Mycobacteri

Micobatteri non tubercolari che possono essere isolati da campioni clinici

Il peptidoglicano è ricoperto verso la superficie cellulare esterna, da una complessa struttura particolarmente ricca di carboidrati e lipidi

nei micobatteri oltre il 40% dei lipidi cellulari totali sono presenti negli involucri esterni essenzialmente formati da arabino-galattani che legano al peptidoglicano una serie di particolari acidi grassi, denominati acidi micolici (acidi grassi a lunga catena ramificata) cui sono ulteriormente legati (a formare strutture del tipo delle «cere») una serie di molecole di glicolipidi fenolici

La struttura è inoltre attraversata da altre molecole glicolipidiche (fosfoinositido-mannani, lipo-arabinomannani) ancorate alla membrana cellulare

CEMOVIS

• Cryo-electron microscopy of vitreous section

• Molti componenti della parete cellulare presentano attività biologica

• È noto che componenti non proteiche della parete cellulare di M.tuberculosis intervengono nel meccanismo di patogenicità

• un ruolo importante viene svolto dagli acidi micolici che sono delle complesse strutture

molecolari di acidi grassi a lunga catena

Gli acidi micolici più semplici sono costituiti da due catene, una lunga fino a 60 atomi di carbonio (distale) e una più corta (prossimale)

Esistono cinque tipi di acidi micolici

gli acidi micolici possono essere organizzati in strutture complesse

• Il trealosio dimicolato (TDIM)

anche noto come FATTORE CORDALE• è uno dei più importanti ed esercita una potente azione biologica• Presenta un’attività immunostimolatoria, stimola la secrezione di citochine ed è

strettamente coinvolto nel meccanismo di patogenesi che sfocia con il danno tissutale tipico della TB

• coinvolto nella protezione da stress ambientali• contribuisce alla bassa permeabilità della parete cellulare che conferisce una

naturale resistenza ai farmaci • coinvolto nella protezione dagli stress ossidativi • nella persistenza nei tessuti dell’ospite immunocompetente

• La porzione esterna della parete è ricca in glicolipidi complessi e fenolici,che sono delle cere non polari rilasciate dalla cellula e svolgono una importante azione biologica

MTBC Mycobacterium tuberculosis complex

• Mycobacterium tuberculosis

• Mycobacterium canettii

• Mycobacterium africanum

• Mycobacterium microti (roditori)

• Mycobacterium bovis

Nel 1998 è stato completato il sequenziamento del genoma di M. tuberculosis

Genoma costituito da 4411529 bp codifica per 3986 proteine

• Più recentemente è stato completato il genoma di un ceppo clinico di M.tuberculosis (ceppo CDC1551) e quello di un ceppo di M. bovis

• Nel complesso è stato osservato che M. tuberculosis presenta:

• un maggior numero di geni rispetto a quanto osservato per altri batteri patogeni

• un metabolismo più complesso di quanto fosse possibile ritenere in passato

• può essere considerato una specie geneticamente stabile con poca variabilità genetica

• M bovis è l’agente eziologico della TB negli animali e ha uno spettro d’ospite molto ampio, potendo infettare bovini, antilopi, foche, elefanti, leoni

• Raramente causa patologia nell’uomo, che si infetta assumendo alimenti contaminati, come il latte di bovini infetti

• M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori e non è patogeno per l’uomo

Analisi di genomica comparativa tra vari ceppi di MTBC hanno permesso

• di individuare regioni in cui maggiori sono le differenze tra questi

• di definire in modo corretto i rapporti genetici

• Rapporti evolutivi tra le varie specie e/o sottospecie

È stato possibile costruire un albero genealogico all’interno di MTBC

e di dimostrare come le varie subspecie si siano evolute attraverso

un processo di DELEZIONE GENICA, in cui frammenti di genoma

anche di diverse decine di kb SONO STATI PERSI

È interessante notare come questo processo abbia avuto un effetto

sull’adattamento all’ospite/ mammifero

le tre subspecie che causano la TB nell’uomo, M. tuberculosis, M. africanum e M. canettii, raramente o mai infettano gli animali

M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori di campagna, ma è

assolutamente avirulento per l’uomo

È interessante osservare inoltre come M. microti abbia perso per delezione

genica un frammento di genoma simile a quello responsabile della perdita di

virulenza del ceppo BCG

M. bovis presenta il maggior numero di delezioni geniche e

paradossalmente presenta il più ampio spettro d’ospite

• La TB è stata trasmessa dall’uomo agli animali e non viceversa come è avvenuto in passato per la maggior parte degli agenti patogeni

La secrezione di proteine e antigeni attraverso la membranarappresenta un potente ed efficace sistema per interferire con i

meccanismi di difesa dell’ospite

Anche per M. tuberculosis questo meccanismo promuove l’azione patogena e assicura la moltiplicazione nei tessuti dell’ospite

Oltre ai sistemi di secrezione delle proteine ESAT-6 e CFP10, M.tuberculosis presenta altri sistemi di secrezione come il Sec e il TAT

Il sistema Sec è coinvolto nella secrezione della superossido dismutasi, un enzima che consente al micobatterio di rendere meno battericida l’ambiente all’interno del fagolisosoma

Ceppi di M. tuberculosis in cui il Sec è stato inattivato geneticamente risultano essere fortemente attenuati

I sistemi di secrezione finora caratterizzati mediano il trasporto delle proteine attraverso la membrana plasmatica

RAPPORTO OSPITE-PARASSITA• L’interazione dei micobatteri con il sistema immunitario innato e acquisito, gioca un ruolo

fondamentale nel rapporto ospite-parassita

• Alcuni componenti di parete interagiscono con recettori presenti sulla superficie delle cellule del sistema immunitario, tra cui in particolare i recettori Toll-like (TLR)

• È stato dimostrato ad esempio che il LAM (lipoarabinomannani) interagisce con il TLR2

.

• è stato possibile dimostrare l’induzione di apoptosi, che consente al micobatterio di evadere la risposta dell’ospite o di modulare l’intensità della risposta immunitaria

• M. tuberculosis induce una intensa risposta cellulare specifica diretta verso gli antigeni secreti dal micobatterio durante le prima fasi dell’infezione

• le proteine Esat-6 e CFP10 sono due tra gli antigeni più immunogenici di M. tuberculosis, tanto da essere utilizzati come base per la diagnosi indiretta di infezione da M. tuberculosis

Incidenza e prevalenza

• La tubercolosi è provocata da Mycobacterium tuberculosis e può colpire vari organi.

• I sintomi specifici sono tipici per le varie sedi di infezione e sono generalmente accompagnati da febbre, sudorazione e calo ponderale.

• Circa un terzo della popolazione mondiale è infettata da M. tuberculosis.

• Il microrganismo è responsabile del maggior numero di decessi da malattie infettive.

• L'Organizzazione mondiale della sanità stima che il 95% dei casi si verifichi nei paesi in via di sviluppo e che il 25% dei decessi evitabili in tali paesi sia attribuibile alla tubercolosi.

• In Italia nel 1997 (ultimi dati disponibili) sono stati notificati 5.176 casi di tubercolosi, con un'incidenza pari a 9/100.000.

La tubercolosi in cifre

1

Numero di bacilli tubercolari necessari per stabilire un’infezione

10

Numero medio di persone che vengono infettate da un singolo caso di tubercolosi polmonare

20 Tempo in ore necessario ad un singolo micobatterio tubercolare per riprodursi

130

Ore di esposizione ad un caso di tubercolosi polmonare aperta necessarie per contrarre una infezione tubercolare

4287

Numero di casi di tubercolosi in Italia nel 2001

2.500.000

Numero di morti per tubercolosi all’anno nel mondo

8.000.000

Numero di nuovi casi di tubercolosi per anno nel mondo

2.000.000.000

Numero stimato di persone con infezione tubercolare latente

Si stima che la TB uccida ogni giorno circa 5000 persone

• L’OMS indica circa 1,5-2 milioni il numero di decessi all’anno

• 8-10 milioni il numero di nuovi casi

• circa 30 milioni il numero di pazienti con TB attiva

• Il 95% dei casi si registra nei Paesi in via di sviluppo: Africa sub-sahariana e alcuni Paesi del Sud-Est asiatico, dove l’incidenza della malattia è

nell’ordine dei 100-500/100.000 abitanti

• in questi Paesi la TB rappresenta un drammatico problema sanitario, sociale ed economico

• Le nuove migrazioni, l’avvento dell’AIDS, la comparsa di nuove povertà hanno determinato un riemergere dell’infezione anche nei paesi industrializzati

• Per tali motivi l’OMS ha dichiarato nel 1993 la TB emergenza globale

• In Europa 10-30 /100.000 abitanti

• In Italia 5-10 /100.000 “

L’epidemia tubercolare è stata definita

dall’Organizzazione Mondiale della Sanità un’emergenza globale

Il fatto che la situazione sia così poco controllata è particolarmente grave, considerando che il trattamento antitubercolare è uno degli interventi sanitari più efficaci sia in termini individuali che di salute pubblica

trasmissione della tubercolosi e progressione dalla forma latente alla attiva

Small PM et al, N Engl J Med, 2001

RISPOSTA IMMUNITARIALa caratterizzazione immunologica della risposta immunitaria che sisviluppa in risposta all’infezione da M. tuberculosis è piuttosto complessa

La risposta cellulare è caratterizzata dalla presenza di linfociti CD4, che secernono citochine pro-infiammatorie (IFN-γ) e da linfociti CD8 ad azione citotossicaNon è stato possibile ad oggi evidenziare dei correlati immunologici di protezione, vale a dire un tipo di risposta immunitaria specifica correlabile con il controllo dell’infezioneL’assenza di tali informazioni rende ancora più difficile lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la TB

PATOGENESIMycobacterium tuberculosis si trasmette per via aerea da un paziente malato con TB polmonare attiva e aperta e si ritiene siano sufficienti pochi batteri per iniziare il ciclo patogenetico di infezione nel nuovo paziente

Il bacillo, una volta raggiunto lo spazio alveolare, viene fagocitato dai macrofagi alveolari, dove può essere rapidamente ucciso oppure può resistere a tale azione Microbicida Nel primo caso l’infezione non ha luogo e l’ospite non matura alcuna risposta immunitaria specifica

Quando viceversa i bacilli resistono all’azione microbicida dei macrofagi, si ha moltiplicazione attiva all’interno del macrofago e i micobatteri possono infettare anche altri fagociti e cellule epiteliali presenti in prossimità del sito di infezione

Durante questa fase i batteri possono disseminarsie raggiungere attraverso il sangue qualsiasi tessutoe organo

La moltiplicazione batterica richiama cellule del sistema immunitario cheiniziano a infiltrarsi e a organizzare il tipico granuloma attorno al sito diinfezione primariaLa presenza di leucociti e la secrezione di citochine e chemochine ad azioneinfiammatoria inducono la comparsa della tipica necrosi caseosa

Nel 90-95% dei casi la risposta dell’ospite è in grado di circoscrivere econtrollare l’infezione e nell’ospite permane soltanto una lesione nel sito diinfezione primaria che prende il nome di complesso primario

In questi soggetti il bacillo non viene completamente ucciso ma permanein una fase di latenza.

Si stabilisce un equilibrio tra M. tuberculosis e il sistema immunitariodell’ospite, in cui da un lato si impedisce la moltiplicazione incontrollatadel bacillo e dall’altro il bacillo è in grado di resistere all’azionemicrobicida del sistema immunitario.

Tale condizione è evidenziata dalla presenza di una intensa rispostacellulo-mediata nei confronti degli antigeni di M. tuberculosis,classicamente evidenziata dalla reazione della tubercolina (Mantoux)

La fase di latenza, clinicamente asintomatica,può perdurare anche per decenni e può sfociare in circa il 5-10% dei casi in una riattivazione dell’infezione con comparsa di TB attivaIn questi casi, così come quando l’infezione primaria non viene controllata, il bacillo si replica attivamente e la risposta dell’ospite non solo non è in grado di controllare l’infezione ma è responsabile del danno tissutale tipicamenteassociato alla TB (immunopatologia)

La moltiplicazione del batterio richiama cellule del sistema immunitario, che mediante la secrezione di chemochine e citochine inducono uno stato infiammatorio che causa una necrosi caseosa e danno tissutale che sfocia nella comparsa delle tipiche caverne presenti a livello del parenchima polmonare: questa è la classica forma di TB polmonare, clinicamente evidente e che rappresenta la forma contagiosa dell’infezione

La più importante delle regioni RD è la RD1contiene una regione del genoma che codifica per i geni Esat-6 e cfp10, e più in generale per il cluster genico ESX1:RD1 è essenziale per la virulenza di M. tuberculosis

FATTORI di VIRULENZA

• Non sono stati ancora identificati le proteine e i fattori di virulenza di M. Tuberculosis

si ipotizza un diretto coinvolgimento delle:

proteine codificate dalla regione di differenza 1 (RD1)

• La regione RD1 è un frammento di genoma di 10,7 kb che codifica per

numerosi geni, tra cui in particolare Esat-6 e cfp10

• Tale regione è assente nel ceppo vaccinico M. bovis BCG ed è stato

dimostrato come l’attenuazione di quest’ultimo sia dovuta all’assenza di RD1

l’inserimento della regione RD1 nel genoma di BCG ha come risultato un aumento della virulenza del ceppo BCG ricombinante

• la proteina ESAT-6, codificata dalla regione RD1, potrebbe indurre la

formazione di pori nelle membrane dei vacuoli del macrofago in cui il

micobatterio si moltiplica

• La regione che codifica per ESAT-6 e CFP10 comprende anche altre

proteine che costituiscono l’apparato secretorio.

una malattia con una storia naturale complessa

per raggiungere un controllo totaledella tubercolosi esistono tre diverse strategie, tra loro

complementari,con un diverso livello di priorità, in base alla prevalenzadi malattia nella popolazione:

la vaccinazione, che è stato dimostrato avere un’efficacia limitata e variabile

il trattamento della tubercolosi attiva, intervento di elevata e provata efficacia per il controllo della malattia, ma non sempre effettuato tempestivamente,soprattutto nei Paesi in via di sviluppo

la diagnosi ed il trattamento dell’infezione tubercolare latente, che è l’elemento chiave per l’eliminazione della tubercolosi

La patologia tubercolare è emersa negli ultimi anniquale problema sanitario di primaria importanza sia

nei Paesi industrializzati, sia in quelli in via di sviluppo.

La tubercolosi infatti causa un numero di mortipiù elevato rispetto a qualsiasi altra patologia

infettivaLe ragioni del ritorno epidemiologicodella tubercolosi sono principalmente: 1) l’espansione dell’epidemia da HIV2) la ridotta efficienza delle misure di sorveglianza

della malattia nei Paesi in via di sviluppo e nei Paesi dell’ex Unione Sovietica

3) l’emergenza e la diffusione globale della tubercolosi da germi multi-resistenti

“la tubercolosi èun’infezione con un periodo di incubazione che varia da poche

settimane ad una vita intera”

• Le persone con aumentato rischio di sviluppare la tubercolosi attiva dopo avere acquisito l’infezione si giovano della terapia con isoniazide, di provata efficacia nel ridurre lo sviluppo successivo di malattia.

• Tuttavia queste persone sono tuttora difficili da identificare,essendo per definizione asintomatiche e con radiografia del torace negativa.

Il test cutaneo tubercolinico inoltre (l’unico sistemausato fino ad ora per identificarle) è gravato da molteplicilimitazioni, sia in termini di ridotta sensibilità, che di bassa

specificità.

Mycobacterium tuberculosis

fattori di rischio

• I fattori sociali comprendono povertà, sovraffollamento, mancanza di fissa dimora e accesso inadeguato ai servizi sanitari.

• I fattori clinici includono l'infezione da HIV e l'immunodepressione.

“la tubercolosi èun’infezione con un periodo di incubazione che varia da poche settimane ad una vita intera”

Recenti studi immunologici hanno consentito di sviluppare due nuove tecniche diagnostiche, entrambe basate sull’identificazione

di linfociti T specifici per antigeni tubercolari: Il test Elispot ed il test QuantiFERON®-TB. Queste tecniche sono dotate di sensibilità e specificità

maggiori rispetto al test cutaneo tubercolinico

Elispot

il M. tuberculosisevoca una forte risposta immune cellulo-mediata, sostenuta in modo particolare da linfociti di tipo Th1,che producono come citochina principale l’interferone gamma. L’acronimo di questa particolare tecnica è Elispot (Enzyme-Linked-ImmunoSPOT).

I linfociti T che incontrano un patogeno in vivo si sensibilizzano per gli antigeni di quel particolare microrganismo e, quando vengono di nuovo messi in contatto con questi medesimi antigeni ex vivo nell’Elispot, rispondono producendo interferone gamma.

Nell’incubazione, che avviene durante la notte, vengono catturate nel sistema le singole molecole di interferone gamma non appena rilasciate dai linfociti T, i quali vengono successivamente identificati da uno spot blu scuro il giorno successivo.

Ogni spot rappresenta quindi l’impronta di ogni singolo linfocita T, che produce interferone gamma specifico per l’antigene micobatterico.

Metodo

Peripheral blood

PBMC

PHAPPDESAT-6 peptidesESAT-6 protein

ELISPOT(day 2)

Cell cultures

L’estrema sensibilità della tecnologia Elispot è stata poi combinata con le più recenti acquisizioni in materia di genomica

micobatterica, per dare vita ad un test altamente specifico e sensibile, con una potenziale ricaduta nella pratica clinica.

Alla fine degli anni ’90 sono state perfezionate tecniche che hanno consentito il confronto di interi genomi di singoli ceppi di batteri tra loro correlati. Grazie a questo tipo di confronto sono

state identificate le differenze genetiche tra vari ceppi di BCG e di M. tuberculosis.

Il risultato è che tutti i ceppi di BCG usati nel mondo mancano di un particolare segmento genomico,che è al contrario presente nel

M. tuberculosis. Sembra che questa delezione genetica sia avvenuta spontaneamentenel ceppo di BCG, prodotto

originariamenteda Calmette e Guerin tramite colture ripetute di M. bovis, prima del 1921, quando il BCG fu distribuito in tutto il

mondo come vaccino. Il segmento di genoma deleto è noto come Region of

Difference(o RD-1), e codifica per nove geni.

Due prodotti del gene RD-1, l’early secretory antigenic target-6 (ESAT-6) e il colture filtrate protein 10 (CFP10), sono bersagli importanti dei linfociti Th-1, che secernono

interferone gamma nei soggetti con infezione da M. tuberculosis

Il test QuantiFERON©-TB

Il test QuantiFERON©-TB (QFT-TB) è stato approvato nel 2001 per l’uso clinico negli Stati Uniti dalla Food and Drug Administration quale valido strumento per la diagnosi di infezione tubercolare latente in selezionate condizioni cliniche. È un test diagnostico in vitro su sangue venoso che permette di rilevare la risposta immune cellulo-mediata specifica per M. tuberculosis, attraverso la misurazione della quantità d’interferone-gamma rilasciato dai linfociti T specificamente sensibilizzati, dopo incubazione con PPD e con antigeni di controllo. Questo test possiede alcune caratteristiche che lo rendono interessanteper l’uso clinico: 1) ha sensibilità e specificità comparabili rispetto al test cutaneo; 2) non necessita di una visita di ritorno per la lettura del test; 3) prevede la stimolazione con antigeni diversi e non soltanto con il PPD; 4) ha minore variabilità nell’esecuzione e nella lettura dei risultati; 5) è completamente standardizzato per quanto riguarda i reagenti; 6) non presenta il rischio di possibili effetti collaterali sistemici7) non è affetto da effetti di potenziamento (booster) e quindi ha una ridotta incidenza di risultati falsamente positivi.

NUOVI VACCINI

Negli ultimi anni, anche grazie a un rinnovato investimento nella ricerca sulla TB, abbiamo assistito allo sviluppo di nuovi vaccini sperimentaliSono state implementate diverse strategie di vaccinazione:

vaccini a subunità, costituiti da due o più antigeni ricombinanti e purificati di M. tuberculosis,somministrati con sostanze adiuvanti

ceppi di Vaccinia virus ricombinanti che esprimono antigeni dominantidi M. tuberculosis

ceppi di BCG ricombinanti che iper - esprimono antigeni dominanti o chesono stati modificati per renderli più immunogenici

I risultati ottenuti con alcuni di questi vaccini sono buoni in modellipreclinici animali e si spera che gli studi clinici possano a brevefornire una valida alternativa al vaccino BCG

DOTS Directed Observed Therapy Short-course

Il protocollo terapeutico suggerito dall’OMS prende il nome di DOTS econsiste nell’assunzione simultanea di:

3 farmaci (isoniazide, pirazinamide e rifampicina) per i primi 2 mesi

2 farmaci (isoniazide e rifampicina) per i restanti quattro mesi

Il trattamento con più farmaci contemporaneamente si rende necessario perevitare la selezione di resistenze nel corso della terapia

È stato calcolato, ad esempio, che la frequenza di mutanti primari è di circa1 ogni 105 per l’isoniazide, 1 ogni 106 per la streptomicina e 1 ogni 107 per larifampicinaLa lenta crescita del micobatterio e i lunghi periodi di trattamento fanno sìche la comparsa di resistenze ai singoli farmaci sarebbe frequente nel casodi terapia con un singolo antibiotico Viceversa, poiché la probabilità di resistenza ai farmaci è moltiplicativa, l’utilizzo di più farmaci fa sì che la frequenza passi da 10-5 nel caso dell’isoniazide a 10-18 nel caso di somministrazione con i suddetti tre farmaci contemporaneamente

Mycobacterium marinum:

questo organismo vive in ogni tipo d'acqua, piscine, serbatoi, eccetera. Le infezioni conseguono a traumi, anche lievi, punture di pesci o crostacei. La malattia si limita alle zone più fredde del corpo, spesso solo le estremità.

Infatti, una volta, l'applicazione locale di calore rappresentava l'unica cura. Le infezioni da questo organismo non sono acute: è necessario un periodo di incubazione da una a otto settimane, prima della comparsa dei segni di infezione. Le lesioni iniziali sono piccole papule color carne, che lentamente ingrossano assumendo un colore rosso-bluastro. Possono localizzarsi lungo i vasi linfatici, assumendo un andamento lineare e svilupparsi, occasionalmente, in forma di cellulite progressiva.