Metode istraživanja u histologiji

Livia Puljak

Katedra za histologiju i embriologiju

Zašto se uči histologija

• Učenje mikroskopske građe ljudskog tijela• Razumijevanje načina na koji različita tkiva

funkcioniraju – temelj za fiziologiju• Da bi znali kako izgleda bolesno tkivo, moramo

znati kako izgleda zdravo – temelj za patologiju• Histologija je važna za moderna znanstvena

polja: apoptoza stanice, prepoznavanje stanice, implantacija embrionalnih matičnih stanica, itd.

• Histologija je temelj za kliničke znanosti

2

Mikro-morfologija tkiva

3

Proučavanje tkiva

• Uobičajeni postupak: pripravljanje histoloških rezova• Promatranje svjetlosnim mikroskopom• Tkiva i organi su debeli

– Treba ih rezati da kroz njih može prolaziti svjetlo• Moguće je promatrati žive stanice

– Tanki slojevi tkiva• Ipak, najčešće se tkiva mogu proučavati tek nakon što

se izrežu na tanke rezove koji se prilijepe na stakalca

4

Idealan histološki preparat

• Pripravak tkiva očuvan• Tkivo na stakalcu ima jednaku građu i molekularni

sastav kakvo je imalo u tijelu• Rijetko izvedivo u praksi• Na pripravku gotovo uvijek ima

– Artefakata– Deformacija– Gubitaka sastojaka

Nabor na preparatu hrskavice

5

Priprema histoloških rezova

1. Uzimanje i obrada tkiva ili stanica

2. Fiksiranje/smrzavanje tkiva

3. Uklapanje tkiva

4. Rezanje tkiva mikrotomom ili kriostatom

5. Bojanje tkiva

6. Analiza

6

Fiksacija

• Za pripremu trajnih preparata

• Da se izbjegne razgrađivanje tkiva– Enzimima– Bakterijama

• Nužna brza i prikladna fiksacija

• Kemijske i fizikalne metode fiksacije

7

Kemijska fiksacija tkiva

• Otopine tvari (fiksativi)• Stabiliziraju ili križno povezuju tkivne bjelančevine• Rezanje i umakanje tkiva u otopinu• Intravaskularna perfuzija

• Ubrizgavanje fiksativa u krvožilni sustav

8

Kemijski fiksativi

• Križno povezivanje bjelančevina– Aldehidi

• Precipitirajući fiksativi– Alkohol

• Oksidirajuće tvari– Osmijev tetraoksid, kalij dikromat, kromna kiselina,

kalij permanganat• Živini spojevi• Pikrati • HOPE fiksativ

9

Fizikalna fiksacija tkiva

• Fiksacija toplinom• Kad se bris osuši na sobnoj temperaturi• Preparat se nekoliko puta prinese plameniku• Rutinski se koristi za bakterije• Čuva morfologiju, ali ne interne strukture• Toplina:

– denaturira proteolitičke enzime– spriječava autolizu

10

Postupak uklapanja ili impregniranja tkiva

• Dehidriranje– Uklanja se voda– Uzastopnim prenošenjem u sve koncentriranije

mješavine etanola i vode• Zamjena etanola otapalom za sredstvo za uklapanje• Za vrijeme prožimanja otapalom tkivo obično postane

prozirno (prosvjetljivanje)• Uklapanje u otopljeni parafin u termostatu• Van termostata:

– tkivo proženo parafinom se stvrdne

11

Uklapanje tkiva

• Tkivo se može rezati tek kad se uklopi u neko čvrsto sredstvo

• Za rezanje mikrotomom – plastične smole i parafin

• Za rezanje smrznutih rezova – uklapanje u poseban medij koji se brzo smrzne

12

Tkiva uklopljena u parafinu i spremna za rezanje i postavljanje na stakalca

13

Rezanje tkiva

• Rezanje tkiva točno određene debljine

• Mikrotom– Nužna prethodna

složena priprema tkiva

• Kriotom– Smrznuti rezovi,

jednostavna priprema tkiva

Mikrotom

Kriotom

14

Smrznuti rezovi

• Brza metoda• Bez prethodnog dugog postupka uklapanja• Rutinska primjena u bolnicama za pregledavanje

tkiva tijekom kirurškog zahvata• Korisno u histokemijskom istraživanju vrlo

osjetljivih enzima i malih molekula• Za proučavanje tkivnih lipida

15

Bojenje

• Tkiva su uglavnom bezbojna

• Stoga nije moguće svjetlosnim mikroskopom proučavati neobojena tkiva

• Bojenjem se ističu pojedini sastojci tkiva

• Bazofilne boje

• Acidofilne boje

• Trikromi

• Kontrastno bojenje

16

Hematoksilin i eozin

Jednjak

Hematoksilin boji bazofilne sastojke tkiva, a eozin boji acidofilne sastojke

17

Trikromi

Trikromi dobro prikazuju jezgru i citoplazmu, a različito oboje kolagen i glatko mišićje

18

Kontrastno bojenje

-U mnogim postupcima (npr. imunocitokemija) pojedinosti na rezovima označavaju se nekim precipitatom-Ali tada se ne vide obrisi stanica-Kontrastno bojenje, jednom bojom, omogućuje blijedo bojenje jezgre i citoplazme

-Slika: crveno je bojenje za protein CD61, a plavo je kontrastno bojenje jezgre

19

Svjetlosni mikroskop

-Zasniva se na uzajamnom djelovanju svjetla i tkivnih sastojaka-Najvažniji preduvjet za dobivanje jasne slike jest moć razlučivanja mikroskopa

20

Polarizacijski mikroskop

Omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula

21

Slika preparata snimljenog na polarizacijskom mikroskopu

Štakorski mezenterij obojen pikrosirijusom za prikazivanje kolagenih vlakana. U polariziranom svjetlu kolagena su vlakna obojena sjajno crveno ili žuto

Polarizacijski mikroskop omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula

22

Konfokalni mikroskop

Omogućuje veoma točno fokusiranje na sasvim tanku ravninu unutar stanice ili histološkog reza

23

Slika preparata snimljenog na konfokalnom mikroskopu

Mreža aktinskih vlakana u glatkom mišiću dijafragme štakora

24

Slika preparata snimljenog na fluorescencijskom mikroskopu

Fibroblasti maternice. Bojanje s 3 različite fluorescentne boje.

Fluorescencijski mikroskop sadrži izvor ultraljubičastog svijetla i posebne filtre za odabir svjetlosnih zraka različitih duljina

25

Elektronski mikroskop-Dopušta povećanja od 400 000 puta

-Transmisijski EM (na slici)-Snop elektrona prolaze kroz preparat

-Skenirajući (scanning) EM-Omogućuje prikaz naizgled trodimenzionalne slike-Uski snop elektrona polagano klizi na površini preparata (skenira)

26

Slika preparata snimljena na TEM

Crijevni mikrovili

27

Slika preparata snimljena na SEM

Leukociti u krvnoj žili

28

EM slike mogu se računalno obojati

Jajna stanica

29

Ako su tkiva dobro obrađena i fiksirana mogu se uspoređivati kontrolna tkiva

obojena H&E sa onima koja su patološki promijenjena i utvrditi razlike

30

Artefakt: nabor tkiva Artefakt: pukotina u tkivu

Artefakt: znak noža i nabor

31

Proučavanje histoloških preparata

• Pregledati cijeli preparat

• Presjek – poprečni ili uzdužni

• Povećanje – veliko, srednje ili malo

• Na mnogim preparatima je teško točno utvrditi za sve stanice koje su – nemojte se stoga frustrirati

32

Presjek – uzdužni, poprečni, kosi

33

Ponekad se na istom preparatu vide različiti presjeci kroz istu vrstu tkiva

34

Ako nema informacije o povećanju, treba utvrditi je li malo, srednje ili veliko

Hint: Malo povećanje – puno stanica, veliko povećanje – malo stanica

35

Usporedba zdravog i bolesnogHistologija - Patologija

Blokirana koronarna arterija

36

Emfizem pluća

37

Anemija srpastih stanica

38

Upala mliječne žlijezde zbog curenja silikona

39

Čir želuca

40