GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA:

SPERMATIDI

Contenuto in DNA durante la spermatogenesi

Classificazione degli spermatidi(Vanderzwalmen et al, 1997)

• spermatide maturo: spermatozoo con connessioni con le cellule del Sertoli

• spermatidi “elongated”: coda ben evidente, di lunghezza variabile

• spermatide “elongating”: coda visibile come protrusione laterale

• spermatide rotondo: cellula rotonda, con diametro di 7-8 micron, abbozzo dell’acrosoma visibile come uno spot chiaro o scuro, o come protrusione

Indicazioni

Azoospermia secretiva dovuta a:

• ipospermatogenesi

• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatocita di I ordine

• arresto maturativo allo stadio di spermatide rotondo

• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatogone

• forme miste (Sertoli cell only syndrome “incompleta” e arresto maturativo)

ICSI con precursori degli spermatozoi

• ELSI (Fishel et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi allungati da cellule con un abbozzo di coda fino alle forme più mature con differenziazione completa ma unite alle cellule di Sertoli

• ROSI (Tesarik et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi rotondi con o senza abbozzo del cappuccio acrosomiale

• ROSNI (Sofikitis et al, 1997): iniezione intracitoplasmatica del solo nucleo di spermatidi rotondi

Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) e di nuclei di spermatidi rotondi (ROSNI): fase sperimentale

Autore specie tecnica risultato fattoremaschile

Ogura et al, hamster ROSNI+ES embrioni no

1993Ogura et al, topo ROSI+ES prole no1994

Sofikitis et al, coniglio ROSNI prole no1994

Kimura e topo ROSNI prole noYanagimachi, 1995

Sofikitis et al, coniglio ROSNI+ES prole no

1996

Goto et al, 1996 bovino ROSI blastocisti no

Sofikitis et al,1996 coniglio ROSNI+ES no gravidanze varicocele

Sasagawa e topo ROSI prole criptorchidismoYanagimachi,1997

Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (1)

Autore tecnica gravidanze aborti nati

cliniche

Hannay et al,1995 ROSNI 4 4 0

Tesarik et al, 1995 ROSI- eiaculato 2 0 2

Fishel et al, 1995 ELSI elongated 1 0 1

Mansour et al, 1996 ROSI 1 0 1

Tanaka et al, 1996 ROSI 1 1 0

Araki et al, 1997 ELSI elongated 3 0 4

Vanderzwalmen ELSI elongated/ 3 0 3et al, 1997 elongating

Vanderzwalmen ROSI 1 0 1et al, 1997

Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (2)

Autore tecnica gravidanze aborti naticliniche

Sofikitis et al, 1997 ROSNI 3 0 3

Amer et al, 1997 ELSI elongated/ 2 0 ?elongating

Sofikitis et 1998 ELSI elongated 2 0 2

Sofikitis et al, 1998 nucleo di 1 0 1spermatocita di II ordine

Kaharaman et al,1998 ELSI 2 1 2

Kaharaman et al,1998 ROSI 1 1 0

Barak et al, 1998 ROSI-eiaculato 1 0 1

Barros et al, 1998 ELSI 3 0 1

AL-Hasani et al,1999 ELSI 2 0 0

Aspetti di laboratorio

ROSI ELSI

cicli 108 60

oociti iniettati 648 475

2 PN (%) 274 (31) 277 (58)

gravidanze cliniche 11 (11) 16 (18)

nati 10 13

% impianto 6.5 6.1

Problematiche di laboratorio

• identificazione della cellula

• attivazione dell’oocita

• timing dei 2 pronuclei

• sviluppo embrionale

Identificazione degli spermatidi rotondi

• TEM

• visualizzazione selettiva dell’acrosina o della proacrosina con anticorpi monoclonali

• FISH per la valutazione dell’aneuploidia

• Papanicolau

• Testsimplet

• microscopio cofocale

• microscopio con ottica Hoffman

• microscopio con contrasto di fase

Spermatide rotondo:criteri per l’identificazione a fresco

• cellula rotonda con diametro di 6.5-8 micron (cellule più piccole)

• nucleo rotondo, centrale

• contorno liscio

• citoplasma uniformemente distribuito

• protusione laterale o spot a diversa densità ottica addossato al nucleo

• vitalità: resistenza all’aspirazione nella micropipetta

Problematiche di laboratorio

fertilizzazione dell’oocita

• materiale genetico (DNA + nucleoproteine)

• asincronia maturativa

• fattore attivante l’oocita

• centrosoma

zigote e singamia

• comparsa dei 2 PN a 8-9 ore dall’iniezione

• singamia con presenza di 1 nucleo a 16-18 ore

Metodiche per la preparazione

• separazione meccanica con aghi o vetrini

• digestione enzimatica:– collagenasi

– collagenasi + elastasi

– tripsina + DNAsi

Rischi potenziali

legati alla tecnica

• aumentato rischio di mosaicismo per anomalie del centrosoma

• aumentato rischio di iniettare materiale diploide

• anomalie dell’imprinting

legati alla patologia sottostante

• mutazioni genetiche legate alla sterilità

• anomalie numeriche e traslocazioni

• AZF: AZFa (Sertoli cell-only), AZFb (arresto maturativo), AZFc (Sertoli cell-only “incompleta)

Coltura in vitro di spermatidi(Fishel et al, 1998)

sopravvivenza

• 50% a 48 ore

• 0% a 96 ore

maturazione

• 8 % con crescita completa del flagello a + 4 ore

• 22 % con crescita completa del flagello da +8 ore