Nouveaux mécanismes de résistance aux antibiotiques…et

les bactéries en action

Y. GlupczynskiService de Microbiologie

Cliniques U.C.L Mont-Godinne

28 juin 2007

Community

- Strep. pneumoniae -MDR- CA-MRSA- Salmonella, E. coli (ESBL,

FQ)- Campylobacter (FQ,

macrolides)- Helicobacter pylori

(macrolides, imidazoles)- Myc. tuberculosis - MDR

Healthcare

- Staphyloccocus aureus(MRSA, VISA, VRSA)

- Enterococcus spp. (VRE)

- Enterobacteriaceae (BLSE, FQ, carbapénémases)

- Ps. aeruginosa - MDR- Ac. baumannii - MDR

The challenging

resistant pathogens

Antibiotiques actifs sur la synthèse protéique

16S rRNA

Mécanismes de résistance aux aminoglycosides

•

Inactivation enzymatique -

N-acetylation

(AAC)

-

O-Nucleotidylation

(ANT)-

O-Phosphorylation (APH)

•

Diminution de l’accumulation intracellulaire-

Diminution de la perméabilité

membranaire

-

Diminution du transport membranaire-

Efflux actif

•

Modification de la cible–

Mutations dans des protéines ribosomales / 16 S rRNA

Fréquent

Rare

Phénotypes

de résistance aux aminoglycosides

Phénotype Enzyme GEN TOB NET AKN ISE Espèces

Sauvage - S S S S S Toutes(Providencia)

G AAC(3)-I I/R S S S S E.coli, P. mirabilis,K. pneumoniae

A APH(3’)-VI S S S I/R I/R (rares)

KTG ANT(2”) I/R I/R S S S toutes

KTA ANT(4’)-II S R S R R (rares)

GTN AAC(2’)-IAAC(3)-II, -IV

I/RR

I/RR

I/RS/I/R

SS

SS

P. stuartiiE. coli, Proteus,KES, Citrobacter

KTNA(I) AAC(6’)-I S R R S/I/R S KES, Citrobacter

KTGNAI Imperméabilitéplus, enzymes

RR

RR

RR

RR

RR

Toutes (rares)Toutes (rares)

Methylation de l’ARNr 16S

G1405(Gram -)

A1408(Actinomycetes)

Doi

& Arakawa, Clin Infect Dis 2007; 45:88-94

Arbre phylogénique des 16S rRNA méthylasesd’Actinomycetes et de bactéries à Gram-négatif

Yamane

et al., Emerg. Infect. Dis 2005

Actinomycetes(Micromonospora,Streptomyces)

Gram-négatifs-

Enterobactéries-

Non-fermentants

??

Dendrogramme d’homologie de séquence des 16S rRNA méthylases

30-35% homologie séquence AA

Profil de résistance aux aminosides associé aux 16S rRNA méthylases

Molécule Sensibilité

4,6-

DOS* GentamicineTobramycineAmikacineArbekacine (-> Dibekacine)

Résistance HNRésistance, Résistance HNRésistance HN Résistance HN

4,5-

DOS,NéomycineApramycine

SensibleSensible

Non-

DOSStreptomycine Sensible

* DOS, deoxystreptamine

Distribution géographique des gènes codant pour les 16S rRNA méthylases

Doi

& Arakawa, Clin Infect Dis 2007; 45:88-94

Prevalence / distribution des 16S rRNA methylases « Worldwide »

•

Prévalence exacte ? (0.01 –

1%) •

ArmA

>> RmtB

> RmtA

> RmtC/RmtD

•

Asie > Europe, Am. Sud (Brésil)•

Enterobactéries

(ArmA, RmtB, RmtC)

•

P. aeruginosa, Acinetobacter

spp. (RmtA, RmtD, ArmA)•

Association avec ESBL (CTX-M-3, M-9, SHV-5/-12) ou carbapenemase

(SPM-1)

•

Localisation sur transposons composites (Tn1548)•

Plasmides transférables (Inc

L/M, Inc

FI, Inc

N)

•

Isolés à

partir de souches humaines, animales (pigs)

16S rRNA

methylases

en Belgique•

Screening 15,000 souches d’Entérobactéries dans 2 hôpitaux belges (2000-2005)

•

PCR (ArmA, RmtA/B) + Résistance HN Genta, Tobra, Amika

•

20 souches (19 armA, 1RmtB)–

K. pneumoniae

(10), E. coli

(5), E. aerogenes

(2), E. cloacae

(1),

C. diversus

(1)

•

Cas index (importation: Algérie, Serbie)•

Association constante avec BLSE (CTX-M-3, M-14, M-9)

•

Diffusion clonale (K. pneumoniae), polyclonale

(E. coli,…)•

Plasmides conjugatifs

(≠

groupe Inc

L/M, IncFI)

•

Résistance transférable in vitro (aminogl, BL, quinolones)

Bogaerts et al., JAC 2007

Profil de résistance aux aminosides caractéristique d’une souche de E. coli

productrice de 16S rRNA

méthylase

(armA)

Haut niveau de résistance: Genta, Tobra, Amika

(CMI > 256 µg/ml)

Arbekacine

(CMI > 256 µg/ml)

E. coli transconconjugant

Bogaerts

et al., JAC 2007

Fluoroquinolone Structures

Gemifloxacin

Bacterial Type II Topoisomerases Quinolone

Target Enzymes

Enzyme Subunits Activities

DNA DNA GyraseGyrase((TopoisomeraseTopoisomerase II)II)

2 2 GyrAGyrA2 2 GyrBGyrB

DNA DNA SupercoilingSupercoiling(DNA Relaxation)(DNA Relaxation)(DNA (DNA DecatenationDecatenation))

TopoisomeraseTopoisomeraseIVIV

2 2 ParCParC ((GrlAGrlA))2 2 ParEParE ((GrlBGrlB) )

DNA DNA DecatenationDecatenation(DNA Relaxation)(DNA Relaxation)

Mécanismes de résistance aux quinolones

Chromosomiques :- Diminution d’affinité

par modification de la cible (QRDR)

- Diminution de la conc. intracellulaire de l’ATB :imperméabilité

(ex. OmpF)

efflux actif (ex. AcrAB-TolC)

Plasmidiques :- Protection de la cible (protéines Qnr) 1998- Inactivation par modification de l’ATB (acétylase) 2006

Protéines Qnr (1)

Structure :QnrA

(QnrA1) dans une souche de

K. pneumoniae

(USA, 1998) : 218 AA(gène = 657 bp) Famille des protéines à

motifs penta-

peptidiques répétésMême famille que les protéines McbG

(antidote Microcine

B17) et MfpA

(19.6% et 18.9%)

MfpA

de M. tuberculosis(Vetting

et al. Biochemistry

2006)

Variants :QnrB

et QnrS

id. à

40% et 59% avec QnrA

5 variants QnrA

(1 à

5)6 variants QnrB

(1 à

6)

2 variants QnrS

(1 et 2)

QnrA

Reduces Gyrase

Binding to DNA

Tran J et al. Antimicrob

Agents Chemother

2005; 49:118-125

Protection de la cible: diminue interaction ADN -

gyrase

et donc formationcomplexe ternaire DNA-DNA gyrase-quinolones

Implication dans la R aux quinolones :R à

Ac.Nalidixique

mais pas aux FQ (mais ↑

CMI x20)

Augmente le risque de sélection de mutants résistants (QRDR)

Association avec les BLSE et AmpC plasmidiques :QnrA

associé

à

BLSE (SHV-5, SHV-7, CTX-M-15, VEB-1) et AmpC

(FOX-5) au sein d’une structure intégron

de classe 1 de type sul1QnrB

associé

à

SHV-12

(7.7% of CIP-R E. coli isolates (Shangai, China), most of them associated with CTX-M-9 ß-lactamase Wang et al. AAC 2003; 47: 2242; 11.1% of CAZR K. pneumoniae isolates in USA with FOX-5 or SHV-7 Wang et al. AAC 2004; 48: 1295-1299; 0.3% in E. coli in Paris but associated with an ESBL (VEB-1), Mammeri

et al. AAC 2005; 49:71-76)

Réservoir :Réservoir des déterminants Qnr

dans bactéries de l’environnement,

notamment le milieu marinEx. Progéniteur

de QnrA

: S. algae

(Vibrio

vulnificus,

V. parahaemolyticus,….)

Protéines Qnr (2)

Réservoirs des gènes qnr•

Bactéries

d’environnement

aquatiques

identifiés

par

homologie

de séquences

génomiques

–

Photobacterium

profundum•

66% homologie

avec QnrA

•

Clonage

de qnrA

dans

E. coli: CMI à

la cipro

augmentée

x 80

–

Vibrio

vulnificus•

60% homologie

avec QnrA

•

Clonage

de qnrA

confère

une

augmentation de CMI cipro

x 64

–

Vibrio

parahaemolyticus•

58% homologie

avec QnrA

•

Clonage

de qnrA

confère

une

augmentation de CMI cipro

x 16

–

Shewanella

algae•

Homologue de QnrA

•

Clonage

de qnrA

augmente

la CMI cipro

x 16Poirel

L et al. J Antimicrob

Chemother. 2005; 56:1118Saga T et al. Antimicrob

Agents Chemother. 2005; 49:2144

Effect of qnrA on Quinolones

Wang M et al. Antimicrob

Agents Chemother. 2004; 48:1400-1

Increase

of MIC by 16x to 125x fold

values for most

agents in qnrA

+ transconjugants

QnrA facilite la sélection de haut niveau de résistance aux quinolones

Martínez-Martínez

L et al. Lancet 1998; 351:797-9

Les systèmes de capture de gènes: les intégrons

intI1

attI

sul1qacE∆

resistance

gene

cassette (R gene)

integrase

Int

3'-

conserved

segment

attC

antP

antP

attIintI1 sul1qacE∆R gene attC

Profils de résistances d’enterobactéries porteuses d’Integrons

Antimicrobial

Percent Resistant Integron

(-)

Integron

(+)

(n = 120) (n = 54)

Piperacillin

24

94*Ceftazidime

26

33

Cefotaxime

29

44*Meropenem

0

0

Gentamicin

2

94*Ciprofloxacin

3

33*

Nijssen

S et al. Clin

Infect Dis. 2005; 41:1-9.

Espèces

1993

1996

1999

E. coli 2.6 6.2 10.1

K. pneumoniae 4.8 9.1 17.4

E. cloacae 9.5 19.0 36.4

Pourcentage de souches positivesPourcentage de souches positives

In37 in transconjugant 12-4

intI1 dfr16 aadA2 qacEΔ1

sul1 orf513 qnr ampR qacEΔ1 sul1 orf6 IS6100 EcoRII

catB3 aar-3qacEΔ1

sul1 orf513 qnr ampR qacEΔ1 sul1 orf5 orf6 IS6100 EcoRII

EcoRII cytosine methylase

aac(6’)-Ib

Gene cassettes5’-CS 3’-CS1 Common region 3’-CS2

In36 in transconjugant 4-59

intI1 aadA2 qacEΔ1

sul1 orf513 blaCTX-M-9 orf3-like qacEΔ1

sul1

In60

EcoRII cytosine methylase

IS3000

intI1 aadA2 qacEΔ1 sul1 orf513 ampC ampR qacE

Δ1 sul1 orf5

pSAL-1

intI1 aadB sul1 orf513 orf5

In7

qacEΔ1

intI1 aacA4 aadA2 sul1 orf513 catA2 qacEΔ1 sul1 orf5

In6

qacEΔ1

Unique region

In35 (InS21)

intI1 blaOXA-2 orfDqacEΔ1 sul1

orf513blaCTX-M-2 orf3

qacEΔ1

orf5

qacEΔ1 sul1dfrA10

sul1

dfr16

aac(6’)-Ib

intI1 blaOXA-30

Wang M et al. Antimicrob

Agents Chemother. 2003; 47:2242-8

Associations of qnr genes with complexSul1-type integrons

Plasmid-Encoded Quinolone Resistance: Qnr Genes

Robicsek

A et al. Lancet Infect Dis

2006; 6:629-40

Resistance patterns of E. coli J53 and E. coli J53/pQR1 transconjugant

E. coli J53 Transconjugant E. coli J53/pQR1

Worldwide distribution of Qnr Quinolone Resistance Genes

Robicsek A et al. Lancet Infect Dis 2006; 6:629-40

•

Europe–

E. coli: 1 of 297 NalR

with qnrA

(France)

–

Enterobacteriaceae: 1 qnrA

associated with VEB-1 β-lactamase

(France)

–

Enterobacter

–

1 of 703 with qnrA

(Germany)–

Citrobacter

freundii:

qnrA

outbreak in 4 patients

(German ICUs)–

E. cloacae, K. pneumoniae, E. coli, C. freundii: 15 qnrA

(32%) of 47 (ciproR

cefotaxR) (UK)

Prevalence of Plasmid-Mediated Quinolone Resistance

Mammeri

H et al. Antimicrob

Agents Chemother

2005; 49:71Jonas D et al. Antimicrob

Agents Chemother

2005; 49:773Poirel

L et al. Antimicrob

Agents Chemother

2005; 49:3091Corkill

JE et al. J Antimicrob

Chemother

2005; 56:1115

•

Europe–

Enterobacteriaceae

(France 2002-2005):

28 /1468 (1.9%) isolates3.3% of all ESBL + isolates; 0% in non-ESBL isolates22 qnrA

E. cloacae

(78%) associated with SHV-12

clonal

spread in two hospitalsexistence of different integrons

structures

Prevalence of Plasmid-Mediated Quinolone Resistance

Cambau

et aL. Clin

Microbiol

Infect. 2006; 12: 1013-20Honoré

et al. Pathol

Biol. 2006; 54: 270-9

Acétylase AAC(6’)-Ib-crRésistance enzymatique aux quinolones

Aminoglycoside

acétyltransférase

qui confère la R à

(Kana), Tob

et AmikVariant de l’AAC(6’)-Ib

avec 2 mutations :

. Trp102Arg

. Asp179Tyr

Mutations resp. de la R à

certaines FQ par acétylation au niveau cycle pipérazinyle

non substitué

(comme CIP et NOR ++)

Effet de l’AAC(6’)-Ib

sur les CMI des FQ :

Résistance de bas niveau (x 4), mais favorise la sélection de haut niveau de résistance si exposition aux quinolones

aac(6’)-Ib-cr sur

plasmide

avec ou

sans gènes

qnr

(effets

additifs)

Souche CMI (µg/mL)CIP NAc-CIP ENR NOR PEF LEV GEM

DH10B 0.02 0.08 0.02 0.156 0.08 0.08 0.005DH10B + aac(6’)Ib-cr 0.04-

0.08

0.08 0.02 0.625 0.08 0.08 0.005

Infections nosocomiales avec des souches ‘pan-résistantes’

•

Nombreuses

descriptions “worldwide”

d’

Entérobactéries, P. aeruginosa

et Acinetobacter

spp. resistants

à

tous

les

antibiotiques, excepté

la colistine/polymyxin

B.

•

Nombreuses

épidémies

avec des organismes

génotypiquement reliés, soulignant

la nécessité

de mesures

de lutte

contre

les

infections nosocomiales

renforcées

A. baumannii et la médiatisation

Activity of broad-spectrum antibiotics against Acinetobacter

spp.

Acinetobacter - MYSTIC Belgium - 1998/2005

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MEM IMP CAZ CPE TAZO CIP AN

% s

usce

ptib

le s

trai

ns

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

With

courtesy

from

G. Ieven

(03/2006)

Imipenem-resistant Acinetobacter Jan ’96- Dec ‘03, USA

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

Per c

ent

R ITSN®-Database, USA

Carbapenemases de type-OXA (oxacillinases)

• Enzymes Classe D, >120 enzymes

• 4 clusters génomiques chez Acinetobacter(OXA-23/27, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58)

• Support génétique mobile (transposons, plasmides)

• Prévalence élevée dans certains pays (Grèce, Espagne, Portugal, Turquie, France, UK,…)

• Multi-résistance (penicillines, +/- inhibiteurs BL, C3, C4,aminoglycosides, SXT,…)

• Niveau de résistance variable à imip & merop (4->256 µg/ml)

Class DOxacillinase-Mediated Resistance to carbapenem

Three main clusters (amino acid identity)

OXA-40OXA-24OXA-25OXA-26

OXA-23OXA-27

OXA-58 (less than 48% with the two other clusters)

99%

99%60%

Acinetobacter sp.

Enterobacteriaceae

OXA-48

Class D (OXA) carbapenemases

in Acinetobacter

baumannii

Oxa-23 Oxa-58

•

Prévalence en Belgique (1-5% ??)

•

Alerte nationale 2003-2004 (Epidémie d’

A. baumannii VEB-1 en France)

•

Epidemies

d’infections à

A. baumannii

dans qq

hôpitaux-

BLSE type VEB-1 & PER-1

(Naas et al., JAC 2006)

-

Carbapénémases

OXA-23, OXA-58 (Bogaerts

et al., JCM 2006)

(Bogaerts

et al., ICAAC 2006)

•

Cas sporadiques d’infections à

A. baumannii

MR (Importation: Espagne, Portugal, Grèce, Turquie, Af. Sud)

Acinetobacter

spp.

producteurs

de carbapenemase

OXA et de BLSE en Belgique

Pseudomonas aeruginosa - MYSTIC Belgium - 1998/2004

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MER IMI CAZ CPM PTZ CIP AMU

% s

usce

ptib

le s

trai

ns

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

Activity vs

Pseudomonas aeruginosa

n=263 n=211 n=233 n=264 n=214 n=204 n=242

P. aeruginosa

isolate

producing

VIM-2 carbapenemase

ß-lactamases

plasmidiques

de classe B Enzyme Espèce

Pays (isolement)IMP-1 S. marcescens, K. pneumoniae, K. oxytoca

E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, M. morganii, P. rettgerii JaponA. xylosoxydans, A faecalisP. aeruginosa Japon, SingaporeP. stutzeri, P. putida, P. fluorescens Japon, Singapore B. cepacia JaponA. baumannii Japon, Corée, ItalieA. junii Angleterre

IMP-2 P. aeruginosa JaponA. baumannii Italie, JaponA. lwoffi

JaponIMP-3

S. flexneri JaponIMP-4

A. baumannii Hong-KongC. youngae ChineK. pneumoniae, E. coli

AustralieIMP-5

A. baumannii PortugalIMP-6

S. marcescens JaponIMP-7

P. aeruginosa Canada, MalaisieIMP-8

K. pneumoniae, E. cloacae TaiwanIMP-9

P. aeruginosa ChineIMP-10

P. aeruginosa, A. xylosoxydans JaponIMP-11

P. aeruginosa, A. baumannii JaponIMP-12

P. putida ItalieIMP-13

P. aeruginosa, Italie, Belgique…IMP-21

Enzyme Espèce

Pays (isolement)VIM-1

P.aeruginosa Italie, GrèceA. baumannii ItalieA. xylosoxydans ItalieP. putida ItalieE. coli Grèce

VIM-2

P. aeruginosa France,

Belgique, Grèce , Italie,

Japon, Corée, Portugal, Espagne,Croatie

A. baumannii Italie, CoréeE. cloacae CoréeS. marcescens CoréeP. putida Corée, Taiwan, JaponP. stutzeri TaiwanA. xylosoxydans Corée C. freundii Taiwan

VIM-3

P. aeruginosa TaiwanC. freundii Taiwan

VIM-4 P. aeruginosa Grèce , Suède, Hongrie, Pologne, Belgique

VIM-5

P. aeruginosa TurkieK. pneumoniae Turkie

VIM-6

P. putida SingaporeVIM-7

P. aeruginosa USA…VIM-12

SPMSPM--11

P. P. aeruginosaaeruginosa BrBréésil (1997)sil (1997)

GIMGIM--11

P. P. aeruginosaaeruginosa Allemagne (2003)Allemagne (2003)SIMSIM--11

A. baumannii CorCoréée (2005)e (2005)

Carbapenèmases

•

Metallo beta-lactamases (Classe B)

–

P. aeruginosa, S. marcescens, Acinetobacter….

–

Plasmides/intégrons

–

Spectre large (hydrolysent tous les beta-lactames sauf aztreonam)

–

Japon/Corée, US, Italie, Grèce, France

–

Fréquence ↑ depuis 1995–

Pas de relation claire avec exposition préalable aux carbapenèmes

–

réservoir des gènes de résistance (bactéries de l’environnement ?)

Pseudomonas aeruginosaSPM-1 (MBL)

Class B beta-lactamasesMetalloenzymes (MBL) - Carbapenemases

+ EDTA+ EDTA

EDTA (240 µg)

EDTA (120 µg)

Imipenem (10 µg) + EDTA (240 µg)

Imipenem (10 µg) + EDTA (120 µg)

Genetically mobile (acquired) metallo-β-lactamase genes

• IMP-1 (now to IMP-23) • VIM-1 (now to VIM-12) • VIM-7 (North America)• SPM-1 (South America)• GIM-1 (Germany)• SIM-1 (Korea)Broad spectrum β-lactam resistance

Highly mobile (integron-associated)

Increasing prevalence worldwide

Few treatment possibilities (colistin !), no clinically available inhibitor

SE AsiaS. AmericaEurope (Italy, Greece, France,…)

IntI1 aacA7 blaVIM-2 aacC1 aacA4 qacEΔ1/sulIn58

Mobile metallo-β-lactamases

Found as gene cassettes on integrons(co-resistance to other drugs)

5’CS 3’CS

Resistance gene collection device

attI1 site 59 base element

Structure

variable region

Mobile—gene cassettes—transposons—plasmids etc

Nordmann

P, Poirel

L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin Microbiol

Infect. 2002 .Walsh TR, Toleman

MA, Poirel

L, Nordmann

P. Metallo ß-lactamases; the quiet before the storm. Clin Microbol

Rev

2005

Associated

resistance….

Metallo-β-Lactamases: epidemiology

Senda et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1996; 40:349Kurokawa et al., Lancet 1999; 354:955Yamasaki et al., J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51:631

Country IsolatesYear(s) PrevalenceSpecies

Japan 92-94 P. aeruginosa 3700 (17 hosp.) 0.4% (IMP)

Japan 96-97 P. aeruginosaS. marcescens

25333222

1.3% (IMP)4.4% (IMP)

Japan 98 & 00 P. aeruginosaEnterobacteriaceae

200800 0.7% (IMP)

Greec

e98-00 Pseudomonas spp. 233 (1 hosp.) 0.9% (VIM)

Italy 01 P. aeruginosa 506 (1 hosp.) 0.8% (VIM)

Nationwide

Regional

Tsakris et al., Clin. Microbiol. Infect. 2003; 9:846Luzzaro et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 48:13Jones et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 49: 289Kimura et al., J. Clin, Microbiol. 2005; 43: 458

Japan 98-02 Gram-negatives 801 (3 hosp.) 1.1% (IMP)

Japan 02 P. aeruginosa 594 1.9% (IMP/VIM)Nationwide

•

No exact data on frequency/prevalence

for Belgium, but present

at

least in P. aeruginosa

(P. putida)

–

>80 VIM+ P. aeruginosa

isolates

in 8 hospitals

since associated

with

limited

or major outbreaks

–

Spread

of two

major clones across

different

hospitals

–

Multi-drug

resistant

(variable resistance

profiles)

–

VIM-2, gene

cassettes on class 1 integrons

Where are we now with metallo-β-lactamases in Belgium ?

Deplano

et al. Eurosurveillance

2007

Conclusion

•

Souches pan-résistantes–

détection

du/des mécanisme(s) difficlie

–

responsables d’épidémies

–

Rôle des systèmes de capture de gène (intégrons) dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques

•

Surveillance des taux de résistance aux antibiotiques ne suffit plus–

Les taux de résistance (incidence, prévalence) peuvent cacher un mécanisme émergent de résistance

–

Importance de la mise en évidence précoce des mécanismes émergents de résistance aux antibiotiques

–

==> OUTILS MOLECULAIRES–

==> OBSERVATOIRES DE SURVEILLANCE NATIONALE

(centres de réf.)

Treatment regimens for multi-resistant Gram-negative organisms

- No new drugs expected for the coming years- Resistance will get worse not better