METODI’DI’SELEZIONE’ GENOMICAIN’PATATA 4.pdf · patata coltivata e ridurre gradualmente il contenuto di genoma selvatico; questo obiettivo è raggiunto attraverso i gameti

METODI DI SELEZIONE GENOMICA IN PATATA

Riccardo AVERSANO [email protected] , 081.2532.124, www.pbglab.it

5 ASPETTI RILEVANTI PER IL MIGLIORAMENTO GENETICO DELLA

PATATA!!

PROVIAMO A RIASSUMERE

Quanto più diversi sono gli alleli di uno stesso locus, tanto più elevata è l’eterozigosi, e maggiore è il numero di interazioni epistatiche e tra loci distinti. Dal punto di vista fenotipico ciò consente di massimizzare il vigore ibrido (eterosi).

Il peggioramento delle performance delle progenie prodotte a seguito di autofecondazione o di incrocio tra parentali geneticamente simili è attribuibile: •  all’incremento di omozigosi, •  alla perdita di interazioni trialleliche e tetralleliche richieste per massimizzare l’eterosi

Genotipi omozigoti sono difCicili da ottenere tramite autofecondazione a causa della depressione da inbreeding.

5 ASPETTI RILEVANTI PER IL M.G. PATATA

I miglioratori nel deCinire le strategie per massimizzare l’eterozigosi e il multiallelismo (e quindi l’eterosi) devono essere molto attenti all’uso di parentali appropriati. Progenie con alti livelli di multiallelismo possono essere prodotte attraverso:

•  impollinazioni controllate che coinvolgono parentali geneticamente diversi o

•  sfruttando i gameti 2n.


Come ogni specie propagata vegetativamente, la patata è altamente eterozigote. Di conseguenza, nella generazione F1 che segue l’ibridazione, è attesa la segregazione dei caratteri.


Nelle specie a propagazione vegetativa la varietà corrisponde al

CLONE

Gruppo di individui geneticamente identici derivanti dallo stesso progenitore

Come ogni specie propagata vegetativamente, la patata è altamente eterozigote. Di conseguenza, nella generazione F1 che segue l’ibridazione, è attesa la segregazione dei caratteri.

La patata coltivata ha una base genetica ridotta rispetto alle specie selvatiche. Ciò è dovuto principalmente al numero limitato di genotipi che sono stati usati per sviluppare le tipologie coltivate.

In tutti i programmi di miglioramento genetico occorre avere informazioni sulla base genetica dei caratteri da modiCicare.


•  Gli obiettivi •  Metodi covenzionali di miglioramento genetico -  Livello intraspeciCico -  Livello interspeciCico

•  Le colture in vitro -  Produzione di aploidi -  Fusione somatica

•  Ingegneria genetica •  La selezione assistita

OUTLINE

•  Gli obiettivi del m.g. patata •  Metodi covenzionali di miglioramento genetico -  Livello intraspeciCico -  Livello interspeciCico



OUTLINE

ricerca

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Miglioramento genetico

Per una pataticoltura moderna ed ecosostenibile è fondamentale l’uso di varietà che a un ridotto consumo energetico associno il massimo rendimento e la migliore qualità del tubero. La costituzione di nuove varietà di patata con tali caratteristiche è un’attività di pertinenza del miglioramento genetico, inteso come arte e scienza finalizzate a modificare l’assetto genetico delle piante coltivate. Le recenti acquisizioni nel campo della genetica, delle biotecnologie, della fisiologia, della biologia molecolare e di numerose altre discipline hanno enormemente ampliato le possibilità del miglioramento genetico. Sono ormai molto diffusi approcci sperimentali ”ad alto rendimento” (high-throughput) che consentono l’analisi su vasta scala dei genomi e dei loro prodotti di espressione. Grazie alle conquiste della genetica molecolare e della genomica sono note la struttura, l’organizzazione e la funzione di molti geni, e a breve, quale risultato di uno sforzo scientifico internazionale, sarà disponibile l’intera sequenza del genoma della patata. Si può quindi affermare che le attività dei miglioratori si stanno sempre più indirizzando verso un miglioramento genetico ”di precisione” (precision breeding), che permetterà di ottenere il genotipo con alleli mirati per ogni specifico ambiente. In questo capitolo saranno prese in considerazione alcune delle più interessanti e diffuse strategie utilizzate nel miglioramento genetico della patata per produrre variabilità genetica e per effettuare una selezione efficiente. Affinché un miglioratore operi con successo è necessario che sappia integrare strategie convenzionali e innovative, coniugando le conoscenze della

MIGLIORAMENTOGENETICOBiochimica Agronomia

Biotecnologie Statisticae bioinformatica

Fisiologie

Biologiamolecolare

Patologiaed entomologia Genetica

Multidisciplinarità del miglioramento genetico

MIGLIORAMENTO GENETICO DELLA PATATA

miglioramento genetico

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genetica vegetale con quelle delle altre discipline a essa collegate, nonché con le più recenti acquisizioni della genomica strutturale e funzionale.

Aspetti genetici rilevanti per il miglioramento geneticoCome discusso nel capitolo Risorse genetiche e genomica, la genetica della patata è davvero unica, e risulta più complicata di quella di ogni altra specie diploide o allopoliploide. Particolarmente importante per il miglioramento genetico è la situazione allelica a ciascun locus. Negli autopoliploidi, infatti, quanto più diversi sono gli alleli di uno stesso locus, tanto più elevata è l’eterozigosi, e maggiore è il numero di interazioni epistatiche e tra loci distinti. Dal punto di vista fenotipico ciò consente di massimizzare il vigore ibrido (eterosi). A ogni locus sono possibili fino a 4 alleli differenti (per esempio A1, A2, A3, A4) e quindi vari effetti genetici non-additivi: di primo ordine (tra due alleli), di secondo ordine (tra tre alleli) e di terzo ordine (tra tutti e quattro gli alleli). In un genotipo tetrallelico ciò corrisponde a 11 interazioni eteroalleliche. Il peggioramento delle performance delle progenie prodotte a seguito di autofecondazione o di incrocio tra parentali geneticamente simili è attribuibile non solo all’incremento di omozigosi, ma anche alla perdita di interazioni trialleliche e tetralleliche richieste per massimizzare l’eterosi. I miglioratori, pertanto, nel definire le strategie per massimizzare l’eterozigosi e il multiallelismo (e quindi l’eterosi) devono essere molto attenti all’uso di parentali appropriati. Progenie con alti livelli di multiallelismo possono essere prodotte attraverso impollinazioni controllate che coinvolgono parentali geneticamente diversi o sfruttando i gameti 2n.

Prove di progenie

Spesso si ricorre alle cosiddette prove di progenie per identificare la migliore combinazione di parentali. Esse permettono di scegliere una coppia di genitori in base alle performance delle loro progenie

Queste prove si basano sulla stima di due importanti parametri: l’attitudine alla combinazione generale e l’attitudine alla combinazione specifica. La prima si riferisce alla performance media della progenie di un parentale incrociato con altri parentali; la seconda, invece, riguarda la performance della progenie di un parentale in una specifica combinazione a confronto con la performance dello stesso parentale in altre specifiche combinazioni

SELEZIONE

Dogma centrale del miglioramento genetico

MIGLIORAMENTO GENETICO DELLA PATATA

FOOD SAFETY FOOD QUALITY ENVIRONMENT

• pesticides • water availability • climate changes

• glycoalkaloids • acrylamide

• nutritional value • improved Plavour • improved

processing quality

OBIETTIVI DEL M.G. DELLA PATATA

POTATO PROCESSING VOLUME ($)

processed

fresh

0

20

40

60

80

100

120

China EU USA

%

POTATO PROCESSING VOLUME

Il miglioramento delle caratteristiche qualitative del tubero sta diventando sempre piu importante. I principali caratteri qualitativi sono: -  caratteri morfologici (colore della buccia e della polpa, forma del

tubero, profondità degli occhi, caratteristiche della buccia, lunghezza degli stoloni)

-  caratteri Pisiologici (dormienza e tuberizzazione) -  tipologia culinaria e tessitura -  caratteri qualitativi interni (contenuto in amido, glicoalcaloidi,

resistenza a imbrunimento, addolcimento, peso speciCico, ammaccatura)

QUALITÀ DEL TUBERO -‐ 1

Tra i nuovi obiettivi dei miglioratori c’è lo sviluppo di varietà che nei tuberi non accumulano asparagina e glicoalcaloidi.

-  L’asparagina è un aminoacido precursore dell’acrilamide, che si forma durante la reazione Maillard come parte del processo di cottura. Ha effetti cancerogeni e potrebbe danneggiare il sistema nervoso.

-  I glicoalcaloidi sono ugualmente tossici, se assunti in grandi quantità, avendo possibili effetti teratogeni, embriotossici e cancerogeni

QUALITÀ DEL TUBERO -‐ 2

POTATO PROCESSING VOLUME

EXTERNAL INTERNAL

tuber appearance tuber size tuber shape skin colour

dry matter content flavour sugar content starch quality

protein content ……. …….. flesh colour

TUBER QUALITY

The deCinition of potato quality changes according to the speciCic market

DRY MATTER, % 18-22 20-26 >22 <18

FF CHIPS MASHED CANNED

REDUCING SUGARS, %

<0.5 <0.25 >1 >1

SHAPE obl./elong. round round/oval round/oval

SIZE, MM 60-80 40-60 - <35

REQUIREMENTS BY TYPE

Variety

Soil, water and climatic conditions

Crop maturity

Cultural practices

Pests and diseases

Storage temperature

FACTOR AFFECTING QUALITY

quality traits that can be improved through breeding

Biological traits proteins, carbohydrates, vitamins, minerals, reduced amounts of toxic factors (GA)

Sensorial traits Clavour, texture, colour

Industrial traits shape, size, dry matter content, cold sweetening, oil absorption, starch quality

BREEDING FOR QUALITY

COSA SAPPIAMO SUL CONTROLLO GENETICO DEI CARATTERI LEGATI ALLA

QUALITÀ?

Gene action and/or heritability values have been identi8ied for quality traits such as

-‐ Anthocyanin pigmentation -‐ Polyphenol oxidase activity -‐ Ca concentration -‐ Tuber shape

-‐ Flesh pigmentation -‐ SpeciPic gravity -‐ Chip colour -‐ Starch content


Distribution on the potato map of QTLs controlling quality traits

TRAIT CHROMOSOMES REFERENCE

Specific gravity I, II, III, IV, V, VII, IX, XI, XII Bonierbale et al., 1993, Van der Berg et al., 1996

Chip colour II, IV, V, X Douches & Freyre, 1994

Starch content All Schafer-Pregl et al., 1998

GA content I, IV, VI, VIII, XI, XII Yencho et al., 1998 Bouarte-Medina et al., 2002





OUTLINE




OUTLINE

LIVELLO INTRASPECIFICO

tbr 4x x tbr 4x

4X POPOLAZIONE

ricerca

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vantaggio è quello di avere necessità di una popolazione di partenza più ridotta. Il miglioramento genetico interspecifico a livello diploide si basa sul fatto che il modello EBN consente di prevedere l’esito positivo o negativo degli incroci tra specie differenti e quindi di sviluppare opportuni schemi di miglioramento genetico. Esso sfrutta anche i vantaggi dei gameti 2n, molto diffusi nelle specie selvatiche e coltivate di patata, e la relativa semplicità con cui è possibile ottenere aploidi di S. tuberosum. La prima fase di un programma di ibridazione intespecifica basato sull’uso di specie 2x(EBN) consiste nella produzione e nella selezione di aploidi di varietà coltivate. Gli aploidi sono sporofiti con il corredo cromosomico gametico, e nella patata possono essere facilmente ottenuti attraverso incroci S4x 2x tra le varietà tetraploidi di S. tuberosum (genitore femminile) e genotipi diploidi di S. phureja (genitori maschili). Questi ultimi stimolano lo sviluppo partenogenetico dell’ovocellula che darà uno zigote, e quindi una pianta, con corredo cromosomico 2n=2x=24 ed EBN=2. Gli aploidi selezionati sono in seguito incrociati con le specie selvatiche 2x(2EBN). Gli ibridi interspecifici prodotti da questi incroci hanno il 50% di genoma selvatico. Pertanto, dopo un accurato lavoro di selezione per i caratteri desiderati ed eventualmente altra attività di miglioramento genetico, è necessario ristabilire il corredo cromosomico tetraploide della patata coltivata e ridurre gradualmente il contenuto di genoma selvatico; questo obiettivo è raggiunto attraverso i gameti 2n. Nella fase successiva, infatti, gli ibridi che presentano caratteristiche superiori e che producono gameti 2n sono incrociati con le varietà coltivate 4x(4EBN) per ripristinare la condizione tetraploide

Mutazioni meiotiche e gameti 2n

I gameti 2n sono il frutto di mutazioni meiotiche che, nei casi più frequenti, alterano l’appaiamento dei cromosomi omologhi, la corretta formazione dei fusi e la citocinesi

Nella patata la produzione di polline 2n è in genere dovuta alla formazione di fusi paralleli in metafase II o a citocinesi prematura. In presenza di queste mutazioni, alla fine della meiosi, si formano diadi con due microspore 2n, e non tetradi con quattro microspore n. La formazione di ovocellule 2n, invece, è principalmente dovuta a un’omissione della seconda divisione meiotica. In presenza di questa mutazione sono prodotte due megaspore 2n; una di esse degenera, l’altra produce la spora funzionale

Varietà AAnno

I

II-III

IV-VII

VIII-X

Varietà B

Registrazioneclone superiore

Semenzali F110% selezionati

I e II generazionedi selezione clonale;10 % selezionatoogni anno

III, IV, V e VI generazionedi selezione clonale;Parcelle ripetuteValutazione qualitàe resistenzeConfronto con vaietàcontrollo

x

Schema di un programma di selezione clonale

Tuberi da una parcella sperimentale

SELEZIONE CLONALE

Clone parentale !A X

^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ I

II-III

IV-VII

VIII-X

Anno

10000 F1!10% selezionato!

10% selezionato ogni anno!

Prove ripetute!Località differenti!Confronto con standard!

Registrazione clone superiore!

Clone parentale !B

SELEZIONE CLONALE

SELEZIONE CLONALE

http://cropscience.ch/?p=536

Anno Piantine F1 da incrocio A x B!100000

3000

2000

800

150

50

3

NUOVA VARIETA’

1

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

3 tuberi/genotipo!

10 tuberi/genotipo!

20 tuberi/genotipo!

.!

.

.

.

.

.

. !

SELEZIONE CLONALE IN PATATA

EVALUATION OF 4X CLONES FOR SEVERAL TRAITS

- Earliness - Plant habit - Yield - Tuber morphology - Tuber specific gravity - Chipping ability - Resistances - ………


TEST FRITTURA DI CLONI AVANZATI 4X

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

< 4 5 - 6 > 6

Valore indice frittura

% c

loni

Clo

nes,

%

Transformation index

At harvest

Without reconditioning

Reconditioned

TEST FRITTURA DI CLONI AVANZATI 4X

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5

1 = very early

5 = very late

Earliness

% o

f clo

nes

PRECOCITÀ CLONI AVANZATI 4X

Ø  Uso di parentali multiplex

Ø  Prove di progenie Ø  Considerare ereditabilità caratteri in F1

miglioramento genetico

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genetica vegetale con quelle delle altre discipline a essa collegate, nonché con le più recenti acquisizioni della genomica strutturale e funzionale.

Aspetti genetici rilevanti per il miglioramento geneticoCome discusso nel capitolo Risorse genetiche e genomica, la genetica della patata è davvero unica, e risulta più complicata di quella di ogni altra specie diploide o allopoliploide. Particolarmente importante per il miglioramento genetico è la situazione allelica a ciascun locus. Negli autopoliploidi, infatti, quanto più diversi sono gli alleli di uno stesso locus, tanto più elevata è l’eterozigosi, e maggiore è il numero di interazioni epistatiche e tra loci distinti. Dal punto di vista fenotipico ciò consente di massimizzare il vigore ibrido (eterosi). A ogni locus sono possibili fino a 4 alleli differenti (per esempio A1, A2, A3, A4) e quindi vari effetti genetici non-additivi: di primo ordine (tra due alleli), di secondo ordine (tra tre alleli) e di terzo ordine (tra tutti e quattro gli alleli). In un genotipo tetrallelico ciò corrisponde a 11 interazioni eteroalleliche. Il peggioramento delle performance delle progenie prodotte a seguito di autofecondazione o di incrocio tra parentali geneticamente simili è attribuibile non solo all’incremento di omozigosi, ma anche alla perdita di interazioni trialleliche e tetralleliche richieste per massimizzare l’eterosi. I miglioratori, pertanto, nel definire le strategie per massimizzare l’eterozigosi e il multiallelismo (e quindi l’eterosi) devono essere molto attenti all’uso di parentali appropriati. Progenie con alti livelli di multiallelismo possono essere prodotte attraverso impollinazioni controllate che coinvolgono parentali geneticamente diversi o sfruttando i gameti 2n.

Prove di progenie

Spesso si ricorre alle cosiddette prove di progenie per identificare la migliore combinazione di parentali. Esse permettono di scegliere una coppia di genitori in base alle performance delle loro progenie

Queste prove si basano sulla stima di due importanti parametri: l’attitudine alla combinazione generale e l’attitudine alla combinazione specifica. La prima si riferisce alla performance media della progenie di un parentale incrociato con altri parentali; la seconda, invece, riguarda la performance della progenie di un parentale in una specifica combinazione a confronto con la performance dello stesso parentale in altre specifiche combinazioni

SELEZIONE

Dogma centrale del miglioramento genetico


Svantaggi •  Eredità tetrasomica •  Selezione su grosse popolazioni •  Sterilità elevata

Ø  Uso di parentali adattati




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Tertiary

Tertiary Genepool: wild species “distantly” related to a crop species

Secondary Secondary Genepool: wild species “fairly closely” related to a crop species

Primary

Primary Genepool: a cultivated crop including all cultivars and land races

X

S. tuberosum

GENE POOL CONCEPT

In un numero crescente di programmi di miglioramento si cerca di utilizzare l’immenso patrimonio genetico delle specie selvatiche, fornitrici di caratteri (e quindi geni) utili e di diversità allelica.

IL MODELLO EBN

Nelle strategie di miglioramento genetico basate sull’ibridazione sessuale è importante conoscere il numero di bilanciamento dell’endosperma (Endosperm Balance Number, EBN) dei parentali per deCinire schemi di incrocio appropriati

specie selvatiche

5

Foto R. Angelini

Come è stato già detto, le moderne varietà di patata sono state costituite principalmente attraverso l’applicazione dei principi del-la genetica mendeliana e dei metodi di miglioramento genetico convenzionali. Tuttavia, le esigenze della moderna agricoltura so-no cambiate nel corso dell’ultimo trentennio. Il nuovo compito del miglioramento genetico è quello di generare tecnologie moderne volte a produrre varietà di piante ecocompatibili, in altre parole adatte alle caratteristiche dei diversi ecosistemi, in armonia con l’ambiente e perciò più idonee a limitare il degrado delle risorse naturali: acqua, suolo, biodiversità, clima. Così è nata la genomi-ca, la scienza che integra citologia, genetica classica, quantitati-va, di popolazione e molecolare con nuove tecnologie derivanti dall’informatica e dalle possibilità offerte dall’introduzione di si-stemi automatizzati e robotizzati. I risultati prodotti negli studi di genomica forniscono gli strumenti per aumentare l’efficienza dei metodi convenzionali del miglioramento genetico classico e per utilizzare appieno l’enorme patrimonio di specie selvatiche della patata.

Genomica e studi sulla patataCom’è avvenuto per molte importanti piante di interesse agrario, la genomica sta rivoluzionando la ricerca biologica sulla patata. Il termine “genoma” si riferisce collettivamente a tutte le sequenze geniche e non codificanti di un organismo, mentre il termine “ge-nomica” indica un approccio globale allo studio del genoma nel suo insieme. La genomica può essere considerata una branca della genetica sviluppatasi grazie ai progressi tecnologici e alle accresciute capacità analitiche degli ultimi decenni. In questo paragrafo discuteremo due principali suddivisioni nel campo del-la genomica: la genomica strutturale e la genomica funzionale. Ognuna di esse è stata ampiamente utilizzata nello studio della patata.

Genomica strutturaleLa genomica strutturale si occupa dell’organizzazione fisica del genoma, compresi l’aspetto dei cromosomi (il cariotipo) e la di-stribuzione dei geni e degli elementi non codificanti su di essi. Tra gli strumenti molecolari che consentono l’indagine dei genomi e lo studio della loro organizzazione, i marcatori molecolari sono, certamente, i più efficaci e adoperati. L’uso dei marcatori nella genetica vegetale è iniziato negli anni ’70, quando il metodo per la caratterizzazione e la differenziazione genetica degli individui si basava sull’analisi delle forme alternative delle proteine (gli iso-enzimi). In seguito, i ricercatori hanno iniziato ad analizzare diret-tamente le differenze (polimorfismi) nella sequenza nucleotidica del DNA, sviluppando così i primi marcatori molecolari come gli RFLP (acronimo di Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione), mes-

Genetica e genomica

La genetica differisce dalla genomica in quanto la prima si occupa specificamente dell’azione di un singolo gene o per lo meno di pochi geni alla volta, mentre la seconda studia l’azione collettiva di tutti i geni contemporaneamente

Endosperma

L’endosperma è un tessuto di riserva del seme di estrema importanza per lo sviluppo dell’embrione. Esso gioca un ruolo analogo a quello della placenta nei mammiferi nel trasferimento di nutrienti dalla madre all’embrione. Geneticamente, l’endosperma deriva dalla fusione di un nucleo aploide di origine paterna (nucleo spermatico) e due nuclei aploidi di origine materna (nuclei polari). La fecondazione dei tre nuclei origina un cellula triploide (endosperma primario) con un rapporto di genomi materni e paterni di 2:1

DOPPIA FECONDAZIONE

•  Ogni specie ha un numero effettivo (l’EBN), che non necessariamente riClette la sua ploidia

•  L’EBN è un numero assegnato empiricamente a una specie in base all’esito di incroci interspeciCici con specie tester a EBN preassegnato

•  S. chacoense (2n=2x=24) fu scelta come specie tester e ad essa fu assegnato un valore arbitrario di EBN=2 (2EBN). Analogamente, agli individui tetraploidi (2n=4x=48) di S. chacoense, ottenuti mediante raddoppiamento cromosomico, fu assegnato un EBN=4 (4EBN).

•  Le specie di Solanum furono classiCicate in diversi gruppi sulla base della loro com-‐patibilità d’incrocio con il diploide (2EBN) e il tetraploide (4EBN) di S. chacoense e da queste informazioni predissero l’EBN di ciascun gruppo.

IL MODELLO EBN

1 EBN 2x: S. brachistotrichum, S. brevidens, S. jamesii, S.

bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. commersonii….

2 EBN

2x: S. tuberosum haploids, S. chacoense, S. berthaultii, S. multidissectum, S. phureja ...

4x: S. acaule, S. fendleri

4 EBN 4x: S. tuberosum, S. andigena, S. brachycarpum ... 6x: S. demissum

IL MODELLO EBN

Af8inché un incrocio abbia successo è necessario che nell’endosperma degli ibridi ci sia un rapporto di 2:1 tra EBN materno e paterno. Questo normalmente si veri8ica quando i due parentali hanno lo stesso EBN

IL MODELLO EBN

2x 1EBN 2x

1EBN

4x(3EBN) 6x(5EBN) 4 : 1

S. tuberosum 4x(4EBN) x S. acaule 4x(2EBN)

2x 2EBN 2x

2EBN

4x(4EBN) 6x(6EBN) 2 : 1

S. tuberosum 4x(4EBN) x S. andigena 4x(4EBN)

2x 2EBN 2x

2EBN

4x(4EBN) 6x(6EBN) 2 : 1

S. tuberosum 4x(4EBN) x S. chacoense 2x(2EBN) (2n gametes)

Embryo Endosperm EBN : EBN Gametophyte female

male

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

2x 2EBN

IL MODELLO EBN

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