Upload
-
View
124
Download
10
Embed Size (px)
Citation preview
LỜI CẢM ƠN
Thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học là một trong những cơ hội giúp chúng tôi
học hỏi thêm nhiều kỹ năng, nâng cao tinh thần kỹ luật, luôn học hỏi, tìm tòi để thực
hiện công việc, đồng thời cũng giúp chúng tôi có thêm kỹ năng giải quyết vấn đề. Để
đạt được kết quả này, ngoài sự cố gắng của bản thân phải kể đến sự giúp đỡ của thầy
cô, gia đình và bạn bè.
Trước tiên, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã luôn
luôn ủng hộ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi học tập, nghiên cứu.
Tiếp đến chúng tôi xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học,
trường đại học Mở TP. HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, những kinh
nghiệm quý giá làm nền tảng cho chúng tôi có thể ứng dụng vào thực hiện đề tài
nghiên cứu.
Và đặc biệt chúng tôi xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và Cô Dương Nhật
Linh, người đã tận tình chỉ dẫn, động viên, tạo cho em niềm say mê nghiên cứu.
Bên cạnh đó chúng tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ động
viên, giúp chúng tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian qua.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2011
Nhóm sinh viên thực hiện
Đỗ Bảo Ngọc
Trần Thị Khánh Linh
Hà Thị Bảo Yến
i
i
MUC LUC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................12
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................15
1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH PHÒNG
TRỊ BỆNH TRÊN TÔM........................................................................................16
1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]....................................16
1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5].....................................16
1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41].......................................................17
1.2.1 Phân loài..................................................................................................17
1.2.2 Các giai đoạn phát triển...........................................................................18
1.2.3 Tuổi thành thục........................................................................................19
1.2.4 Tập tính ăn...............................................................................................20
1.2.5 Lột xác.....................................................................................................20
1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]..................21
1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ BỆNH
CHO TÔM [34, 36]................................................................................................23
1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY
SẢN .................................................................................................................24
1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]...........................................................24
1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]................25
1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm..............................29
1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản
[35, 39, 22, 9, 30].....................................................................................30
1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DUNG TRONG
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN..................................................................................36
ii
ii
1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]............................................................36
1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản.......................39
1.7 VI KHUẨN BACILLUS...........................................................................41
1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus..........................................................41
1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12]............................................................41
1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17].....................................................42
1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24, 28]....43
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................45
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.........................................46
2.2 VẬT LIỆU...............................................................................................46
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu..............................................................................46
2.2.2 Môi trường - hóa chất..............................................................................46
2.2.3 Thiết bị - dụng cụ.....................................................................................47
2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM............................................................................48
2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS...................................................................49
2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG.................................................................................50
2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26]...................50
2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26].........................51
2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27]...............................................52
2.7 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS..............................................................................................................54
2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1]............................................................54
2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú [11] 54
2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ...................................................................................58
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................59
3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS.................................................60
iii
iii
3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG...............................................................63
3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc..........................63
3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp................................66
3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY.......................................................72
3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. parahaemolyticus72
3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. alginolyticus.......82
3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. harveyi................91
3.4 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS:...........................................................................................................101
3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết................................................................101
3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú. .102
Chương 4...................................................................................................................105
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................105
4.1 KẾT LUẬN............................................................................................106
4.2 KIẾN NGHỊ...........................................................................................106
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................108
PHU LUC.................................................................................................................112
iv
iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA One-way analysis of variance
CFU Đơn vị khuẩn lạc
Cs Cộng sự
DC Đối chứng
LB Luria Bertani
NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
PL Postlarvae (hậu ấu trùng)
TCBS Thiosulphate citrate bile salts sucrose
v
v
DANH MỤC CÁC ĐƠN VỊ ĐO
% Phần trăm
µl Microlít
‰ Phần nghìn
cm Centimét
g Gam
g/L Gam/lít
L Lít
m Mét
mg Miligam
mL Millilít
nm nanometoC Nhiệt độ bách phân
pH Độ pH
vi
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập..................................................................................61
Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc.....................64
Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.....................67
Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................72
Bảng 3.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................74
Bảng 3.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................75
Bảng 3.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................77
Bảng 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................78
Bảng 3.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)............................................................................80
Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................82
Bảng 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................83
Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus ( tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................85
Bảng 3.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................86
vii
vii
Bảng 3.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................88
Bảng 3.15. Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)...................................................................................89
Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................91
Bảng 3.17 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................93
Bảng 3.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................94
Bảng 3.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................96
Bảng 3.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................98
Bảng 3.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)..................................................................................99
Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết.........................................................102
Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus................103
viii
viii
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Biểu đồ 3.1 Thử khả năng đối kháng của chủng Bacillus đối với V.
parahaemolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.......................69
Biểu đồ 3.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V.
alginolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ...............................69
Biểu đồ 3.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. harveyi theo
thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ............................................................70
Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F2 ở những mật độ khác nhau.....................................................73
Biểu đồ 3.5 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F10 ở những mật độ khác nhau...................................................74
Biểu đồ 3.6 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F11 ở những mật độ khác nhau...................................................76
Biểu đồ 3.7 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F27 ở những mật độ khác nhau...................................................77
Biểu đồ 3.8 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F28 ở những mật độ khác nhau...................................................79
Biểu đồ 3.9 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F33 ở những mật độ khác nhau...................................................80
Biểu đồ 3.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F2 ở những mật độ khác nhau...............................................................82
Biểu đồ 3.11 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F10 ở những mật độ khác nhau..............................................................84
Biểu đồ 3.12 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F11 ở những mật độ khác nhau..............................................................85
ix
ix
Biểu đồ 3.13 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F27 ở những mật độ khác nhau..............................................................87
Biểu đồ 3.14 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F28 ở những mật độ khác nhau..............................................................89
Biểu đồ 3.15 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F33 ở những mật độ khác nhau..............................................................90
Biểu đồ 3.16 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở
những mật độ khác nhau.......................................................................92
Biểu đồ 3.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở
những mật độ khác nhau.......................................................................93
Biểu đồ 3.18 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở
những mật độ khác nhau.......................................................................95
Biểu đồ 3.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở
những mật độ khác nhau.......................................................................97
Biểu đồ 3.20 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở
những mật độ khác nhau.......................................................................98
Biểu đồ 3.21 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở
những mật độ khác nhau.....................................................................100
Biểu đồ 3.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus............104
x
x
DANH MỤC CÁC HINH
Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú............................................19
Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio.........................................................................................21
Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm..........................................23
Hình 1.4 Trùn quế 37
Hình 1.5 Vi khuẩn Bacillus......................................................................................41
Hình 1.6 Cấu trúc của bào tử...................................................................................42
Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm.................................................................................48
Hình 2.2 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc...................................................51
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy.....................................................53
Hình 2.5 Thuần hóa tôm...........................................................................................56
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử
nghiệm lên ấu trùng tôm sú..................................................................56
Hình 2.6 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm......................................................................57
Hình 2.7 Hộp bố trí thí nghiệm................................................................................57
Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy...........................60
Hình 3.2 Nhuộm gram Bacillus...............................................................................60
Hình 3.3 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc............................65
Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp........71
Hình 3.5 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ
107 ở ngày 5........................................................................................102
Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết.....................................................103
xi
xi
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐẶT VẤN ĐỀ
12
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế quốc
dân và thu hút nhiều lao động. Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói
chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ.
Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề nuôi tôm ở Việt
Nam còn nhiều vấn đề tồn đọng mà vấn đề quan trọng nhất là dịch bệnh gây chết hàng
loạt đã gây nhiều tổn thất cho người nuôi tôm nói riêng và ngành thủy sản nói chung.
Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do
phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới
đáy ao nuôi.
Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi khuẩn
Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tôm sú, trong nhóm
này có V. harveyi và V. parahaemolyticus là các lòai vi khuẩn có độc lực cao, gây bệnh
phát sáng trên ấu trùng tôm sú. Các lòai Vibrio khác như: V. vulnificus, V.
alginolyticus, V. splendidus,.. được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú
thương phẩm. Khi Vibrio xuất hiện trong nước với mật độ cao, có thể gây chết hàng
loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 % . [2, 7]
Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩm
thủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh tế.
Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây bệnh
cũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm bảo được
sự phát triển bền vững.
Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thế
kháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường
trong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng vững chắc
cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Khác với biện pháp hóa học
và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn, bền vững đối với
người nuôi và tiêu dùng.
13
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản. Nhưng Bacillus vẫn được xem là đối tượng quan trọng vì đã có
nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus giúp thủy sản sinh trưởng nhanh,
tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được báo cáo nhiều nhất là khả
năng đối kháng với Vibrio và khả năng tạo bào tử của nó.
Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số
chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật,
pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho động
vật thủy sản. [5]
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI
KHÁNG VỚI VIBRIO VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN ĐỐI VỚI ẤU TRÙNG
TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ TRÙN QUẾ”
Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế tiếp tục
được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh và đánh giá
tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thành công của
đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển thành chế phẩm vi sinh
trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm Vibrio spp. gây ra trên
động vật thủy sản.
Mục tiêu
Tái phân lập Bacillus từ trùn quế và phân trùn quế.
Thử khả năng đối kháng của Bacillus với V. harveyi, V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus.
Đồng nuôi cấy Bacillus với 3 loài vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra sự thay đổi mật
độ của vi khuẩn Vibrio theo thời gian nuôi cấy.
Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus.
14
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 1. T
ỔNG QUAN TÀI LIỆU
15
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1 SƠ LƯỢC VỀ TINH HINH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH
PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN TÔM
1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]
Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thủy sản có giá trị thương phẩm cao và
cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á như
Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Việt Nam và Ecuador. Nghề nuôi tôm không
chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn
có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho
người nuôi thủy sản. [6] Hiện nay, nghề nuôi tôm nước lợ ở nhiều nước trên thế giới đã
và đang chịu ảnh hưởng nghiêm trọng do môi trường nuôi ô nhiễm và dịch bệnh phát
sinh, đặc biệt là mô hình nuôi tôm sú thâm canh. Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm bị
thất bại liên tục đã bị bỏ hoang, gây nên những tác động nghiêm trọng về kinh tế xã
hội. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ
733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến
năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. [3]
1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5]
Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản
nói riêng của nước ta đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2008, diện tích nuôi trồng thủy sản đã được
mở rộng lên trên 1 triệu ha và sản lượng đạt gần 2,45 triệu tấn, tăng gấp 12 lần so với
năm 1980. Bên cạnh đó, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam ngày càng tăng mạnh,
năm 2008 đạt trên 4,5 tỷ USD, đứng thứ tư trong những ngành hàng có kim ngạch xuất
khẩu cao nhất của cả nước.[5]
Tuy nhiên, thực tế cho thấy giá cả hấp dẫn và ổn định của con tôm trên thị
trường thế giới cùng với giá đất tương đối thấp của vùng Duyên Hải đã đưa đến sự
bùng nổ việc phát triển nghề nuôi tôm. Điều đáng lưu ý là kỹ thuật nuôi tôm tuy không
quá phức tạp, nhưng bản thân hệ sinh thái khá biến động đối với việc nuôi thâm canh,
16
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
hệ thống sản xuất thiếu tính bền vững đã dẫn đến nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm.
Tại Việt Nam, trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan
rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng.
Theo sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bạc Liêu năm 2008 - 2009, nhiều hộ dân
tại 3 đơn vị của tỉnh đã chuyển gần 1.000 ha đất nuôi tôm công nghiệp kém hiệu quả
sang làm muối. Trước tình hình trên, nhiều chương trình nghiên cứu liên quan đến việc
xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi, cụ thể ở Đồng bằng Sông Cửu
Long cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện
của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV
(White Spot Syndrom Virus) .[3]
1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41]
Tôm Sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tiếng Anh là Giant Tiger
Shrimp.
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản,
Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi. Nhìn chung, tôm
sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nước vùng
xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippin và Việt Nam.
Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và
rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống
vùng nước sâu hơn.
1.2.1 Phân loài
Ngành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
17
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Loài: Monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
1.2.2 Các giai đoạn phát triển
Nauplli: 6 giai đoạn: 36-51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ
4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng, không cần cho ăn.
N1:dài khoảng 0,40 mm, dày 0,20 mm.
N2: dài khoảng 0,45mm, dày 0,20 mm.
N3: dài khoảng 0,49 mm, dày 0,20 mm.
N4: dài khoảng 0,55 mm, dày 0,20 mm.
N5: dài khoảng 0,61 mm, dày 0,20 mm.
Zoea: 3 giai đoạn: 105-120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần,
mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vất phiêu sinh.
Z1: dài khoảng 1 mm, dày 0,45 mm, xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt.
Z2: dài khoảng 1,9 mm, xuất hiện mặt và chủy.
Z3: dài khoảng 2,7 mm, xuất hiện gai trên bụng.
Mysis: 3 giai đoạn : 72 giờ, các Mysis bơi hướng xuống sâu, đuôi đi trước, đầu
đi sau.
M1: dài khoảng 3,4 mm, có hình dạng của tôm trưởng thành, xuất hiện các cặp
chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại.
M2: dài khoảng 4,0 mm.
M3: dài khoảng 4,4 mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng
trên chủy.
Postlarvae: giai đoạn gần trưởng thành.
Juvenile: giai đoạn trưởng thành.
18
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Trứng tôm Giai đoạn 1: Naupli Giai đoạn 2: Zoeal
Giai loạn 3: Mysis Giai đoạn 4: Postlarva
Giai đoạn 5: Juvenile
Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú
1.2.3 Tuổi thành thục
Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định
sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ.
Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, chỉ khi nào tìm thấy được tinh
trùng ở cuối ống dẫn tinh.
Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH, gonal inhibiting hormone)
được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tới
tuyến giáp sinap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục sinh dục của
tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt sẽ thúc đẩy chu kỳ lột xác,
đem lại sự thành thục mau chóng hơn.
Số lượng trứng đẻ của tôm cái: nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng buồng
trứng và trọng lượng cá thể: trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành
thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng. Nếu
cắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thì cho số lượng trứng từ 200.000 - 600.000 trứng.
19
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ) trứng sau khi đẻ
được 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-28 oC sẽ nở thành ấu trùng (Nauplii). Tôm sú đẻ quanh
năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3-4 và tháng 7-10.
Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm, con cái chừng 2 năm.
1.2.4 Tập tính ăn
Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống và di chuyển chậm hơn là xác
thối rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnh vụn
hữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng. Tôm sống ngoài tự nhiên ăn 85% là
giáp xác, cua nhỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại 15% là cá, giun nhiều tơ,
thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu cơ, cát bùn.
Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú trong
ao thì hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Tôm bắt mồi bằng càng, sau
đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày.
1.2.5 Lột xác
Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ nhất
định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm. Sự
lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác nhưng không tăng thể
trọng.
Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: Lớp biểu bì
giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo
sau là phần bụng và các phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn
cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ với tôm nhỏ, 1-2 ngày
đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môi
trường sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, có
thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời.
Hormone hạn chế sự lột xác lột xác (MIH, molt - inhibiting hormone) được tiết
ra do các tế bào trong cơ quan của cuống mắt, truyền theo sợi trục tuyến xoang, chúng
20
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
tích luỹ lại và chuyển vào trong máu, nhằm kiểm tra chặt chẽ sự lột xác. Các yếu tố bên
ngoài như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, đều có ảnh hưởng tới sự lột xác của tôm.
1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]
Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau
Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio
Vibrio có hình que, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,5×3μm, hai đầu không
đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, qua nhiều lần cấy truyền thì tính chất phẩy khuẩn
biến mất, là vi khuẩn gram âm.Vibrio không tạo bào tử, không tạo giáp mô, di động
nhờ tiêm mao ở đầu. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tăng trưởng nhanh trong
môi trường có tính kiềm (8,5 - 9), ưa môi trường có muối với nồng độ khác nhau tùy
theo loài. Sống được ở nhiệt độ 16-42 oC. Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị diệt
bởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khô, chỉ tồn tại 10 phút ở 55oC. [4]
Vibrio là một trong những tác nhân gây ra dịch bệnh lớn ở động vật giáp xác và
cá. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng
thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100%.
Bệnh do Vibrio là một trong những nguyên nhân chính gây chết cho tôm nuôi
trên toàn thế giới. Loài vi khuẩn Vibrio phân bố rộng rãi , thường gây nhiễm trùng
trong các trại trại sản xuất giống cũng như trong ao nuôi tôm gây thiệt hại nghiêm
trọng. Bệnh do Vibrio gây ra chủ yếu là do một số loài như: V. harveyi, V. vulnificus,
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. penaeicida …
21
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sự bùng nổ dịch bệnh có thể xảy ra khi nhân tố môi trường làm tăng nhanh số
lượng vi khuẩn tồn tại sẵn trong máu tôm ở mức thấp, hoặc bằng cách xâm nhập qua
rào cản vật chủ.
Vibrio xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua nhiều con đường như sau:
Lớp vỏ ngoài của động vật thủy sản là hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại mầm
bệnh. Tuy nhiên, Vibrio có thể gây bệnh trên vỏ và có thể xâm nhập qua vết thương ở
lớp vỏ ngoài hay lỗ chân lông.
Mang dễ bị tổn thương dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn bởi vì mang chỉ được
bao bọc bởi lớp vỏ mỏng.
Tuyến tiêu hóa và ruột giữa không được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài nên mầm
bệnh từ nước, thức ăn, chất thải có thể xâm nhập vào trong cơ thể. [23]
Bệnh do Vibrio gây ra có thể là kết quả của môi trường nuôi xấu, do tôm đã yếu
vì mắc bệnh khác và trong một số trường hợp do độc lực mạnh của một số loài Vibrio.
Nếu tôm bị nhiễm cục bộ ở một số nơi trên bề mặt cơ thể do bị trầy xướt hay ở
đường ruột thì có thể thấy các triệu chứng như: tạo thành chổ viêm có bao và có thể có
màu đen trên thân, viêm ruột hay hoại tử đốm ở gan. Nếu tôm bị nhiễm toàn diện thì có
thể thấy các đốm đen ở cơ quan lympho, tim, mang,... [31]
Một số bệnh do Vibrio gây ra
V. salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh.
V. parahaemolyticus, V. harveyi gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú.
V. alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú.
V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. anguillarum... gây bệnh đỏ
thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây bệnh máu vón cục ở cua, gây bệnh ấu trùng
nhuyễn thể. [5]
22
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm
1.4 TINH HINH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ
BỆNH CHO TÔM [34, 36]
Nuôi trồng thủy sản với quy mô công nghiệp không thể tránh khỏi dịch bệnh
làm tôm chết, gây tổn thất cho người nuôi. Để đối phó với tình trạng dịch bệnh người ta
thường sử dụng kháng sinh (Tetracycline, Streptomycin....). Tuy nhiên khi sử dụng một
loại thuốc quá lâu, sử dụng không đúng liều lượng, thời điểm sẽ gây ra hiện tượng
kháng thuốc. Đáng lo ngại hơn là gen kháng có thể truyền cho thế hệ sau hoặc truyền
ngang giữa các tế bào vi khuẩn thông qua tiếp hợp, tải nạp, tạo những chủng vi khuẩn
mang gen kháng kháng sinh và có thể gây bệnh cho người. Khi đã xảy ra hiện tượng
kháng thuốc thì sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc phòng và điều tri bệnh cho vật nuôi,
dễ bùng phát các trận dịch khó kiểm soát, gây thiệt hại kinh tế.
Bên cạnh đó dư lượng thuốc kháng sinh ảnh hưởng đến giá trị xuất khẩu tôm.
Tôm xuất khẩu thường bị trả về do dư lượng kháng sinh còn quá nhiều. Dư lượng
thuốc còn lại trong thịt, nội tạng của vật nuôi, khi sử dụng vật nuôi làm thực phẩm
chúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Ngoài kháng sinh người nuôi còn dùng nhiều hóa chất độc hại khác để tiêu diệt
các loài không mong muốn như dùng Sulfat đồng để diệt tảo, các chất diệt cá tạp như
Nicotin, các loại thuốc trừ sâu..... Các hóa chất này có thể tiêu diệt các loài không
mong muốn nhưng đồng thời cũng tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật có lợi cho ao nuôi.
[36]
Bên cạnh đó, mô hình nuôi tôm hiện nay đa phần không có hệ thống xử lý nước
thải. Do vậy lượng hóa chất cùng với nước thải của hệ nuôi đưa trực tiếp ra môi trường
ngoài gây ô nhiễm nguồn nước. Tiến sĩ khoa học Nguyễn Văn Trương - Viện Tài
Nguyên Sinh Thái cho rằng nếu chỉ có một vài hộ nuôi xả bỏ chất thải ra biển thì
không sao, nhưng vài chục ngàn hộ dân cùng thải nước như vậy ắt hẳn cả vùng biển bị
23
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ô nhiễm, biển lại thông với sông nên ảnh hưởng càng thêm nghiêm trọng hơn. [34] Đặc
biệt, cần thận trọng khi sử dụng thuốc trừ sâu hữu cơ vì chúng có độc tính, gây ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người do cơ chế tích lũy sinh học.
Tóm lại, vấn đề sử dụng hóa chất cũng như kháng sinh chỉ giải quyết tình trạng
bệnh trong nhất thời nhưng nó lại mang đến không ít tác hại trong đời sống và kinh tế.
Hóa chất và kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi sinh vật có hại mà còn diệt luôn vi
sinh vật có lợi.
Hóa chất, kháng sinh có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm.
Nguy cơ tạo ra vi sinh vật kháng thuốc, có thể truyền tính kháng thuốc cho tác
nhân gây bệnh cho người.
Ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái, đến quần thể sinh vật trong hệ sinh thái…
1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG
THỦY SẢN
1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]
Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ "pro" có nghĩa là dành
cho và "biosis" có nghĩa là sự sống.[25] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa
khác nhau, nó được sử dụng lần đầu tiên năm 1965 để mô tả một chất được tạo ra bởi
một protozoon để kích thích sự tăng trưởng của một con khác.
Đến những năm 1970 nó được mô tả chất chiết từ mô có tác dụng tăng sinh mô.
Năm 1974, Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các vi
sinh vật và chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng hệ vi sinh vật
ruột.
Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “một vi sinh vật sống
bổ sung qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện vi sinh vật
đường ruột”. [8]
Năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld đưa ra định nghĩa về probiotic như sau:
“Probiotic là chế phẩm hay sản phẩm chứa vi sinh vật sống xác định với số lượng đủ có
24
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
thể làm thay đổi hệ vi sinh vật tại một phần của cơ thể ký chủ và nhờ đó tạo ra các hệ
quả có lợi cho sức khỏe ký chủ”.
Trải qua lịch sử, probiotic được định nghĩa ngày càng cụ thể hơn. Theo định
nghĩa hiện được thông qua bởi FAO/WHO năm 2001: “probiotic là những vi sinh vật
sống mà khi dùng với lượng thích hợp, kiểm soát chặt chẽ sẽ đem lại lợi ích sức khỏe
cho vật chủ”. [13, 5]
1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]
1.5.2.1 Tiết ra các hợp chất ức chế [40]
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in-vitro kìm
hãm được các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu này cũng chứng
minh khả năng kìm hãm vi khuẩn khác của những dòng vi khuẩn thông thường dễ tìm
thấy trong môi trường.
Theo Sugita và cs (1997) những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trường
những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm vi khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi
sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi
trường. Sự hiện diện những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột,
trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vi
khuẩn cơ hội, gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Sản phẩm có thể là chất kháng sinh,
siderophore, men phân hủy, H2O2, acid hữu cơ…
Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định được nên được gọi chung là chất ức
chế. Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là loại tiết ra chất kháng vi khuẩn (bacteriocin)
chống lại các vi khuẩn Gram (+). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là
nhóm Gram (-). Vì vậy, tác động ức chế của vi khuẩn lactic trong nuôi trồng thủy sản
bị hạn chế nhưng nó là vi khuẩn không có hại và là đối tượng cạnh tranh chỗ cư trú.
Nhiều vi khuẩn khác cũng tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh
như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Cơ chế tiết ra chất chống lại
vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong môi
trường nước.
25
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.5.2.2 Cạnh tranh nơi cư trú [40]
Olsson và cs (1992) khẳng định cạnh tranh chỗ bám trong ruột của vật chủ có
ảnh hưởng rất quan trọng đến sức khoẻ của vật chủ. Việc bám dính được vào lớp màng
nhầy của ruột là rất cần thiết để vi khuẩn thiết lập quần thể trong hệ ruột của cá. Khả
năng bám dính lên thành ruột là tiêu chuẩn lựa chọn đầu tiên của vi khuẩn hữu ích. Sự
bám dính trên màng ruột có thể là chuyên biệt, không chuyên biệt.
Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng
cách tranh giành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác. Người ta đã
chứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột, hay
niêm mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này cạnh tranh vượt trội
và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V. anguillarum và A.
hydrophila.
1.5.2.3 Cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng [40]
Nhiều quần thể vi sinh vật cùng tồn tại trong cùng một hệ sinh thái thì sẽ có sự
cạnh tranh về dinh dưỡng và năng lượng. Cạnh tranh trong giới vi sinh vật chủ yếu là
xảy ra ở nhóm dị dưỡng như cạnh tranh các chất hữu cơ mà chủ yếu là nguồn carbon
và năng lượng. Rico-Mora (1998) đã cho một dòng vi khuẩn được chọn lọc có khả
năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Tác giả cấy vi khuẩn này vào bể nuôi
tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus thì vi khuẩn Vibrio này không phát triển và thử
nghiệm in-vitro không thấy có sự ức chế. Do đó chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh
tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ. Do vậy những dòng vi khuẩn chọn
lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và dinh dưỡng.
1.5.2.4 Tương tác với thưc vật thủy sinh [40]
Nhiều dòng vi khuẩn khác có khả năng kích thích sự phát triển của tảo.Tuy
nhiên theo các nghiên cứu gần đây một số dòng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt một số
loài tảo, đặc biệt là tảo gây ra hồng triều. Những chủng vi khuẩn này có thể không tốt
đối với một số loài tảo có lợi trong nuôi trồng thủy sản.
26
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.5.2.5 Cải thiện chất lượng nước
Verschuere và cs (2000) cho rằng cải thiện chất lượng nước là một cơ chế tác
động của “vi sinh vật hữu ích” trong thủy sản khi đưa vi sinh vật hữu ích vào nước
giúp cải thiện chất lượng nước mà không có tác động trực tiếp lên cơ thể vật nuôi,
thường liên quan đến các nhóm Bacillus. [28]
Stanier và cs (1963) đã nghiên cứu được là nhóm vi khuẩn Gram (+) thường
phân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm Gram (-). Duy trì những mật độ
Gram (+) trong ao nuôi sẽ hạn chế được sự tích lũy vật chất hữu cơ trong ao trong suốt
quá trình nuôi, ổn định quần thể tảo nhờ sự sản sinh CO2 từ quá trình phân hủy các vật
chất hữu cơ.
Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi khuẩn
hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Chất lượng nước có liên quan mật thiết đến tính chất
nền đáy của thủy vực, quá trình hấp thụ và giải phóng các chất làm biến đổi chất lượng
nước, đặc biệt là sự hấp thụ và giải phóng dinh dưỡng của nền đáy.
Vũ Ngọc Út (1999) cho rằng các vi khuẩn có lợi phân huỷ các chất hữu cơ có từ
thức ăn dư thừa, các chất bài tiết của tôm cá và có thể ngăn ngừa sự phát triển của vi
khuẩn gây bệnh trong ao nuôi, giúp giảm ô nhiễm đáy ao.
Theo Nguyễn Đình Trung (2004), một trong những cơ chế hoạt động của men vi
sinh là các men có tác dụng phân huỷ các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất
hữu cơ đơn giản. Sau đó các chủng loại vi sinh vật phát huy tác dụng
Giảm ammonia: vi sinh vật dị dưỡng chuyển hoá các hợp chất hữu cơ đơn giản
thành các chất vô cơ (CO2, NH3). Xu thế tăng cao của NH3 được làm giảm do hai loài
vi sinh vật tự dưỡng theo chu trình sau
Nitrosomonas
NH4+ + 1,5 O2 —› NO2
- + 2H+ + H2O
Nitrobacter
NO2- + 0,5O2 —› NO3
-
27
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Giảm tảo: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ
trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối
dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong trong ao nuôi tôm các
tháng cuối không nhỏ hơn 30 cm.
Giảm bệnh: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trường thích hợp sẽ phát
triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của nguyên sinh động vật, các vi
sinh vật và Vibrio có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng. Giảm các tác nhân gây
bệnh cho tôm nuôi.
Nhờ đó mà hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh, giảm thay nước
trong quá trình nuôi, góp phần cải thiện chất lượng nước trong hệ thống nuôi trồng
thủy sản.[40]
1.5.2.6 Nguồn dinh dưỡng và tăng cường khả năng tiêu hóa
Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn probiotic có nhiều lợi ích cho quá trình
tiêu hóa của động vật thuỷ sản. Ở cá, Bacteroide và Clostridium spp. cung cấp cho vật
chủ các acid béo và vitamin. Ngoài ra, một số vi khuẩn có thể tham gia vào quá trình
tiêu hóa bằng cách sản xuất enzym ngoại bào như protease, lipase, cũng như cung cấp
yếu tố tăng trưởng cần thiết. Vi sinh vật có thể cung cấp như một nguồn thực phẩm bổ
sung và hoạt động của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa có thể là nguồn cung cấp vitamin
hay acid amin thiết yếu. [13]
1.5.2.7 Tăng cường đáp ứng miễn dịch [13]
Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi vi khuẩn
probiotic. Đã có chứng minh cá hồi cầu vồng sử dụng vi khuẩn Clostridium butyricum
thì sức đề kháng của cá được tăng cường chống lại Vibrio bằng cách tăng cường hoạt
động thực bào của bạch cầu.
Rengpipat và các cộng sự báo cáo rằng việc sử dụng Bacillus sp. (dòng S11) đã
kích hoạt cả hai hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào ở tốm sú (Penaeus
monodon). [24]
28
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Balcazar đã chứng minh rằng một loài Bacillus ảnh hưởng tích cực lên sự tăng
trưởng và tỷ lệ sống của cá con tôm trắng trong hỗn hợp các chủng vi khuẩn (Bacillus
và Vibrio sp) và nêu ra một bảo vệ hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh là vi khuẩn
Vibrio harveyi và hội chứng virus đốm trắng. Bảo vệ này là do sự kích thích hệ miễn
dịch, bởi tăng cường hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn. [14]
1.5.2.8 Hoạt động kháng virus
Một vài vi khuẩn probiotic có tác động kháng virus, mặc dù cơ chế này vẫn
chưa được biết, trong phòng thí nghiệm có thể chỉ ra, bất hoạt virus có thể được thực
hiện bởi hóa chất và những chất sinh học như: dịch chiết của tảo, sản phẩm ngoại bào
của vi khuẩn.
Kamei và cs (1988) đã báo cáo rằng chủng Pseudomonas spp., Vibrios spp.,
phân lập từ nơi ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHNV (infectious
hematopoietic necrosis virus) với tỉ lệ giảm > 50%.[25]
Direkbusarakom và cs (1998) đã phân lập được 2 chủng Vibrio.sp. NICA 1030
và NICA 1031 từ nơi ấp trứng tôm sú, 2 chủng này có hoạt tính kháng virus IHNV và
OMV (Oncorhynchus masou virus) với tỉ lệ giảm từ 62 và 99% tương ứng.[29]
1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm
Probiotic giải pháp điều trị bệnh cho thủy sản an toàn, thuận lợi vì:
Hạn chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn có hại.
Phân giải chất hữu cơ tích tụ nền đáy.
Phân giải khí độc được tạo thành từ nền đáy trong quá trình nuôi.
Cải thiện tiêu hóa trong đường ruột tôm, cá.
Hiệu quả tốt, chi phí cải tạo ao vụ sau thấp.
Nâng cao năng suất thu hoạch.
Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn.
Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi.
Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt.
29
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Giảm chi phí thay nước.
Giảm chi phí sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong việc điều trị bệnh.
Do đó, sử dụng probiotic có tác dụng phòng bệnh, tăng tỷ lệ sống, nâng cao
nâng suất ao nuôi. Hơn nữa, sử dụng probiotic để quản lý ao nuôi còn có tác dụng hạn
chế sử dụng hóa chất bừa bãi, gây tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái và ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm.
1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng
thủy sản [35, 39, 22, 9, 30]
1.5.4.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới [40]
Theo Balcázar và cs (2006), probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi
thủy sản. Nhưng việc sử dụng probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản
chất của các vi sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi.[13]
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất
kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây
bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu
quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn.
Theo Vijayabaskar và cs (2008), ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ
thể là nhóm vi khuẩn Bacillus spp. trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do
vi khuẩn A. hydrophila gây ra.
Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippin, khi việc sử
dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn
kháng thuốc, xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người nếu sử
dụng quá liều lượng. Do đó, probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ở
Philippin, nghiên cứu của Moriarty (1999) cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm
bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học.
Garriques và Arevalo, (1995) đưa dòng Vibrio alginolyticus vào bể ương ấu
trùng tôm (Litopenaeus vannamei) mỗi ngày. Tỷ lệ sống trung bình và trọng lượng tôm
30
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
cao nhất trong bể có thêm vi khuẩn hữu ích so với bể xử lý bằng kháng sinh
oxytetracyline và đối chứng. Số bể có bổ sung vi khuẩn Vibrio alginolyticus, không
thấy xuất hiện vi khuẩn gây bệnh V. parahaemolyticus, trong khi các nghiệm thức còn
lại có khoảng 10% mẫu có mặt vi khuẩn này.
Sugama và Tsumura (1998) đã cấy dòng BY-9 với mật độ 106 CFU/mL vào bể
ương ấu trùng tôm sú làm giảm mật độ Vibrio và cho tỷ lệ sống cao hơn đối chứng.
Griffith (1995) cho rằng nhờ đưa men vi sinh vào trong bể ương tôm giống ở
Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ
sinh các bể nuôi, sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn
đến 94%.
Theo Maeda và Liao (1994) dòng PM-4 được cấy hàng ngày trong 7 ngày liền
vào vào bể ương ghẹ 200 m3 (Portunus trituberculatus), kết quả mật độ Vibrio tỷ lệ
nghịch với mật độ PM-4. Tỷ lệ sống trung bình của 7 lần thử nghiệm với PM-4 là
27,2%, tỷ lệ sống của 6 trên 9 lần thử nghiệm không có PM-4 là 6,8%.
Bên cạnh đó mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chất
hữu cơ ở đáy ao do thức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làm
môi trường sống của vật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gây
thiệt hại lớn trong nuôi thuỷ sản. Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rất
quan trọng trong các ao nuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt
động của vi sinh vật. Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vai
trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷ
sản thâm canh. Moriarty (1996) đã kết luận hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến
chất lượng nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ
các sản phẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2-, H2S.
Qiao Zhenguo và cs (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng
cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) dùng cải thiện chất lượng môi
trường nước. [30]
31
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu của Graslund và cs (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan
sử dụng men vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn
đáy ao nuôi.
1.5.4.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic ở Việt Nam [40]
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các men vi sinh để cải thiện
môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít. Trong
những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh
và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá
tốt.
Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và cs (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng
chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm
tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn
tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng.
Theo Võ Thị Thứ và cs., (2006) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước
nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt
thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống
như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi. Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng
trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng nhanh.
[9]
Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 của Trung tâm
nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng góp phần đưa
năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý
chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc
phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng
suất. [39]
Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu
mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà
32
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình
nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh. [35]
Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2000) tìm hiểu tác dụng của men
vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm
càng xanh với liều lượng 1g/m3 và nhịp sử dụng khác nhau. Tác giả cho biết với
nghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì nghiệm
thức sử dụng hàng ngày là tốt nhất. Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột
ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng
luôn giữ được ổn định. Điều này cho thấy hiệu quả tích cực của men vi sinh trong sản
xuất giống tôm càng xanh. [22]
Nghiên cứu Nguyễn Thanh Phương (2007) sử dụng 3 loại men vi sinh
Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình
nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu
trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio sp trong môi trường bể
ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1 -
76,6%. Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu về hiệu quả và phương thức sử
dụng men vi sinh trong môi trường ương nuôi tôm càng xanh nhằm cải thiện môi
trường và nâng cao năng suất ương ấu trùng.
Một số chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có mặt ở Việt Nam
Chế phẩm của viện sinh học Nhiệt Đới TPHCM [35]
Chế phẩm Bio II gồm có: vi khuẩn Bacillus spp. ( 1011 CFU/g),
Lactobacillus spp (109 CFU/g), nhóm nấm men Saccharomyces spp. (108 CFU/g). Chế
phẩm này có tác dụng kích thích tiêu hóa của tôm.
Chế phẩm VEM thành phần gồm có: chế phẩm EM có thêm 2 chủng vi
khuẩn lactic (109 CFU/mL), nhóm Bacillus (109 CFU/mL), nhóm nấm men (107
CFU/mL) và nhóm vi khuẩn quang dưỡng (107 CFU/mL). Chế phẩm này làm tăng hiệu
quả đề kháng với vi sinh vật gây bệnh cho tôm và khả năng làm sạch môi trường ao
như: H2S, NH3, NO3.
33
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chế phẩm của Viện Công nghệ sinh học (trung tâm khoa học công
nghệ quốc gia) [9]
Chế phẩm sinh học BioF có chứa tế bào sống chủng vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus được sử dụng trong ao nuôi trồng thủy sản. Chế phẩm này có
tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas và Vibrio gây
ra. Chế phẩm BioF có 9,2 x 108 - 8,9 x 109 CFU/g.
Chế phẩm sinh học BIOCHIE bào gồm một số chủng thuộc chi Bacillus
(Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và chi Lactobacillus
dùng để xử lý nước trong ao nuôi thủy sản. Các chủng trên có khả năng phân hủy các
hợp chất hữu cơ từ thức ăn và chất thải của tôm, làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu
trình thay nước, tăng độ oxy hòa tan. Chóng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn
làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh.
BIOCHIE được dùng cùng với chế phẩm BioF ứng dụng cho nuôi tôm
thịt đã mang lại kết quả tốt. Liều lượng sử dụng là 1011 CFU/1000 m3 nước phun 15
ngày/lần. Chế phẩm BioF được trộn vào thức ăn với liều lượng 109 CFU /1kg thức ăn
(hay là 3g/1kg thức ăn) trong suốt quá trình nuôi.
Chế phẩm sinh học Bio.DW [35]
Là tập hợp các vi sinh được phân lập tuyển chọn nhằm làm sạch nền đáy và
phòng bệnh cho tôm nuôi công nghiệp. Chế phẩm ở dạng bột đóng gói do Viện Công
nghệ Sinh học thuộc Trung tâm khoa học công nghệ quốc gia nghiên cứu và ứng dụng.
Thành phần gồm 2 chủng nấm sợi Aspergillus oryzae và Aspergillus phoenecis NT1
và 2 chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis.
Cách dùng: 2 tuần/1 lần với liều lượng dùng 2,5 - 5 kg/ha.
Chế phẩm sinh học Men Bac [35]
Là sản phẩm của công ty TNHH Toba, Việt nam nhằm mục đích xử lý nước ao
nuôi tôm.
34
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thành Phần: Bacillus mensentericus, Lactobacillus acidophillus, Bacillus
subtillis, Streptococcus facium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Bacillus licheniformis,
Aspergilus oryzace, Saccharomyces cerevisiae, enzyme và các chất dinh dưỡng.
Công dụng: Phân hủy nhanh chóng thức ăn thừa, phân tôm, vỏ tôm ở đáy ao,
hấp thụ khí độc NH3, H2S, NO2, chống ô nhiễm đáy ao, tạo chất lượng nước tốt. Phòng
chống bệnh đen mang, phồng mang, đóng rong, mòn đuôi, phát sáng. Tạo nguồn vi
khuẩn tự nhiên có lợi cho ao nuôi, ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn có hại cho
tôm. Gia tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước, ổn định độ pH, màu nước. Giảm độ
đục của nước, tạo ra các chất dinh dưỡng vô cơ giúp tảo và các vi sinh vật có lợi phát
triển ổn định. Giúp tôm khỏe mạnh, mau lột xác, tăng trọng nhanh, đạt năng suất cao.
Cách dùng: rải trực tiếp xuống ao nuôi mà không cần phải hòa vào nước hoặc sục khí:
1kg/1000 m3, 10 - 15 ngày rải 1 lần.
Men vi sinh Bio - Probiotic tôm, cá [35]
Các vi sinh vật có lợi cho đường ruột: Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophillus, Saccharomyces cerevisae > 3.108 CFU/g. Các enzyme tiêu hoá: Amylase,
Cellulase, Protease.
Công dụng: tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thụ chất dinh dưỡng, hạn chế
được các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hoá và bệnh do vi khuẩn, tăng sức đề kháng của
tôm, tăng tốc độ sinh trưởng, tăng tỷ lệ sống, tăng năng suất và chất lượng cá, tôm nuôi
và giảm hệ số thức ăn.
Cách sử dụng: dùng cho mọi lứa tuổi của tôm; Dùng trong suốt quá trình nuôi
sẽ ngăn được bệnh phân trắng. Trộn đều 500g Bio-Probiotic cho 100kg thức ăn;
Trường hợp tôm, cá biếng ăn dùng liều gấp đôi.
Chế phẩm làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá Bio – DW [35]
Thành phần: các vi sinh vật hữu hiệu: Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophillus, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisae. Các enzyme: Amylase,
Cellulase, Protease.
35
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tác dụng: phân huỷ nhanh thức ăn thừa, giảm lượng khí độc như H2S, NO3,
NH3, làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp đã bị ô nhiễm. Tăng
cường sự phân huỷ và chuyển hoá các chất thải hữu cơ, làm sạch và ổn định môi
trường và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp. Tăng tỉ lệ sống và năng suất.
Cách sử dụng: hoà tan Bio-DW vào nước với tỉ lệ 1/50 rồi tạt đều khắp mặt
nước ao, đồng thời chạy hệ thống quạt nước hoặc hệ thống sục khí đáy. Không sử dụng
thuốc kháng sinh hoặc thuốc sát trùng trong vòng 2 ngày trước và sau khi dùng Bio-
DW. Cải tạo ao trước khi thả giống, dùng với lượng 200g/1000 m3.
+ Hai tháng đầu: 250g/1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần.
+ Hai tháng sau: 500g/ 1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần.
Trường hợp ao bị ô nhiễm quá nặng thì sử dụng 1000g/1000 m3 nước, sục khí hay
quạt nước suốt ngày đêm, mỗi tuần xử lý 1 lần cho đến khi nước hết ô nhiễm.
1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]
Trùn đất có mặt ở khắp mọi nơi trên thế giới, với khoảng 4.500 loài, trong đó ở
Việt Nam có trên 110 loài, nhưng chỉ có sáu tới tám loài được nuôi để sử dụng và sản
xuất phân bón. Trong số đó có loài Eisenia fetida (trùn Quắn) và đặc biệt là loài
Perionyx excavatus (thường gọi là trùn đỏ hay trùn Quế) là được nuôi phổ biến nhất.
36
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ
Megascocidae (họ cự dẫn), ngành ruột khoan. Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường
sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với
phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa
phương sống trong đất.
Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần, nhập nội và đưa vào
nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác
ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch. Kích thước trùn quế trưởng
thành từ 10 - 15 cm, nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô khoảng 15 - 20%. Hàm
lượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 - 70%, lipid: 7 -
8%, chất đường: 12 - 14%, tro 11 - 12%.
Do có hàm lượng protein cao nên trùn quế được xem là nguồn dinh dưỡng bổ
sung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, trùn quế còn được
trong y học, công nghệ chế biến thức ăn gia súc…
Phân trùn (vermicompost) là phân hữu cơ 100%, được tạo thành từ phân trùn
nguyên chất và một phần được phân hủy từ chất hữu cơ. Phân trùn chứa đựng hỗn hợp
vi sinh hoạt tính cao, chất xúc tác sinh học, phần cặn bã của cây trồng và động vật cũng
như kén trùn. Phân trùn gần như không mùi, nếu có cũng ít hoặc không gây ra sự khó
chịu cho người. Độ pH của phân trùn ~7.
Hình 1.4 Trùn quế
37
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Những lợi ích mà phân trùn trong nông nghiệp.
Phân trùn có thể được bón, hấp thu một cách dễ dàng và hiệu quả ngay lập tức
mà không gây hiện tượng cháy cây.
Phân trùn giàu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước, có nhiều hơn 50% chất mùn,
ngoài ra còn có các khoáng chất cần thiết cho cây như N, P, K, Ca…
Phân trùn làm giảm tỷ lệ C/N của đất giúp cây trồng dễ hấp thụ hơn.
Phân trùn không những làm tăng tỷ lệ nảy mầm, kích thích tăng trưởng, cải tạo
đất, duy trì khả năng giữ nước mà còn có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ. Chất mùn
trong phân loại trừ những độc tố và nấm, vi khuẩn hại trong đất giúp đẩy lùi những
bệnh của cây trồng.
Phân trùn có khả năng cố định kim loại nặng trong chất thải hữu cơ. Điều này
ngăn không cho cây trồng hấp thụ nhiều phức hợp khoáng hơn nhu cầu. Những phức
hợp khoáng này sau đó sẽ được phóng thích từ từ khi cây cần đến.
Phân trùn hoạt động như một rào cản ngăn ngừa mức độ pH quá cao vốn khiến
cây trồng không thể hấp thu dinh dưỡng từ đất.
Humic Acid trong phân trùn kích thích sự phát triển của cây trồng ngay cả ở
nồng độ thấp đồng thời kích thích sự phát triển về mật độ vi khuẩn trong đất.
IAA (Indol Acetic Acid) trong phân trùn là một trong những chất kích thích tăng
trưởng hữu hiệu cho cây trồng.
Phân trùn chịu được sự xói mòn và cũng gia tăng khả năng giữ nước của đất cho
cây.
Tại Philippin, trùn quế được liệt kê vào danh mục thức ăn có giá trị dinh dưỡng
cao cho nuôi trồng thuỷ sản.
Tại Việt Nam, từ năm 2000 đã có nhiểu nghiên cứu sử dụng trùn quế trong chăn
nuôi gà và heo, trên từ cở sở đó cũng bắt đầu có những nghiên cứu và ứng dụng trùn
quế trong nuôi trồng thủy sản. Như nghiên cứu quá trình tự phân của trùn quế nhằm tạo
ra sản phẩm giàu đạm làm thức ăn cho tôm và cá con, nghiên cứu sử dụng trùn quế như
là nguổn protein làm thức ăn cho cá trê lai.
38
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Những ứng dụng từ trùn quế trong việc nuôi trồng thủy sản mang lại hiệu quả
kinh tế đáng kể, trùn quế được một số trung tâm khuyến ngư khuyên dùng làm thức ăn
cho tôm cá, giúp tăng sức đề kháng, giảm được nhiều bệnh do vi sinh vật. Đồng thời
phân trùn cũng được các trung tâm khuyến ngư khuyên dùng để xử lý ao tôm, gây màu
nước.
1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản
Trong nông nghiệp, trùn quế được coi là loại thức ăn đạm cao cấp cho vật nuôi.
Các loài cá, baba, tôm, ếch, lươn, cua biển... đều rất thích ăn trùn. Đối với gia súc, gia
cầm, trùn là loại thức ăn bổ dưỡng. Tuy nhiên, trùn quế tươi chỉ có thể để không quá
một ngày ở nhiệt độ thường nên rất khó lưu trữ.
Từ thực tế đó, tiến sĩ Võ Thị Hạnh cùng các cs thuộc Phòng Vi sinh Viện Sinh
học nhiệt đới đã tạo ra 3 chế phẩm sinh học từ trùn quế trong đó chế phẩm BIO-T và
BIO-PT được dùng trong thủy sản.[32] Các chế phẩm này có thể được bảo quản, lưu
trữ trong thời gian dài, từ 6 - 10 tháng. Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là
vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo
thời gian.
Chế phẩm đầu tiên là BIO-T, dùng làm thức ăn cho tôm sú, cá tra, gà lương
phượng và vịt xiêm. Điều đáng nói là nếu sử dụng trùn quế tươi phải cần một lượng
nhiều gấp 10 lần so với BIO-T mới có hiệu quả tương tự. BIO-T được sản xuất bằng
cách sử dụng trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi khuẩn hữu ích và enzyme tiêu hóa
dùng trong chăn nuôi, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu dinh dưỡng (đạm protein
và amin cao), enzyme tiêu hóa, vi khuẩn hữu ích và các chất kháng sinh...
Chế phẩm BIO-PT được tạo ra bằng cách dùng phân trùn ủ lên men, sản phẩm
làm ra có mùi thơm, độ ẩm 40%, đạm tổng 2%, chất hữu cơ, kháng sinh và hỗn hợp vi
khuẩn hữu ích. BIO-PT dùng để gây màu và xử lý nước ao nuôi tôm dùng trong nuôi
trồng thủy sản.
Ngoài ra, công ty TNHH Trùn quế An phú cũng đã và đang cho ra thị trường
nhiều sản phẩm từ trùn và phân trùn quế phục vụ cho nuôi trồng thủy sản. [37]
39
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dịch trùn quế PROMIN: Không chỉ đơn thuần là chất dẫn dụ hấp dẫntôm, cá mà
dịch trùn quế Promin còn được xem như là một thức ăn bổ sung dạng nước với kháng
thể thiết yếu nhất có thể thay thế tất cả các loại như dầu mực, thức ăn bổ sung, vitamin
C, men vi sinh......và ngay cả kháng sinh khi cần thiết, loại bỏ hoàn toàn bệnh phân
trắng và đốm trắng trên tôm.
Phân trùn xử lý ao tôm: Qua tiến hành thử nghiệm trên thực tế đã cho thấy phân
trùn đem lại kết quả khả quan khi sử dụng phân trùn cho ao nuôi tôm, đặc biệt đối với
những ao hồ đã trải qua nhiều vụ nuôi. Sử dụng phân trùn từ 15-20 kg/1000 m2 cho ao
cần cải tạo và lượng tương ứng khi gây màu cho thấy quá trình gây màu nhanh hơn,
màu nước bền hơn so với các ao đối chứng. Đặc biệt áp dụng tốt cho các ao nuôi quảng
canh cũng như ao nuôi công nghiệp khi gây màu và với giá thành không phải là cao
(giá thị trường vào khoảng 3.500đ/kg).
Bột trùn Powder worm meal: giúp làm tăng khả năng tăng trưởng, phát triển cơ,
tăng trọng, bồi đắp lượng Protein và Acid amin thiếu hụt, tăng cường khả năng tình
dục, ngon miệng và làm cho thức ăn có vẽ hấp dẫn và lôi cuốn hơn đối với vật nuôi. Vì
thế sẽ tránh được trường hợp thừa thải thức ăn. Bột trùn được sử dụng như là một loại
thức ăn bổ sung, khi sử dụng kết hợp với tảo và Artemia, làm tăng khả năng bắt mồi.
Sử dụng bột trùn có thể tạo ra tôm chất lượng hơn so với các loại thức ăn thông
thường. Những nghiên cứu về kết quả sử dụng bột trùn cho thấy tôm khi sử dụng bột
trùn sẽ lớn hơn từ 50-100% và tôm hậu ấu trùng có khả năng chịu đựng stress, lên màu
tốt và đồng cỡ hơn so với các mô hình nuôi sử dụng thức ăn thông thường.
40
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.7 VI KHUẨN BACILLUS
1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus
Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau
Hình 1.4 Vi khuẩn Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn và đa dạng của vi khuẩn thuộc họ Bacilliaceae. Đặc
điểm chung của chi này là những vi khuẩn hình que, gram dương, tạo hoặc không tạo
giáp mô. Bacillus là vi khuẩn dễ mọc, phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông
thường. Vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp từ 5 - 50oC, tối ưu là
35 - 40oC. pH thích hợp là 7 - 7,2. [4]
Khi gặp điều kiện môi trường không thuận lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng,
vi khuẩn sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ dạng hình cầu hay hình bầu dục được
gọi là bào tử. Mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử. Bào tử có khả năng kháng nhiệt, kháng
với các tác nhân có hại như sự khô hạn, tia bức xạ, acid mạnh.... Trong thời kỳ nghỉ
không thấy bào tử thể hiện bất kỳ hoạt lực trao đổi chất nào, người ta gọi đó là trạng
thái sống ẩn. Bào tử có thể sống từ vài năm , vài chục năm.
1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12]
Cấu trúc của bào tử khi được quan sát dưới kính hiển vi điện tử rất khác với tế
bào sinh dưỡng, nó phức tạp hơn tế bào sinh dưởng bởi có nhiều lớp:
41
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 1.5 Cấu trúc của bào tử
Lớp ngoài cùng: là nang bào hay là màng ngoài chiếm 2-3% khối lượng khô của
bào tử. Màng ngoài gồm 2 lớp: lớp ngoài cùng dày 6 nm, lớp trong dày 19 nm, thành
phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có chứa một lượng nhỏ acid amin có tính thẩm thấu
kém.
Lớp áo bào tử: dày 3 nm, gồm khoảng 3- 15 lớp chủ yếu là protein sừng (chiếm
khoảng 50-80% protein tổng số của bào tử) và một số ít phospholipoprotein. Áo bào tử
có sức đề kháng cao với lisozyme, protease, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm
thấu kém với các cation.
Vỏ bào tử: chiếm thể tích 36-60% bào tử, chứa một lượng lớn peptidoglucan,
không chứa acid teichoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ có thể tới 20 atm, lượng chứa
nước là 70% (tế bào sinh dưỡng là 80%) cao hơn nhiều so với lượng chứa nước bình
quân trong bào tử (khoảng 40%).
Lớp lõi bào tử: là thể chất nguyên sinh của bào tử. Lõi bào tử cấu tạo bởi 4
thành phần: thành tế bào, màng bào tử, bào tử chất và nhân.
1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17]
Quá trình hình thành bào tử trải qua một chuỗi các giai đoạn nối tiếp nhau. Kể
từ khi bắt đầu, quá trình hình thành bào tử cần 8 giờ. Để bắt đầu quá trình này, tế bào
42
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
phải đạt đến một giai đoạn nhất định trong vòng đời, có thể là do các kích thích nào đó
không thuận lợi cuả môi trường.
Đầu tiên là sự hình thành vách ngăn không đối xứng chia tế bào ra làm 2 phần:
phần tiền bào tử và phần tế bào mẹ. Phần tiền bào tử sau này phát triển thành bào tử
còn phần tế bào mẹ có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho bào tử đến khi quá trình
hình thành bào tử hoàn tất.
Sau khi lớp vách ngăn được hình thành, các bản đồ gen sẽ lập trình tách ra và có
hai chương trình hoạt động riêng, một ở tế bào mẹ và một ở tiền bào tử. Chúng là quá
trình xây dựng phía bên ngoài (quá trình tổng hợp protein từ tế bào mẹ) và xây dựng
bên trong (quá trình sản xuất protein ở tiền bào tử).
Sau khoảng 3 giờ vách ngăn dịch chuyển đến bề mặt tiền bào tử ôm sát lấy tiền
bào tử để hình thành nên thể nguyên sinh. Thể nguyên sinh này nằm tự do trong tế bào
mẹ và được bao bọc lớp màng. Lớp vỏ sơ khai được hình thành giữa hai lớp màng của
bào tử.
Tiếp theo là sự hình thành lớp áo thông qua việc tổng hợp protein trong tế bào
mẹ xảy ra xung quanh tiền bào tử. Lớp áo này sẽ hiện rõ sau khoảng 5 giờ.
Bước cuối cùng của quá trình hình thành bào tử là tế bào mẹ bị teo dần và tách
khỏi bào tử con.
1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24,
28]
Probiotic là sản phẩm đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản để
tăng cường sự tăng trưởng và kháng bệnh cho thủy sản, đặc biệt là tôm sú. Vi khuẩn
được ứng dụng làm probiotic hiện nay phần lớn thuộc giống Bacillus. Do Bacillus có
khả năng tạo bào tử chịu được nhiệt thuận lợi cho quá trình sản xuất và bảo quản, có
khả năng sống sót trong pH thấp của dạ dày, có khả năng sinh enzyme và kháng sinh
có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.
43
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong thủy sản, Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay
nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy hợp chất hữu cơ
thải ra từ thức ăn thừa nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease,
amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh
vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio spp., Aeromonas spp., Edwardsiella spp.…
do chất lượng nước nuôi bị giảm. Ngoài ra, chúng còn có tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ
chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của môi trường nuôi.[20]
Rengpipat và Rukpratanporn (1998) cho rằng Bacillus S11 là vi khuẩn hữu ích
có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho ấu trùng tôm sú ăn. Kết
quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỉ lệ sống 100% khi gây cảm nhiễm
với V. harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 26%.[24]
Theo Moriarty (1998) sử dụng Bacillus trong nuôi tôm thịt ở Indonesia sẽ an
toàn trong 160 ngày, các trại không sử dụng Bacillus hầu như gặp thất bại, bệnh vi
khuẩn phát sáng do Vibrio thường làm tôm chết trước 80 ngày. [21]
Không chỉ vậy bào tử Bacillus cũng được sử dụng như một tác nhân sinh học
giúp giảm bệnh Vibrio trong hệ thống nuôi thuỷ sản. Gatesoupe (1991) đã nghiên cứu
và sử dụng bào tử vi khuẩn Bacillus IP5832 đưa vào môi truờng nuôi luân trùng dùng
làm thức ăn cho cá bơn.[15]
Meunpol và cs (2002) sử dụng probiotic với dòng vi khuẩn Bacillus S11 trộn
vào thức ăn viên công nghiệp cho ấu trùng tôm sú ăn. Sau khi cho ăn thức ăn trộn
probiotic trong 1 tháng thì cấy vi khuẩn Vibrio harveyi rồi xục ozon vào từng bể
(0,3333 - 0,341 mg O3/ mL). Tỉ lệ sống của tôm được xác định sau 6 ngày đạt cao nhất
75% so với nghiệm thức đối chứng tỷ lệ sống chỉ có 18%.[19]
Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật
hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố
vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi
khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Vì vậy,
Bacillus spp. giúp giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan.[28]
44
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 2. V
ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
45
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ 02/2011 đến 05/2011.
Địa điểm: tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở
TPHCM.
2.2 VẬT LIỆU
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu
25 chủng vi khuẩn Bacillus (F2, F3, F4, F5, F6, F7, F10, F11, F12, F13, F14, F17, F21,
F26, F27, F28, F33, F34, F35, F36, T1, T5, T9, T12) đã được phân lập từ trùn và phân trùn quế,
cung cấp bởi Phòng TN Công nghệ vi sinh Trường Đại Học Mở TP.HCM.
3 chủng vi khuẩn gây bệnh cho tôm: V. harveyi, V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus được cung cấp bởi Phòng TN Công nghệ vi sinh Trường Đại Học Mở
TP.HCM.
Ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon Fabricus) sạch bệnh, ở giai đoạn PL12 đến
PL15 được thu ở trại giống Vũng Tàu. Sau khi đem về phòng thí nghiệm, tôm được
thuần hóa trong 12 giờ, với nhiệt độ nước từ 28-32 oC, độ mặn 16-18o/oo.
2.2.2 Môi trường - hóa chất
Môi trường Nutrient broth (NB) bổ sung 1,5% NaCl (w/v).
Môi trường Nutrient agar (NA).
Môi trường Nutrient agar (NA) bổ sung 1,5% NaCl (w/v).
Môi trường Pepton kiềm.
Môi trường Luria Bertani (LB).
Môi trường Blood agar (BA).
Môi trường Thiosulphate citrate bile salts sucrose agar (TCBS)
Bộ thuốc nhuộm Gram gồm: Crystal violet, Lugol, Fuchsine kiềm, cồn 96º.
Nước cất, nước cất vô trùng.
Dung dịch NaCl 0,85%, NaOH 40%, dung dịch H2O2 3%.
Nước biển thu từ Vũng Tàu.
46
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3 Thiết bị - dụng cụ
2.2.3.1 Thiết bị
Máy bể ổn nhiệt MEMMERT
Máy chụp hình SONY
Kính hiển vi OLYMPUS
Tủ cấy ESCO
Máy Vortex Zx3, VELP
Tủ ấm MEMMERT
Tủ sấy MEMMERT
Nồi hấp HIRAYAMA
Microwave SHARP
Cân kỹ thuật
Một số thiết bị khác trong Phòng TN Vi Sinh.
2.2.3.2 Dụng cụ
Micropipet và đầu tip tương ứng
Que cấy
Đèn cồn
Đĩa petri
Erlen
Becher
Que trang
Ống nghiệm
Ống đong
Hộp nhựa 650 mL
…
47
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Hình 2.6 Quy trình thí nghiệm
48
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS
Tái phân lập và đinh danh sơ bộ vi khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp thường
qui, nhuộm gram và thử catalase.
Sau khi nhận giống Bacillus chúng tôi tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria
trên đĩa môi trường NA, ủ 37oC/ 24 giờ.
Nhuộm Gram [1]
Nguyên tắc
Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho khả năng bắt màu
màng tế bào với thuốc nhuộm khác. Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai
nhóm vi khuẩn.
Thực hiện
Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:
Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch. Tạo huyền phù với vi khuẩn cần
nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô.
Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet. Để yên 1 - 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa
trôi thuốc nhuộm dư bằng nước.
Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước.
Tẩy cồn 96o từ 15 - 30 giây, sau đó rửa nước. Phủ hoàn toàn vết bôi với
Safranin O và để yên trong 1 phút. Rửa với nước.
Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát
dưới kính hiển vi với vật kính 100.
Đọc kết quả
Vi khuẩn Gram âm sẽ thấy màu hồng; Gram dương sẽ thấy màu tím; vi khuẩn
đã hình thành bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu nằm bên trong tế bào sinh
dưỡng bắt màu Gram, hoặc bào tử đã phóng thích ra ngoài sẽ tạo một rìa màu hồng
xung quanh khối trong suốt.
49
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thử catalase [1]
Nguyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý đều có enzyme catalase (trừ
Streptococcus sp.). Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2. Sự
thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt
khí, vì thế ta sử dụng đặc tính này để thử khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn.
Thực hiện
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính
sạch. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát.
Kết quả
Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí (+), vi khuẩn không sinh catalase sẽ không
thấy sủi bọt (-).
2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG
2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26]
Nguyên tắc
Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh làm ức chế sự phát
triển của vi khuẩn gây bệnh. Khi cấy vạch vi khuẩn thử nghiệm vuông góc với vạch đã
cấy vi khuẩn gây bệnh nếu khoảng cách từ vi khuẩn thử nghiệm đến chỗ vi khuẩn gây
bệnh bắt đầu sinh trưởng càng lớn thì khả năng ức chế càng mạnh, nếu vi khuẩn cần
kiểm tra không sinh chất ức chế vi khuẩn gây bệnh thì vi khuẩn gây bệnh vẫn phát triển
bình thường ngay điểm giao nhau của hai vạch này.
Thực hiện
Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NA,vi khuẩn gây
bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.
Vi khuẩn gây bệnh được cấy thẳng vạch thứ nhất trên môi trường NA bổ sung
1,5% NaCl. Sau đó lấy vi khuẩn thử nghiệm vạch thẳng vuông góc với vạch thứ nhất ,
ủ ở 37 oC. Quan sát sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.
50
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Kết quả
Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch vi khuẩn gây bệnh không mọc thì vi khuẩn
thử nghiệm có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh ( kết quả dương tính ). Kết quả âm
tính khi vi khuẩn gây bệnh vẫn phát triển bình thường tại điểm giao nhau của 2 vạch.
Nếu tại điểm giao nhau của 2 vạch vi khuẩn thử nghiêm mọc trên đường vạch của gây
bệnh thì vi khuẩn thử nghiệm có khả xâm lấn vi khuẩn gây bệnh.
Hình 2.7 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc
2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26]
Nguyên tắc
Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh làm ức chế sự phát
triển của vi khuẩn gây bệnh. Nếu xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn thử nghiệm
đường kính vòng ức chế càng lớn thì vi khuẩn gây bệnh càng mẫn cảm với chất kháng
sinh do vi khuẩn thử nghiệm tiết ra.
Thực hiện
Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NA,vi khuẩn gây
bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.
Cấy chấm vi khuẩn thử nghiệm thử nghiệm lên đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ, 48
giờ và 72 giờ ở 37 oC. Vi khuẩn gây bệnh được nuôi cấy trong NB bổ sung 1,5% NaCl
trong 24 giờ ở 37 oC, lấy 0,2 mL dịch nuôi cấy này trộn với 20 mL NA bổ sung 1,5%
51
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NaCl (ở 40 - 45 oC) đổ nhẹ nhàng lên đĩa NA đã cấy chấm vi khuẩn thử nghiệm. Ủ 37 oC trong 24 - 48 giờ, quan sát vòng ức chế vi khuẩn. Thử nghiệm được lập lại 3 lần.
Kết quả
Đo đường kính vòng ức chế .
2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27]
Sử dụng thử nghiệm đồng nuôi cấy để đồng nuôi cấy các chủng vi khuẩn thử
nghiệm (mật độ ban đầu 105, 107, 108, 109 CFU/ mL) với các chủng vi khuẩn gây bệnh
(mật độ ban đầu 103 CFU/ mL).
Nguyên tắc
Nhiều vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm
giảm mật độ của chúng.
Thực hiện
Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên NA, vi khuẩn gây bệnh được
tăng sinh trên pepton kiềm ở 37 oC/ 24 giờ.
Các chủng vi khuẩn này được pha trong NaCl 0,85% tạo huyền dịch vi khuẩn
sao cho mật độ vi khuẩn gây bệnh sao khi cho vào LB là 103 CFU/ mL và vi khuẩn thử
nghiệm đạt 105, 107, 108, 109 CFU/ mL.
Đồng nuôi cấy ở 37 oC trong 7 ngày.
Kiểm tra mật độ sau 24 giờ bằng phương pháp trãi đĩa trên TCBS.
Pha loãng dịch đồng nuôi cấy trong NaCl 0,85% đến mật độ đếm được.
Hút 0,1 mL ở 3 mật độ liên tiếp, mỗi mật độ trải trên 2 đĩa thạch TCBS,
lặp lại 3 lần. Ủ 37 oC /24 – 48 giờ.
Đếm khuẩn lạc và tính mật độ khuẩn lạc ban đầu.
52
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy
Công thức tính mật độ tế bào của chủng vi khuẩn khảo sát [10]
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di,
được tính theo công thức là:
Mi (CFU/mL) = Ai X Di/V
Trong đó
Mi: Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu.
Ai: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa.
Di: Độ pha loãng.
V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (mL).
Môi trường LB
Môi trường LB
Cấy trang trên TCBS để xác định mật độ Vibrio
Cấy trang trên TCBS để xác định mật độ Vibrio
Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Vibrio
Vi khuẩn Vibrio
53
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.7 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS
2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1]
Nguyên tắc
Một vài loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym hemolysin làm tan máu (dung
huyết). Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu BA (Blood Agar), có bổ sung 5 – 10%
máu cừu, tùy theo loài vi khuẩn, có 1 trong 3 loại tan máu sau:
Tan máu : tan máu không hoàn toàn.
Tan máu : tan máu hoàn toàn,vùng tan máu rộng.
Tan máu : không tan máu.
Thực hiện
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường thạch máu BA, có bổ sung
5% máu cừu, có thể tiến hành với vi khuẩn đối chứng không dung huyết.
Cho vào tủ ấm 37 oC, ủ trong 24 giờ.
Đọc kết quả: Tùy loại vi khuần, sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết sau:
Tiêu huyết α (tiêu huyết không hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn,
tạo nên vùng tiêu huyết nhỏ, mờ, hơi màu xanh.
Tiêu huyết β (tiêu huyết hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng
tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khóm vi khuẩn trên thạch máu.
Tiêu huyết γ (không tiêu huyết): hồng cầu không bị ly giải nên không tạo ra
vòng tiêu huyết.
2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng
tôm sú [11]
Nguyên tắc:
Đánh giá tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử nghiệm lên ấu trùng tôm sú.
Thực hiện:
54
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nước biển được thu từ Vũng Tàu được pha đến độ mặn thích hợp cho tôm 16 –
18o/oo. Tiến hành lọc để loại bỏ tạp chất. Hấp ở 12 oC/1atm /20 phút. Ấu trùng sau khi
thuần hóa 12 giờ được cho vào nước biển đã để nguội theo lô thí nghiệm 60 ấu
trùng/300 mL/1 hộp thí nghiệm.
Vi khuẩn thử nghiệm được hoạt hóa trên NA ở 37 oC trong 18 - 24 giờ
Vi khuẩn được pha trong NaCl 0,85% tạo huyền dịch vi khuẩn sao cho mật độ
khi cho vào hộp thí nghiệm là 106 CFU/ mL.
Đọc kết quả
Theo dõi tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sau 24 giờ sau khi bổ sung vi khuẩn.
Các thử nghiệm được lặp lại 6 lần và được xử lý thống kê Anova một yếu tố
bằng phần mềm Excel. Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình (mm)±sai số
chuẩn.
Hình 2.10 Thuần hóa tôm
Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử
nghiệm lên ấu trùng tôm sú
Thử nghiệm tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử
nghiệm trên ấu trùng tôm sú
Thử nghiệm tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử
nghiệm trên ấu trùng tôm sú
Đối chứng: ấu trùng tôm
(không vi khuẩn)
Đối chứng: ấu trùng tôm
(không vi khuẩn)
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 1 + ấu trùng tôm
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 1 + ấu trùng tôm
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 2+ ấu trùng tôm
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 2+ ấu trùng tôm
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 3+ ấu trùng tôm
Vi khuẩn vi khuẩn thử
nghiệm 3+ ấu trùng tôm
Theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ
Theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ
55
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.11 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm
Hình 2.12 Hộp bố trí thí nghiệm
56
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ
Kết quả được xử lý thống kê ANOVA của phần mềm Excel của Microsoft với
độ tin cậy P< 0,05. Kết quả trình bày gồm giá trị trung bìnhsai số.
57
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 3. KẾ
T QUẢ VÀ BÀN LUẬN
58
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS
Tái phân lập 25 chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế và phân trùn quế,
tất cả 25 chủng Bacillus đều thuần Gram dương, sinh bào tử, phản ứng catalase dương.
Các chủng phân lập từ trùn quế được ký hiệu T và từ phân trùn quế ký hiệu F,
kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Hình 3.13 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy.
Hình 3.14 Nhuộm gram Bacillus
59
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập
ST
TMã
chủngĐặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể
Cat
alas
e
1 F2
Rìa nhăn, khuẩn lạc
khô, bám sát mặt thạch
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
2 F3
Rìa nhăn, bờ nhô cao,
khô
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
3 F4 Rìa tròn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
4 F5 Rìa nhănHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
5 F6 Rìa nhăn, lồiHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
6 F7 Rìa nhăn, khô, dẹpHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
7 F10 Rìa nhăn, mọc lan mạnhHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
8 F11 Rìa nhăn, bờ nhô caoHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
9 F12 Rìa nhăn, bóngHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
10 F13 Rìa nhănHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
11 F14 Rìa nhăn, bóng, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
60
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ST
TMã
chủngĐặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể
Cat
alas
e
12 F17 Rìa tròn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
13 F21 Rìa nhăn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
14 F26 Rìa nhăn, khô,xù xìHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
15 F27 Rìa nhăn, khuẩn lạc khôHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
16 F28 Rìa nhăn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
17 F33 Rìa tròn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
18 F34
Rìa nhăn, xù xì, mọc
phân lớp
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
19 F35 Rìa tròn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
20 F36 Rìa tròn, khôHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
21 T1 Rìa nhăn, dẹp, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
22 T4 Rìa nhăn, ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
23 T5
Rìa nhăn, khuẩn lạc
khô, xù xì
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
61
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ST
TMã
chủngĐặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể
Cat
alas
e
24 T9 Rìa trơn, khuẩn lạc ướtHình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
25 T12
Rìa nhăn, dẹp, ướt,
bóng
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
(+), nội bào tử+
3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG
3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc
Từ 25 chủng vi khuẩn Bacillus tái phân được thử khả năng đối kháng với 3
chủng vi khuẩn gây bệnh cho tôm: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus,
Vibrio harveyi sử dụng phương pháp cấy vạch vuông góc và đọc kết quả sau 24 giờ, 48
giờ, 72 giờ nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
62
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc
STT ChủngV. parahaemolyticus V. alginolyticus V. harveyi
24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
1 F2 - - - - - - + + +
2 F3 - - - - - - + + +
3 F4 - - - - - - - - -
4 F5 - - - - - - - - -
5 F6 - - - - - - + + +
6 F7 - - - - - - - - -
7 F10 - - - - - - - - -
8 F11 - - - - - - + + +
9 F12 - - - x x x - - -
10 F13 - - - - - - y + +
11 F14 - - - - - - - - -
12 F17 - - - - - - + + +
13 F21 - - - - - - - - -
14 F26 - - - - - - - - -
15 F27 - - - - - - y + +
16 F28 - - - - - - y + +
17 F33 - - - - - - - y y
18 F34 - - - - - - - - -
19 F35 - - - - - - - - -
20 F36 - - - - - - + + +
21 T1 - - - - - - - - -
22 T4 - - - - - - - - -
23 T5 - - - - - - y y y
24 T9 - - - - - - - - x
63
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24 T12 - - - - - - - - -
Ghi chú
– -: không kháng
– +: kháng
– y: kháng yếu
– x : xâm lấn
Nhận xét
Trong 25 chủng Bacillus thử nghiệm chúng tôi nhận thấy tất cả các chủng không
kháng với V. parahaemolyticus, V. alginolyticus (ngoại trừ chủng F12) nhưng hầu hết
các chủng kháng với V. harveyi và có khả năng kháng tốt nhất ở 48 và 72 giờ.
6 chủng (F2, F3, F6, F11, F17, F36) kháng mạnh với Vibrio harveyi ở 24, 48, 72 giờ
ngoại trừ 2 chủng kháng yếu (F33,T5). 3 chủng (F13, F27, F28) kháng mạnh với Vibrio
harveyi chỉ ở 48 và 72 giờ.
12 chủng (F4, F5, F7, F10, F14, F21, F26, F34, F35, T1, T4, T12) không đối kháng với cả
3 chủng vi khuẩn gây bệnh.
Trong đó chỉ có chủng F12 xâm lấn V. alginolyticus ở 24, 48, 72 giờ và T9 xâm
lấn với V. harveyi ở 72 giờ.
Để khẳng định một lần nữa khả năng đối kháng chúng tôi tiếp tục tiến hành thử
nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.
Hình 3.15 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc
64
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp
Song song với phương pháp cấy vạch vuông góc, 25 chủng Bacillus cũng được
thử nghiệm khả năng đối kháng với 3 chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp đổ
thạch hai lớp.
Thử nghiệm được lặp lại 3 lần và được xử lý thống kê Anova một yếu tố bằng
phần mềm Excel. Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình (mm)±sai số.
65
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.
Chủn
g
V. parahaemolyticus V.alginolyticus V. harveyi
24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
F4 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
F5 0±0 5.33±0.33 15±0.58 0±0 0±0 0±0 15.33±0.8820.67±0 .3
323±0.58
F10 9.6±0.88 15.33±0.33 30±0.58 14.67±0.33 0±0 10.67±1.2 21.33±0.67 24.33±0.33 32.33±0.67
F12 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
F13 6.33±0.33 9.67±1.45 12.67±0.33 0±0 0±0 0±0 11±0.58 16.33±0.33 17.33±0.33
F17 0±0 0±0 12±0.58 0±0 0±0 23±0.58 23.67±0.33 29.33±0.33 24.67±0.88
F21 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
F26 10±1 10.67±1.33 8.67±1.67 0±0 0±0 0±0 10.33±0.33 14±0.58 15±0.58
F33 0±0 0±0 13.67±0.67 16.33±0.67 15±0 12.33±1.33 0±0 27.33±0.88 22.67±1.45
F35 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 19±0.58
F36 0±0 0±0 14.67±0.67 9.33±0.88 11±1.53 14.33±0.67 14.67±1.76 14.67±0.88 19±1
T4 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
F28 9.67±1.2 9.67±0.33 6.67±0.33 16±0.58 18.67±0.33 18±0.58 21.33±0.88 23.67±1.2 21.33±0.33
F11 0±0 6.33±0.88 14.67±0.33 10±0.58 15.33±0.88 16.33±0.67 20.33±0.33 23±0.58 20.67±0.67
66
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủn
g
V. parahaemolyticus V.alginolyticus V. harveyi
24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
F14 0±0 0±0 20.33±0.67 0±0 0±0 7.33±0.88 0±0 0±0 0±0
F27 0±0 9±1.15 13.67±0.88 12±1.15 15.33±0.67 14±0.58 15±7.94 23±1.73 21±2.08
F2 7±3.51 9.67±0.33 11±1.15 10±0 12±1 13.33±1.2 8.33±4.18 22±3.21 21.33±2.4
F3 0±0 9.67±0.33 11.33±5.7 0±0 0±0 0±0 10.67±0.67 14±0.58 18±9.17
F34 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
F6 8.67±0.33 12.33±0.88 11.67±2.03 10±0.58 7±3.51 14.67±0.33 14±0 18.67±0.33 12.33±6.94
F7 9.33±0.67 13±0 23.33±0.88 0±0 0±0 8.33±0.33 20.67±0.33 15± 0.58 19±0
T1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
T12 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
T5 0±0 0±0 14.33±0.67 0±0 0±0 2.67±2.67 0±0 5.67±5.67 0±0
T9 10±0 16.33±3.18 21.33±0.67 0±0 0±0 10.33±1.2 12.33±0.33 17.33±4.63 20±1.73
67
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.1 Thử khả năng đối kháng của chủng Bacillus đối với V. parahaemolyticus
theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
Biểu đồ 3.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. alginolyticus
theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V. harveyi theo
thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
Trong 25 chủng vi khuẩn thử nghiệm thì hầu hết các chủng này đều đối kháng
với các vi khuẩn gây bệnh trừ 7 chủng (F4, F12, F21, F34, T1, T4, T12), đối kháng tốt nhất ở
48 giờ và 72 giờ.
Trong 18 chủng vi khuẩn còn lại thì có 13 chủng (F2, F5, F6, F7, F11, F27, F28, F33,
F10, F17, F36, T5, T9) kháng tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh. 3 chủng (F13, F26, F3)
kháng với khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi. 1 chủng F14 kháng với V.
parahaemolytcus, V. alginolyticus và F35 chỉ kháng với V. harveyi.
Nhận xét :
Tổng hợp kết quả của 2 phương pháp thử đối kháng trên từ 25 chủng ban đầu
chúng tôi thu được 13 chủng (F2, F5, F6, F7, F11, F27, F28, F33, F10, F17, F36, T5, T9) kháng
tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu như : đối
kháng với Vibrio gây bệnh của Kurunasagar và cs (2005)[18], Vichai
Domrongpokkaphan và Wanchaitanawong (2006)[16], Nguyễn Văn Minh và cs (2010)
[5].
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sau khi thử nghiệm đối kháng bằng hai phương pháp vạch vuông góc và đổ
thạch hai lớp, chúng tôi chọn tiêu chí khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh như sau:
Đối kháng với tất cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh.
Và đối kháng mạnh với V. harveyi.
Với tiêu chí trên chúng tôi chọn được 6 chủng (F10, F2, F27, F33, F11, F28) để tiến
hành tiếp thử nghiệm đồng nuôi cấy.
Hình 3.16 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2
lớp
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY
6 chủng (F10, F2, F27, F33, F11, F28) được chọn lựa từ thử nghiệm đối kháng được
đồng nuôi cấy để xác định mật độ Bacillus có khả năng ức chế chủng vi khuẩn gây
bệnh.
Kết quả đồng nuôi cấy 6 chủng Bacillus (mật độ ban đầu 105, 107, 108, 109
CFU/mL) với ba chủng vi khuẩn gây bệnh: V. harveyi và V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus (mật độ ban đầu 103 CFU/ mL) như sau.
3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V.
parahaemolyticus
Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời
gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm ( LOG10 CFU/ mL)
F2-10 5 F2-10 7 F2-10 8 F2-10 9 DC
0 3,03±0,29 2,88±0,1 3,68±0,1 3,36±0,01 3,85±0,03
1 7,96±0,12 7,72±0,06 9,17±0,09 8,47±0,44 10,21±0,00
2 9,73±0,07 9,6±0,39 8,58±0,3 8,63±0,05 10,26± 0,09
3 7,12±0,23 7,91±0,35 7,03±0,32 6,76±0,15 10,56±0,52
4 6,96±0,68 6,98±0,01 7,92±0,17 6,86±0,03 11,11±0,06
5 6,96±0,06 7,7±0,01 6,77±0,04 6,55±0,2 11,29±0,15
6 7,14±0,01 6,85±0,04 6±0,01 5,11±0,06 11,26±0,02
7 6,13±0,85 5,68±0,02 5,18±0 4,98±0,02 10,68±0,10
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F2 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F2 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp
2.1 lần so với đối chứng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC
0 3,37±0,03 2,94±0,05 3,48±0,09 4,05±0,01 3,85±0,03
1 8,75±0,05 7,85±0,04 7,2±0,06 8,92±0,07 10,21±0,00
2 10,12±0,02 8,8±0,06 7,54±0,18 8,38±0,02 10,26± 0,09
3 8,68±0,02 8,84±0,04 8,03±0,02 6,87±0,02 10,56±0,52
4 8,33±0 7,23±0,03 6,54±0,13 6,69±0,1 11,11±0,06
5 7,06±0,09 7,99±0,08 6,62±0,07 5,79±0,13 11,29±0,15
6 7,51±0,1 7,33±0,02 6,5±0,02 5,69±0,1 11,26±0,02
7 7,36±0,02 7,23±0,11 6,14±0,11 4,99±0,01 10,68±0,10
Biểu đồ 3.5 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F10 ở những mật độ khác nhau.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo biểu đồ 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F10 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp
2.1 lần so với đối chứng.
Bảng 3.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F11 10 5 F11 10 7 F11 10 8 F11 10 9 DC
0 2,96±0,01 3,84±0,01 3,79±0,05 3,26±0,12 3,85±0,03
1 8,67±0,02 10,37±0,04 8,76±0 7,63±0,21 10,21±0,00
2 10,75±0,01 9,33±0.01 8,95±0,01 8,33±0,01 10,26± 0,09
3 8,51±0,05 8,61±0,16 9,69±0,1 9,09±0,13 10,56±0,52
4 8,14±0,03 6,65±0,03 7,76±0,03 7,72±0,02 11,11±0,06
5 7,92±0,02 6,43±0,02 7,04±0,02 6,41±0 11,29±0,15
6 7,76±0,04 6,56±0,29 6,52±0 6,44±0,02 11,26±0,02
7 7,63±0,01 6,61±0,07 5,74±0,17 5,77±0,04 10,68±0,10
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.6 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F11 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.6, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F11 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp
1.9 lần so với đối chứng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC
0 3,82±0,05 3,7±0,1 3,02±0,01 3,39±0,17 3,85±0,03
1 9,66±0,09 9,24±0,08 9,24±0,05 9,32±0 10,21±0,00
2 10,59±0,09 10,9±0 9,1±0,15 8,93±0,04 10,26± 0,09
3 10,21±0,02 10,32±0,02 8,76±0,07 7,92±0,55 10,56±0,52
4 8,57±0,27 7,61±0,01 6,95±0,05 7,59±0,11 11,11±0,06
5 8,64±0,05 8,38±0,01 6,83±0,2 7,09±0,12 11,29±0,15
6 8,32±0,03 7,92±0 6,83±0,22 7±0,06 11,26±0,02
7 7,67±0,11 6,72±0,07 5,95±0,03 5,5±0,06 10,68±0,10
Biểu đồ 3.7 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F27 ở những mật độ khác nhau
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo biểu đồ 3.7, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp
1.9 lần so với đối chứng.
Bảng 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC
0 3,87±0,04 3,52±0,11 3,74±0,07 3,85±0,07 3,85±0,03
1 9,24±0,03 9,3±0,01 8,99±0 8,79±0,03 10,21±0,00
2 10,04±0,02 10,31±0,02 9,85±0,04 8,04±0 10,26± 0,09
3 8,48±0,05 8,9±0,02 8,74±0,1 7,94±0,13 10,56±0,52
4 8,14±0,08 7,71±0,05 8,11±0 8,25±0,13 11,11±0,06
5 7,85±0,01 7,8±0,02 7,52±0,07 7,79±0,08 11,29±0,15
6 7,94±0 7,86±0 7,24±0,11 6,79±0,09 11,26±0,02
7 7,89±0,02 7,5±0,06 6,45±0,01 6,41±0 10,68±0,10
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.8 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F28 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.8, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7giảm gấp
1.7 lần so với đối chứng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)
Thời
gian
(ngày)
Mật độ chủng vi khuẩn thử nghiệm
F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC
0 3,44±0,18 3,21±0,12 2,99±0,00 3,46±0,09 3,85±0,03
1 9,91±0,13 9,57±0,30 8,10±0,19 8,10±0,01 10,21±0,00
2 10,64± 0,07 10,19±0,06 8,14±0,17 8,91±0,06 10,26±0,09
3 10,55±0,51 9,73±0,18 7,69±0,15 8,10±0,18 10,56±0,52
4 9,72±0,13 8,93±0,02 7,59±0,03 7,14±0,04 11,11±0,06
5 7,57±0,03 7,87±0,03 7,47±0,00 6,92±0,00 11,29±0,15
6 7,69±0,04 7,67±0,02 8,17±0,12 6,61±0,12 11,26±0,02
7 7,99±0,15 7,59±0,01 7,45±0,08 6,26±0,08 10,68±0,10
Biểu đồ 3.9 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F33 ở những mật độ khác nhau.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo biểu đồ 3.9, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô
109 CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp
1.7 lần so với đối chứng.
Nhận xét chung:
Chúng tôi nhận thấy rằng 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) ở những
mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V.
parahaemolyticus thì hầu như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt
ức chế mạnh ở mật độ 109 CFU/mL.
Nhìn chung sau 1 đến ngày 2 mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng như đối chứng sau
đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được tiết ra trong
2 ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy rằng 6
chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V.parahaemolyticus sau 48 giờ.
Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, 2 chủng F2 và F10 là đối kháng mạnh nhất
với V.parahaemolyticus thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm
gấp 2.1 lần so với đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng
khác chỉ giảm từ 1.7-1.9 lần.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V.
alginolyticus
Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F2 10 5 F2 10 7 F2 10 8 F2 10 9 DC
0 2,87±0,17 3,31±0,31 3,09±0 2,39±0,21 3,91±0,02
1 9,93±0,04 9,16±0,06 9,61±0,28 9,45±0,05 9,73±0,25
2 10,28±0,05 10,43±0,19 11,96±0,02 9,2±0,03 11,24±0,09
3 11,27±0,03 11,28±0,04 11,38±0,04 11,37±0,03 11,7±0,07
4 9,91±0,18 9,55±0,16 9,8±0,22 8,68±0,02 13±0,11
5 9,62±0,19 8,96±0 8,09±0,04 8,94±0,06 11,71±0,16
6 9,89±0,07 8,06±0,02 7,78±0,4 7,31±0 11,68±0,09
7 8,74±0,18 7,57±0,25 7,06±0,09 6,63±0,44 11.38±0
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F2
ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.10, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F2 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.7
lần so với đối chứng.
Bảng 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC
0 2,7±0,71 3,95±0 3,89±0,04 3,05±0,15 3,91±0,02
1 11,22±0,06 11,3±0 10,37±0,01 10,15±0,06 9,73±0,25
2 10,59±0,11 10,61±0,03 11,44±0,13 10,75±0,16 11,24±0,09
3 10,7±0,48 9,72±0,14 10,4±0 10,27±0,08 11,7±0,07
4 10,37±0,01 9,65±0,14 10,39±0 10,28±0,01 13±0,11
5 10,18±0,06 9,63±0,17 9,37±0,02 8,96±0,02 11,71±0,16
6 9,96±0,02 9,09±0,17 9,27±0,01 7,76±0,15 11,68±0,09
7 9,67±0,14 8,6±0,32 7,9±0 7,28±0,03 11,38±0
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.11 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F10
ở những mật độ khác nhau.
Theo biểu đồ 3.11, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F10 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.6
lần so với đối chứng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus ( tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F11 10 5 F1110 7 F1110 8 F1110 9 DC
0 3,84±0,03 3,26±0,59 3,08±0,34 2,99±0,05 3,91±0,02
1 10,44±0,19 10,29±0,3 10,12±0,32 9,12±0 9,73±0,25
2 11,26±0,05 11,09±0,06 9,7±0,01 8,61±0,05 11,24±0,09
3 9,7±0,02 9,33±0,25 8,82±0,04 8,91±0,16 11,7±0,07
4 9±0,03 8,36±0,19 8,43±0,02 7,99±0,05 13±0,11
5 8,87±0,03 8,06±0,19 8,21±0,07 7,78±0,2 11,71±0,16
6 8±0,03 7,53±0,04 7,87±0,03 7,62±0,1 11,68±0,09
7 7,86±0 7,41±0 7,29±0 7,3±0,05 11,38±0
Biểu đồ 3.12 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F11
ở những mật độ khác nhau
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo biểu đồ 3.12, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F11 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.6
lần so với đối chứng.
Bảng 3.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC
0 3,86±0,04 3,68±0,2 3,59±0,06 3,93±0,04 3,91±0,02
1 9,28±0,1 8,97±0,17 8,87±0,25 7,81±0,05 9,73±0,25
2 9,05±0,08 9,1±0,07 9,29±0,01 8,96±0,02 11,24±0,09
3 8,67±0,23 8,85±0,02 9,13±0,25 8,48±0,05 11,7±0,07
4 8,51±0,08 8,08±0,33 8,22±0,04 8,28±0,19 13±0,11
5 7,39±0,1 7,89±0,23 7,88±0,23 8,23±0,08 11,71±0,16
6 7,88±0,03 8,26±0,03 7,42±0,01 6,66±0,07 11,68±0,09
7 7,76±0,01 7,73±0,16 6,67±0,09 6,06±0,23 11,38±0
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.13 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F27
ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.13, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.9
lần so với đối chứng.
Bảng 3.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
(ngày) F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC
0 3,37±0,35 3,58±0,13 4,38±0,22 3,03±0,01 3,91±0,02
1 10,83±0,12 10,62±0,01 10,12±0,1 9,91±0,31 9,73±0,25
2 11,12±0,02 9,74±0,14 9,91±0,12 9,22±0,02 11,24±0,09
3 9,87±0,14 9,49±0,05 9,11±0,01 9,04±0,02 11,7±0,07
4 8,28±0,35 8,83±0,24 9,09±0,05 9,04±0,17 13±0,11
5 7,64±0,13 8,89±0,37 8,26±0,02 9,25±0 11,71±0,16
6 8,25±0,17 8,41±0,29 7,89±0,03 7,85±0,06 11,68±0,09
7 8,49±0,04 7,61±0,35 7,42±0,01 7,53±0,04 11,38±0
Biểu đồ 3.14 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F28
ở những mật độ khác nhau
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo biểu đồ 3.14, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.5
lần so với đối chứng.
Bảng 3.15. Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL)
Thời gian
(ngày)
Nồn độ chủng vi khuẩn thử nghiệm
F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC
0 3,45±0,39 3,05±0,00 3,38±0,21 3,77±0,14 3,91±0,02
1 10,14±0,34 9,31±0,24 9,46±0,25 9,30±0,22 9,73±0,25
2 10,44±0,02 8,06±0,12 9,60±0,65 9,35±0,03 11,24±0,09
3 8,03±0,18 8,76±0,12 7,63±0,02 8,50±0,09 11,70±0,07
4 8,07±0,03 7,83±0,10 8,10±0,18 8,31±0,15 13,00±0,11
5 7,76±0,03 8,11±0,32 7,74±0,15 7,45±0,08 11,71±0,16
6 8,34±0,04 8,29±0,16 6,91± 0,06 6,97±0,01 11,68±0,09
7 7,61±0,10 7,26±0,08 6,48±0,02 6,83±0,06 11,38±0,00
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.15 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F33
ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.15, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F33 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.7
lần so với đối chứng.
Nhận xét chung
Chúng tôi nhận thấy rằng 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) ở những
mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V.alginolyticus thì
hầu như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ
109 CFU/mL.
Nhìn chung sau ngày đầu tiên mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng gần giống như đối
chứng sau đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
tiết ra trong ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy
rằng 6 chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V. alginolyticus sau 24 giờ.
Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chủng F27 là đối kháng mạnh nhất với V.
alginolyticus thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm gấp 1.9 lần
so với đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng khác chỉ giảm
từ 1.7-1.9 lần.
3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. harveyi
Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F2 10 5 F2 10 7 F2 10 8 F2 10 9 DC
0 3,03±0,29 3,49±0,07 3,03±0,07 3,07±0,06 4,74±0,03
1 8,59±0,06 7,57±0,04 7,49±0,04 7,97±0,02 9,37±0,35
2 10,36±0,02 10,97±0,19 10,06±0,03 9,71±0,36 10,31±0,42
3 8,16±0,09 8,94±0,05 8,9±0,12 9,14±0,34 9,27±0,49
4 7,62±0,08 6,88±0,21 8,58±0,02 7,8±0,21 9,5±0,08
5 7,79±0 6,88±0,07 7,13±0,03 5,42±0,24 9,4±0,02
6 7,05±0,02 6,86±0,05 6,74±0,05 5,46±0,08 9,62±0,2
7 6,82±0,07 6,67±0,16 5,8±0,19 4,76±0,16 9,57±0,09
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.16 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.16, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F2 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.9
lần so với đối chứng.
Bảng 3.17 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời gian Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
(ngày) F10 10 5 F10 10 7 F10 10 8 F10 10 9 DC
0 3,37±0,03 2,94±0,05 3,48±0,09 4,05±0,01 4,74±0,03
1 8,75±0,05 7,85±0,04 7,2±0,06 8,92±0,07 9,37±0,35
2 10,12±0,02 8,8±0,06 7,54±0,18 8,38±0,02 10,31±0,42
3 8,68±0,02 8,84±0,04 8,03±0,02 6,87±0,02 9,27±0,49
4 8,33±0 7,23±0,03 6,54±0,13 6,69±0,1 9,5±0,08
5 7,06±0,09 7,99±0,08 6,62±0,07 5,79±0,13 9,4±0,02
6 7,51±0,1 7,33±0,02 6,5±0,02 5,69±0,1 9,62±0,2
7 7,36±0,02 7,23±0,11 6,14±0,11 4,99±0,01 9,57±0,09
Biểu đồ 3.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.17, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F10 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 2
lần so với đối chứng.
Bảng 3.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F11 10 5 F11 10 7 F11 10 8 F11 10 9 DC
0 3,46±0,17 3,74±0,2 2,95±0,04 4,62±0,15 4,74±0,03
1 8,77±0,1 8,57±0,08 9,24±0,09 9,25±0,04 9,37±0,35
2 10,69±0,06 10±0,03 10,33±0,02 10,18±0,09 10,31±0,42
3 9,04±0,05 8,66±0,16 8,63±0,05 8,46±0,05 9,27±0,49
4 9,37±0,08 7,29±0,02 8,37±0,03 6,31±0 9,5±0,08
5 8,84±0,1 7,64±0,02 7,09±0,03 5,6±0,07 9,4±0,02
6 8,67±0,17 7,27±0,02 7,58±0,04 5,35±0,09 9,62±0,2
7 8,06±0,24 7,19±0,08 7,24±0,04 4,97±0,49 9,57±0,09
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.18 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.18, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F11 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 1.9
lần so với đối chứng.
Bảng 3.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F27 10 5 F27 10 7 F27 10 8 F27 10 9 DC
0 3,31±0,03 3,29±0,12 3,44±0,04 3,3±0,11 4,74±0,03
1 8,74±0,09 8,75±0,14 8,84±0,03 8,4±0,08 9,37±0,35
2 8,32±0,14 7,14±0,41 7,62±0,06 8,13±0,15 10,31±0,42
3 8,14±0,19 7,07±0,45 6,88±0,31 7,65±0,17 9,27±0,49
4 7,21±0,09 7±0,07 7,18±0,14 6,52±0,17 9,5±0,08
5 6,9 ±0,06 6,66±0,09 6,66±0,09 6,34±0,11 9,4±0,02
6 6,74±0,14 6,08±0,13 6,32±0,05 4,93±0,17 9,62±0,2
7 6,18±0,28 4,7±0,04 4,96±0,03 4,39±0,07 9,57±0,09
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.19, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 2.2
lần so với đối chứng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời
gian
(ngày)
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm
F28 10 5 F28 10 7 F28 10 8 F28 10 9 DC
0 3,15±0,11 3,82±0,06 4,37±0,29 3,84±0,1 4,74±0,03
1 8,84±0,33 9,28±0,03 8,63±0,07 8,48±0,09 9,37±0,35
2 10,5±0,06 10,63±0,11 10,41±0,37 10,16±0,01 10,31±0,42
3 9,87±0,04 9,09±0,17 9,95±0,01 6±0,09 9,27±0,49
4 8,67±0,02 7,78±0,01 7,49±0,01 5,86±0,06 9,5±0,08
5 6,2±0,06 7,33±0 5,97±0,23 5,69±0,2 9,4±0,02
6 7,57±0,14 7,91±0,03 6,6±0,08 5,3±0,11 9,62±0,2
7 7,16±0,04 6,71±0,01 5,78±0,2 4,42±0,08 9,57±0,09
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.20 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.20, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 2.2
lần so với đối chứng.
Bảng 3.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. harveyi (tính trên LOG10
CFU/ mL)
Thời gian
(ngày)
Mật độ chủng vi khuẩn thử nghiệm
F33 10 5 F33 10 7 F33 10 8 F33 10 9 DC
0 2,87±0,29 2,86±0,22 2,13±0,03 2,29±0,01 4,74±0,03
1 8,34±0,03 8,52±0,08 8,57±0,15 8,19±0,01 9,37±0,35
2 7,97±0,49 7,98±0,25 8,09±0,05 7,61±0,27 10,31±0,42
3 7,51±0,31 7,68±0,06 7,60±0,03 7,22±0,20 9,27±0,49
4 7,60 ±0,22 7,09±0,40 7,25±0,34 7,22±0,05 9,5±0,08
5 7,58±0,34 7,41±0,20 7,03±0,01 6,15±0,12 9,4±0,02
6 7,53 ±0,31 7,36±0,02 7,64±0,27 5,09±0,01 9,62±0,2
7 7,56±0,10 6,88±0,10 6,27±0,05 4,02±0,05 9,57±0,09
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Biểu đồ 3.21 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở
những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.21, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (105, 107, 108,
109 CFU/mL ) đều có khả năng đối kháng với V. harveyi, đặc biệt ở mật đô 109
CFU/mL là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm gấp 2.4
lần so với đối chứng.
Nhận xét
Chúng tôi nhận thấy rằng 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) ở những
mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V. harveyi thì hầu
như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ 109
CFU/mL.
Nhìn chung sau 1 đến 2 đầu mật độ vi khuẩn gây bệnh tăng gần giống như đối
chứng sau đó mới bắt đầu giảm mạnh và có sự khác biệt rõ ràng do chất ức chế được
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
tiết ra trong ngày đầu còn ít chưa đủ ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ đó chúng tôi thấy
rằng 6 chủng Bacillus trên có khả năng ức chế tốt V. harveyi sau 24 - 48 giờ.
Chúng tôi nhận thấy rằng 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) ở những
mật độ khác nhau 105, 107, 108, 109 CFU/mL khi đồng nuôi cấy với V. harveyi thì hầu
như ở cả 4 mật độ đều ức chế vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ức chế mạnh ở mật độ 109
CFU/mL.
Trong 6 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chủng F33 là đối kháng mạnh nhất với V.
harveyi thể hiện qua mật độ vi khuẩn gây bệnh vào ngày thứ 7 giảm gấp 2.4 lần so với
đối chứng (ở mật đô Bacillus 109 CFU/mL). Trong khi các chủng khác chỉ giảm từ 1.9
- 2.2 lần
Nhìn chung 6 chủng vi khuẩn (F2, F10, F11, F27, F28, F33) đều có khả năng đối
kháng tốt với 3 chủng V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi, trong đó đối
kháng mạnh nhất với V.harveyi, sau đó tới V.alginolyticus và yếu nhất đối với
V.parahaemolyticus. Kết quả của thử nghiệm trên cũng cho thấy rằng Bacillus có khả
năng ức chế tốt với sự tăng trưởng của Vibrio sau 1 - 2 ngày. Điều này phù hợp với kết
quả của thử nghiệm đối kháng.
Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus sp đã cho thấy rằng chúng có thể làm
giảm vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Như báo cáo của Vaseeharan và
Ramasamy (2003), đã sử dụng Bacillus subtilis BT23 để kiểm soát V. harveyi[27] ,
Rengpipat S và cs (1998) đã sử dụng Bacillus S11 để kiểm soát tác nhân gây bệnh V.
harveyi [24], và trong một báo cáo khác của Jose Luis Balcazar và Tyrone Rojas-
Luna (2007) cho thấy Bacillus subtilis UTM 126 có khả năng ức chế 3 chủng
V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi [14]. Trong thử nghiệm của tôi chủng
vi khuẩn Bacillus cũng có khả năng kiểm soát sự tăng trưởng của 3 chủng vi khuẩn
gây bệnh là V.parahaemolyticus, V. alginolyticus, V.harveyi ở mật độ Bacillus là 105,
107, 108, 109 CFU/mL. Vì vậy sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus sp. có thể bảo vệ các
loài thủy sản đối với các bệnh do vi khuẩn gây ra và có thể ứng dụng sản xuất probiotic
trong nuôi trồng thủy sản.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 3.17 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ
107 ở ngày 5
3.4 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS:
3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết
Chúng tôi tiến hành thử khả năng sinh hemolysin của 6 chủng (F2, F10, F11, F27,
F28, F33). Đây là bước sàng lọc sơ bộ tính an toàn của các chủng thử nghiệm. Kết quả
được thể hiện ở bảng 3.22.
Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết
Chủng Hemolysin
F2 α
F10 γ
F11 γ
F27 γ
F28 α
F33 α
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ghi chú:
α tan máu không hoàn toàn
γ không tan máu
Nhận xét
Trong 6 chủng thử khả năng sinh hemolysin thì có 3 chủng gây tan máu không
hoàn toàn (F2, F28, F33), 3 chủng không gây tan máu (F10, F11, F27) và không có chủng
nào gây tan máu hoàn toàn.
Theo WHO/FAO thử nghiệm hemolysin là một bước sàng lọc tính gây bệnh của
các chủng để đảm bảo tính an toàn của probiotic.
Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm tính an toàn của Bacillus, trong đó nghiên
cứu của Shafiqur và cs (2009) về Bacillus phân lập được từ ao tôm tỉ lệ dương tính
hemolysin là 51%.[26]
Hình 3.18 Kết quả thử khả năng gây dung huyết
3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng
tôm sú
Ở thí nghiệm này ta nghiên cứu ảnh hưởng của 6 chủng Bacillus (F10, F2, F28,
F11, F27, F33) lên ấu trùng tôm. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được lặp lại 6 lần.
Mật độ vi khuẩn thử nghiệm bổ sung là 106 tế bào/mL. Sau 24 giờ theo dõi ta thu được
kết quả sau:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus
Chủng Tỷ lệ sống( %)
ĐC (không vi
khuẩn) 45,56±8,74
F10 23,61±7,48
F2 19,72±8,47
F28 19,17±11,27
F11 42,22±8,17
F27 34,72±3,56
F33 21,94±6,36
Biểu đồ 3.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các chữ cái giống nhau cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê .
Kết quả thí nghiệm cho thấy có 6 chủng Bacillus (F10, F2, F28, F11, F27, F33)
không có sự khác biệt so với đối chứng (P>0.05) nên 6 chủng trên an toàn với ấu trùng
tôm sú.
Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2009)
về nghiên cứu tính an toàn của một số chủng vi khuẩn lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm
sú, các chủng vi khuẩn an toàn cho ấu trùng tôm đều không có khác biệt về tỷ lệ sống
so với đối chứng về mặt thống kê sau 24 giờ thí nghiệm.[11]
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 4.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1 KẾT LUẬN
Đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được kết quả như sau.
Tái phân lập sơ bộ được 25 chủng Bacillus. Sau thử nghiệm đối kháng với 3
chủng Vibrio gây bệnh cho tôm chúng tôi nhận thấy có 7 chủng vi khuẩn (F4, F12, F21,
F34, T1, T4, T12) không đối kháng với cả 3 vi khuẩn gây bệnh đang khảo sát. 18 chủng vi
khuẩn (F2, F3, F5, F6, F7, F10, F11, F13, F14, F17, F26, F27, F28, F33, F35, F36, T5, T9) có khả năng
đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Trong đó 13 chủng được quan tâm nhất (F2, F5, F6, F7,
F11, F27, F28, F33, F10, F17, F36, T5, T9) có khả năng đối kháng với cả 3 chủng vi khuẩn gây
bệnh .
Từ 13 chủng trên chúng tôi chọn được 6 chủng (F2, F10, F11, F27, F28, F33) tiến
hành đồng nuôi cấy với lần lượt 3 chủng vi khuẩn gây bệnh V. parahaemoluticus, V.
aginolyticus và V. harveyi. Kết quả cho thấy 6 chủng đều có khả năng kiểm soát sự
tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh.
Kết quả của thử nghiệm tính an toàn cho thấy 6 chủng Bacillus ( F10, F2, F28, F11,
F27, F33) gây tan máu yếu hoặc không gây tan máu và an toàn đối với ấu trùng tôm,
được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo và có tiềm năng lớn để làm probiotic
cho tôm.
4.2 KIẾN NGHỊ
Để hoàn thiện kết quả nghiên cứu và ứng dụng được trong thực tiễn chúng tôi
đưa ra một số đề nghị sau:
Khảo sát các đặc tính ứng dụng làm probiotic
Định danh chính xác các chủng Bacillus
Từ kết quả thí nghiệm 6 chủng Bacillus an toàn đối với ấu trùng tôm cần tiến
hành thí nghiệm về khả năng bảo vệ ấu trùng tôm đã gây nhiễm trước đó bởi các chủng
Vibrio. Sau đó lựa chọn những chủng vi khuẩn có tiềm năng để thí nghiệm với quy mô
lớn hơn.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tiến hành tối ưu hóa môi trường cho các chủng Bacillus để ứng dụng sản xuất
chế phẩm vi sinh.
Dựa vào kết quả của những thí nghiệm trên, chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất
đưa vào ứng dụng thực tiễn sản xuất chế phẩm vi sinh phòng và trị bệnh trên tôm.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
TÀI LIỆU THAM KHẢOTIẾNG VIỆT
[1]. Tô Minh Châu, Phan Hữu Nghĩa, Nguyễn Văn Minh, (2006), Thực hành Vi sinh
cơ sở, Trường đại học Mở TPHCM.
[2]. Nguyễn Văn Hảo, Một số hiểu biết cần thiết về bệnh ở tôm, NXB Nông nghiệp.
[3]. Nguyễn Văn Hảo, (2003), Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại
Việt Nam, Viện NCNTTS II, pp.
[4]. Mai Nguyệt Thu Hồng, (2006), Giám định vi sinh vật học.
[5]. Nguyễn Văn Minh ,Dương Nhật Linh và cs., (2010), Phân lập và sàng lọc một
số vi khuẩn tiềm năng làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản từ trùn quế
(Perionyx excavatus), Hội Nghị CNSH Thủy sản toàn quốc, pp.
[6]. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Thị Kiều Trang, và Trương Quốc Phú, Biến động
mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghép với cá rô phi đỏ
ở Sóc Trăng, pp.
[7]. Trần Thị Tâm, Bệnh thường gặp ở tôm, NXB Nông nghiệp.
[8]. Nguyễn Văn Thanh ,Trần Cát Đông, (2006), Công nghệ sinh học dược, Đại học
Y Dược TP.HCM.
[9]. Võ Thị Thứ (2006), Hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh
học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản: Hà Nội.
[10]. Trần Linh Thước, (2008), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm, nxb giáo dục.
[11]. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chủng vi
khuẩn lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú và cá chẽm hương trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
TIẾNG ANH
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
[12]. Aroson A. I. ,Fitz-Jame P., (1976), Structure and morphogeniesis of the
bacterial spore coat, Bacteriol. Rev 40, pp.360-402.
[13]. Jose ´ Luis Balca ´zar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, David
Cunningham, Daniel Vendrell, Jose ´ Luis Mu ´zquiz, (2006), The role of
probiotics in aquaculture, Veterinary Microbiology 114, pp.173-186.
[14]. Jose Luis Balcazar ,Tyrone Roja-Luna, (2007), Inhibitory activity of Probiotic
Bacillus subtilis UTM 126 against Vibrio Species confers protection against
Vibriosis in Juvenle Shrimp (Litopeaneaus vannamiei), Current Microbiology
55, pp.409-412.
[15]. Abel Antonio Carrias, (2011), Evaluation of Biological Agents for Controlling
Enteric Septicemia of Catfish pp.
[16]. Vichai Domrongpokkaphan ,and Penkhae Wanchaitanawong, (2006), In vitro
Antimicrobial Activity of Bacillus spp. Against Pathogenic
Vibrio spp. in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon), Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40, pp.
949 - 957.
[17]. Drisks.A., (1999), Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular
Biology Review 63, pp.1-20.
[18]. Karunasagar I. ,B. Kennedy M. Vinod, A. Vijay, A. Deepanjali, K. Umesh and
I. Karunasagar, (2005), Biocontrol of Bacterial Pathogens in Aquaculture with
Emphasis on Phage Therapy, Diseases in Asian Aquaculture V, pp.535-542.
[19]. Meunpola Oraporn ,E-mail The Corresponding Author Corresponding Author
Contact Information, Kanyajit Lopinyosiri and PiamsakMenasveta, (2002), The
effects of ozone and probiotics on the survival of black tiger shrimp (Penaeus
monodon) pp.
[20]. Moriarty D. J. W. ,và cs, (2005), Probiotics in aquaculture, AQUA Culture
AsiaPacific Magazine, pp.14-16.
[21]. Moriarty David J. W., Disease Control in Shrimp Aquaculture with Probiotic
Bacteria, pp.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
[22]. Đặng Thị Hoàng Oanh, Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thanh Phương, The Effects of
Probiotics on Culture Conditions of Freshwater Prawn (Macrobrachium
rosenbergii) Larvae
Institute for Marine Aquaculture, College of Agriculture,Can Tho Unversity, Can Tho,
Vietnam pp.1-7.
[23]. Venkateswara Rao, Vibriosis in Shrimp Aquaculture, pp.1-9.
[24]. Rengpipat S., Piyatiratitivorakul S., Phianpaik W., Menasveta P., (1998), Effects
of probiotic bacterium on black tiger shrimp Peanaeus monodon survial and
growth, Aquaculture 167, pp.301-313.
[25]. Maloy Kumar Sahu, Swarnakumar N.S., Sivakumar K., Thangaradjou T.,
Kannan L., (2008), Probiotics in aquaculture: importance and future
perspectives, Indian J. Microbio, pp.
[26]. Shafiqur R. ,Niamul N. M. Shakila N. K., and Manjurul K. M., , (2009),
Application of probiotic bacteria: A novel approach towards ensuring food
safety in shrimp aquaculture, Journal of Bangladesh Academy of Sciences
33(1), pp.139-144.
[27]. Vaseeharan B. ,Ramasamy P., (2003), Control of pathogenic Vibrio spp. by
Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp
Penaeus monodon, Lett Appl Microbiol 36(2), pp.83-87.
[28]. Verschuere L. ,Sorgeloos P. Rombaut G., And Verstraete W., (2000), Probiotic
Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture, Microbiology and
Molecular Biology Reviews 64(4), pp.655–671.
[29]. Laurent Vershuere, Geert Rombaut, Patrick Sorgeloss, Willy Verstraete, (2000),
Probiotic Bacteria as Biological Control Agent in Aquaculture, Microbiology
and Molecular Biology Reviews 64(4), pp.655-671.
INTERNET
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
[30]. http://www.alken-murray.com/China98.htm, Application of Probiotics in
Aquaculture
[31]. http://www.tomboyaquafeed.com/benhdovidrio.htm, Bệnh do Vibrio trên tôm
lớn
[32]. http://haiduongdost.gov.vn/index, Chế phẩm sinh học từ trùn quế
[33]. http://agriviet.com/nd/620-dac-diem-sinh-hoc-va-hinh-thai-cua-tom-su/, Đặc
điểm sinh học và hình thái của tôm sú
[34]. http://www.ciren.gov.vn
[35]. http://www.hoasinhvietnam.com.vn
[36]. http://www.Nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2K6-08.htm
[37]. http://www.trunque.net/?frame=news_detail&id=35
[38]. http://thusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Ky-thuat-nuoi-trun-que, Kỹ thuật nuôi
trùn quế
[39]. http://www.monre.gov.vn/v35/default.aspx?
tabid=428&cateID=24&id=22323&code=1RTQG22323, Sóc Trăng phát triển
nuôi tôm bằng công nghệ sinh học theo hướng bền vững
[40]. http://thuysan2.forumvi.com/t153-topic, Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi
trồng thủy sản
[41]. http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4m_s%C3%BA, Tôm sú
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm thử tính đối
kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp.
Anova: Single Factor
VP-24
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 0 0.00 0.00
F10 3 29 9.67 2.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 19 6.33 0.33
F17 3 0 0.00 0.00
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 30 10.00 3.00
F33 3 0 0.00 0.00
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 0 0.00 0.00
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 29 9.67 4.33
F11 3 0 0.00 0.00
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 0 0.00 0.00
F2 3 21 7.00 37.00
F3 3 0 0.00 0.00
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 26 8.67 0.33
F7 3 28 9.33 1.33
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 30 10.00 0.00
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1315.413 24 54.80889 28.15525
2.55E-
21 1.73708
Within Groups 97.33333 50 1.946667
Total 1412.747 74
Anova: Single Factor
VP-48
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 16 5.33 0.33
F10 3 46 15.33 0.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 29 9.67 6.33
F17 3 0 0.00 0.00
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 32 10.67 5.33
F33 3 0 0.00 0.00
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 0 0.00 0.00
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 29 9.67 0.33
F11 3 19 6.33 2.33
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 27 9.00 4.00
F2 3 29 9.67 0.33
F3 3 29 9.67 0.33
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 37 12.33 2.33
F7 3 39 13.00 0.00
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 49 16.33 30.33
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2444.853 24 101.8689 48.66348
8.32E-
27 1.73708
Within Groups 104.6667 50 2.093333
Total 2549.52 74
Anova: Single Factor
VP-72
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 45 15.00 1.00
F10 3 90 30.00 1.00
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 38 12.67 0.33
F17 3 36 12.00 1.00
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 26 8.67 8.33
F33 3 41 13.67 1.33
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 44 14.67 1.33
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 20 6.67 0.33
F11 3 44 14.67 0.33
F14 3 61 20.33 1.33
F27 3 41 13.67 2.33
F2 3 33 11.00 4.00
F3 3 34 11.33 97.33
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 35 11.67 12.33
F7 3 70 23.33 2.33
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 43 14.33 1.33
T9 3 64 21.33 1.33
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 5267.333 24 219.4722 39.95247 8.4E-25 1.73708
Within Groups 274.6667 50 5.493333
Total 5542 74
Anova: Single Factor
VA-24
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 0 0.00 0.00
F10 3 44 14.67 0.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 0 0.00 0.00
F17 3 0 0.00 0.00
F21 2 0 0.00 0.00
F26 3 0 0.00 0.00
F33 3 49 16.33 1.33
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 28 9.33 2.33
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 48 16.00 1.00
F11 3 30 10.00 1.00
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 36 12.00 4.00
F2 3 30 10.00 0.00
F3 3 0 0.00 0.00
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 30 10.00 1.00
F7 3 0 0.00 0.00
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 0 0.00 0.00
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2630.986 24 109.6244 244.1635
4.68E-
43 1.74162
Within Groups 22 49 0.44898
Total 2652.986 73
Anova: Single Factor
VA-48
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 0 0.00 0.00
F10 3 0 0.00 0.00
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 0 0.00 0.00
F17 3 0 0.00 0.00
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 0 0.00 0.00
F33 3 45 15.00 0.00
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 33 11.00 7.00
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 56 18.67 0.33
F11 3 46 15.33 2.33
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 46 15.33 1.33
F2 3 36 12.00 3.00
F3 3 0 0.00 0.00
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 21 7.00 37.00
F7 3 0 0.00 0.00
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 0 0.00 0.00
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3005.147 24 125.2144 61.37963 3.4E-29 1.73708
Within Groups 102 50 2.04
Total 3107.147 74
Anova: Single Factor
VA-72
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00 0.00
F5 3 0 0.00 0.00 0.00
F10 3 32 10.67 4.33 1.20
F12 3 0 0.00 0.00 0.00
F13 3 0 0.00 0.00 0.00
F17 3 69 23.00 1.00 0.58
F21 3 0 0.00 0.00 0.00
F26 3 0 0.00 0.00 0.00
F33 3 37 12.33 5.33 1.33
F35 3 0 0.00 0.00 0.00
F36 3 43 14.33 1.33 0.67
T4 3 0 0.00 0.00 0.00
F28 3 54 18.00 1.00 0.58
F11 3 49 16.33 1.33 0.67
F14 3 22 7.33 2.33 0.88
F27 3 42 14.00 1.00 0.58
F2 3 40 13.33 4.33 1.20
F3 3 0 0.00 0.00 0.00
F34 3 0 0.00 0.00 0.00
F6 3 44 14.67 0.33 0.33
F7 3 25 8.33 0.33 0.33
T1 3 0 0.00 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00 0.00
T5 3 8 2.67 21.33 2.67
T9 3 31 10.33 4.33 1.20
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3971.12 24 165.4633 85.58448 1.16E- 1.73708
32
Within Groups 96.66667 50 1.933333
Total 4067.787 74
Anova: Single Factor
VH-24
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 2 0 0.00 0.00
F5 3 46 15.33 2.33
F10 3 64 21.33 1.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 33 11.00 1.00
F17 3 71 23.67 0.33
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 31 10.33 0.33
F33 3 0 0.00 0.00
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 44 14.67 9.33
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 64 21.33 2.33
F11 3 61 20.33 0.33
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 45 15.00 189.00
F2 3 25 8.33 52.33
F3 3 32 10.67 1.33
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 42 14.00 0.00
F7 3 62 20.67 0.33
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 37 12.33 0.33
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 5402.572 24 225.1072 21.15777
2.62E-
18 1.74162
Within Groups 521.3333 49 10.63946
Total 5923.905 73
Anova: Single Factor
VH-48
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 62 20.67 0.33
F10 3 73 24.33 0.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 49 16.33 0.33
F17 3 88 29.33 0.33
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 42 14.00 1.00
F33 3 82 27.33 2.33
F35 3 0 0.00 0.00
F36 3 44 14.67 2.33
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 71 23.67 4.33
F11 3 69 23.00 1.00
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 69 23.00 9.00
F2 3 66 22.00 31.00
F3 3 42 14.00 1.00
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 56 18.67 0.33
F7 3 45 15.00 1.00
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 17 5.67 96.33
T9 3 52 17.33 64.33
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 8068.613 24 336.1922 39.0316
1.44E-
24 1.73708
Within Groups 430.6667 50 8.613333
Total 8499.28 74
Anova: Single Factor
VH-72
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
F4 3 0 0.00 0.00
F5 3 69 23.00 1.00
F10 3 97 32.33 1.33
F12 3 0 0.00 0.00
F13 3 52 17.33 0.33
F17 3 74 24.67 2.33
F21 3 0 0.00 0.00
F26 3 45 15.00 1.00
F33 3 68 22.67 6.33
F35 3 57 19.00 1.00
F36 3 57 19.00 3.00
T4 3 0 0.00 0.00
F28 3 64 21.33 0.33
F11 3 62 20.67 1.33
F14 3 0 0.00 0.00
F27 3 63 21.00 13.00
F2 3 64 21.33 17.33
F3 3 54 18.00 252.00
F34 3 0 0.00 0.00
F6 3 37 12.33 144.33
F7 3 57 19.00 0.00
T1 3 0 0.00 0.00
T12 3 0 0.00 0.00
T5 3 0 0.00 0.00
T9 3 60 20.00 9.00
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 8073.333 24 336.3889 18.53723
2.53E-
17 1.73708
Within Groups 907.3333 50 18.14667
Total 8980.667 74
Phụ lục 2: Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm đồng nuôi cấy.
Anova: Single Factor
P33 OH
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 10.31857 3.439524 0.093206
P33- 10^7 3 9.629715 3.209905 0.042058
P33- 10^8 3 8.994032 2.998011 4E-05
P33- 10^9 3 10.38382 3.461274 0.023206
DC P 3 11.53865 3.846215 0.003389
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.20525 4 0.301313 9.305568 0.002104 3.47805
Within Groups 0.323798 10 0.03238
Total 1.529048 14
Anova: Single Factor
P33 -1H
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 29.73877 9.912925 0.046953
P33- 10^7 3 28.69577 9.565257 0.27181
P33- 10^8 3 24.29866 8.099554 0.103613
P33- 10^9 3 24.30013 8.100042 0.000428
DC P 3 30.64052 10.21351 1.59E-05
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 12.26218 4 3.065545 36.25117
6.34E-
06 3.47805
Within Groups 0.84564 10 0.084564
Total 13.10782 14
Anova: Single Factor
P33-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 31.92179 10.6406 0.016796
P33- 10^7 3 30.55694 10.18565 0.009867
P33- 10^8 3 24.43185 8.143949 0.082403
P33- 10^9 3 26.71999 8.906665 0.00943
DC P 3 30.77074 10.25691 0.023139
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13.36374 4 3.340936 117.9406
2.27E-
08 3.47805
Within Groups 0.283273 10 0.028327
Total 13.64702 14
Anova: Single Factor
P33-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 31.65271 10.5509 0.189537
P33- 10^7 3 29.18331 9.727768 0.096583
P33- 10^8 3 23.06118 7.68706 0.063752
P33- 10^9 3 24.29208 8.097361 0.102389
DC P 3 31.66814 10.55605 0.008224
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 22.11143 4 5.527858 60.02212 5.93E- 3.47805
07
Within Groups 0.92097 10 0.092097
Total 23.0324 14
Anova: Single Factor
P33-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 29.15728 9.719092 0.051002
P33- 10^7 3 26.79972 8.93324 0.001643
P33- 10^8 3 22.7686 7.589534 0.002
P33- 10^9 3 21.43458 7.144861 0.003686
DC P 3 33.31806 11.10602 0.010463
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 31.00911 4 7.752278 563.4353
1.01E-
11 3.47805
Within Groups 0.13759 10 0.013759
Total 31.1467 14
Anova: Single Factor
P33-5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 22.6966 7.565534 0.003492
P33- 10^7 3 23.62021 7.873405 0.002164
P33- 10^8 3 22.40934 7.46978 5.42E-05
P33- 10^9 3 20.76492 6.92164 6.09E-05
DC P 3 33.86157 11.28719 0.066678
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 36.61384 4 9.153459 631.707
5.69E-
12 3.47805
Within Groups 0.1449 10 0.01449
Total 36.75874 14
Anova: Single Factor
P33-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 23.07373 7.691243 0.004406
P33- 10^7 3 22.99827 7.666091 0.001779
P33- 10^8 3 24.52151 8.173838 0.353656
P33- 10^9 3 19.84073 6.613578 0.04095
DC P 3 33.79073 11.26358 0.00162
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 37.24041 4 9.310102 115.679
2.5E-
08 3.47805
Within Groups 0.804822 10 0.080482
Total 38.04523 14
Anova: Single Factor
P33-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
P33- 10^5 3 23.96627 7.988757 0.071863
P33- 10^7 3 22.77291 7.590969 0.000124
P33- 10^8 3 22.33925 7.446418 0.000966
P33- 10^9 3 18.77472 6.25824 0.01814
DC P 3 32.03663 10.67888 0.027094
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 32.05117 4 8.012792 338.9897
1.25E-
10 3.47805
Within Groups 0.236373 10 0.023637
Total 32.28754 14
Anova: Single Factor
H33 0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 8.624225 2.874742 0.245281
H33-10^7 3 8.572639 2.857546 0.139162
H33-10^8 3 6.376548 2.125516 0.002076
H33-10^9 3 6.869818 2.289939 0.000124
DCH 3 9.899273 3.299758 0.38378
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2.738086 4 0.684521 4.442504 0.025428 3.47805
Within Groups 1.540846 10 0.154085
Total 4.278932 14
Anova: Single Factor
H33 1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 25.01912 8.339705 0.003557
H33-10^7 3 25.54642 8.515473 0.021433
H33-10^8 3 25.70204 8.567346 0.067114
H33-10^9 3 24.57909 8.193029 0.000124
DCH 3 27.12755 9.042517 1.376049
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.242082 4 0.310521 1.057432 0.426146 3.47805
Within Groups 2.936554 10 0.293655
Total 4.178636 14
Anova: Single Factor
H33- 2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 23.91381 7.971271 0.728595
H33-10^7 3 23.94052 7.980172 0.183821
H33-10^8 3 24.273 8.091 0.007778
H33-10^9 3 22.83136 7.610454 0.224629
DCH 3 24.8169 8.272301 0.728595
ANOVA
Source of SS df MS F P-value F crit
Variation
Between Groups 0.702825 4 0.175706 0.468945 0.757673 3.47805
Within Groups 3.746837 10 0.374684
Total 4.449662 14
Anova: Single Factor
H33-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 22.54386 7.51462 0.190776
H33-10^7 3 23.04813 7.68271 0.009879
H33-10^8 3 22.79934 7.59978 0.002982
H33-10^9 3 21.64521 7.21507 0.11428
DCH 3 25.1284 8.376133 0.46897
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2.203581 4 0.550895 3.500472 0.049171 3.47805
Within Groups 1.573774 10 0.157377
Total 3.777355 14
Anova: Single Factor
H33-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 22.81154 7.603848 0.14487
H33-10^7 3 21.28074 7.093578 0.490861
H33-10^8 3 21.74139 7.24713 0.352293
H33-10^9 3 21.66572 7.221906 0.007873
DCH 3 25.48777 8.495925 0.021368
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3.911505 4 0.977876 4.806398 0.020117 3.47805
Within Groups 2.03453 10 0.203453
Total 5.946034 14
Anova: Single Factor
H33- 5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 22.74191 7.580635 0.35176
H33-10^7 3 22.21527 7.405089 0.115276
H33-10^8 3 21.08781 7.02927 0.000148
H33-10^9 3 18.43521 6.145071 0.046789
DCH 3 25.19103 8.397011 0.001213
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 8.099208 4 2.024802 19.6512
9.95E-
05 3.47805
Within Groups 1.030371 10 0.103037
Total 9.129579 14
Anova: Single Factor
H33-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 22.58877 7.52959 0.292104
H33-10^7 3 22.08189 7.360629 0.001434
H33-10^8 3 22.91335 7.637784 0.216205
H33-10^9 3 15.27981 5.093271 0.000196
DCH 3 25.8485 8.616166 0.123695
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 20.27593 4 5.068982 39.99925
4.02E-
06 3.47805
Within Groups 1.267269 10 0.126727
Total 21.5432 14
Anova: Single Factor
h33- 7d
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
H33-10^5 3 22.676 7.558666 0.028524
H33-10^7 3 20.64521 6.881737 0.032658
H33-10^8 3 18.81657 6.272191 0.008648
H33-10^9 3 12.04752 4.015839 0.007035
DCH 3 25.71328 8.571093 0.026923
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 34.95308 4 8.73827 420.9709
4.28E-
11 3.47805
Within Groups 0.207574 10 0.020757
Total 35.16066 14
Anova: Single Factor
A33-0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 10.3631 3.4544 0.4473
A33-10^7 3 9.1418 3.0473 0.0000
A33-10^8 3 10.1502 3.3834 0.1361
A33-10^9 3 11.3016 3.7672 0.0623
DCA 3 11.7383 3.9128 0.0014
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups
1.38465789
7 4
0.3461644
7
2.6743359
3
0.0943676
1
3.47804969
1
Within Groups
1.29439413
6 10
0.1294394
1
Total
2.67905203
3 14
Anova: Single Factor
A33-1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 30.4323 10.1441 0.3519
A33-10^7 3 27.9381 9.3127 0.1739
A33-10^8 3 28.3742 9.4581 0.1878
A33-10^9 3 27.8992 9.2997 0.1443
DCA 3 29.1890 9.7297 0.1906
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups 1.5153023 4
0.3788255
8
1.8064035
3 0.2042284
3.47804969
1
Within Groups
2.09712596
6 10 0.2097126
Total
3.61242826
6 14
Anova: Single Factor
A33- 2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 31.3144 10.4381 0.0016
A33-10^7 3 26.4186 8.8062 0.0449
A33-10^8 3 28.7884 9.5961 1.2675
A33-10^9 3 28.0484 9.3495 0.0023
DCA 3 33.7346 11.2449 0.0269
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 11.0676642 4 2.766916062 10.29969828 0.001427909 3.478049691
Within Groups 2.68640497 10 0.268640497
Total 13.7540692 14
Anova: Single Factor
A33- 3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 24.0969 8.0323 0.0937
A33-10^7 3 26.2774 8.7591 0.0407
A33-10^8 3 22.8983 7.6328 0.0009
A33-10^9 3 25.5148 8.5049 0.0217
DCA 3 35.1045 11.7015 0.0137
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups
31.1390813
2 4
7.7847703
3
227.92753
5
8.9379E-
10
3.47804969
1
Within Groups
0.34154584
8 10
0.0341545
8
Total
31.4806271
7 14
Anova: Single Factor
A33-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 24.1964 8.0655 0.0036
A33-10^7 3 23.5008 7.8336 0.0322
A33-10^8 3 24.2888 8.0963 0.1018
A33-10^9 3 24.9273 8.3091 0.0691
DCA 3 39.0067 13.0022 0.0341
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups
58.5812233
3 4
14.645305
8
304.13437
3
2.1468E-
10
3.47804969
1
Within Groups 0.48154063 10 0.0481540
2 6
Total
59.0627639
6 14
Anova: Single Factor
A33-5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 23.2943 7.7648 0.0031
A33-10^7 3 24.3388 8.1129 0.3073
A33-10^8 3 23.2079 7.7360 0.0644
A33-10^9 3 22.6644 7.5548 0.0179
DCA 3 35.1412 11.7137 0.0761
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups
37.3989671
8 4
9.3497417
9
99.697594
3
5.1488E-
08
3.47804969
1
Within Groups
0.93781017
1 10
0.0937810
2
Total
38.3367773
5 14
Anova: Single Factor
A33- 6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 25.0125 8.3375 0.0038
A33-10^7 3 24.8746 8.2915 0.0813
A33-10^8 3 20.7200 6.9067 0.0094
A33-10^9 3 20.9182 6.9727 0.0005
DCA 3 35.0543 11.6848 0.0249
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 45.1953254 4 11.29883136 470.6788197
2.45928E-
11 3.47804969
Within Groups 0.24005396 10 0.024005396
Total 45.4353794 14
Anova: Single Factor
A33-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
A33-10^5 3 22.8357 7.6119 0.0292
A33-10^7 3 21.7816 7.2605 0.0213
A33-10^8 3 19.4294 6.4765 0.0008
A33-10^9 3 20.5038 6.8346 0.0097
DCA 3 34.1514 11.3838 0.0000
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between
Groups
47.3683842
8 4
11.842096
1
969.49930
3
6.7389E-
13
3.47804969
1
Within Groups
0.12214651
5 10
0.0122146
5
Total
47.4905307
9 14
Anova: Single Factor
P21-0 d
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 9.084576 3.028192 0.24405
10 7 3 8.643453 2.881151 0.029674
10 8 3 11.03663 3.678876 0.027094
10 9 3 10.09018 3.363392 0.000287
DC 3 8.857332 2.952444 0.00235
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.339935 4 0.334984 5.51949 0.013076 3.47805
Within Groups 0.606911 10 0.060691
Total 1.946846 14
Anova: Single Factor
P21-1 d
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 23.86529 7.955098 0.043546
10 7 3 23.17125 7.723751 0.011429
10 8 3 27.51255 9.17085 0.026241
10 9 3 25.39933 8.466443 0.580748
DC 3 27.89676 9.298921 0.371628
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 5.958823 4 1.489706 7.206444 0.005341 3.47805
Within Groups 2.067186 10 0.206719
Total 8.026009 14
Anova: Single Factor
P21- 2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.20217 9.734058 0.013571
10 7 3 28.79473 9.598244 0.444778
10 8 3 25.74036 8.580121 0.269258
10 9 3 25.89856 8.632854 0.007414
DC 3 27.17301 9.057671 0.046919
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3.415347 4 0.853837 5.45973 0.013539 3.47805
Within Groups 1.563881 10 0.156388
Total 4.979229 14
Anova: Single Factor
P21-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 21.37153 7.123842 0.16067
10 7 3 23.71956 7.906521 0.361207
10 8 3 21.08591 7.028638 0.31606
10 9 3 20.29003 6.763345 0.070193
DC 3 31.35689 10.4523 0.237942
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 27.47334 4 6.868336 29.96467 1.52E-05 3.47805
Within Groups 2.292145 10 0.229214
Total 29.76549 14
Anova: Single Factor
P21-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 20.87453 6.958176 1.401518
10 7 3 20.93197 6.977322 0.000524
10 8 3 23.76104 7.920347 0.085877
10 9 3 20.57349 6.857831 0.003281
DC 3 33.18127 11.06042 0.000357
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 38.39445 4 9.598613 32.1765 1.1E-05 3.47805
Within Groups 2.983113 10 0.298311
Total 41.37757 14
Anova: Single Factor
P21-5 D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 20.8841 6.961365 0.012509
10 7 3 23.09621 7.698738 0.000302
10 8 3 20.31234 6.770779 0.004902
10 9 3 19.66082 6.553606 0.118746
DC 3 34.04062 11.34687 0.000597
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 47.6541 4 11.91353 434.6226 3.65E-11 3.47805
Within Groups 0.274112 10 0.027411
Total 47.92821 14
Anova: Single Factor
P21-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 21.40903 7.136342 0.000493 0.012824
10 7 3 20.54322 6.847741 0.00461 0.039202
10 8 3 18.01143 6.00381 0.000667 0.014915
10 9 3 15.32842 5.109473 0.010298 0.058588
DC 3 30.3195 10.1065 0.137325 0.213951
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 42.75085 4 10.68771 348.3754 1.1E-10 3.47805
Within Groups 0.306787 10 0.030679
Total 43.05764 14
Anova: Single Factor
P21-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 18.37892 6.126306 2.177144
10 7 3 17.05496 5.684986 0.000986
10 8 3 15.53339 5.177795 0.009092
10 9 3 14.93799 4.979331 0.000877
DC 3 27.90292 9.300974 0.03015
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 37.22139 4 9.305347 20.97453 7.49E-05 3.47805
Within Groups 4.436499 10 0.44365
Total 41.65789 14
Anova: Single Factor
A2-0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 8.603821 2.86794 0.088762
10 7 3 9.916454 3.305485 0.293219
10 8 3 9.280152 3.093384 4.91E-05
10 9 3 7.176091 2.39203 0.12757
DC 3 11.73827 3.912755 0.001382
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3.770658 4 0.942664 9.224051 0.002175 3.47805
Within Groups 1.021964 10 0.102196
Total 4.792622 14
Anova: Single Factor
A2- 1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.78322 9.927741 0.005544
10 7 3 27.46582 9.155272 0.012017
10 8 3 28.84366 9.614552 0.230934
10 9 3 28.34805 9.449351 0.007226
DC 3 29.18897 9.729656 0.190605
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.025604 4 0.256401 2.872343 0.080156 3.47805
Within Groups 0.892655 10 0.089265
Total 1.918259 14
Anova: Single Factor
A2-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 30.84847 10.28282 0.008028
10 7 3 31.30033 10.43344 0.105242
10 8 3 35.87286 11.95762 0.001859
10 9 3 27.60552 9.20184 0.002982
DC 3 33.73464 11.24488 0.026877
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13.01785 4 3.254461 112.2331 2.89E-08 3.47805
Within Groups 0.289973 10 0.028997
Total 13.30782 14
Anova: Single Factor
A2- 3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 33.82291 11.2743 0.002825
10 7 3 33.8253 11.2751 0.004792
10 8 3 34.14428 11.38143 0.005487
10 9 3 34.12181 11.37394 0.003457
DC 3 35.1045 11.7015 0.013667
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 0.36996 4 0.09249 15.29933 0.00029 3.47805
Within Groups 0.060454 10 0.006045
Total 0.430413 14
Anova: Single Factor
A2-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.71791 9.90597 0.094871
10 7 3 28.64972 9.549908 0.074164
10 8 3 29.41091 9.803637 0.147688
10 9 3 26.05496 8.684986 0.000986
DC 3 39.00672 13.00224 0.034146
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 32.44025 4 8.110064 115.247 2.54E-08 3.47805
Within Groups 0.703712 10 0.070371
Total 33.14397 14
Anova: Single Factor
A2- 5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 28.86806 9.622685 0.112784
10 7 3 26.88425 8.961417 5.63E-06
10 8 3 24.26031 8.086771 0.004105
10 9 3 26.83206 8.944022 0.010302
DC 3 35.14117 11.71372 0.076144
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 22.51845 4 5.629612 138.4286 1.04E-08 3.47805
Within Groups 0.40668 10 0.040668
Total 22.92513 14
Anova: Single Factor
A2- 6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.67512 9.891706 0.015125
10 7 3 24.16665 8.055551 0.001768
10 8 3 23.34729 7.78243 0.47881
10 9 3 21.92245 7.307482 1.83E-05
DC 3 35.05431 11.68477 0.024905
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 39.68025 4 9.920064 95.27039 6.42E-08 3.47805
Within Groups 1.041254 10 0.104125
Total 40.72151 14
Anova: Single Factor
A2-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 26.23204 8.744014 0.10067
10 7 3 22.70388 7.567959 0.194098
10 8 3 21.18639 7.06213 0.022873
10 9 3 19.90135 6.633783 0.569392
DC 3 34.14873 11.38291 7.28E-06
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 43.63078 4 10.90769 61.48364 5.29E-07 3.47805
Within Groups 1.774081 10 0.177408
Total 45.40486 14
Anova: Single Factor
H2-0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 9.084576 3.028192 0.24405
10 7 3 10.47966 3.493221 0.015864
10 8 3 9.090611 3.030204 0.014861
10 9 3 9.209515 3.069838 0.01237
DC 3 14.21589 4.73863 0.002265
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 6.476053 4 1.619013 27.97096 2.08E-05 3.47805
Within Groups 0.578819 10 0.057882
Total 7.054872 14
Anova: Single Factor
H2-1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 25.76391 8.587971 0.011406
10 7 3 22.71265 7.570883 0.004124
10 8 3 22.48149 7.493829 0.005885
10 9 3 23.91033 7.97011 0.000915
DC 3 28.1181 9.3727 0.358803
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 7.419174 4 1.854793 24.33265 3.89E-05 3.47805
Within Groups 0.762265 10 0.076227
Total 8.181439 14
Anova: Single Factor
H2-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 31.07738 10.35913 0.000924
10 7 3 32.91142 10.97047 0.107183
10 8 3 30.17464 10.05821 0.00325
10 9 3 29.13354 9.71118 0.398198
DC 3 30.92023 10.30674 0.536302
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2.569405 4 0.642351 3.070932 0.068361 3.47805
Within Groups 2.091714 10 0.209171
Total 4.661118 14
Anova: Single Factor
H2-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 24.47712 8.15904 0.022873
10 7 3 26.83203 8.944009 0.007075
10 8 3 26.69142 8.897141 0.044422
10 9 3 27.41162 9.137207 0.344958
DC 3 27.8169 9.272301 0.728595
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2.232631 4 0.558158 2.431162 0.116057 3.47805
Within Groups 2.295848 10 0.229585
Total 4.52848 14
Anova: Single Factor
H2-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 22.86655 7.622182 0.017731
10 7 3 20.63196 6.877321 0.136366
10 8 3 25.75278 8.584259 0.001568
10 9 3 23.38881 7.79627 0.131494
DC 3 28.48777 9.495925 0.021368
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 11.98662 4 2.996656 48.56388 1.62E-06 3.47805
Within Groups 0.617054 10 0.061705
Total 12.60368 14
Anova: Single Factor
H21-5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 23.37718 7.792392 0
10 7 3 20.64028 6.880094 0.01596
10 8 3 21.37508 7.125026 0.002718
10 9 3 16.27021 5.423404 0.179524
DC 3 28.19103 9.397011 0.001213
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 25.09701 4 6.274252 157.3158 5.55E-09 3.47805
Within Groups 0.398832 10 0.039883
Total 25.49584 14
Anova: Single Factor
H2-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 21.14543 7.048478 0.000966
10 7 3 20.57597 6.858658 0.006127
10 8 3 20.23049 6.743497 0.006162
10 9 3 16.3917 5.463899 0.021573
DC 3 28.8485 9.616166 0.123695
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 27.5558 4 6.888951 217.2845 1.13E-09 3.47805
Within Groups 0.317048 10 0.031705
Total 27.87285 14
Anova: Single Factor
H2-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 20.46598 6.821992 0.013951
10 7 3 20.00508 6.668361 0.080005
10 8 3 17.39633 5.798777 0.112784
10 9 3 14.26867 4.756224 0.081215
DC 3 28.71328 9.571093 0.026923
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 38.54045 4 9.635114 152.9979 6.36E-09 3.47805
Within Groups 0.629755 10 0.062975
Total 39.17021 14
Anova: Single Factor
P28-0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 11.61194 3.870645 0.005798
10 7 3 10.57142 3.523806 0.036009
10 8 3 11.22656 3.742185 0.01307
10 9 3 11.54065 3.846883 0.013861
DC 3 8.857332 2.952444 0.00235
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.736192 4 0.434048 30.52922 1.4E-05 3.47805
Within Groups 0.142175 10 0.014217
Total 1.878367 14
Anova: Single Factor
P28-1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 27.72048 9.240159 0.002138
10 7 3 10.57142 3.523806 0.036009
10 8 3 26.96691 8.98897 4.46E-05
10 9 3 26.36175 8.787249 0.002125
DC 3 27.89676 9.298921 0.371628
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 74.56245 4 18.64061 226.2516 9.27E- 3.47805
10
Within Groups 0.823889 10 0.082389
Total 75.38634 14
Anova: Single Factor
P28-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 30.12615 10.04205 0.001715
10 7 3 30.92958 10.30986 0.001088
10 8 3 29.54119 9.847063 0.005506
10 9 3 24.12414 8.041381 1.56E-05
DC 3 27.17301 9.057671 0.046919
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 10.15562 4 2.538906 229.7908
8.59E-
10 3.47805
Within Groups 0.110488 10 0.011049
Total 10.26611 14
Anova: Single Factor
P28-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 25.44273 8.48091 0.008202
10 7 3 26.70757 8.902523 0.000739
10 8 3 26.22926 8.743086 0.027441
10 9 3 23.82282 7.940941 0.051002
DC 3 31.35689 10.4523 0.237942
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 10.58882 4 2.647205 40.68546
3.71E-
06 3.47805
Within Groups 0.650651 10 0.065065
Total 11.23947 14
Anova: Single Factor
P28-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 24.42099 8.140329 0.017982
10 7 3 23.13164 7.710548 0.007175
10 8 3 24.33174 8.110581 1.13E-05
10 9 3 24.75243 8.250811 0.054607
DC 3 33.18127 11.06042 0.000357
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 22.2081 4 5.552025 346.4324
1.13E-
10 3.47805
Within Groups 0.160263 10 0.016026
Total 22.36836 14
Anova: Single Factor
P28-5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 23.54402 7.848007 0.000237
10 7 3 23.40613 7.802045 0.000951
10 8 3 22.54623 7.515411 0.012761
10 9 3 23.36052 7.78684 0.021333
DC 3 34.04062 11.34687 0.000597
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 31.46059 4 7.865148 1096.075
3.65E-
13 3.47805
Within Groups 0.071757 10 0.007176
Total 31.53235 14
Anova: Single Factor
P28-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 23.83345 7.944483 0
10 7 3 23.57191 7.857305 3.64E-05
10 8 3 21.7337 7.244568 0.033911
10 9 3 20.36907 6.789689 0.022101
DC 3 30.3195 10.1065 0.137325
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 19.48695 4 4.871738 125.9675
1.65E-
08 3.47805
Within Groups 0.386746 10 0.038675
Total 19.8737 14
Anova: Single Factor
P28-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 23.66571 7.888571 0.000954
10 7 3 22.51188 7.503961 0.010463
10 8 3 19.36333 6.454443 0.000524
10 9 3 19.21945 6.406485 7.25E-05
DC 3 27.90292 9.300974 0.03015
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 17.04865 4 4.262161 505.4351
1.73E-
11 3.47805
Within Groups 0.084327 10 0.008433
Total 17.13297 14
Anova: Single Factor
A28-OD
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 10.1181 3.3727 0.358803
10 7 3 10.73573 3.578578 0.05187
10 8 3 13.12857 4.37619 0.143553
10 9 3 9.08158 3.027193 0.000204
DC 3 11.73827 3.912755 0.001382
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 3.198647 4 0.799662 7.193644 0.005374 3.47805
Within Groups 1.111623 10 0.111162
Total 4.31027 14
Anova: Single Factor
A28-1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 32.48359 10.82786 0.044708
10 7 3 31.8695 10.62317 0.000107
10 8 3 30.35313 10.11771 0.029996
10 9 3 29.72263 9.907545 0.293219
DC 3 29.18897 9.729656 0.190605
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 2.634974 4 0.658744 5.895997 0.010559 3.47805
Within Groups 1.117273 10 0.111727
Total 3.752247 14
Anova: Single Factor
A28-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 33.37468 11.12489 0.000767
10 7 3 29.20952 9.736505 0.058212
10 8 3 29.71517 9.905056 0.043961
10 9 3 27.66463 9.221544 0.001531
DC 3 33.73464 11.24488 0.026877
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 9.586654 4 2.396664 91.23357 7.92E-08 3.47805
Within Groups 0.262695 10 0.02627
Total 9.849349 14
Anova: Single Factor
A28-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.6103 9.8701 0.057333
10 7 3 28.4575 9.485834 0.00727
10 8 3 27.32097 9.106989 0.000288
10 9 3 27.12057 9.040191 0.001568
DC 3 35.1045 11.7015 0.013667
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 14.30556 4 3.576391 223.1711 9.92E-10 3.47805
Within Groups 0.160253 10 0.016025
Total 14.46582 14
Anova: Single Factor
A28-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 24.84223 8.280745 0.363898
10 7 3 26.48558 8.828526 0.177806
10 8 3 27.273 9.091 0.007778
10 9 3 27.12943 9.043143 0.082057
DC 3 39.00672 13.00224 0.034146
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 43.4038 4 10.85095 81.50208 1.37E-07 3.47805
Within Groups 1.331371 10 0.133137
Total 44.73517 14
Anova: Single Factor
A28- 5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 22.90889 7.636296 0.049562
10 7 3 26.6807 8.893568 0.421207
10 8 3 24.76734 8.255781 0.000908
10 9 3 27.74759 9.249197 1.5E-06
DC 3 35.14117 11.71372 0.076144
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 29.21761 4 7.304403 66.66774 3.59E-07 3.47805
Within Groups 1.095643 10 0.109564
Total 30.31325 14
Anova: Single Factor
A28-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 24.74714 8.249048 0.083973
10 7 3 25.23937 8.413125 0.258615
10 8 3 23.67046 7.890154 0.002536
10 9 3 23.55 7.850001 0.009673
DC 3 35.05431 11.68477 0.024905
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 31.51178 4 7.877945 103.7381 4.24E-08 3.47805
Within Groups 0.759407 10 0.075941
Total 32.27119 14
Anova: Single Factor
A28-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 25.46264 8.487546 0.005004
10 7 3 22.82489 7.608296 0.36942
10 8 3 22.26834 7.422781 0.000606
10 9 3 22.60228 7.534092 0.004887
DC 3 34.14873 11.38291 7.28E-06
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 33.59706 4 8.399265 110.5387 3.12E-08 3.47805
Within Groups 0.759848 10 0.075985
Total 34.35691 14
Anova: Single Factor
H28-0D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 9.452553 3.150851 0.03433
10 7 3 11.45589 3.818631 0.009824
10 8 3 13.10547 4.36849 0.253658
10 9 3 11.50871 3.836236 0.029338
DC 3 14.21589 4.73863 0.002265
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 4.381819 4 1.095455 16.62732 0.000204 3.47805
Within Groups 0.658828 10 0.065883
Total 5.040647 14
Anova: Single Factor
H28-1D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 26.52168 8.840561 0.321608
10 7 3 27.83142 9.277141 0.002107
10 8 3 25.89679 8.632264 0.014861
10 9 3 25.42703 8.475678 0.024845
DC 3 28.1181 9.3727 0.358803
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1.857033 4 0.464258 3.214084 0.061118 3.47805
Within Groups 1.444449 10 0.144445
Total 3.301482 14
Anova: Single Factor
H28-2D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 31.51188 10.50396 0.010463
10 7 3 31.88392 10.62797 0.03433
10 8 3 31.24092 10.41364 0.401975
10 9 3 30.48359 10.1612 0.000224
DC 3 30.92023 10.30674 0.536302
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 0.38596 4 0.09649 0.490646 0.74305 3.47805
Within Groups 1.966589 10 0.196659
Total 2.352548 14
Anova: Single Factor
H28-3D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 29.59799 9.865997 0.004238
10 7 3 27.2667 9.088901 0.082057
10 8 3 29.86187 9.953956 0.000373
10 9 3 18.01242 6.004138 0.022873
DC 3 27.8169 9.272301 0.728595
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 31.75342 4 7.938354 47.35719 1.82E-06 3.47805
Within Groups 1.676272 10 0.167627
Total 33.42969 14
Anova: Single Factor
H28-4D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 25.99989 8.66663 0.001073
10 7 3 23.33397 7.77799 0.00021
10 8 3 22.4738 7.491265 0.000126
10 9 3 17.56575 5.855251 0.010663
DC 3 28.48777 9.495925 0.021368
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 22.46573 4 5.616434 839.7795 1.38E-12 3.47805
Within Groups 0.06688 10 0.006688
Total 22.53261 14
Anova: Single Factor
H28-5D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 18.58576 6.195253 0.01173
10 7 3 21.979 7.326333 4.2E-06
10 8 3 17.90069 5.966898 0.155747
10 9 3 17.06311 5.687703 0.124278
DC 3 28.19103 9.397011 0.001213
ANOVA
Source of SS df MS F P-value F crit
Variation
Between Groups 27.75829 4 6.939571 118.434 2.23E-08 3.47805
Within Groups 0.585944 10 0.058594
Total 28.34423 14
Anova: Single Factor
H28-6D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 22.72221 7.57407 0.058562
10 7 3 23.73618 7.912059 0.002293
10 8 3 19.80061 6.600203 0.019633
10 9 3 15.89973 5.299909 0.038933
DC 3 28.8485 9.616166 0.123695
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 30.76185 4 7.690463 158.1647 5.4E-09 3.47805
Within Groups 0.486231 10 0.048623
Total 31.24808 14
Anova: Single Factor
H28-7D
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
10 5 3 21.471 7.156999 0.005735
10 7 3 20.12121 6.707068 0.000654
10 8 3 17.32925 5.776418 0.123553
10 9 3 13.27439 4.424796 0.019417
DC 3 28.71328 9.571093 0.026923
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 43.43374 4 10.85843 307.9856 2.02E-10 3.47805
Within Groups 0.352563 10 0.035256
Total 43.7863 14
Phụ lục 3: : Kết quả xử lý thống kê ANOVA một yếu tố thí nghiệm thử tính an
toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú
Anova: Single Factor
SUMMARYGroups Count Sum Average Variance
ĐC 6 273.3333 45.55556 458.5185F10 6 141.6667 23.61111 336.0185F2A1 6 118.3333 19.72222 430.463F28 6 115 19.16667 761.9444F11 6 253.3333 42.22222 400.7407F27 6 208.3333 34.72222 76.01852F33 6 131.6667 21.94444 242.6852
ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critBetween Groups 4446.164 6 741.0273 1.916647 0.1055461 2.3717812Within Groups 13531.94 35 386.627
Total 17978.11 41 .