Metode MikrobiologisPenanganan MikrobiaSterilisasi dan desinfeksiMikroskopiPengecatan mikrobiaEnumerasi mikrobia

1. Penanganan mikrobiaSafe handling microbes:Sebagian besar mikrobia bermanfaatSebagian kecil mikrobia merupakan agensia penyakit e.g. HIV, Neisseria meningitisKultur mikrobia tidak terlepas ke lingkunganKultur mikrobia tidak terkontaminasi oleh mikrobia lainTeknik saftey harus dipenuhi dalam bekerja dengan mikrobia Bahan dan alat dan tempat bekerja harus steril (teknik aseptis)Kultur mikrobia yang tidak dipakai lagi harus dimusnahkan

Metode kultur murni (Pure culture)Mikrobia yang dipelajari harus dalam bentuk kultur murniStrain : kumpulan sel kultur murni yang berasal dari satu sel tunggalUntuk memperoleh kultur murni maka harus dbekerja dengan Teknik AseptisSemua bahan dan alat yang digunakan harus steril

Isolasi: kultur murniInokulasiKoloni

2. Sterilisasi dan disinfeksiSteril: bebas dari segala bentuk kehidupanSterilisasi: upaya untuk mencapai keadaan sterilBactericidalFungicidalViricidal (seolah virus jasad hidup !) - inactivatorGermicidesBacteristaticFungistaticAntibiotics

2. Sterilisasi dan disinfeksiDesinfectionDesinfectanAntisepsisAntisepticSanitation

Metode Sterilisasi1. Metode Fisikawi:Mekanis : filtrasiPemanasan: Pemijaran: e.g. pemijaran ose Udara panas kering: e.g. ovenUap air panas: e.g. Arnold steam sterilizerUap air panas bertekanan: e.g. AutoclavePenyinaran : Radiasi UV, gamma

Metode Sterilisasi2. Metode Kimiawi:Disinfectant: fenol, cresolAntiseptics: HgCl2, betadineAntibioticsOzonization (ozon)

3. MikroskopiLight microscopy:Bright-field microscopyDark-ground microscopyPhase-contrast microscopyFluorescence microscopyElectron microscopy:Scanning Electron Microscopy (SEM)Transmission Electron Microscopy (TEM)

Confocal microscopyConfocal scanning laser microscopy (CSLM)Memakai sinar LASERBayangan tiga dimensi dan lebih jelasScaning Probe MicroscopyScanning tunneling microscope (1980)G. Binnig & H. Rohrer : Nobel Prize (1986)Perbesaran 100 juta kaliDapat melihat atom pada permukaan padatAtomic force microscope (lebih baru)Spesimen yang non-konduktor: interaksi protein, letak restriction site pada plasmid

4. Pengecatan mikrobiaGram stainingZiehl-Neelsen stainingGranules stainingNegative stainingSpore stainingSimple staining

Pengecatan Gram

Pengecatan Gram

5. Enumerasi mikrobiaTotal countsBreed slide methodPetroff-Houser chamberHaemocytometerViable countSpread-plate techniquePour-plate techniqueFiltrationMPN (Most Probable Number)Berat keringSpectrophotometric

Breeds Slide methodSejumlah volume (0,1 ml) sampel dibuat preparat smear di atas gelas benda dengan luas tertentu (1 x 4 cm2)Difiksasi, lalu diwarnai dan dikeringkanDiamati di bawah mikroskop cahaya

Densitas bakteri (sel/ml) = (As x N)/(Af x V)

N: jumlah rerata sel/bidang pandang (sel)As: Luas area smear (As = 400 mm2)Af:: Luas bidang pandang (mm2)V: volume sampel (ml) DF: (dilution factor) = faktor pengenceran

Densitas (sel/ml) = (400 x N x)/(Af ) (x 1/10)Densitas (sel/ml) = (400 x N x)(10)/(Af )

Densitas dalam suspensi (sel/ml) = (400 x N x DF x 10)/(Af )

Total count: Petroff-Hauser Chamber

Haemocytometer

Total count: HaemocytometerLuas kotak di tengah (L1) = 1 mm2 (dibagi 25 = 1/25 mm2)Kedalaman (d) = 0,02 mm Volume (V1) = 1mm2 x 0,02 mm = 0,02 mm3 = 0,02 x 10-3 cm3 (1 cm3 = 1000 mm3) = 2 x 10-5 cm3 (= 2/105 cm3 =2/100.000 cm3) =1/50.000 cm3 = 1/50.000 mlContoh:Jika jumlah sel dalam kotak (L1) = 28 sel (= 28 per 1/50.000 ml) = 28 x 50.000 sel/ml = 1.400.000 sel/ml

Bidang Pandang

Luas kotak (L2) = 1/25 mm2Kedalaman (d) = 0,02 mmVolume (V2) = 1/25mm2 x 0,02 mm = 8 x 10-4 mm3 = 8 x 10-4 x 10-3 cm3 = 8 x 10-7 cm3 = 8 x 10-7 ml = 8/107 ml = 1/ 1.250.000 mlContoh:Jika jumlah sel dalam kotak (L2) = 28 sel (= 28 sel per 1/1.250.000 ml) = 28 x 1.250.000 sel/ml = 35.000.000 sel/ml

Luas kotak (L3) = 1/400 mm2Kedalaman (d) = 0,02 mmVolume (V3) = 1/400 mm2 x 0,02 mm = 5 x 10-5 mm3 = 5 x 10-5 x 10-3 cm3 = 5 x 10-8 cm3 = 5 x 10-8 ml = 5/108 ml = 1/ 20.000.000 ml

Contoh:Jika jumlah sel dalam 5 kotak (L2) = 500 sel Dalam 5 kotak L2 terdapat: 5 x 16 kotak L3 = 80 kotak L3 Maka Jumlah rerata sel per kotak L3 = 500/80 sel/1.20.000.000 ml = 6,25 sel/1.20.000.000 ml = 6,25 x 20.000.000 sel/ml

Petroff-Hausser ChamberLuas kotak terkecil (L) = 1/400 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,200 mmVolume kotak terkecil (V) = 1/400 x 0,200 mm3 = 1/400 x 2/10 mm3 = (1/400 x 2/10) x 1/1.000 cm3 = (2/4000) x 1/1000 cm3 = 2/4.000.000 cm3 = 1/2.000.000 ml

HaemocytometerLuas kotak terkecil (L) = 0,025 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,1 mm = 1/10 mm = 1/400 mm2Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 1/10 mm3 = 1/4.000 mm3 = (1/4.000) x 1/1000 cm3 = 1/4.000.000 cm3 = 1/4.000.000 ml

Haemocytometer

Bidang pandang

Spermatozoa

Viable countMetode Pengenceran samplePlating pada medium padat dan diinkubasikanHitung jumlah koloniKerapatan mikrobia/ml sample dapat dihitung: = jumlah koloni x faktor pengencerane.g. jika sampel yang diencerkan 10-6 x diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke dalam medium padat. Setelah diinkubasikan ditemukan sejumlah 50 koloni. Berapakah kerapatan mikrobia per ml atau gram sampel ?

Plate Count

HPC: Heterotrophic Plate Count

Persayaratan Plate CountJumlah koloni/petridish 30 300, jika tidak ada yang memenuhi, dipilih ang terdekatKoloni spreader tidak dipakaiPerbandingan hasil pengenceran yang berurutan:jika 2 : hasilnya direratajika > 2 : dipakai pengenceran yang lebih kecil4. Jika ada ulangan maka jumlah koloni direrata

Perhitungan

Membran filterKerapatan sel sangat rendah:Sejumlah volume sampel difilterFilter diletakkan di atas mediumDihitung jumlah koloni yang tumbuhDihitung kerapatan per volume sampelN.B. Metode ini digunakan jika kerapatan mikrobia dalam sampel sangat rendah !

Metode MPNSampel diencerkan lalu diinokulasikan ke dalam medium cairDiinkubasikan lalu di amati adanya pertumbuhan mikrobiaKerapatan dihitung berdasarkan jumlah sampel yang positif tumbuh

Jika dipilih ; 5 4 3 dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6 maka angka MPN untuk tiap 100 gram atau ml sampel: 280 x 105/100 ml sampelAngka 280 diperoleh dari Tabel MPN (Hoskins)

Metode Berat Kering (Biomasa)Kultur mikrobia disample dengan volume tertentu (ml)Dikeringkan pada 80C sampai beratnya konstanKerapatan dinyatakan dengan mg-DCW/ml atau g-DCW/ml

Metode SpektrofotometriKultur cair mikrobia diambil Dimasukkan ke dalam kuvetDibaca nilai OD pada panjang gelombang tertentu, mis OD-600 nmOD: Optical Density