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LINEE GUIDA LINEE GUIDA PER LA CITOGENETICAPER LA CITOGENETICA
Dicembre 2005Dicembre 2005Dicembre 2005Dicembre 2005
INDICAZIONI ALL’ANALISIINDICAZIONI ALL’ANALISI
Età materna >/= 35 anniEtà materna >/ 35 anniPrecedente figlio affetto da anomalia cromosomicaGenitori portatori di anomalia strutturale dei cromosomi geneticamente bilanciatageneticamente bilanciataGenitori con riscontro citogenetico di mosaicismo cellulareAnomalie fetali osservate in ecografiaTest biochimici indicanti un aumento del rischio cromosomicoMalattia genetica
Situazioni particolari devono essere valutate singolarmente con appropriata consulenza multidisciplinare che valuti i rischi generici del caso in oggetto ed i rischi connessi con il prelievo di celluledel caso in oggetto ed i rischi connessi con il prelievo di cellule fetali
Il completamento dell’iter diagnostico può richiedere l’estensione d li i i it idegli esami ai genitori
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICOCELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO
Per ogni liquido amniotico vanno allestite non meno di tre colture primarie, da mantenere in due diversi incubatori
E’ buona norma usare due diversi tipi di terreno o due lotti diversi dello stesso terreno, per eliminare i rischi di contaminazione delle lt / it ll lcolture e/o scarsa crescita cellulare
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICOCELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO
L t di d l i ti it li d ll l i ti dLo studio del cariotipo va eseguito analizzando cellule provenienti da un minimo di due colture primarie
Per il metodo in fiasca vanno esaminate almeno 16 cellule derivanti da due colture indipendenti ed in cui sia cresciuto un minimo di 10 colonie in totalecolonie in totale
Per il metodo in situ vanno esaminate almeno 10 metafasi, una per colonia, provenienti da 2 o più colture indipendenti
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICOCELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO
Indipendentemente dal metodo di coltura utilizzato devono essere li l 4 f i li ll di i l i i f ianalizzate almeno 4 metafasi, con un livello di risoluzione non inferiore
alle 320 bande per il riconoscimento degli omologhi e con ricostruzione del cariotipo, di cui 2 su stampa fotografica o con sistema di analisi dell’immagine
In caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero diIn caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero di metafasi/colonie analizzate esaminando altre colture ed eseguire un cariotipo per ogni linea cellulare trovata
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICOCELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO
I di b d i it ll l è bilitàIn caso di scarso bandeggio e scarsa crescita cellulare è responsabilità di chi firma il referto dare le adeguate spiegazioni sui limiti del referto
Si consiglia di non processare tutte le colture allestite per la diagnosi ma mantenere in vitro come riserva una piccola aliquota di cellule da utilizzare per ulteriori indagini Ciò evita la ripetizione del prelievoutilizzare per ulteriori indagini. Ciò evita la ripetizione del prelievo
ANALISI DA CELLULE ANALISI DA CELLULE DIDI VILLO CORIALEVILLO CORIALE
L’analisi citogenetica dei villi coriali può essere eseguitaL analisi citogenetica dei villi coriali può essere eseguita
Con metodo diretto
Le cellule del citotrofoblasto, che sono in divisione spontanea, vengono analizzate dopo una breve incubazione
Con metodo della coltura
Il villo viene disgregato con tecniche meccaniche o enzimatiche g gper permettere il rilascio di cellule dal mesenchima
Queste proliferano in coltura e vengono utilizzate dopo circa una settimana di colturasettimana di coltura
Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le g ppmetodiche
ANALISI DA CELLULE ANALISI DA CELLULE DIDI VILLO CORIALEVILLO CORIALE
Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodichePer una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodiche
Possono, infatti, verificarsi situazioni di discrepanza tra
Il cariotipo osservato da metafasi ottenute con metodo diretto e quello osservato in metafase ottenute con metodo da coltura
Il cariotipo osservato su villo coriale e quello osservato su altri tessuti fetali
Se la quantità di villo coriale è inferiore a 10 mg, insufficiente per entrambe le metodiche è preferibile optare per il metodo diretto perchéentrambe le metodiche, è preferibile optare per il metodo diretto perché esclude il rischio di analizzare cellule di origine materna
ANALISI DA CELLULE ANALISI DA CELLULE DIDI VILLO CORIALEVILLO CORIALE
MODALITA’ DI ANALISI (METODO SINGOLO)MODALITA DI ANALISI (METODO SINGOLO)
Nell’analisi del cariotipo si contano almeno 16 metafasi e analizzando 4 metafasi per riconoscimento degli omologhi e ricostruzione cariotipo, di cui due su stampa fotografica o con analisi di immagine
L’eventuale presenza di un mosaico richiede l’esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare
Nel caso del metodo da coltura si consiglia di analizzare metafasi provenienti da più aree di crescita ottenute da almeno due coltureprovenienti da più aree di crescita ottenute da almeno due colture indipendenti
ANALISI DA CELLULE ANALISI DA CELLULE DIDI VILLO CORIALEVILLO CORIALE
MODALITA’ DI ANALISI (COMBINAZIONE DEI METODI)MODALITA DI ANALISI (COMBINAZIONE DEI METODI)
Per l’analisi del cariotipo vanno analizzate 4 metafasi, con un livello di risoluzione non inferiore alle 320 bande, mediante l’appaiamento degli omologhi, 2 di queste con ricostruzione del cariogramma su stampa fotografica o con sistema di analisi di immagineg g
Per la definizione del cariotipo si devono analizzare in totale almeno 16 f i i i d i i b l di hmetafasi provenienti dai preparati con entrambe le metodiche
L’eventuale presenza di un mosaico richiede l’esecuzione di almeno unL eventuale presenza di un mosaico richiede l esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare ed il confronto dei risultati ottenuti con entrambe le metodiche
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA SANGUE FETALECELLULE DA SANGUE FETALE
L’indagine citogenetica prenatale su sangue fetale viene eseguita l i di i l i i di i isolo in presenza di particolari indicazioni
Riscontro tardivo di condizioni ad alto rischio diRiscontro tardivo di condizioni ad alto rischio di anaomalia cromosomica
Malformazione fetale evidenziata ecograficamente
Controllo di mosaicismo cromosomico e/o anomalieControllo di mosaicismo cromosomico e/o anomalie strutturali riscontrati su amniociti o su cellulee di villi coriali
ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA SANGUE FETALECELLULE DA SANGUE FETALE
Per l’analisi del cariotipo del feto vanno contate almeno 16 metafasi, 4 devono essere analizzate con appaiamento degli omologhi duedevono essere analizzate con appaiamento degli omologhi, due delle quali con ricostruzione del cariotipo su stampa fotografica o con sistema di analisi computerizzata.
Nel caso di controllo di mosaicismo precedentemente riscontrato su amniociti o cellule di villi coriali devono essere contate almeno 100amniociti o cellule di villi coriali devono essere contate almeno 100 cellule
Se il numero di metafasi analizzabili non fosse elevato, per la diagnosi citogenetica si dovrebbe fare riferimento alla tabella di esclusione di mosaicismo cromosomico ed al relativo grado di confidenza (Hook 1977)
La risoluzione del bandeggio non può essere inferiore a 550 bandeLa risoluzione del bandeggio non può essere inferiore a 550 bande
MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE
Il mosaicismo cromosomico rappresenta uno dei principali problemiIl mosaicismo cromosomico rappresenta uno dei principali problemi diagnostici nella determinazione del cariotipo fetale sia da villi coriali che da liquido amniotico
Mosaicismo fetale vero
Mosaicismo confinato alla placenta (CPM)Mosaicismo confinato alla placenta (CPM)
Pseudomosaicismo
Possono avere origine da
Errore mitotico postzigotico precoce in un embrione diploide normalenormale
Un fenomeno di ricostituzione della disomia da un concepimento trisomico
MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE
VILLI CORIALI
Il mosaicismo cromosomico può presentarsi in tre distinte situazioni
I. L’anomalia cromosomica a mosaico risulta presente solo nel citotrofoblasto, cioè osservata nelle metafasi ottenute con il metodo diretto e non in quello da coltura
II Il cariotipo anomalo a mosaico si osserva solo nella componenteII. Il cariotipo anomalo a mosaico si osserva solo nella componente mesenchimale del villo, indagabile con il metodo colturale e non nel citotrofoblasto
III. La line a cellulare anomala è presente sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima
MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE
VILLI CORIALI
Il riconoscimento di una condizione di mosaicismo nei villi corialiIl riconoscimento di una condizione di mosaicismo nei villi coriali richiede generalmente una conferma nel secondo trimestre
Nel caso in cui la linea cellulare anomala sia confermata si è in presenza di un mosaicismo vero, nel caso contrario si ha un CPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziatoCPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziato
Differenze nel cariotipo delle diverse componenti nell’unità feto‐placentare vengono osservate nell’1‐2% dei prelievi di villi coriali
MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE
LIQUIDO AMNIOTICOQ
Si possono evidenziare tre livelli di mosaicismo
I. Presenza di singola cellula con anomalia numerica e strutturale osservabile con una frequenza che varia dal 2,5 a 7 % nelle colture di amniociti
II. Due o più cellule con la stessa alterazione provenienti da una l i fi i l l i iù l i lcoltura in fiasca oppure singola colonia o più colonie anomale
osservate in una singola coltura in situ. Si è stimata una frequenza pari allo 0,7 – 1,1 %
III. Più metafasi o colonie osservate in almeno due preparati provenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture inprovenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture in situ indipendenti
MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE
LIQUIDO AMNIOTICO
I livelli I e II sono comunemente definiti come pseudomosaicismo
Il livello III mosaicismo fetale vero
La condizione di mosaicismo fetale vero osservata in prelievi di liquido amniotico è un fenomeno raro
DISOMIA UNIDISOMIA UNI--PARENTALE (UPD)PARENTALE (UPD)
E’ l’ereditarietà di due cromosomi omologhi da un solo genitore
E’ causata generalmente da eventi di non‐disgiunzione, seguiti da meccanismi di correzione di trisomie o monosomie
E’ associata, sembrerebbe, all’età materna e può venire individuata inizialmente in forma di trisomia a mosaico durante la diagnosi
t l i l di li i di illi i li h l diprenatale, sia nel caso di prelievi di villi coriali che nel caso di liquido amniotico
Traslocazioni Robertsoniane e cromosomi marcatori soprannumerari sembrano associate ad un rischio aumentato di UPD
DISOMIA UNIDISOMIA UNI--PARENTALE (UPD)PARENTALE (UPD)
INDICAZIONI PER LO STUDIO DI UPDINDICAZIONI PER LO STUDIO DI UPD
Estensione dell’indagine citogenetica a più tessuti fetali nei casi di osservato mosaicismo per escludere un mosaicismo fetale vero
Esecuzione del test in tutti i casi in cui sia evidenziata la presenza
Trisomia a mosaico per il cromosoma 15, in quanto è stata dimostrata la correlazione tra UPD materna e paterna e l’espressione di fenotipi patologici come sindrome di Prader‐Willi e la sindrome di Angelmanpatologici come sindrome di Prader Willi e la sindrome di Angelman
Trisomia a mosaico per i cromosomi 7, 11 e 14 per la provata esistenza di regioni di questi cromosomi sottoposte all’imprinting correlata alla manifestazione di fenotipi patologicimanifestazione di fenotipi patologici
Traslocazione coinvolgente i cromosomi 14 e 15
REFERTAZIONEREFERTAZIONE
1. L’intero referto deve essere scritto su carta intestata del laboratorio in cui è stata eseguita l’analisi
2. Deve essere riportata la data del prelievo e di arrivo in2. Deve essere riportata la data del prelievo e di arrivo in laboratorio del campione
3. La data del referto deve essere quella in cui si chiude e si firma l’ li i NO f ti li i il’analisi. NO referti preliminari
4. Identificazione del paziente con cognome, nome, data di nascita e numero di accettazione, codice paziente nel laboratorio
5. Indicare il tipo di tessuto
6 L’i di i ll’ li i ò f lt ti6. L’indicazione all’analisi può essere facoltativa
7. Il cariotipo fetale deve essere scritto secondo ISCN 95 e sue successive modifiche
REFERTAZIONEREFERTAZIONE
8. La formula del cariotipo sia normale che patologico deve essere accompagnata da una descrizione comprensibile anche ai non specialisti
9. Il referto deve contenere una descrizione dei metodi utilizzati. In particolare per analisi su villi coriali va chiaramente indicato l’eventuale utilizzo di entrambe le metodiche (diretta ol eventuale utilizzo di entrambe le metodiche (diretta o coltura)
10. Va segnalato il numero di colonie, aree, metafasi e il numero delle colture indipendenti analizzate. Per i villi coriali deve essere specificare la provenienza del preparato. Il numero delle metafasi è facoltativo
11. Ogni analisi va firmato dallo specialista responsabile diretto dell’analisi, con nome stampato.