Materijali za vježbe

1

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA FIZIKALNO-KEMIJSKIM

METODAMA

Izbor metode za određivanje koncentracije proteina u pojedinom slučaju ovisi o količini

proteina kojom se raspolaže, njihovoj koncentraciji, prisutnosti različitih agenasa koji mogu

utjecati na rezultate mjerenja (detergenti, organska otapala, reducirajući agensi, soli, kiseline,

lužine itd.), o vrsti i čistoći proteina u otopini te o potrebnoj preciznosti mjerenja. Fizikalno-

kemijske metode za određivanje koncentracije proteina se dijele na apsorpcijske i

kolorimetrijske metode.

APSORPCIJSKE METODE

Apsorpcijske metode se baziraju na apsorpciji svjetlosti određene valne duljine u

otopini proteina. Proteini imaju apsorpcijske maksimume pri valnim duljinama od 280 nm i

205 nm (UV dio spektra).

Svjetlost valne duljine 280 nm u molekulama proteina apsorbiraju aromatski prstenovi

aminokiselina (Trp, Phe, Tyr). Proteini sa manjim udjelom aromatskih aminokiselina stoga

imaju manju A280 u odnosu na proteine koji sadrže više aromatskih aminokiselina. Nadalje, na

vrijednost A280 utječu faktori koji djeluju na tercijarnu strukturu proteina (budući da

interakcije aminokiselinskih ostataka u tercijarnoj strukturi doprinose stabilizaciji elektrona u

aromatskim prstenovima) kao i prisustvo drugih molekula u otopini koje apsorbiraju svjetlost

pri 280 nm.

Svjetlost valne duljine 205 nm apsorbiraju peptidne veze u proteinima pa

aminokiselinski sastav proteina znatno manje utječe na vrijednost A205 nego što je to slučaj

kod A280. Veliki broj pepetidnih veza u molekuli proteina rezultira visokom vrijednošću

apsorbancije pa je mjerenjem A205 moguće detektirati znatno manje koncentracije proteina

nego pri 280 nm (A205 su oko 30 puta veće nego A280 za istu koncentraciju proteina).

Međutim, znatno veći broj kemikalija apsorbira svjetlost pri ovoj valnoj duljini nego što je to

slučaj pri 280 nm (pogotovo one koje sadrže dvostruke veze između atoma ugljika ili ugljika i

kisika). Određivanje koncentracije proteina mjerenjem A280, odnosno A205 je brzo i

jednostavno, a odnos koncentracije proteina i vrijednosti apsorbancija je linearan u širokom

opsegu koncentracija. Dodatna prednost ovih metoda je što se proteinima tijekom mjerenja ne

dodaju nikakvi reagensi, niti se na bilo koji način utječe na njihova svojstva, pa se nakon

završetka mjerenja mogu koristiti u daljnjim eksperimentima.

KOLORIMETRIJSKE METODE

Kolorimetrijske metode se baziraju na kemijskoj reakciji proteina sa različitim

reagensima pri čemu se razvija karakteristično obojenje otopine. Intenzitet razvijene boje je u

određenom opsegu koncentracija proteina proporcionalan koncentraciji proteina, a

najpreciznija su mjerenja u središnjem dijelu područja proporcionalnosti. Na točnost mjerenja

mogu utjecati i druge molekule koje su prisutne u otopini proteina (puferi, soli, detergenti

itd.), a na rezultate mjerenja utječe i vrsta proteina tako da različiti proteini jednake

koncentracije mogu pokazivati različite vrijednosti apsorbancije. Stoga je od iznimne važnosti

da se za izradu baždarnog dijagrama, ukoliko je to moguće, koristi protein čiju koncentraciju

kasnije želimo određivati u uzorcima, odnosno, ako to nije moguće, protein koji daje

najsličnije vrijednosti apsorbancije. Osim toga slijepa proba mora sadržavati sve komponente

koje sadrži i uzorak u kojem mjerimo koncentraciju proteina kako bi se eliminirao njihov

utjecaj na vrijednosti apsorbancije.

2

Određivanje koncentracije proteina metodom po Lowry-u

Metoda se bazira na reakciji Cu2+

sa peptidnim vezama proteina u lužnatom mediju pri

čemu dolazi do redukcije Cu2+

u Cu+. Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje Folin-

Ciocalteu reagens koji reagira sa Cu+-protein kompleksom kao i sa pobočnim lancima Tyr,

Trp i Cys stvarajući u početku nestabilan kompleks koji se polako reducira pri čemu se razvija

plavo obojenje. Prisustvo agenasa koji zakiseljuju otopinu (npr. kiseline, jaki kiseli puferi,

visoka konc. amonij sulfata i sl.), kelirajućih agenasa koji vežu Cu2+

(npr. EDTA) ili

reducirajućih agenasa (npr. -merkaproetanol, ditiotreitol i sl.) znatno utječe na rezultate

mjerenja. Također na rezultate mjerenja utječu i razlike u sadržaju Tyr i Trp u proteinima.

Određivanje koncentracije proteina metodom po Bradford-u

Metoda se bazira na reakciji proteina sa bojom Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB)

u kiselom mediju. CBB reagira prvenstveno sa pobočnim grupama Arg, a u manjoj mjeri i sa

pobočnim grupama His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Boja se na proteine veže hidrofobnim

interakcijama i ionskim vezama što stabilizira boju u anionskom obliku i dovodi do vidljive

promjene boje iz smeđe u plavu. Pri tome se apsorpcijski maksimum boje pomiče sa 465 nm

na 595 nm što se prati spektrofotometrijski. Ova metoda je u širokoj upotrebi zbog svoje

jednostavnosti, brzine i širokog opsega proprocionalnosti intenziteta obojenja i koncentracije

proteina.

3

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA MJERENJEM APSORPCIJE U

UV DIJELU SPEKTRA

Pripremiti uzorke otopine proteina albumina iz goveđeg seruma (BSA), odnosno

albumina iz bjelanjka kokošjeg jajeta (Alb), mješanjem otopine proteina početne

koncentracije 5 mg/ml; 0,5 mg/ml odnosno 0,05 mg/ml sa odgovarajućim volumenom

destilirane vode tako da konačne koncentracije proteina u uzorcima odgovaraju

vrijednostima navedenim u tablici 1., pri čemu konačni volumen uzorka treba biti 1

ml.

Tablica 1.

mjerenje A280 mjerenje A205

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

početna

konc.

proteina

(mg/ml)

volumen

otopine

proteina

( l)

volumen

vode

( l)

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

početna

konc.

proteina

(mg/ml)

volumen

otopine

proteina

( l)

volumen

vode

( l)

2 5 0,1 0,5

1,5 5 0,05 0,5

1 5 0,01 0,05

0,5 0,5 0,025 0,05

0,1 0,5 0,005 0,05

izmjeriti A280 i A205 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) i konstruirati dijagrame ovisnosti

A280 i A205 o koncentraciji proteina u uzorku

Tablica 2.

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

A280

BSA

A280

Alb

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

A205

BSA

A205

Alb

2 0,1

1,5 0,05

1 0,01

0,5 0,025

0,1 0,005

usporediti rezultate za BSA i Alb i odrediti područje linearnosti za određivanje

koncentracije proteina mjerenjem A280 odnosno A205

OTOPINE

- vodene otopine BSA koncentracija: 5 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml

- vodene otopine albumina koncentracija: 5 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml

4

Dijagram ovisnosti A280 o koncentraciji proteina:

Zaključak:

5


Zaključak:

6

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO LOWRY-u



koncentracije 0,5 mg/ml odnosno 0,05 mg/ml sa odgovarajućim volumenom

destilirane vode tako da konačne koncentracije proteina u uzorcima odgovaraju

vrijednostima navedenim u tablici 3., pri čemu konačni volumen uzorka treba biti 2

ml.

Tablica 3.

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

početna

konc.

proteina

(mg/ml)

volumen

otopine

proteina

( l)

volumen

vode

( l)

0,2 0,5

0,1 0,5

0,05 0,05

0,01 0,05

0,005 0,05

za svaku koncentraciju proteina potrebno je pripremiti tri paralelne probe te za cijelu

seriju mjerenja jednu slijepu probu

u 0,4 ml otopine proteina dodati 2 ml reagensa C, promiješati potresivanjem i držati na

sobnoj temperaturi 10 do 15 minuta

naglo dodati 0.2 ml Folin-Ciocalteu reagensa uz snažno mješanje (vortex) i ostaviti na

sobnoj temp. 40 do 60 minuta

izmjeriti vrijednost A740 (vrijednosti upisati u tablicu 4.) i konstruirati dijagrame

ovisnosti A740 o koncentraciji proteina u uzorku

Tablica 4.

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

A740

BSA

A740

Alb

0,2

0,1

0,05

0,01

0,005


koncentracije proteina metodom po Lowry-u

OTOPINE

- vodene otopine BSA koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml

- vodene otopine albumina koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml

- reagens A: 2% Na2CO3 u 0.1 M NaOH

7

- reagens B: 0.5 % CuSO4 x 5H2O u 1% K,Na - tartaratu

- reagens C: 50 ml reagensa A + 1 ml reagensa B

- Folin-Ciocalteu reagens: komercijalni reagens razrijeđen dest. vodom u omjeru 1:2


Zaključak:

8

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO BRADFORDU



koncentracije 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml odnosno 0,005 mg/ml sa odgovarajućim

volumenom destilirane vode tako da konačne koncentracije proteina u uzorcima

odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 5., pri čemu konačni volumen uzorka

treba biti 1 ml.

Tablica 5.

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

početna

konc.

proteina

(mg/ml)

volumen

otopine

proteina

( l)

volumen

vode

( l)

0,1 0,5

0,075 0,5

0,05 0,05

0,01 0,05

0,005 0,005

za svaku koncentraciju proteina potrebno je pripremiti tri paralelne probe te za cijelu

seriju mjerenja jednu slijepu probu

u 0,2 ml otopine proteina dodati 0,8 ml Bradfordovog reagensa, lagano promiješati i

ostaviti na sobnoj temperaturi 5 minuta

izmjeriti vrijednost A595 (vrijednosti upisati u tablicu 6.) i konstruirati dijagrame

ovisnosti A595 o koncentraciji proteina u uzorku

Tablica 6.

konc.

proteina

u uzorku

(mg/ml)

A595

BSA

A595

Alb

0,1

0,075

0,05

0,01

0,005


koncentracije proteina metodom po Bradford-u

OTOPINE

- vodene otopine BSA koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,005 mg/ml

- vodene otopine Alb koncentracija: 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,005 mg/ml;

- Bradford-ov reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250; 50 ml 95% EtOH; 100 ml

85% fosfatne kiseline; H2O do 1000 ml

9


Zaključak:

10

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UGLJIKOHIDRATA

Većina metoda za određivanje ugljikohidrata bazira se na reaktivnosti reducirajućih

grupa šećera. Rekacije na kojima se baziraju ove metode mogu se podjeliti na redukcijske

reakcije, reakcije s aromatskim aminima i reakcije s jakom kiselinom i fenolom ili

fenolnim spojevima. Metode koje se baziraju na redukcijskim reakcijama su jednostavne,

brze, točne i ne zahtijevaju posebnu opremu, međutim osjetljive su na redukcijske spojeve

i ne daju informaciju o kojem ugljikohidratu se radi, a određivanje nereducirajućih

ugljikohidrata zahtjeva prethodnu hidrolizu glikozidnih veza. Metode koje se baziraju na

reakciji reducirajućeg šećera sa jakom kiselinom i fenolom ili fenolnim spojevima daju

obojene komplekse čija je boja donekle specifična za pojedine ugljikohidrate. Fenolni

spojevi koji se koriste u tu svrhu su -naftol, 3-indol octena kiselina, rezorcinol, p-

bromoanilin, orcinol i sam fenol. 3-indol octena kiselina je specifična za ketoze pa se

koristi za određivanje fruktoze u prisutnosti glukoze. Orcinol i p-bromoanilin daju

različitu boju s pentozama u odnosu na heksoze.

11


POMOĆU REAKCIJA KARBONILNE GRUPE

DNS METODA

DNS metoda je jedna od redukcijskih metoda za određivanje koncentracije ugljikohidrata.

Bazira se na reakciji 3,5-dinitrosalicilne kiseline (DNS) sa slobodnom aldehidnom grupom

reducirajućih šećera u lužnatim uvjetima. Pri tome se aldehidna grupa šećera okisidira u

karboksilnu, a 3,5-dinitrosalicilna kiselina reducira u 3-amino-5-nitrosalicilnu kiselinu. 3-

amino-5-nitrosalicilna kiselina apsorbira svjetlost pri 530 nm pa se nastajanje 3-amino-5-

nitrosalicilne kiseline može pratiti spektrofotometrijski.

oksidacija

aldehidna grupa ----------> karboksilna grupa

redukcija

3,5-dinitrosalicilna kiselina ----------> 3-amino-5-nitrosalicilna kiselina

Različiti reducirajući šećeri međutim daju različit intenzitet obojenja pa je za svaku vrstu

šećera potrebno napraviti poseban baždarni dijagram.

ORCINOL – SULFATNA METODA

Orcinol –sulfatna metoda se bazira na reakciji šećera sa jakom kiselinom i fenolnim spojem

orcinolom. Tijekom zagrijavanjem šećera sa sulfatnom kiselinom šećer se dehidrira i nastaje

furfural (pentoze) ili hidroksimetilfurfural (heksoze), koji se zatim kondenzira sa dvije

molekule orcinola. Nastali spoj je obojen pa se može detektirati mjerenjem aposorbancije pri

505 nm.

12


DNS METODOM

pripremiti uzorke otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana mješanjem

otopine šećera početne koncentracije 1 mg/ml sa odgovarajućim volumenom

destilirane vode tako da konačne koncentracije šećera u uzorcima odgovaraju

vrijednostima navedenim u tablici 1. pri čemu konačni volumen uzorka treba biti 5 ml.

Tablica 1.

konc.

šećera

u uzorku

( g/ml)

volumen

otopine

šećera

( l)

volumen

vode

( l)

500

300

100

50

10

1 ml otopine šećera dodati 250 l DNS reagensa, epruvetu zatvoriti poklopcem i

inkubirati 5 minuta na 90 0C

izvaditi epruvete iz kupelji i ohladiti ih pod mlazom vode

dodati 1 ml destilirane vode

izmjeriti A530 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) prema slijepoj probi i konstruirati

dijagrame ovisnosti A530 o koncentraciji šećera u uzorku

Tablica 2.

konc.

šećera

u uzorku

( g/ml)

A530

glukoza

A530

fruktoza A530

ksiloza

A530

saharoza

A530

ksilan

500

300

100

50

10

usporediti rezultate za različite šećere i odrediti područje linearnosti za određivanje

koncentracije šećera DNS metodom

OTOPINE

- vodene otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana koncentracije 1 mg/ml

- DNS reagens: 1 g DNS-a otopi se u 20 ml 2 M NaOH i doda 50 ml svježe prokuhane

destilirane vode (ohlađene na 50 0C). Zatim se doda 30 g K,Na-tartarata i kada se sve otopi

nadopuni vodom do 100 ml.

13

Dijagram ovisnosti A530 o koncentraciji šećera:

Zaključak:

14


ORCINOL - SULFATNOM METODOM

pripremiti uzorke otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana mješanjem

otopine šećera početne koncentracije 1 mg/ml sa odgovarajućim volumenom

destilirane vode tako da konačne koncentracije šećera u uzorcima odgovaraju

vrijednostima navedenim u tablici 3. pri čemu konačni volumen uzorka treba biti 2 ml.

Tablica 3.

konc.

šećera

u uzorku

( g/ml)

volumen

otopine

šećera

( l)

volumen

vode

( l)

500

350

250

100

50

u 0,5 ml otopine šećera dodati 4,5 ml orcinol-sulfatnog reagensa, epruvetu zatvoriti

poklopcem i inkubirati 50 minuta na 80 0C

izvaditi epruvete iz kupelji i ohladiti ih pod mlazom vode

izmjeriti A505 (vrijednosti upisati u tablicu 4.) prema slijepoj probi i konstruirati

dijagrame ovisnosti A505 o koncentraciji šećera u uzorku

Tablica 4.

konc.

šećera

u uzorku

( g/ml)

A505

glukoza

A505

fruktoza A505

ksiloza

A505

saharoza

A505

ksilan

500

350

250

100

50

usporediti rezultate za različite šećere i odrediti područje linearnosti za određivanje

koncentracije šećera orcinol-sulfatnom metodom

OTOPINE

- vodene otopine glukoze, fruktoze, ksiloze, saharoze i ksilana koncentracije 1 mg/ml

- orcinol-sulfatni reagens: 8 ml 1,6% -tne vodene otopine orcinola pomješati sa 60 ml

razrijeđene H2SO4 (300 ml H2SO4 + 200 ml H2O)

Dijagram ovisnosti A505 o koncentraciji šećera:

15

Zaključak:

16

PROIZVODNJA PROTEINA Scw4-HA U STANICAMA

KVASCA S. cerevisiae

pripremiti 50 ml YNB podloge (tablica 1) za uzgoj kvasca S. cerevisiae transformiranog

plazmidom koji nosi gen za protein Scw4p obilježen HA-oznakom pod kontrolom

promotora za galaktozidazu

Tablica 1.

volumen

otopine

(ml)

50% vodena otopina glukoze 2

ili 20% vodena otopina galaktoze 5

vodena otopina His konc. 20 mg/ml 0,15

vodena otopina Lys konc. 3,6 mg/ml 0,4

vodena otopina Trp konc. 4,8 mg/ml 0,415

vodena otopina YNB konc. 6,7 g/l 45

prije inokulacije odvojiti 10 ml podloge i izmjeriti pH te koncentraciju proteina po

Bradfordu i koncentraciju šećera DNS metodom u podlozi (rezultate upisati u tablicu 2)

Tablica 2.

podloga pH konc. proteina

(mg/ml)

konc. šećera

(mg/ml)

prije inokulacije

nakon uzgoja

uzgojiti stanice kvasca preko noći na tresilici pri temperaturi 30 0C

odvojiti stanice kvasca od podloge centrifugiranjem 5 min / 3000 rpm

odvojiti 10 ml podloge i izmjeriti pH te koncentraciju proteina po Bradfordu i

koncentraciju šećera DNS metodom u podlozi (rezultate upisati u tablicu 2)

proteine izlučene u podlogu istaložiti dodatkom hladnog acetona u omjeru 11 ml podloge:

7,5 ml acetona, 1 sat na +4 0C

talog proteina odvojiti centrifugiranjem 1 sat na 10 000 rpm pri +4 0C, osušiti na zraku i

otopiti u 50 l Laemmli pufera

stanice kvasca isprati s 20 ml vode pa 2 puta sa po 20 ml pufera A

resuspendirati stanice u 0,5 ml pufera-A i prebaciti ih u Eppendorf-epruvetu

centrifugirati stanice u Eppendorf-centrifugi 30 sek., resuspendirati u 0,2 ml pufera A i

dodati 0,3 ml staklenih kuglica za razbijanje stanica

razbiti stanice vorteksiranjem 4-5 min

užarenom iglom probiti dno Eppendorf-epruvete i postaviti je u drugu Eppendorf-

epruvetu. Tako centrifugirati 15 sekundi pri čemu suspenzija razbijenih stanica prolazi u

drugu epruvetu, dok u prvoj zaostaju staklene kuglice

baciti supernatant (intracelularni sadržaj), a talog (stanične stijenke) isprati 3 puta sa po 1

ml pufera A uz centrifugiranje u Eppendorf-centrifugi 1 min.

17

resuspendirati stijenke u 1 ml “Laemmli”- pufera za uzorke i inkubirati ih 10 min. u

vrijućoj vodenoj kupelji

centrifugirati u Eppendorf-centrifugi 1 min i uzeti supernatant

prirediti 12%-tni poliakrilamidni gel za elektroforezu

po 20 l uzoraka proteina istaloženih iz podloge i proteina izoliranih iz stijenke

opomiješati sa 5 l Laemmly pufera i inkubirati 2 min. u vrijućoj vodenoj kupelji. Uzorke

nanijeti na gel i provesti elektroforezu. Na isti gel nanijeti još po 20 l uzorka kao

kontrolu koja će biti bojana na proteine.

po završetku elektroforeze dio gela s kontrolnim uzorcima odrezati i staviti u otopinu

Coomassie boje. Drugi dio gela pripremiti za prijenos proteina sa gela na nitrocelulozu

(“bloting” postupak)

provesti “bloting” 1,5 sat pri konstantnoj jakosti struje od 380 mA

blot inkubirati 30 min. u 10 ml pufera za blokiranje

blot inkubirati 60 min. u 5 ml pufera za blokiranje blota uz dodatak 5 l otopine anti-HA

isprati nitrocelulozu 3 puta 5 -10 min. puferom za ispiranje

dodati po 0,2 ml svake ECL-otopine na blot i pokriti nitrocelulozu folijom u kazeti za

razvijanje filmova

pokriti nitrocelulozu rendgenskim filmom 2 sata ili preko noći i razviti film

YNB-podloga za uzgoj kvasca: 6,7 g/L YNB; 2% glukoza ili galaktoza; 60 g/ml His; 40

g/ml Trp; 30 g/ml Lys

pufer-A: 50 mM K-fosfatni pufer pH 8,0

“Laemmli pufer” za uzorke proteina koji će se analizirati elektroforezom: 0,05 M Tris-

HCl pufer pH 6,8; 2% SDS; 5% -merkaptoetanol; 10% glicerol; 0,001% bromfenol

plavo

aceton

12 % poliakrilamidni gel za elektroforezu

pufer za provedbu elektroforeze: 25 mM Tris; 0,25 M glicin; 0,1% SDS

otopina boje Coomassie Briliant Blue R-250 za bojenje proteina u gelu: 0,1 g boje

Coomassie Brilliant Blue R250; 50 ml metanola; 7 ml ledene octene kiseline; destilirana

voda do 100 ml

pufer za “elektrobloting”: 10 mM NaHCO3; 3 mM Na2CO3; 20% MetOH

pufer za ispiranje nitroceluloze: 50 mM tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-

100

pufer za blokiranje nitroceluloze: pufer za ispiranje nitroceluloze; 1% obranog mlijeka u

prahu

otopina antitijela na HA-oznaku

ECL-otopine za reakciju peroksidaze (“razvijanje blota”)

razvijač i fiksir za razvijanje rendgenskog filma

18

Skica gela i blota:

Zaključak:

19

ODREĐIVANJE ČISTOĆE, KVALITETE I KOLIČINE DNA

Čistoću, koncentraciju i kvalitetu DNA je moguće analizirati spektrofotometrijskim,

fluorometrijskim te elektroforetskim metodama. Spektrofotometrijski se može odrediti

koncentracija DNA te ispitati čistoća uzorka tj. detektirati prisutnost RNA, proteina i fenola.

Najjednostavnija spektrofotometrijska metoda se bazira na mjerenju apsorbancije u UV dijelu

spektra. Postoje i druge, nešto složenije spektrofotometrijske metode za određivanje

koncentracije DNA kao npr. Burtonova kolorimetrijska metoda koja se bazira na reakciji

deoksiriboze sa difenilaminom pri čemu nastaje kompleks koji apsorbira svetlost pri 600 nm.

Fluorometrijske metode se baziraju na reakciji DNA sa nekim fluorescirajućim reagensom

kao što su npr. etidij-bromid i diaminobenzoična kiselina (DABA). Etidij-bromid interkalira

između susjednih baza u molekuli DNA pri čemu se razvija fluorescencija, dok DABA

reagira sa aldehidnom grupom deoksiriboze (sa koje je prethodno pomoću jake kiseline

uklonjena baza) dajući fluorescentni spoj. Elektroforeza DNA se može provesti u agaroznom

ili akrilamidnom gelu. Elektroforeza se standardno koristi za brzu i jednostavnu analizu DNA,

a omogućuje identifikaciju, razdvajanje, određivanje količine i pročišćavanje DNA.

SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE

Purinske i pirimidinske baze apsorbiraju svijetlost valne duljine 260 nm pri čemu

vrijednost A260=1 (mjereno u kiveti širine 1 cm) odgovara približno koncentraciji dvolančane

DNA od 50 g/ml. Jednolančana DNA i RNA jače apsorbiraju svjetlost pa tako vrijednost

A260=1 približno odgovara koncentraciji od 37 g/ml jednolančane DNA, odnosno 40 g/ml

RNA. Čistoća DNA se može spektrofotometrijski ispitati mjerenjem A280 i A230 te

izračunavanjem omjera A260/A280 i A260/A230. Čista DNA daje omjer A260/A280 između 1,8 i

2,0. Vrijednost omjera A260/A280 manja od 1,8 je pokazatelj prisutnosti proteina u uzorku, dok

su vrijednosti veće od 2,0 pokazatelj prisutnosti RNA u uzorku.

ELEKTROFORETSKE METODE

U neutralnom ili bazičnom mediju fosfatne grupe u molekuli DNA su negativno

nabijene pa sve molekule DNA u električnom polju putuju prema anodi. Razdvajanje

molekula različite veličine (koja se izražava brojem parova baza - bp) u električnom polju

postiže se provođenjem elektroforeze u gelu određene veličine pora koji pruža otpor prolazu

molekula. Brzina putovanja je obrnuto proporcionalna logaritmu veličine molekula, a ovisi i o

konformaciji molekula DNA, veličini pora gela, jakosti električnog polja i svojstvima pufera

u kojem se provodi elektroforeza.

Veličina pora u gelu se podešava ovisno o veličini molekula DNA koje želimo

razdvajati elektroforezom, pa tako u agaroznom gelu odgovarajuće gustoće možemo

razdvojiti molekule dvolančane DNA duljine od 50 do 50000 pb. Elektroforeza u

akrilamidnom gelu omogućuje bolje razlučivanje fragmenata DNA sličnih duljina nego

elektroforeza u agaroznom gelu i može se koristiti za veličine molekula od 6 do 5000 pb.

Nakon provedene elektroforeze molekule DNA u gelu se još uvijek najčešće

vizualiziraju pomoću etidij-bromida budući da se je metoda brza, jednostavna (etidij-bromid

se može dodati u gel, u uzorak ili se gel nakon provedene elektroforeze uroni na nekoliko

minuta u otopinu boje) i jeftina. Nedostatci metode su visoka toksičnost etidij-bromida, brzo

razlaganje DNA pod UV svjetlom što rezultira gubitkom signala te štetnost UV zračenja za

čovjeka. Zbog jake toksičnosti etidij-bromida sve se više koristite druge, uglavnom

20

fluorescirajuće boje koje su manje toksične i osjetljivije, ali višestruko skuplje. Nakon

elektroforeze u akrilamidnom gelu DNA se može bojati srebrom. Bojenje srebrom je vrlo

osjetljiva, jeftina i trajna metoda bojanja DNA, ali je kompliciranija i dugotrajnija od bojenja

etidij-bromidom. Bazira se na reakciji srebrnog nitrata u kiselim uvijetima sa DNA, nakon

čega se u lužnatim uvijetima ioni srebra reduciraju djelovanjem formaldehida i dolazi do

pojave obojenja. Boja se razvija zbog razlike u oksido-redukcijskom potencijalu između

područja u kojem se nalazi DNA i ostatka gela (redoks-potencijal dijela gela u kojem se nalazi

DNA je veći nego u ostatku gela).

Veličina molekula DNA na osnovu duljine putovanja u gelu može se odrediti

usporedbom sa duljinom putovanja DNA fragmenata poznate veličine (standardi). Pri tome

se, ukoliko je potrebno precizno određivanje veličine molekule DNA, mora konstruirati

baždarni dijagram koji prikazuje ovisnost logaritma veličine molekula DNA (bp) i duljine

njihovog putovanja. Budući da je osim veličine fragmenata poznata i količina DNA u

standardima moguće je ujedno, usporedbom intenziteta obojenja vrpce DNA sa vrpcom

standarda jednake (ili približno jedanke) veličine, procjeniti i količinu DNA u uzorku.

Broj vrpci nakon provedene elektroforeze daje informaciju o integritetu i čistoći

uzorka, a može se uočiti i eventualno prisustvo RNA u uzorku kao difuzna mrlja na dnu gela

(RNA molekule su znatno manje od DNA i međusobno vrlo različitih veličina pa smjesa

stanične RNA zaostale u uzorku, za razliku od DNA, ne daje oštro razlučene vrpce u gelu).

21

ODREĐIVANJE ČISTOĆE I KONCENTRACIJE DNA

MJERENJEM APSORPCIJE U UV DIJELU SPEKTRA

Pripremiti uzorke otopine DNA (genomska DNA izolirana iz stanica kvasca S.

cerevisiae), mješanjem otopine DNA početne koncentracije 50 g/ml sa

odgovarajućim volumenom destilirane vode tako da konačne koncentracije DNA u

uzorcima odgovaraju vrijednostima navedenim u tablici 1. (konačni volumen uzorka

treba biti 1 ml)

Tablica 1.

konc. DNA

u uzorku

( g/ml)

volumen

otopine

DNA

( l)

volumen

vode

( l)

50

35

20

10

5

izmjeriti vrijednost A260 (vrijednosti upisati u tablicu 2.) prema slijepoj probi i

konstruirati dijagram ovisnosti A260 o koncentraciji DNA u uzorku

Tablica 2.

konc. DNA

u uzorku

( g/ml)

A260

50

35

20

10

5

odrediti koncentraciju DNA u uzorku plazmidne DNA pomoću pripremljenog

baždarnog dijagrama

izmjeriti A280 za uzorke plazmidne DNA te izračunati omjer A260/A280 (vrijednosti

upisati u tablicu 3)

Tablica 3.

A260 konc.DNA

( g/ml) A280 A260/ A280

OTOPINE

- otopina genomske DNA koncentracije 50 g/ml

- otopine plazmidne DNA

22

Dijagram ovisnosti A260 o koncentraciji DNA:

Zaključak:

23

ODREĐIVANJE ČISTOĆE, KOLIČINE I INTEGRITETA DNA

ELEKTROFOREZOM

pripremiti 20 ml 1%-tnog agaroznog gela (izvagati agarozu i dodati u 20 ml TAE

pufera), rastaliti zagrijavanjem i kada se ohladi na 50 – 60 0C izliti u kalup za gel

te umetnuti češljić za jažice

pustiti da se gel skruti na sobnoj temp., izvaditi češljić i gel položiti u kadicu za

elektroforezu tako da pufer prekriva površinu gela

pripremiti uzorke za elektroforezu (linearizirani plazmid, plazmid nakon restrikcije

sa EcoRI i DdeI restrikcijskim enzimima) mješanjem otopine DNA sa puferom za

uzorke u omjeru 6:1 i nanjeti ih u jažice gela; u jednu jažicu staviti 1 l otopine

standarda koncentracije 0,5 g/ l

provesti elektroforezu

gel nakon elektroforeze uroniti u otopinu etidij-bromida na 15 minuta

pogledati gel pod UV svjetlom i skicirati položaj i jačinu fragmenata u odnosu na

standarde

konstruirati baždarni dijagram (ovisnost logaritma veličine molekula DNA (bp)

standarda i duljine njihovog putovanja)

izračunati udio (%) i masu (ng/0,5 g) pojedinog fragmenta u standardima i

usporedbom intenziteta vrpci u DNA procjeniti količinu DNA u jažici

Skica gela:

bp % ng/0,5 g linearizirani EcoRI DdeI

plazmid restrikcija restrikcija

Materijali:

- DNA standardi (λ /HindIII)

- otopina linearizirane plazmidne DNA

- otopine plazmidne DNA nakon restrikcije sa EcoRI

- otopine plazmidne DNA nakon restrikcije sa DdeI

- agaroza

- TAE pufer (50x koncentriran: 242 g TRIS; 57,1 ml octena kiselina; 37,2 g Na2EDTA; pH 8,5)

24

Baždarni dijagram:

Zaključak:

Documents

Materijali za vježbe