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09/11/2013

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Pr. A. Calender

MUTATIONSdans les maladies génétiques humaines

Jeudi 8 novembre 2012

- Chaque triplet denucléotides sur l'ADNcorrespond à un codon del'ARNm.

- Chaque codon de l'ARNmcorrespond à un anti-codonspécifique de l'ARNt.

- Chaque anti-codoncorrespond à un acideaminé spécifique.

DONC: chaque triplet de nucléotides surl'ADN correspond à un acide aminé.

RAPPELS

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Quels codonscodent pour VAL ?

Quels codonscodent pour GLU ?

GUUGUGGUCGUA

GAAGAG

RAPPELS

‘ In some disciplines the term "mutation" is used to indicate "achange" while in other disciplines it is used to indicate "a disease-

causing change". Similarly, the term "polymorphism" is used bothto indicate "a non disease-causing change" or "a change found at a

frequency of 1% or higher in the population". To prevent thisconfusion we do not use the terms mutation and polymorphism

(including SNP or Single nucleotide Polymorphism) but use neutralterms like "sequence variant", "alteration" or "allelic variant"

‘

"c." for a coding DNA sequence (like c.76A>T)"g." for a genomic sequence (like g.76A>T)

"m." for a mitochondrial sequence (like m.8993T>C)"r." for an RNA sequence (like r.76a>u)

"p." for a protein sequence (like p.K76A)Septembre 2005

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Coding DNA Reference Sequence

• there is no nucleotide 0

• nucleotide 1 is the A of the ATG-translation initiation codon

• the nucleotide 5' of the ATG-translation initiation codon is -1

• the nucleotide 3' of the translation stop codon is *1

•intronic nucleotides

•beginning of the intron; the number of the last nucleotide of the preceding exon, aplus sign and the position in the intron, like c.77+1G, c.77+2T, etc.•end of the intron; the number of the first nucleotide of the following exon, a minussign and the position upstream in the intron, like c.78-1G.•in the middle of the intron, numbering changes from "c.77+.." to "c.78-.."; forintrons with an uneven number of nucleotides the central nucleotide is the lastdescribed with a "+"

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Nucleotide numbering is purely arbitrary and starts with 1 at the first nucleotide of thedatabase reference fileno +, - or other signs should be used

The sequence should include all nucleotides covering the sequence (gene) of interest and incase of a gene should start well 5' of the promoter

a range of affected residues is indicated by a "_"-character (underscore), separating the first and lastresidue affected (like c.76_78delACT)for all descriptions the most 3' position possible is arbitrarily assigned to have been changed, thisimportant especially in single residue (nucleotide or amino acid) stretches or tandem repeatsspecific changesduplicating insertions are described as duplications, not as insertions; ACTTTGTGCC toACTTTGTGGCC is described as c.8dupG and not as c.8_9insG.two sequence variants in one individual

two sequence changes in different alleles (e.g. for recessive diseases) are listed between squarebrackets, separated by a "+"-character; c.[76A>C]+[87delG]two sequence variants in one allele are listed between square brackets, separated by a ";"-character; c.[76A>C; 83G>C] (seetwo sequence changes with alleles unknown are listed between square brackets, separated by

"(+)"; c.[76A>C (+) 83G>C]descriptions of sequence changes in different genes (e.g. for recessive diseases) are listed

between brackets, separated by a "+"-character and include a reference to the sequence (gene)changed; DMD:c.[76A>C] + GJB:c.[87delG]

a unique identifier should be assigned to each mutation; when available, the OMIM - identifiercan be used, otherwise database curators should assign a unique identifier.

Elles génèrent un codon STOP parmiles 3 possibles dans le système

universel du code génétique soitTAA, TGA ou TAG

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MUTATIONS PONCTUELLES

- Mutations NON SENS [2]

La nomenclature est : p. aa – codon – effet

Conventionnellement : p.Glu542X (Gly >STOP)Ou ancienne proposition : p.E542X

Nucléotide : c. ou g.1624 G >T

Il est important de mentionner que la mise enévidence d’une mutation STOP au niveau germinaldans un gène candidat d’une maladie héréditaireSIGNE LA RESPONSABILITE de ce gène danscette même maladie (mutation dite DELETERE)


- Mutations NON SENS [3]

Les mutations NON SENS entraînent un effet dePERTE DE FONCTION que la “truncation soit courteou longue.

Suivant la position du codon STOP anormal (début,milieu ou fin de la chaine protéique), la proteine peut :

-soit continuer à exercer un effet biologique dans sarégion conservée (ex : DMD - dystrophine)

- soit être totalement DESTABILISEE et disparaîtrerapidement par diminution de la 1/2 vie(ex : Waardenburg - PAX3)

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- Mutations FAUX SENS (missense) [1]

ATG CCC GAA GTGTAC GGG CTT CACM P E V

ATG CCC AAA GTGTAC GGG TTT CACM P K V

La nomenclature est : p. aa1 – codon – aa2

Conventionnellement : p.E 210 KOu récente proposition : p.Glu 210 Lys

Nucleotide : c. ou g.628 G > A

Une substitution d’une base a pour conséquence lechangement de la signification en aminoacide du codon



Les mutations FAUX SENS, d’apparence moléculairemoins aggressive sont à l’origine de :

L’EFFET DOMINANT NEGATIF ou protéine suicide dontl’analogie avec la forme normale entraine desperturbations majeures de la voie physiologiqueconcernée (Ex : collagène, RET dans maladie de Hirsprung …)

L’ACTIVATION GENIQUE ou ONCOGENIQUE(Ex : RET, SCN4A et paralysie périodique hyperkalièmique …)

L’ALTERATION D’INTERACTIONS FONCTIONNELLES ET

DES EFFETS BIOLOGIQUES lorque la mutation FAUXSENS intervient dans un domaine d’interactionproteine-proteine ou protéine-ADN

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Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-Ser-Ala-Val-Thr-Ala-Leu-Try-Gly-Lys-Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Glu-Arg-Phé-Phé-Glu-Ser-Phé-Gly-Asp-Leu-Ser-Thr-Pro-Asp-Ala-Val-Met-Gly-Asp-Pro-Lys-Val-Lys-Ala-His-Gly-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Phé-Ser-Asp-Gly-Leu-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Gly-Thr-Phé-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys-Asp-Lys-Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asp-Phé-Arg-Leu-Leu-Gly-Asp-Val-Leu-Val-Cys-Val-Leu-Ala-His-His-Phé-Gly-Lys-Glu-Phé-Thr-Pro-Pro-Val-Glu-Ala-Ala-Tyr-Glu-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Ala-Leu-Ala-His-Lys-Tyr-His

Ex: la chaîne ß de l'hémoglobine (145 aa)

Anémie falciforme = maladie génétiquecaractérisée par une hémoglobine anormale.

Anomalie dans la chaîne ß de l'hémoglobine :6e acide aminé = VAL alors qu'il devrait être GLU



Les mutations FAUX SENS représentent environ 30%des mutations germinales dans nombre de maladiesgénétiques.

Elles posent le problème de leur identitéphysiopathogénique quand elles sont de découverteinitiale dans des familles de très petite taille ouchez des patients isolés :

S’agit-il alors de réelles mutations ou depolymorphismes ?

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- Mutations silencieuses (isosémantiques) (1)


ATG CCC GAC GTGTAC GGG CTG CACM P D V

Mutation Faux sens NEUTRED ou E : effet identique

ATG CCC GAG GTGTAC GGG CTC CACM P E V

Mutation SILENCIEUSE(codon different, aa identique)

isosémantique


- Mutations silencieuses (2)

Ces mutations ne changent pas lasignification du code génétique

Elles sont à la base des polymorphismes denucléotides (SNPs) et globalement nonpathogènes.

Souvent, elles seront méconnues su un gène n’a pasété exhaustivement séquencé

Rien n’exclut cependant qu’une telle substitutionisosémantique ne puisse influer sur l’activité ou lafonction d’un gène surtout si elle survient dans uneséquence CONSENSUS, tel que CRE, TRE, NLS, NES

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DELETIONS / INSERTIONS GENIQUES (1)

MUTATIONS FRAMESHIFTEntraînant un décalage du cadre de lecture

Délétion ou insertiond’un nombre de basesNON multiple de 3,soit 1,2,4,5,7 pb …

Ces anomaliesfréquentes dans lesmaladies génétiqueshumaines décalementle cadre normal delecture basé sur le

rythme ternairedu code génétique.


ATG CTC CGA AGT GTAC GAG GCT TCA CM V R S

STOP


- Les mutations “frameshift” aboutissentgénéralement à un codon STOPprématuré situé plus ou moins loin enaval de la délétion ou de l’insertion.

- Il peut s’agir de délétion (del), d’insertion(ins), de duplications (nonmultiples de 3) ou de réarrangementsplus complexes incluant une délétion puisune insertion de séquence ou inversement

La nomenclature est :N° nucléotide cDNA (c) ou génomique (g) – position –type - Nbre ou type de bases

Exemples : c.924 ins C - g.1484 delG -

c.1213_1231del17pbg.692_693del / c.92_93del

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Deletions / Insertions EN PHASE :Multiples de 3, elles ne mofifient pas lecadre de lecture.Elles induisent la perte d’un ou plusieurs aa

La nomenclature est comme lesframeshifts :N° nucléotide cDNA (c) ougénomique (g) – position – type -Nbre ou type de bases

c.1380ins3pbg.1480_1482del (AGG)c.734_745del (12pb)


ATG AAA CCC GAA GTGTAC TTT GGG CTT CACM K P E V


Remarques :Pièges du diagnostic en biologie moléculaire

(PCR), ces délétions doivent être envisagées dans lesmaladies avec haplo-insuffisance dès lors que lesrecherches conventionnelles en séquençages’avèrent négatives dans les exons et les introns.

Amorces PCR

En effet, la PCR, si elle n’estpas quantitative, n’amplifie

que l’allèle normal.

Symbolisées par DEL (…..), elles ne sont accessiblesque par la PCR ou le Southern-Blotquantitatifs ou par les techniques de FISHsur le tissu constitutionnel ou lésionnel.

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Nombre de loci, outre ceux liés au chromosomeX peuvent se retrouver en hémizygotie du faitde la délétion du second allèle, notamment

dans les génomes des tumeurs

PERTE D’HETEROZYGOTIE

PERTE D’HETEROZYGOTIECaractéristique des gènes impliqués dans les

cancers et dont la fonction physiologique est larégulation physiologique est la régulationnégative de la prolifération cellulaire

Loss of heterozygosity with polymorphic markerssurrounding the MEN1 locus in 11q13 suggests that

MEN1 is a growth suppressor gene (Knudson)

PYGM ‘caga’ repeatLocated 70 Kb downstream

of MEN1

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MUTATIONS PONCTUELLESDES SITES D’EPISSAGE (1)

Elles surviennent aux jonctions constituées de 2bases consensus présentes chez tous lesorganismes supérieurs. :

- EXONS-INTRON (site donneur GT)- INTRON-EXON (site accepteur AG)

L’épissage (splicing) est un phénomène précispermettant d’exciser les introns en évitant toutdécalage du cadre de lecture.

Mutation d’unsite d’épissage

Excision anormale de l’EXON

Rétention anormale de l’INTRON

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MUTATIONS PONCTUELLESDES SITES D’EPISSAGE (2)

L’épissage n’est pas un phénomène passif maiscontrolé par le spliceosome, complexe de

proteines régulatrices et de snRNA (small RNA)

Il est possible que des mutations ponctuelles situées au delà des sitesDONNEUR et ACCEPTEUR puissent influer le phénomène d’épissage.Ex : mutation ponctuelle située au milieu d’un intron peut modifier

une séquence consensus de fixation d’un facteur d’épissage.

La nomenclature est :N° nucléotide extreme de exon IVS +/- nbre nucléot. Nucléot.1>nucléot.2

Exon 4 Exon 5

Intron 4GT AG

IVS4 +2 T>Aou 234 +2 T>A

234 235

IVS4 -5 G>Aou 235 -5 G>A

Functionnal effects of MEN1 intronic mutations

Vercherat et al, submitted

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Even after abnormal exon skipping or intronic retention, splice-site mutationsdo not seem to affect the expression (quantitatively and qualitatively) of menin

in patients LCL

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Nombre des mutations de type NON SENS, en décalage de cadre delecture avec codon STOP prématuré, et probablement des sites

donneurs / accepteurs d ’épissage confèrent à l ’ARN messager uneconformation qui pourrait stimuler le processus de ‘ mRNA decay ’

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MUTATIONS « DYNAMIQUES » (1)

Maladies par expansion de “triplets”

EPM : épilepsie myocloniqueFRAXA : retard mental lié à l’X-fragileFRDA : ataxie de FriedreichHD : maladie de HuntingtonSCA(…) : ataxie spinocérébélleuses 1-7DM : dystrophie myotonique de Steinert

Ces séquences sont susceptibles de sedéstabiliser par “slippage” etl’amplification anormale est à l’origine desyndrome cliniques graves

MUTATIONS « DYNAMIQUES » (2)

normales malades

Nbre de répétitions

Maladies Séquence

11-34 40-200Huntington’s diseaseGène HD

CAG

6-54 200-1300Syndrome de l’X Fragilegène FMR-1

CGG

Maladies par expansion de “triplets”

Fils atteint

Normal

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EFFETS FONCTIONNELS DESMUTATIONS EN FONCTION DE LEUR

POSITION DANS LE GENE (1)

Régions promotrices - 5’

D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations dans les sites régulateurs / promoteurs

- Sous expression du gène(méthylation, mutation affectant un siteconsensus de fixation du complexe d’initiation)

- Fusion-dérégulation dans les réarrangement dutype translocation, inversion, délétion ...




D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations exoniques

- Modification de la signification d’un aa avec induction d’effetdominant-négatif et/ou modification de substrat et /ou déviationmétabolique

- Truncations proteiques (effet délétère)

- Effet de délocalisation intra-cellulaire de la protéine (F508 dans CFTR)

- Effet de la maturation et/ou stabilité post-transcriptionnelle et/oupost-traductionnelle

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Mutations des sites d’épissage et intronique

- Inactivation d’un site donneur d’épissage avec lecture“traductionnelle” d’un intron

- Inactivation d’un site donneur ou accepteur d’épissageavec excision aberrante d’un exon (MEN1 : 894ivs4+1)

- Activation d’un site cryptique d’épissage avec gainou perte d’une séquence codante(ivs1-110G>A de la -globuline > -thallassémie)




D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns




D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations des sites régulateurs en 3’ (mal connus)

- Altération du codon de terminaison et élongationprotéique anormale(Hb constant spring TAA > CAA)

- Altérations des signaux de polyadénylation >instabilité de l’ARNm

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D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations extra-géniques ou effets trans

- Mal identifiées, il s’agit de mutations intervenantsur un gène ou une séquence proche ou distantedu gène de la maladie et influant par effet“trans” sur celui-ci.

Ex : Méthylation de la région FRAXA> FMR-2 associées > Retard mentaux

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Résumés desmutations

Recherche demutations :

choix de stratégies

Professeur Alain CALENDER

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Nouveau Gène Identifié :

- localisation chromosomique

- ARNm - séquence codante

- pattern d ’expression

- structure du gène

- taille génomique

- spectre de mutations

La méthode de recherche de mutationsdoit être de préférence :

~ sensible

~ rapide

~ peu coûteuse

~ automatisable

~ avec utilisation minimum de produits toxiques

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ADNg ARNmA

van

tag

es

Désavan

tag

es

- facilement accessible- deux allèlesreprésentésde manière égale

- connaissance de la structuredu gène n ’est pas nécessaire

- moins de fragment PCR à analyser- anomalies du transcrit

- séquence et structuregénomiquesindispensables

- analyse exon par exon

- potentiellement faible expression dansles tissus accessibles

- transcrit muté complètementou partiellement instable

- ADNg nécessaire pour caractériserdes mutations dansles régions non-codantes

Recherche de mutations provoquantdes remaniements de la taille de:

< 100 pb

ADNg, ADNc

- différence de conformation- reconnaissance enzymatiqueou chimique de mésappariements

- test de protéine tronquée- séquençage

> 100 pb

ADNg

- FISH- peignage de l’ADN- électrophorèse en champ pulsé- Southern- PCR quantitative- PCR « longe range »

ADNc

- PCR semi « longe range »

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Mutations germinales identifiées

BRCA2

1 kb

MOTIFS BRC

Domaine d’activation

transcriptionnelle

1 2 3 4 7 9 exon 10 14 151617 1819 2223 25 exon 27

5 6 8 12 13 20 21 24 26

5’

exon 11

AUG

UAG (AAA)

n

24ter240ter

275ter

1258ter958ter

1907ter1882ter 2098ter

2337ter2565ter 2862ter 3148ter

3015ter3043ter

2714ter

414ter 1785ter 1953ter

tyr42cys

leu1019valala2951thr

tyr3098his

2311ter

NLS

EXONS :

3’

1909ter

1 kb

BRCA1

81ter 503ter 1460ter 1530ter1829ter

87ter 526ter 1115ter 1563ter1835ter

563ter 1163ter 1719terAUG

UAG (AAA

)n

1 6 7 8 exon 11 13 14 15 16exon 24

3 5 9 10 12 1723

1822

1921

20

2

EXONS :

5’

3’

36ter 143ter 255ter 908ter 998ter 1241ter39ter

cys61glycys64glyΔexon5

NLS1 NLS2RING FINGER MODULESBRCT

285ter

233ter 1546ter1548ter

1672ter

1694ter

1853ter

SEQUENÇAGE DE L’ADN

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PRINCIPE

Séquençage du DNA - Méthode

chimiqueMaxam etGilbert

1ère méthodeFin des années 70

Coupure au niveaude l’une des quatrebases

4 fractions :Traitementchimiqueparticulier

PREPARATION

Séquençage du DNA Méthode

chimique

1- Le fragment ADN est marqué en5 ’(R*/Fluo)

2- Dénaturation : ADN monocarénaire

3- Excision (Séparation de la base dudesoxyribose)

G Disulfate methyleG+A Acide FerriqueC+T HydrazyneC Hydrazine + Soude 5M

4- Coupure chimique (conditions pouravoir une coupure par brin)

5- Detection grace au marquage en 5 ’

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REALISATIONPRATIQUE ETRESULTATS

Séquençage du DNA Méthode

chimique

- Gel de poly-acrylamide

- Pose dans quatre puitsdifférents

- Marquage R* ou sondesfroides

- Automatisation

Séquençage duDNA

Méthode enzymatiquePRINCIPE - Sanger

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Séquençage du DNA parMéthode enzymatique

REALISATION PRATIQUE ET RESULTATS

Séquençeur automatiqueddNTP marqués par 4 fluorochromes différentsDépots dans le meme puit

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MUTATION ?

GUANINE ( PIC NOIR) PAR UNETHYMINE (T )

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MUTATION ?

AGT GGTAcide aspartique Glycine

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MUTATION, CONTAMINATION ?

DELETION DE 5 pb !

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• Pour connaître la séquence des ADN, on fait synthétiser un brin d'ADN parune enzyme spécifique.

• L'enzyme commence son travail à partir de l'extrémité 3' d'une sondehybridée qui sert d'amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceuxdu brin d'ADN qu'elle copie.

• On lui donne pour substrats des désoxynucléotides triphosphates normauxmélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3'est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.

• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquementpar des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC,jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)

• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique(électrophorèse : les ADN sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), enfonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).

• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèlela séquence des fragments synthétisés.

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Séquençage direct

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