J. AMER . SOC. HORT. SCI. 120(2):347-352. 1995.

Stable Transformation of Gladiolus UsingSuspension Cells and Callus

Kathryn Kamo1

U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Floral and Nursery Plants Research Unit, Beltsville, MD 20705-2350

Alan Blowers, Franzine Smith, and Joyce Van EckSanford Scientific, 877 Marshall Rd, Waterloo, NY 13165

Roger LawsonU.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Floral and Nursery Plants Research Unit, Beltsville, MD 20705-2350

Additional index words. transgenic plants, particle gun, GUS

Abstract. More than 100 transgenic Gladiolus plants were recovered after particle bombardment of regenerable suspension cells and callus. For transformation, Gladiolus callus and suspension cells were co-bombarded with phosphinothricin acetyltransferase-(PAT) and ß- glucuronidase (GUS) -expressing plasmids. Stably transformed calli were selected on medium containing either phosphinothricin (PPT) or bialaphos followed by transfer to a regeneration medium to recover transgenic plants. Stable transformation was confirmed by detection of the PAT gene by DNA gel blot analysis and by enzymatic assays to measure GUS activity. In general, particle bombardment of regenerable suspension cells rather than callus resulted in the largest number of transformants. The rate of co-expression for GUS in PPT-resistant plants was high 70%). Promoters that are typically more efficient in dicotyledonous plants were very active in Gladiolus, a monocotyledonous bulb plant. Establishment of an efficient transformation protocol for Gladiolus will now allow the introduction of transgenes to confer resistance to the viral and fungal pathogens that decrease Gladiolus production.

Many of the floral bulb crops-tulips, lilies, hyacinths, narcis- sus, Crocus, Hemerocallis, Iris- are monocots. Before the devel- opment of the particle gun (Klein et al., 1987), monocots had not been readily amenable to transformation using existing tech- niques. Recently, transgenic plants from several agronomically important monocots-corn, wheat, rice, oat, and sugarcane—have been transformed using particle bombardment of either regener- able suspension cells or callus (Bower and Birch, 1992; Christou et al., 1991; Fromm et al., 1990; Gordon–Kamm et al., 1990; Somers et al., 1992; Vasil et al., 1992; Weeks et al., 1993). Gladiolus is a monocotylcdonous floral bulb crop that ranked fifth in 1993 (U.S. Dept. of Agriculture, 1994) for the number of stems (79,663 million) shipped worldwide. Gladiolus production areas are severely plagued by viral and fungal pathogens; a typical cultivar lasts only several years before it succumbs to disease and is removed from production. Therefore, Gladiolus represents a commercially important floral crop that would benefit tremen- dously from transgene-mediated crop protection strategies. Al- though the infection of Gladiolus cormel tissue by Agrobacterium was reported, definitive evidence for transformation by DNA gel blot analysis was not presented and no transgenic plants were recovered (Graves and Goldman, 1987). The goal of this study was to produce a large number of transgenic Gladiolus plants. This is the first report of generation of a large number of transgenic plants of a monocotyledonous floral bulb crop.

Received for publication 14 June 1994. Accepted for publication 24 Oct. 1994. Mention of a trademark, proprietary product, or vendor does not imply its approval to the exclusion of other products or vendors that may also be suitable. We thank Lisa Lee for advice throughout this study. John Sanford for use of his particle gun, and Anne O’Connor and Katerina Serlemitsos for technical assistance. The cost of publishing this paper was defrayed in part by the payment of page charges. Under postal regulations, this paper therefore must be hereby

marked advertisement soley to indicate this fact.1To whom reprint requests should be addressed.

J. AMER . SOC. HORT. SCI. 120(2):347–352. 1995.

Materials and Methods

Tissue culture. Regenerablc callus was initiated from either cormel slices or in vitro-grown plantlets of Gladiolus ‘Jenny Lee’ and ‘Peter Pears’ (Kamo et al., 1990; Logan and Zettler, 1985) and maintained in vitro for to 6 months on MS basal salts medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2% (w/v) su- crose, 0.2% (w/v) Gelrite (Sigma Chemical Co., St. Louis) and the following (mg·liter

–1

): glycine, 1.0; thiamine. 1.0: pyridoxine, 0.5: nicotinic acid, 0.5; either 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba), 2.0; napthaleneacctic acid (NAA). 10.0. or 2,4- dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), 0.5, pH 5.8. All media were autoclave at 121C/18 psi. Suspension cells were initiated from the regenerable callus in MS basal salts medium supplemented with the same medium components as for callus, except that Gelrite was omitted. ‘Peter Pears’ and ‘Jenny Lee’ suspension cells wet-c cultured in 20 ml of MS basal salts medium supple- mented with 2 mg·liter

–1

dicamba anti 0.5 mg·liter-1

2,4-D, respec- tively. Callus and suspension cells were grown in the dark at 26C. Callus was routinely transferred every month and suspension cells every 7 days at a 1:2 dilution to fresh medium. Suspension ceils were shaken on a gyratory shaker at 120 rpm/26C in the dark.

Plasmid constructs. Plamlid DNA was isolated using alkaline lysis followed by purification from a cesium chloride gradient (Maniatis et al., 1982). Plasmid p35SAc that contains the PAT (phosphinothricin acetyltransferase) gene under control of the

CaMV 35S (cauliflower mosaic virus) promoter (P. Eckes, Hoechst Roussell Co., Somerville. N. Y.) was used to transform plant cells.

Plasmids used for the evaluation of promoters consisted of the gusA gene under control of the following promoters: Act1 (actin) (McElroy et al., 1991; Zhang et al., 1991), CaMV 35S (Odell et al..1985), Ubi1 (ubiquitin) (Christensen et al., 1992), mas2 (mannopine synthase) (Velten et al., 1984), rolD (Leach and Aoyagi. 1991). All constructs that contained the gusA gene under the various promoters were in either pUC or pUC-like vectors to eliminate any

347

possible effect from the vector on gene expression. Plasmids used for evaluation of either the Adh1 (alcohol dehydrogenase) or Act1 first introns were under control of the CaMV 35S promoter ((Dennis et al., 1984; McElroy et al., 1991).

Particle gun bombardment. The cells were transformed using the PDS-1000/He system (BioRad, Richmond, Calif.), which is a helium-driven particle accelerator with flying membrane for par- ticle delivery (Sanford et al.. 1991). M10 tungsten particles were coated with plasmid DNA as previously described (Sanford et al.,1993). For all experiments, the gap distance and flying membraneflight distance were set at 1 cm and the target distance at 12 cm. The suspension cells and callus were bombarded at 8.3 MPa (1200 psi) one and two times per plate, respectively.

Callus selection. One week following particle bombardment. the calluS was transferred to MS basal salts medium supplemented with either PPT (phosphinothricin; Hoechst Roussell Co., Somerville. N.J.) or bialaphos (Meiji Seika Kaisha, Tokyo) and either 2 or 1 mg·liter dicamba for callus derived from in vitro- grown cormel slices or plantlets, respectively. PPT and bialaphos were added by filter sterilization to autoclaved MS basal salts medium. and the concentration of the selection chemical was based on active ingredient. Callus was transferred every 14 to 21 days to fresh medium during selection containing 6 mg·liter

-1

P P T or bialaphos. When of the callus had died, the callus was tl-ansl’erred to regeneration medium, which was MS basal salts medium supplemented with 2 mg·liter

–1

kinetin (Logan and Zettler,19X5 ) and either- 0, 0.5, or 3.0 mg·liter–1 bialaphos. Regenerating

cultures were grown at 26C under a 16-h photoperiod at 75 µE/m2

per sec provided by cool-white fluorescent lights.Suspension selection. Several methods of selection were used

for the suspension cells, and all resulted in transgenic plants. For some bombardments, suspension cells were transferred to MS basal salts medium supplemented with 0.5 mg·liter

-1

2,4-D and0.125 M osmoticum (0.0625 M mannitol and 0.0625 M sorbitol) 2 hours he fore particle bombardment; for other bombardments the osmoticum pretreatment was omitted. Following bombardment, the suspension cells were cultured for one week on solidified MS basal salts medium supplemented with 0.5 mg·liter

–1

2.4-D and either with or without 0.125 M ostmoticum to allow the cellS t o recover from bombardment. These cellS

were then transferred to sol idif ied MS basal sa l t s medium supplemented with 0 .5 mg·liter

–1

2,4-D and either 1 or 6 mg·liter–1

PPT or bialaphos.

After at least two subcultures onto solidified MS basal salts medium supplemented with 2 or 6 mg·liter

–1

bialaphos or PPT, the cell S were transferred to regeneration medium supple - mented with either 0, 0.5, or 3 mg·liter

–1

bialaphos. Al te rna - tively, some of the bombarded cells were cultured 2 weeks in liquid MS basal salts medium supplemented with 0.5 mg·liter–1 2,4- D and 0.1 mg·liter

–1

bialaphos immediately after bombard- ment. These cells were then transferred to solidified MS basal

salts medium supplemented with 0.5 mg·liter -1

2,4-D and 1 mg·liter

–1

bialaphos until they were ready for transfer to regenera- tion medium. All cells on selection media were transferred every 14 to 21 days to fresh media and grown at 26C in the dark. Cells on regeneration medium were grown in a 16-h light photoperiod at 26C. Shoots that regenerated from the callus and suspension cells were excised and grown on a MS basal salts medium lacking hormone and selection agent where they formed roots.

GUS analysis. The method of Jefferson et al. (1987) was used for histochemical and fluorometric determinations of ß-glucu- ronidasc (GUS) gene expression in suspension cells and putative, transformed tissues. The specific activity of GUS was measured by fluorometric determination of 4-methylumbelliferone (4-MU). The protein concentrations were determined using the BCA pro- tein assay reagent according to the manufacturer’s instructions (Pierce Co., Rockford, Ill.). Transient GUS expression analysis was used to optimize gene delivery into ‘Jenny Lee’ suspension cellS that had been bombarded with gu.sA-containing plasmids. Each experiment consisted of three replicates, and each replicate consisted of two to three plates of suspension cells per treatment. GUS expression was determined 48 h after particle gun bombard- ment by adding the substrate 5-bromo-3-chloro-3-indolyl- -D- glucuronic acid directly to the filter paper on which the suspension cells were cultured. Following a 16-h incubation of the samples with substrate at 37C, the blue spots were counted. Alternatively, the suspension cells were removed from the filter paper, ground up using mortar and pestle, and then used for the fluorometric deter- mination of specific activity of GUS. Nontransformed plant tissues and suspension cells of ‘Jenny Lee’ and ‘Peter Pears’ were used as the negative controls.

DNA analysis. DNA for polymerase chain reaction (PCR)amplification was isolated from fresh leaves grown in vitro essen- tially according to the method of Dellaporta et al. (1983). PCR amplification was performed using an Eppendorff microcycler. The PAT gene was amplified using the primer sequence: 5

1

- G A G A G G A G A C C A G T T G A G - 3

1

and 5 ' -TTGGAGGAG C - TGGCAAC-3’ and the microcycler conditions: 94C for 3 min (one cycle), 94C for 1 min, 55C for 1 min, 72C for 2 min (40 cycles),72C for 5 min (one cycle).

DNA for Southern hybridization was isolated from leaves of in vitro-grown plants using the method of Dellaporta et al. (1983). Undigested DNA (10 µg) and DNA digested with either EcoRI or PstI were electrophoresed on a 0.7% (w/v) agarose (BioRad, Richmond, Calif.) gel in TBE (89 mM Tris-borate, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8) buffer at 75 V, 50 mA for h. Following electrophoresis, the DNA was transferred by capillary movement ova-night to Nytran nylon membrane (Schleicher and Schuell, Keene, N. Y.) (Maniatis et al., 1982). The probe used for hybridiza- tion was p35SAc digested with SalI followed by gel purification and labeled by random primer

32

P] dCTP using the Megaprime

Table 1. Comparison of gene promoter activities in suspension cells of Gladiolus ‘Jenny Lee’.

Gene GUS specific activityz Relative GUSPromoter source (pmoles 4-MU/h/mg protein) expression y

3 5 S CaMV 92 1.00mas2 Agrobacterium 185 2.01r o l D Agrobacterium 99 1.08Act1 Rice 20 0.22

Ubi1 Maize 28 0.30z

GUS expression waS measured 48 h after particle gun bombardment of the cells. Values represent the mean of three bombardments(replicates).y

Values represnt relative GUS expression, where 35S–GUS is set at 1.00.

348 J. AMER. SOC. HORT. SCI. 120(2):347–352. 1995.

Kit (Amersham, Arlington Heights, Ill.). Blots were incubated in prehybridization buffer for 2 h at 42C followed by hybridization buffer and probe at 60C for 16 h (Maniatis et al., 1982). Three washes in 6x SSC, 1% SDS for 5 min each at 26C, two washes in lx SSC, 1% SDS for 1 min each at 65C, and two washes in 2x SSC for 5 min each at 26C were done before exposure of the blot at –70C with an intensifying screen.

Results and Discussion

Transient GUS gene expression analysis. Initially two promot- ers, the 35S RNA promoter from cauliflower mosaic virus (CaMV) and the actin 1 (Act1) promoter from rice, fused to gusA wer e analyzed. The 35S and Act1 promoters have been previously demon- strated to direct high levels of gene expression in transformed dicots and monocots, respectively (McElroy et al., 1990; Zhang et al.,1991). We expected that GUS expression in Gladiolus would be highest from the Act1 promoter since this promoter is most active in monocots while the CaMV 35S promoter is relatively inactive in monocots. Surprisingly, transient GUS expression levels in bombarded Gladiolus cells were nearly 5-fold higher from the CaMV 35S, promoter than from the Act1 promoter (Table 1).

Three additional promoters were evaluated: mas2 and rolD from Agrobacterium and ubiquitin Ubi1 from maize. From previ- ous reports, the mas2 and rolD promoters would be expected to be most active in dicots whereas the Ubi1 promoter would be ex- pected to be most efficient in monocots (Christensen et al., 1992; Cornejo et al., 1993; Leach and Aoyagi, 1991; Velten et al., 1984). GUS expression in Gladiolus was highest from the three dicot-

preferred promoters: mas2, rolD, and 35S. We observed that GUSexpression from the most efficient promoter, mas2, was 7-fold and9-fold higher than the Ubi1 and Act1 promoters, respectively.

Next we looked at the effect that the presence of monocot introns might have on GUS expression levels since the Ubi1 and Act1 promoter-containing fragments used here also contain an intron in their untranslated leader region (Fig. 1). It is well established that addition of an intron such as the first introns from the maize Adh1 and rice Act1 genes to the primary transcript can dramatically increase gene expression levels in transformed mono-

cots (McElroy et al., 1991). For example, GUS expression in transformed maize cells increased 6- and 60-fold when the Act1 and Adh1 first introns, respectively, were added to a 35S- gusA chimeric gene. In contrast to maize, GUS expression was reduced1.25- and 3-fold in Gladiolus when the Adh1 and Act1 first introns, respectively, were added to a 35S- gusA chimeric gene (data not shown). Results similar to those with Gladiolus were found when petunia was bombarded with the exact same intron-containing plasmids (data not shown). These results clearly indicated that GUS expression was not stimulated in Gladiolus cells with the addition of monocot introns to the gusA transcript. This observa- tion suggested that splicing of monocot introns may be relatively inefficient in Gladiolus, a nongraminaceous monocot, as it is in dicots such as petunia. Alternatively, stimulation in gene expres- sion by introns may be a feature that is generally limited to graminaceous monocots like maize and rice.

Results similar to those obtained with Gladiolus were also observed with orchid, another nongraminaceous monocot (data not shown). The 35S promoter was most active in bombarded

Fig. 1. Schematic diagrams of the gusA chimeric genes and p35SAc. (Top to bottom) 35S RNA promoter from cauliflower mosaic virus, the actin 5' region that contains the promoter and first intron, the mas2 promoter, the rolD promoter, and the Ubi1 5' region that contains the promoter and first intron. The bottom construct (p35SAc) is the PAT gene under control of the CaMV 35S promoter.

J. AMER . SOC . HORT . SCI. 120(2):347–352. 1995. 349

orchid protocorms followed by the mas2 promoter. Our results suggest that some nongraminaceous ornamental monocots should be treated more like dicots rather than monocots when issues regard- ing transgene expression are being addressed. It should be recognized that the relative efticiencies of the promoters in regenerated Gladi- olus plants may be different from the values obtained in our transient assays, and this will be addressed when transgenic plants contain- ing these gusA gene fusions are available for analysis.

Others (Russell et al., 1992; Vain et al., 1993) have reported that tobacco and maize suspension cells preconditioned in osmoticum before particle bombardment increased levels of GUS expression

3-fold compared to cells not grown in osmoticum. The optimumconcentration of osmoticum resulting in a 3.2-fold increase of GUS expression was 0.125 M for suspension cells of Gladiolus compared to 0.25 M and 0.4 M for tobacco and maize suspension cells, respectively (data not shown).

Recovery of transgenic Gladiolus cells. The plasmid, pAct1-F4, which contains an Act1- GUS chimeric gene, was co-bom- barded with p35SAc DNA into nonregenerable Gladiolus cells. For selection, bombarded cells were moved to MS basal salts medium containing either PPT or bialaphos. After 4 weeks, healthy, yellow microcalli began to appear against a background of dead cells. The microcalli were subculture to PPT-containing medium for continued growth. When PPT-resistant Gladiolus cells were assayed for GUS activity (Fig. 2A), of the transformants that contained the PAT gene as determined by PCR analysis expressed detectable levels of GUS enzyme. This co-expression rate com- pares favorably with the rates observed in other plant transforma- tion systems after co-bombardment with two plasmids. Suspen- sion cells of ‘Jenny Lee’ expressed high levels of GUS (25 to 40 nmol MU/h per mg protein), which is comparable to the highest levels reported for other monocots (Hagio et al., 1991; Lyznik et al., 1989).

Recovery of transgenic Gladiolus plants. Stably transformed Gladiolus plants were recovered following particle gun bombard- ment of either regenerable suspension cells or callus with plasmid p35SAc that had the 35 S-PAT chimeric gene to confer resistance to PPT. Only a few of the regenerable cells were co-bombarded with the Act1 GUS chimeric gene resulting in a few plantlets just beginning to differentiate that showed GUS expression (Fig. 2B). Currently, we are in the pocess of transforming plants with the GUS gene under various promoters that will allow us to distinguish between tissue-specific GUS expression and possible chimeras. These results will be reported once these plants are available. To recover transgenic plants (Fig. 2C), PPT-resistant calli that had been bombarded with p35SAc were transferred to regeneration medium. The regeneration medium either lacked the selection agent or contained a lower concentration (0.5 or 3.0 mg·liter

–1

PPT). After 3 to 4 weeks, green shoots appeared on some of the calli. The shoots were transferred to MS basal salts medium lacking hormones and a selection agent for further plant develop- ment. When multiple shoots were recovered from a single callus, PCR analysis performed on individual shoots sampled from the single callus verified that at least 90% of the shoots derived from that callus were transgenic. Twenty-five of the transgenic plants were grown for 2 months on MS medium supplemented with 4.0

mg·liter –1

PPT compared to the nontransformed plants that died after only 1 week on this concentration of PPT, indicating

expres- sion of phosphinothricin acetyltransferase by the transgenic plants.

A total of 33 plates of regenerable callus and 18 plates ofregenerable suspension cells was bombarded with the PAT gene, resulting in 110 transformed plants recovered. The 110 trans- formed plants contain the PAT gene as indicated by PCR analysis.

Fig. 2. (A) ‘Jenny Lee’ callus showing GUS expression after incubation with 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-3- -glucuronic acid (X-gluc). The callus had been selected on MS basal salts medium supplemented with 0.5 mg·liter

–l

2,4-D and6 mg·liter

–1

PPT. (B) Plantlets just beginning to develop and stained to show GUS expression. (C) Transgenic plants of Gladiolus ‘Jenny Lee’ grown in vitro on MS basal salts medium without hormones.

350 J. AMER. SOC. HORT. SCI. 120(2):347-352. 1995.

Fig. 3. DNA blot of genomic DNA isolated from leaves of Gladiolus grown in vitro probed with p35SAc digested with Sal L Each lane contains 10 µg DNA. Lane 1: p35SAc digested with EcoRI, which released 50 pg of a 1.34 kb insert. Lane 2:4 µg lambda DNA digested with HindIII. Lanes 3-6 are uncut genomic DNA fornontransformed (NT) Gladiolus or three transformants (T1-3). Lanes 7–10 aregenomic DNA digested with EcoRI for NT or three transformants (T1-3). Size markers shown on the left represent 23.1, 9.4, 6.7, 4.4, 2.3, 2.0, and 0.56 kb, from top to bottom.

Additional putative transformed plants could have been recovered from the selection medium; however, we did not wish to maintain more plants. Southern hybridizations have been performed on nine of the transformants, and two were found to be duplicates. Cur- rently, the other transformed plants are being analyzed by DNA blot analysis so that it can be determined whether they are indepen- dent transformants.

DNA gel blot analysis indicated stable incorporation of the PAT gene into the Gladiolus genome (Fig. 3). When the transgenic plants reached sufficient size, genomic DNA was isolated for DNA gel blot analysis. Genomic DNA samples were digested with EcoRI and probed-with radiolabeled PAT DNA. The expected 1.3 kb EcoRI fragment was observed in lanes containing DNA from the transgenic plants. T3 contains one or only a few copies of the PAT gene compared to T1 and T2. PCR analysis clearly verified the presence of the PAT gene in T3 (data not shown). The amount of DNA loaded onto the gel was identical as that used for T1 and T2, so the difference in signal of the diagnostic band can be attributed to a difference in copy number. The particle gun typi- cally results in a variable number of copies inserted into the plant genome (Gordon–Kamm et al., 1990; Somers et al., 1992; Weeks et al., 1993). No 1.3 kb signal was evident in the lane containing genomic DNA isolated from untransformed plants. There was a difference in the minor bands for T1 and T2, indicating a different pattern of gene rearrangement for each transformant. The particle gun frequently results in gene rearragements (Gordon–Kamm et al., 1990; Somers et al., 1992; Weeks et al., 1993). Additional evidence that T1 and T2 represent independent transformants was provided following digestion of their genomic DNA with PstI that digests once within the transgene (Fig. 4)

Fig. 4. DNA blot of genomic DNA isolated from leaves of Gladiolus grown in vitro probed with p35SAc digested with SalI. Each lane contains 10 µg DNA. Lane 1: p35SAc digested with SalI, which released 50 pg of a 559 bp insert. Lane 2:4 µg lambda DNA digested with HindIII. Lane 3:2 µg 1 kb ladder. Lane 4 genomic DNA digested with PstI from NT plant. Lanes 5 and 6: Genomic DNA digested with PstI from T1 and T2, respectively.

The introduced plasmid DNA was determined to have inte- grated into the genome (Fig. 3). Undigested genomic DNA was electrophoresed through agarose and probed with the PAT gene. The PAT-hybridizing signal was located in the region of the gel that contained high molecular weight DNA consistent with inte- gration of the plasmid into the genome.

This biolistic transformation protocol resulted in the recoveryof large numbers of transgenic Gladiolus plants transformed with the PAT and gusA genes. More than 100 transformed plants were obtained from both bombarded callus and suspension cells of two commercial y available Gladiolus ‘Jenny Lee’ and ‘Peter Pears’. We are now positioned to introduce transgenes that can confer horticulturally important traits into commercial cultivars of Gladi- olus.

Literature Cited

Bower, R. and R.G. Birch. 1992. Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment. Plant J. 2:409-416.

Christensen, A. H., R.A. Sharrock, and P.H. Quail. 1992. Maize polyubiquitin genes: Structure, thermal perturbation of expression and

J. AMER. SOC. HORT. SCI. 120(2):347–352. 1995. 351

transcript splicing, and promoter activity following transfer to proto- plasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18:675-689.

Christou, P., T.L. Ford, and M. Kofron. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Biotechnology 9:957–962.

Cornejo, M.J., D. Luth, K.M. Blankenship, O.D. Anderson, and A.E. Blechl. 1993. Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Mol. Biol. 23:567–581.

Dellaporta, S., J. Wood, and J. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation version II. Plant Mol. Biol. Rpt. 1:19–21.

Dennis, E. S., W.L. Gerlach, A.J. Pryor, J.K. Bennetzen, A. Inglis, D. Llewellyn, M.M. Sachs, R.J. Ferl, and W.J. Peacock. 1984. Molecular analysis of the alcohol dehydrogenase (Adh1) gene of maize. Nucleic Acids. Res. 12:3983-4000.

Fromm, M. E., F. Morrish, C. Armstrong, R. Williams, J. Thomas, andT.M. Klein. 1990. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Biotechnology 8:833-839.

Gordon–Kamm, W.J., T.M. Spencer, M.L. Mangano, T.R. Adams, R.J. Dairies, W.G. Start, J.V. O’Brien, S.A. Chambers, W.R. Adams, Jr., N.G. Willetts, R.B. Rice, C.J. Mackey, R.W. Krueger, A.P. Kausch, and P.G. Lemaux. 1990. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2:603-618.

Graves, A.C.F. and S.L. Goldman. 1987. Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of the monocot genus Gladiolus: detection of expression of T-DNA-encoded genes. J. Bacteriol. 169:1745-1746.

Hagio, T., A.D. Blowers, and E.D. Earle. 1991. Stable transformation ofsorghum cultures after bombardment with DNA-coated microprojectiles. Plant Cell Rpt. 10260-264.

Jefferson, R. A., T.A. Kavanagh, and M.W. Bevan. 1987. GUS-fusions: glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6:3901–3907.

Kamo, K., J. Chen, and R. Lawson. 1990. The establishment of cell suspension cultures of Gladiolus that regenerate plants. In Vitro Cell. Dev. Biol. 26:425-430.

Klein, T.M., E.D. Wolf, R. Wu, and J.C. Sanford. 1987. High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into plant cells. Nature327:70-73.

Leach, R. and K. Aoyagi. 1991. Promoter analysis of the highly expressed rolC and rolD root-inducing genes of Agrobacterium rhizogenes: En- hancer and tissue-specific DNA determinants are dissociated. Plant Sci.79:69–76.

Logan, A.E. and F.W. Zettler. 1985. Rapid in vitro propagation of virus- indexed Gladioli. Acta Hort. 164: 169–180.

Lyznik, L.A., R.D. Ryan, S.W. Ritchies, and T.K. Hodges. 1989. Stable co-transformation of maize protoplasts with gusA and neo genes. Plant Mol. Biol. 13:151–161.

Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning Alaboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har- bor, N.Y. p. 368-369.

McElroy, D., W. Zhang, J. Cao, and R. Wu. 1990. Isolation of an efficient

actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2: 163–171. McElroy, D., A. Blowers, B. Jenes, and R. Wu. 1991. Construction

ofexpression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5' region for use in monocot transformation. Mol. Gen. Genet. 231:150-160.

Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497.

Odell, J.T., F. Nagy, and N. Chua. 1985. Identification of DNA sequences

required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313:170-173.

Russell, J.A., M.K. Roy, and J.C. Sanford. 1992. Major improvements inbiolistic transformation of suspension-cultured tobacco cells. In VitroCell Dev. Biol. 28P:97–105.

Sanford, J.C., M.J. DeVit, J.A. Russell, F.D. Smith, R.P. Harpending, M.K. Roy, and S.A. Johnston, 1991. An improved, helium-driven biolistic device. Technique 3:3–16.

Sanford, J. C., F.D. Smith, and J.A. Russell, 1993. Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods Enzymol. 217:483–510.

Somers, D.A., H.W. Rines, W. Gu, H.F. Kaeppler, and W.R. Bushnell.1992. Fertile, transgenic oat plants. Biotechnology 10: 1589–1594. U.S.

Department of Agriculture. 1994. Fresh fruits, vegetables andornamental crops. No. WS-04-94.

Vain, P., M.D. McMullen, and J.J. Finer. 1993. Osmotic treatmentenhances particle bombardment-mediated transient and stable transfor- mation of maize. Plant Cell Rpt. 12:84-88.

Vasil, V., A.M. Casino, M.E. Fromm, and I.K. Vasil. 1992. Herbicideresistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Biotechnology10:667-674.

Velten, J., L. Velten, R. Hain, and J. Schell. 1984. Isolation of a dual plantpromoter fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens.EMBO J. 3:2723–2730.

Weeks, J.T., O.D. Anderson, and A.E. Blechl. 1993. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiol. 102: 1077–1084.

Zhang, W., D. McElroy, and R. Wu. 1991. Analysis of rice Act1 5' regionactivity in transgenic rice plants. Plant Cell 3:11 55–1 165.

352 J. AMER. SOC. HORT. SCI. 1995.

1Nhóm 7:Nuôi cấy huyền phù tế bàoBản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn năng. Thực v t b c cao là â âm t nguôn cung cấp cac hơp chất hóa hoc và dươc li u rất quan trong. Tuy nhiên trong những năm gân đây sản lương ô êcac thực v t đó rất khó đảm bảo ơ mức ôn định do h u quả của m t sô yếu tô như:â â ô- Điều ki n tự nhiên không thu n lơi.ê â- Chi phi lao đ ng ngày càng tăng.ô- Khó khăn ky thu t và kinh tế trong trông trot.âPhương phap nuôi cấy huyền phù tế bào (dịch lỏng) của thực v t có khả năng góp phân giải quyết những khó khăn âtrên.2NỘI DUNGKhai niệm nuôi cấy huyền phù tế bàoLịch sử nghiên cứuCac phương phap nuôi cấyĐặc trưng của tế bào nuôi cấy huyền phùCac chỉ tiêu xac định tôc độ sinh trươngỨng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bàoCông trình nghiên cứu cụ thểKết luận3I. KHÁI NIỆMNuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures): Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ơ trạng thai lơ lửng trong môi trường lỏng.

Dịch huyền phù đươc tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và đươc chuyển động trong suôt thời gian nuôi cấy.

4Cac tế bào tach ra khỏi mô sẹo và phân tan trong môi trường lỏng.

Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hơp cac tế bào đơn, cac cụm tế bào, cac mảnh còn lại của mẫu cấy và cac tế bào chết.I. KHÁI NIỆM51949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường lỏng có khuấy.Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng cac tế bào thực vật có thể sinh trương đươc như cac cơ thể vi sinh vật.1959, Melches và Beckman đã tach và nuôi cấy thành công tế bào đơn và huyền phù tế bào.II. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU6Nuôi cấy huyền phù tế bào Khoai tây7III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤYTùy điều kiện và mục đich mà có cac phương phap nuôi cấy tế bào huyền phù khac nhau. Chủ yếu là phương phap: Nuôi cấy dịch thể động.Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thông cung cấp khi (thôi khi), cac khi đều đươc “vô trùng”.83.1. Nuôi cấy dịch thể động3.1.1. Nuôi cấy chìm liên tụcCac tế bào đươc tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng đươc ngâm hẳn vào dung dịch môi trường.

Sự thông khi đươc thực hiện nhờ may lắc chạy ơ tôc độ 100 - 150 vòng/phút. Khi đưa vào phải đảm bảo vô trùng. Qua trình thông khi còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dinh của cac tế bào với nhau.III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY9III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤYTheo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 ml, tôc độ phù hơp nhất của may lắc là 100 – 120 vòng/phút.Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hơp với kich thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình.May lắc tròn10Cac nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng may khuấy từ ơ tôc độ 250 vòng/phút và thời gian cho qua trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày.

Sau đó, cac mẫu nuôi cấy phải đươc cấy chuyển sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trương và phat triển của cac tế bào.III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY113.1.2. Nuôi cấy chìm tuân hoànCac tế bào đươc nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những khoảng thời gian đươc đưa ra ngoài môi trường.

Qua trình đươc thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của cac bình nuôi cấy.III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY12III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤYKhi chuyển động:Khôi tế bào ơ đâu này đươc đưa vào môi trường.Khôi tế bào ơ đâu kia tiếp xúc với không khi. Steward và cộng sự (1952) cũng đã thiết kế những bình nuôi cấy đặc biệt theo phương phap nuôi cấy chìm tuân hoàn.Hệ thông nuôi cấy chìm tuân hoàn13III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY3.2. Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor:Hệ thông nuôi cấy đươc thông khi hoặc đươc trao đôi khi.Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng thời kỳ.Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ thông bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu câu thường xuyên cải thiện hệ thông thông khi và hệ thông trộn môi trường.Tế bào thực vật cân anh sang cho quang hơp nên cân có sự liên kết giữa bioreator với hệ thông chiếu sang.

14Tông hơp lương lớn sinh khôi tảo15Takayama và Miasawa là những người đâu tiên sử dụng bioreactor vào nhân giông cây trông: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giông hoa ly, hoa lan hô điệp.Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn cac giông cây trông nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa.VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với cac ông silicone có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó đươc đặt trên 1tấm giấy loc và phat triển trong 4 tuân.

III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY16 Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật đươc cải tiến từ cac loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh.III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

17 Thuận lơi:Thể tích nuôi cấy tăng giúp sản xuất nhiều hơn mà không cân những kĩ thuật cao cấp.Hâu hết cac bình bioreactor đươc thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ hoc hay thôi khi để duy trì nuôi cấy gân như đông dạng.

III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤYHệ thông bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quôc 18Khi thao tac nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật li có thể đươc kiểm soat thich hơp cho sinh trương. Điều này không thể thực hiện với hệ thông nuôi cấy bình tam giac. Nhươc điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chông nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY19Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp 20Nuôi cấy huyền phù tế bào cân một lương mô sẹo kha lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979).

Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hơp cac tế bào đơn, cac cụm tế bào, cac mảnh còn lại của mẫu cấy và cac tế bào chết.

IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ21Mức độ tach rời của cac tế bào phụ thuộc vào đặc tính của cac khôi tế bào xôp và có thể đươc điều chỉnh bơi thành phân môi trường.VD: trong nhiều trường hơp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khôi tế bào xôp.

Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào.IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ22Sinh trương và phat triển của tế bào nuôi cấy:Pha lag: bắt đâu khi đưa mô sẹo vào môi trường, kéo dài cho tới lân phân bào đâu tiên.Pha tăng tôc: cac tế bào bắt đâu phân chia và sô lương tế bào tăng dân.Pha hàm sô mũ: sô lương tế bào tăng theo hàm sô mũ.Pha ôn định: sô lương tế bào đạt cực đại và không đôi theo thời gian, sô tế bào sinh ra (do phân bào) xấp xỉ sô tế bào chết đi.IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ23IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ24Để duy trì qua trình nuôi cấy, cac tế bào cân đươc cấy truyền vào giai đoạn sớm của pha ôn định.Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đâu khi mật độ tế bào cực đại.Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trương mạnh có thể ngắn hơn, từ 6 – 9 ngày.IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

25Ở lân cấy truyền đâu tiên, dịch nuôi cân đươc loc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, cac mảnh từ mẫu cấy ban đâu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền.Lương tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp qua cac tế bào sẽ không sinh trương đươc.VD: đôi với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thich hơp 9 – 15.103 tb/ml.IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ26IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙTheo King (1980), những tế bào trải qua qua trình nuôi cấy, sinh trương và trao đôi chất trong dịch huyền phù goi là dòng tế bào. Đặc điểm của dòng tế bào:Khả năng tach tế bào cao.Hình thai tế bào đông nhất.Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.Nhiều hạt tinh bột.27IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙTương đôi it cac yếu tô mạch.Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72h.Mất tính toàn năng.Quen với chất sinh trương.Tăng mức đa bội thể.Tế bào trong nuôi cấy huyền phù285.1. Sô lương tế bàoTrước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buông đếm hông câu.Kết quả: sô lương tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG295.2. Thể tích tế bàoLấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ơ tôc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.Thu tế bào và đem xac định thể tích.Kết quả: Sô ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.Tỷ lệ %.V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG305.3. Khôi lương tươi và khôi lương khô tế bàoKhôi lương tươi:Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xac định.Rửa bằng nước cất vô trùngLàm khô trong chân không.Cân để xac định khôi lương.Khôi lương khô:Lấy một thể tích mẫu xac định.Loại bỏ phân nôi, rửa phân tế bào trên giấy loc Whatman.Sấy khô trong 12h ơ 800C đến khôi lương không đôi.

V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG315.4. Xac định thành phân ProteinThu thập tế bào, chuyển lên loc qua giấy Whatman.Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi.Làm khô với Aceton rôi chuyển vào dung dịch NaOH 1M.Đun nóng đến 850C trong 1.5h.Loc và xac định Protein thủy phân trong dịch theo phương phap Lowry và cs (1951).V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG325.5. Xac định chỉ sô nguyên phânHuyền phù tế bào đươc cô định trong hỗn hơp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kinh.Nhỏ 1 giot Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngon lửa đèn côn, để nguội trong 5 phút.Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sat dưới kinh hiển vi quang hoc ơ vật kinh 100.Xac định cac kỳ trong khoảng 1000 tế bào.Tỷ lệ % cac tế bào đang phân bào goi là chỉ sô nguyên phân.V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG336.1. Sản xuất sinh khôi tế bào và cac hơp chất thứ cấpSản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng là những chất có gia trị cao và cân ơ lương nhỏ.Có thể chia thành cac nhóm dựa theo công dụng:Hơp chất thứ cấp trong y hoc.Hơp chất thứ cấp trong hóa my phẩm.Hơp chất thứ cấp trong công nghiệp.

VI. ỨNG DỤNG34Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khôi?Tàn pha môi trường và sự xói mòn di truyền.Sự cung cấp nguôn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lương không ôn định.Nhiễm bẩn do thuôc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng … Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục đươc cac nhươc điểm trên.

VI. ỨNG DỤNG35VI. ỨNG DỤNGNgoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một sô ưu điểm sau:Sản xuất một cach có định hướng, theo quy mô công nghiệp, khôi lương sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ.Tỷ lệ % khôi lương khô cac hơp chất thứ cấp cao hơn so với nguyên liệu thực vật thu hai trong tự nhiên.Không tôn nhiều diện tích gieo trông. Thu sinh khôi tế bào lớn trong thời gian ngắn.36Một sô hơp chất thứ cấp đã đươc sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật:Diosgenin: Tac dụng chông viêm; chữa sôt, đai buôt, đai vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thân kinh. Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) trong bioreactor đã thu đươc năng suất diosgenin cao hơn so với hiệu suất có đươc từ nguyên liệu tự nhiên.Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khôi lương khô, trong khi chỉ chiếm 2 % với nguyên liệu thực vật thu hai trong tự nhiên.

VI. ỨNG DỤNG

37VI. ỨNG DỤNGCodein: Giảm đau và giảm ho.Papaver somniferum là nguôn của 2 hơp chất rất quan trong trong y hoc là morphine và codein.Sản xuất morphin đã đươc thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào Papaver somniferum.

Cây anh túc (Papaver somniferum)38VI. ỨNG DỤNGSteviol:Chất tạo vị ngot đươc biết đến rộng rãi, thu nhận từ cây Stevia rebaudiana.Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tích lũy steviol.Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 %.Cây cỏ ngot (Stevia rebaudiana)39VI. ỨNG DỤNGTaxol:- Là một nhóm chất trong hóa trị liệu ung thư, điều trị ung thư buông trứng, ung thư vú, ung thư phôi, khôi u ac tính, và cac dạng u bướu khac.- Nuôi cấy tế bào cac loài Taxus đươc xem như là một phương phap ưu thế để cung cấp ôn định nguôn taxol và dẫn xuất taxane của nó (T. cuspidata, T. baccata, T. mairei).Cây thông đỏ (Taxus brevifolia)40VI. ỨNG DỤNGScopolamine và hyoscyamine:Là 2 loại tropane alkaloid đươc sử dụng để trị co thắt và gây mê.Có nhiều trong cac cây thuộc ho Solanaceae.Nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica có bô sung tropic acid (như 1 tiền chất) thì có thể tăng hàm lương alkaloid lên 15 lân.Cà độc dươc (Datura metel)41VI. ỨNG DỤNGSaponin và sapogenin:Là một dươc phẩm quý gia, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax ginseng), có tac dụng chữa bệnh rôi loạn tiêu hóa, chông suy nhươc cơ thể, tăng cường sinh lực.Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. ginseng đang tiến hanh trên quy mô công nghiệp. Đây là một trong cac đôi tương đươc cac nhà khoa hoc trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Nhân sâm (Panax ginseng)42VI. ỨNG DỤNGBetalaine:Là một nhóm cac chất nhuộm màu thực phẩm.Bao gôm betaxanthine (màu vàng) và betacyane (màu đỏ).Thành tựu nuôi cấy cơ quan cây Beta vulgaris, nuôi cấy callus và huyền phù của Portulaca americana.

Củ cải đỏ (Beta vulgaris)436.2. Trong công tac chon giông cây trông: Sử dụng để chon loc cac dòng tế bào mong muôn qua cac test thanh loc.Sau đó tai sinh cac tế bào đã chon loc thành cây hoàn chỉnh.Cây hoàn chỉnh sẽ trơ thành vật liệu khơi đâu quan trong trong công tac giông.Ngoài ra, tach protoplast hoặc là nguôn để sản xuất cac phôi vô tính.VI. ỨNG DỤNG44

45Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bắt ruôi Drosera indica L. cho mục tiêu thu nhận Plumbagin. (Quach Diễm Phương).

Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bèo đất Drosera burmalni Vahl cho mục tiêu thu nhận 1 hơp chất Anthraquinone. Quach Diễm Phương (đề tài NCCB của ĐH Quôc gia TP HCM)VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU46Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Mãn Đình Hông Althaea rosea L. nhằm thu nhận Rutin trong điều trị tim mạch. (Quach Diễm Phương).

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào ho cây Drosera.sp để thu nhận cac hơp chất Quinone có hoạt tính sinh hoc. (Quach Ngô Diễm Phương).VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU47Thành công trong quy trình tạo sinh khôi tế bào rễ sâm Ngoc Linh bằng ứng dụng công nghệ Biomass – Hoc viện Quân Y.

Cac nhà khoa hoc Viện Công nghệ sinh hoc (Viện khoa hoc và Công nghệ Việt nam) đã hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh sinh khôi mô của cây Hoàng Liên gai (Berberis Wallichiarna DC) bằng công nghệ tế bào thực vật để làm nguôn dươc liệu sản xuất thuôc becberin.VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU48Tuy nhiên, do những khó khăn trong việc tìm kiếm tài liệu nên nhóm chúng em không đưa ra đươc một quy trình sản xuất dựa trên nuôi cấy huyền phù tế bào, mà chỉ đưa ra đươc một công trình nghiên cứu ơ giai đoạn đâu:49ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀĐƯỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS

Tac giả: Bùi Văn Lệ, Trường Đại hoc Khoa hoc Tự nhiên, ĐHQG-HCMNguyễn Ngoc Hông, Trường Đại hoc Ban công Tôn Đức Thắng

VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU501. ĐẶT VẤN ĐỀDừa cạn Catharanthus roseus.G.Don thuộc ho Trúc đào Apocynaceae là một trong những dươc liệu chứa nhiều alkaloid.Từ dừa cạn người ta chiết đươc chất chữa ung thư như vinblastin và chữa cao huyết ap như ajmalicin, serpentin.Tuy nhiên hàm lương của những chất này có trong cây là rất thấp. Việc nuôi cấy tế bào cây dừa cạn để nâng cao hàm lương alkaloid mong muôn đã đươc nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất.VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU51Cây dừa cạn Catharanthus roseus52Ajmalicin

Vinblastin532. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPMô sẹo màu xanh đươc nuôi trong điều kiện chiếu sang từ la dừa cạn in vitro 4 thang tuôi đươc chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng trong erlen 250 ml.Môi trường cảm ứng gôm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trương thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kin hoặc BAP) + 30g/l đường sucrose.Sau đó đặt vào may lắc 200 vòng/phút ơ nhiệt độ 25± 2oC trong điều kiện chiếu sang liên tục 16 giờ/ngày.VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU54Xac định sinh khôi bằng phương phap cân.

Chiết tach alkaloid toàn phân từ sinh khôi tế bào Dừa cạn theo phương phap của Kutney và cộng sự (1983).

Xac định alkaloid toàn phân bằng phương phap acid-baz - khan theo dươc điển Việt Nam và dươc điển Anh.VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU55VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨUQuy trình thực hiện thi nghiệm563. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Khảo sat ảnh hương của sự thay đôi nông độ cytokinin đến sự tạo sinh khôi573. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Khảo sat ảnh hương của sự thay đôi nông độ cytokinin đến sự tạo sinh khôi

Đường cong tăng trương của dịch huyền phù tế bào dừa cạn trong môi trường bô sung NAA và cytokinin583. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Khảo sat ảnh hương của sự thay đôi nông độ cytokinin đến sự tạo sinh khôiKết luận:Ở bảng trên cho thấy môi trường chỉ bô sung NAA có sự tạo sinh khôi thấp hơn so với môi trường bô sung NAA kết hơp với Kin.Môi trường K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l) + BAP (0.5 mg/l) cho sinh khôi tươi và khô đều cao hơn cac môi trường khac.

593. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.2. Ảnh hương của cac chất điều hòa sinh trương đến việc tạo sinh khôi603. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.2. Ảnh hương của cac chất điều hòa sinh trương đến việc tạo sinh khôi

Đường tăng trương của dịch huyền phù tế bào dừa cạn sau 28 ngày nuôi trong môi trường có bô sung cac hormone thực vật khac nhau.613. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.2. Ảnh hương của cac chất điều hòa sinh trương đến việc tạo sinh khôiKết luận:

Môi trường có bô sung 2,4-D tạo sinh khôi tươi nhiều hơn so với môi trường bô sung NAA nhưng trong lương khô lại rất thấp. Môi trường K3 và K4 có trong lương tươi thấp hơn môi trường K1 và K2 nhưng cho sinh khôi khô nhiều hơn. Môi trường K3 cho sinh khôi tươi và khô đều cao hơn môi trường K3 nhưng xét về mặt thông kê, hai môi trường này không có sự khac biệt ơ mức ý nghĩa α = 0.01.

623. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.2. Ảnh hương của cac chất điều hòa sinh trương đến việc tạo sinh khôiKết luận: 2,4-D kich thich sự phân chia tế bào nhanh nhưng lại pha hủy cấy trúc chặt chẽ của tế bào làm cho tế bào xôp và giảm đi việc tạo cac sản phẩm thứ cấp. Cytokinin cân thiết cho sự hình thành cac hơp chất thứ cấp, khi kết hơp cytokinin với NAA giúp duy trì sự tăng trương cũng như tạo ra alkaloid cao.633. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.3. Ảnh hương của đường sucrose đến việc tạo sinh khôi

643. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.3. Ảnh hương của đường sucrose đến việc tạo sinh khôi

Đường tăng trương của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bô sung cac nông độ đường khac nhau653. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.3. Ảnh hương của đường sucrose đến việc tạo sinh khôiKết luận:Nông độ đường tăng dân từ 20 - 60 gam/l sinh khôi tươi và khô thu đươc trong môi trường tăng dân theo. Môi trường tôi ưu cho thi nghiệm về ảnh hương của nông độ đường lên sự tạo sinh khôi là môi trường Đ5.Tuy nhiên khi tăng nông độ đường lên cao hơn là 70 - 80 gam/lit thì trong lương tươi và khô giảm dân. Nông độ đường có ảnh hương đến sự tạo thành cac sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Ở nông độ đường sucrose cao vừa phải khoảng 50 –60 gam/lit sẽ kich thich tạo sinh khôi và alkaloid.

663. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.4. Định lương alkaloid vinblastin và vincristin có trong la cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bào

673. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.4. Định lương alkaloid vinblastin và vincristin có trong la cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bàoKết luận: bằng phương phap nuôi cấy dịch huyền phù có bô sung 2,4-D thì lương vincristin và vinblastin không có trong mẫu alkaloid toàn phân còn dịch huyền phù NAA + Kin cho lương vinblastin thấp hơn so với cây trông ngoài tự nhiên nhưng

cho lương vincristin kha cao trong khi cây trông ngoài tự nhiên trong thi nghiệm này lại không có.

684. KẾT LUẬN:Tìm -naphthaleneaceticđươc nông độ hormon phù hơp: Ở nông độ 1 mgl-1 acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận đươc sinh khôi và alkaloid toàn phân cao nhất trong khi cũng ơ môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ơ cùng nông độ thu đươc sinh khôi và alkaloid toàn phân thấp.Nông độ đường tôi ưu cho việc nuôi dịch huyền phù tế bào dừa cạn: ơ nông độ 60 gl-1 cho lương sản phẩm là cao nhất.

VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU69VIII. KẾT LUẬNVới nhiều ưu điểm vươt trội của mình, phương phap nuôi cấy huyền phù tế bào đang đươc ap dụng rộng rãi trong nghiên cứu cũng như trong thực tiễn sản xuất.

Nuôi cấy huyền phù tế bào đang mơ ra nhiều định hướng phat triển cho tương lai.70Tuy nhiên, do cơ sơ vật chất cơ bản cho một phòng thi nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào còn cao nên ơ Việt Nam, hướng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ dừng lại ơ mức nghiên cứu.

Trong những năm gân đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình ap dụng cac phương phap của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra cac chế phẩm sinh hoc, y hoc …VIII. KẾT LUẬN71Tài liệu tham khảoCông nghệ sinh hoc. Tập 2: Công nghệ tế bào. NXB Giao dục.Cac nguôn tài liệu trên Internet…72

http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=7712851http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5743-cac-hinh-thuc-nuoi-cay-te-bao-va-mo-thuc-vat.htmlhttp://www.bcevietnam.com.vn/index.php?option=com_ecommerce&view=detail&id=31&catid=7&Itemid=30&lang=vi