sono prese in considerazione, e solo in

seguito a trasfusioni. L’alloimmunizzazione è attribuita alla ultima trasfusione prima

dell’evidenziazione del nuovo alloanticorpo.

Bauer et al. Transfusion 2007

Fattori predisponenti: sesso femminile, diabete mellito, neoplasia solida,

precedente trapianto di CSE.

• Le donne sono esposte ad alloantigeni durante la gravidanza ed il parto

• Diabete: nessuna spiegazionje apparente

• Neoplasia (nonostante chemioterapia): stato infiammatorio, attivazione del

sistema immunitario (Hendrickson Transfusion 2006)

• Trapianto CSE: stato infiammatorio

Fattori protettivi: malattie linfoproliferative, aterosclerosi sintomatica

• Malattie linfoproliferative: clone maligno può alterare la funzionalità dei T e B.

Chemioterapia può provocare immunosoppressione

• aterosclerosi: nessuna spiegazione

Il ruolo dell’infiammazione nell’alloimmunizzazione eritrocitaria

The role of inflammation in alloimmunization to antigens on transfused blood cells

J C Zimring, J E Hendrickson

Curr. Opin Hematol 2008

• Un vaccino proteico è solo debolmente immunogenico se somministrato senza

un adiuvante infiammatorio

• La patologia di base del ricevente una trasfusione potrebbe influenzare la

capacità di immunizzarsi

• casi di pazienti affetti da artrite reumatoide che sviluppano multipli

anticorpi dopo una singola trasfusione

• pazienti affetti da drepanocitosi sviluppano anticorpi con maggiore

frequenza rispetto ad altri pazienti: stato infiammatorio cronico?

• Uso di modelli animali: topi transgenici che esprimono antigeni eritrocitari

umani

• Induzione di uno stato infiammatorio (con un RNA a doppia elica)

• Aumentata produzione di alloanticorpi correlata allo stato infiammatorio

• 98 pazienti D- hanno

ricevuto in totale 445 unità D+

• 24 riceventi hanno formato

44 nuovi anticorpi di cui 22

(22%) anti-D

• dati di precedenti lavori

riferivano una percentuale

molto più elevata (80%)

• 98 pazienti D- hanno

ricevuto in totale 445 unità D+

• 24 riceventi hanno formato

44 nuovi anticorpi di cui 22

(22%) anti-D

• dati di precedenti lavori

riferivano una percentuale

molto più elevata (80%)

Transfusion 2003

• 8 pazienti affetti da AIDS RhD- hanno ricevuto unità di GRC

D+, media per paziente 6,25

• Nessuno ha sviluppato anti-D

• Nello stesso periodo dello studio, 6 pazienti D- affetti da altre

patologie e trasfusi con GRC D+ hanno tutti sviluppato anti-D

• Possibile spiegazione: riduzione dei linfociti T CD4+ tipica della

patologia

• L’immunogenicità dei diversi antigeni dei gruppi sanguigni può essere stimata in base alla frequenza dei relativi anticorpi (Giblett 1961) • Obiettivo dello studio: identificare i fattori che incidono sulla frequenza e specificità dell’alloimmunizzazione • Disegno dello studio: retrospettivo, 19 ospedali, 5 anni • Sono stati considerati anticorpi contro: Rh, Kell, Duffy, Kidd, MSs • Esclusi: anti-D, anticorpi contro Ag a bassa o alta frequenza • Solo pazienti con storia trasfusionale nota sono stati considerati • Dati raccolti: età, sesso, storia trasfusionale, intervallo tra trasfusione e screening Ab

N. Ab di interesse Probabilità di esposizione all’Ag K N. di Ab anti-K Probabilità di esposizione all’Ag d’interesse

X

Potenza relativa degli antigeni, confrontati all’antigene K, è stata determinata con l’equazione di Giblett:

• 1778 pazienti, 2177 anticorpi

• 284 pazienti con specificità

multiple (2-5)

• Rapporto femmine: maschi=2.2

• Età media 64 anni

• Totale 12.379 trasfusioni,

mediana 4 unità

• anti-C più frequente negli anziani, anti-M e anti-S più frequente nei giovani

• anti-Jka predominano nei pazienti di sesso maschile e dopo poche sacche

• anti-K più frequente nei politrasfusi

Anti-Jkb Anti-Jka Anti-Fya

Anti-K

Anti-c

Anti-E

• anti-E più frequente fino a 5 anni dall’evento sensibilizzante

• anti-Jka e anti-Jkb riscontrati nei primi 3 mesi, poi si riducono

Intervallo dalla trasfusione

• 0.3-0.4 % dei pazienti ha sviluppato anticorpi ENTRO 3 giorni dalla trasfusione

• Implicazioni per la regola dei 3 giorni di validità della richiesta trasfusionale

• Potenza immunogena degli Ag relativa al K: anti-K 1.3 volte più immonogeno del E,

3.5 volte Jka, 4.9 volte c, 11.6 volte il Fya

• anti-Jka e anti-Jkb riscontrati nei primi 3 mesi, poi si riducono

Considerazioni conclusive

• E’ importante conoscere i fondamenti immunobiologici dell’alloimmunizzazione anche per la pratica quotidiana • I grandi studi sull’alloimmunizzazione eritrocitaria ci danno indicazioni cliniche che potrebbero essere importanti per prevedere quali pazienti sono più a rischio di alloimmunizzazione • L’alloimmunizzazione eritrocitaria è una complicanza trasfusionale sottovalutata e sottoriconosciuta

SHOT Cumulative data 1996 – 2007 (4335 cases)

Transfusion reactions 2007-2009

FNHTR 195

Allergy (urticaria) 140

TACO 20

Significant hypotension 14

Severe bronchial spasm 4

DHTR 6

Anaphylactic shock 6

TA-GVHD 1

Transfusion errors

(acute hemolysis)

7

(2)

TRALI 2

Other 77

Total 472

Total N. transfused units 219,129

Frequency of transfusion

reactions/transfused unit

0.22%

Hemovigilance data from Friuli Venezia Giulia 2007-2009

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Lezione 4 alloimmunizzazione eritrocitaria dic 2010