Nuevas técnicas de secuenciación en el diagnóstico genético 24... · •1977-Frederick Sanger desarrolló la tecnología de secuenciación basada en la terminación de cadena

Nuevas técnicas de secuenciación en el diagnóstico

genético Ana Mª Pérez Caballero

FEA en Análisis Clínicos

Molecular Clinical Scientist

NE Thames Regional Genetics Service

Great Ormond Street Hospital

Congreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

• 1977 -Frederick Sanger desarrolló la tecnología de secuenciación basada en la terminación de cadena.

• 1987- Introducción de secuenciadores automatizados ABI 370 seguido de secuenciadores capilares.Tamaño de lectura de 600 pb produciendo una lectura de 500Kbases/día

• 1995- ABI 3730XL 2.88M bases por día tamaño de lectura 900 pb

• 2001 – Se completa la secuenciación del Genoma Humano – necesidad de nuevas tecnologías

• 2005 – 454 desarrollo de la pirosecuenciación (Roche) y Solexa Genome Analyser secunciación por síntesis(Illumina)

• 2006 – ABI/Life technologies introducen SOLID system (Sequence by Oligo Ligation Detection).

• Futura 3º generación – Secuenciadores de moléculas sencillas y secuenciadores de lectura larga.

Un poco de historia


2018


2018

chain termination through dideoxynucleotide incorporation

Dideoxynucletide is labelled to allow detection. Original Sanger method used radioactivity to do this

4 separate reactions for each nucleotide

Fragments are size-separated in a gel

• Síntesis por terminaciónmediante incorporación de dideoxinucleótidos

• El cebador está marcado. El método original usabaradioactividad.

• Hay 4 reacciones distintas, unapara cada tipo nucleótido.

• Los fragmentos son separadospor tamaño en un gel

Secuenciación Sanger o de terminación de cadena


2018

Secuenciación Sanger o de terminación de cadena


2018

• Cada dideoxinucleótido está marcado con fluorocomo diferente,por lo que el proceso se lleva a cabo en una única reacción.

• La electroforesis capilar separa los distintos fragmentos portamaño e identifica el nucleótido presente al final de cadafragmento dependiendo del tipo de fluorocromo.

• Hasta 96 muestras pueden ser secuenciadas al mismo tiempo,pero sólo un único fragmento.

Secuenciación Sanger automatizada


2018

BRCA1 c.5266dup p.(Gln1756Profs*74)

• Gold standard• Estudio de pequeños genes (Conexina 26), estudios familiares y

confirmación de resultados de NGS

Secuenciación Sanger


2018

• Distintas plataformas de NGS que usan diferentes técnicas desecuenciación están disponibles en el mercado.

• Todas las plataformas de secuenciación masiva llevan a cabo lasecuenciación de millones de pequeños fragmentos de ADN dedistintos pacientes en paralelo.

• Los análisis bioinformáticos se utilizan para poder agrupar todaesta información y mapear las lecturas individuales con el genomahumano de referencia.

• Cada base es secuenciada múltiples veces para conseguir

resultados precisos.

Secuenciación masiva Next Generation Sequencing (NGS)


2018

• NGS – secuenciación masiva• Roche, 454 Life Sciences• Life Technologies (ION Torrent & ION Proton)• Illumina (Hiseq, Miseq & Nextseq)

• Tercera generación de secuenciación• Pacific Biosciences (PacBio RS)• Oxford Nanopore (MinION, PromethION, GridION)

Roche 454 GS FLX Illumina

ThermoFisher Ion PGM Applied Biosystem SOLID

Secuenciación masiva Next Generation Sequencing (NGS)


2018

Secuenciación Sanger vs Secuenciación masiva

Sanger NGS

Secuenciación de fragmentos largos Secuenciación de fragmentos cortos

Baja tasa de error Alto rendimiento

Secuencia por muestra Se pueden secuenciar distintas muestras al mismo tiempo

Requiere grandes cantidades de ADN Screening de paneles de genes es más rápido

Alto costo por base Método más económico


2018

Preparación de librería

Enriquecimiento Secuenciación Análisis de datos

NGS - Pasos


2018

• Fragmentación de ADN (pequeños fragmentos) Fragmentación física Fragmentación enzimática Fragmentación química

• Unión de adaptadores y barcodes

• Selección de los fragmentos de ADN.

• Cuantificación de la librería.

Preparación de librería / preparación de la muestra


2018

• Secuencia específica para la unión a la fase sólida• Secuencia específica para secuenciación • Barcodes – único para cada muestra

ADN fragmentado

Adaptadores


2018

Selección de los fragmentos de ADN


2018



NGS - pasos


2018

PCR por emulsión

Amplificación en puente (bridge amplification)

Imágenes publicadas por M. Metzker Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46. doi: 10.1038/nrg2626. Epub 2009 Dec 8.

Enriquecimiento / cluster generation


2018

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19997069



NGS - pasos


2018

Pirosecuenciación (Roche 454 GS)

Terminación reversible cíclica (Illumina / Helicos BioSciences)

Secuenciación


2018

Secuenciación por ligación (Applied Biosystems)


2018

Secuenciación por ión semiconductor (ION Torrent)


2018



NGS - pasos


2018

Análisis de datos


2018

NGS Pipeline

• .blc

• .fasq

Raw data

• Genomas de referencia

• De novo

Alineamento • Mapeo

• Anotación

Identificación y anotación de

variantes

• Bases de datos generales y locales

Filtro de variantes • Delecciones

• Duplicaciones

CNVs

Análisis de calidad

Profundidad: número de veces que cada base de ADN está presente en las lecturas producidas durante la secuenciación. Determina la fiabilidad del nucleótido asignado a una posición dada en el genoma.

Cobertura: número de lecturas presentes una región dada o en la totalidad de regiones de la secuencia reconstruida. Informa de cómo ha funcionado la secuenciación (normalmente x30).


2018

Alineamiento


2018

NGS Pipeline

• .blc

• .fasq

Raw data

• Genomas de referencia

• De novo

Alineamento • Mapeo

• Anotación

Identificación y anotación de

variantes

• Bases de datos generales y locales

Filtro de variantes • Delecciones

• Duplicaciones

CNVs


2018

Variante


2018

Clasificación de variantes

Tipo de variante (missense, nonsense, frameshift)

Localización de la variante (Hot spot, dominio importante para la proteína?)

Frecuencia en la población (Exac, gnomAD)

De novo

In silico tools

Publicado previamente?

Segrega la variante con la enfermedad


2018

• Diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias Secuenciación dirigida Secuenciación del exoma Secuenciación del genoma

• Diagnóstico prenatal NIPT NIPD

• Análisis del transcriptoma (ARN-Seq - Transcriptoma completo)

• Estudio del microtranscriptoma

• Identificación de zonas de interacción proteína-ADN (ChIP-seq)

• Identificación de patrones de Metilación (metiloma)

Aplicaciones


2018

GOSH: Panel de 82 genes

Secuenciación dirigida


2018


2018


2018

Diagnóstico Prenatal


2018

Diagnóstico Prenatal

Informar de resultado desfavorable para el feto y / o la madre

Manejo del embarazo

Posibilidad de intervención rápido después del nacimiento

Idear plan para posibles complicaciones durante el parto

Planificar futuros embarazos


2018

Invasivo vs no invasivo

CVS: entre 11-14 semanas de gestación Pequeño riesgo de aborto asociado Pequeño riesgo de infección Posibilidad de tener que repetir la toma de muestra

Amniocentesis entre 15-20 semanas de gestación Pequeño riesgo de aborto asociado Pequeño riesgo de infección

cffDNA

no riesgo asociado de aborto

obtención de la muestra es más sencilla

diagnóstico más temprano (desde 7 semanas)

AMNIOCENTESISCVS


2018

ADN fetal circulante (cffDNA)

Es producido por la placenta (trofoblasto)

Representa el genoma fetal completo

Detectable desde 4 semana

% incrementa con el embarazo

10-20% del total cfDNA

Es eliminado de la circulación en 30 mins después del parto

Más corto que el cfDNA materno

cfDNA materno 166bp

cffDNA 143bp

Cell free DNA


2018

Definiciones

• NIPD: DIAGNÓSTICO – No es necesario una técnica invasiva para confirmar los resultados

• Transtornos de un solo gen

• Determinación del sexo

• NIPT or NIPS: TESTING or SCREENING

• Aneuploidías

Requiere de técnica invasiva para confirmación de los resultados


2018

NIPT or NIPS: TESTING or SCREENING

10-11 semanas de gestación

NIPT para T21 tiene un alta tasa de detección (>99%)

Menos falsos positivos que el triple screening

Reducción del número de técnicas invasivas

No ofrecido por el NHS, pero en proceso de deliberación (para mujeres con triple screening positivo)


2018

NIPT – ¿Por qué no es una técnica de diagnóstico?

Técnica invasiva es necesaria para confirma los resultados

Reorganizamientos cromosómicos maternos/

Mosaicismo

Tumores en la madre

Vanishing twin

Falsos positivos

Mosaicismo confinado a la placenta


2018

• Enfermedades severas ligadas X

• Únicamente afecta a hombres

• DMD, SCID, hemofilia, etc

• Diagnóstico invasivo sólo se lleva a cabo si el feto es de sexo masculino

• Hiperplasia adrenal congénita

• Autosómica recesiva

• Riesgo de virilización genital en niñas afectadas

• El saber el sexo del feto permite la administración de dexametasona

• Diagnóstico invasivo únicamente necesario si es niña

• Identificación mediante ecografía de genitales ambiguos

Hill et al 2011 Prenat Diagn 31:267-73; Hill et al 2011 Clin Genet 80:68-75

Determinación no invasiva del sexo


2018

Diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD)

Detección de ADN fetal circulante (cffDNA) en plasma materno para ofrecer unaalternativa a las técnicas de diagnóstico invasivo.

Enfermedades dominates de origen paterno

Anomalias ecográficas asociadas a determinadas enfermedades genéticas –displasias esqueléticas ( acondroplasia, Apert o Crouzon)

Parejas con previa descencendia con enfermedad genética (variantes patogénicaes de novo)

Exclusión del alelo paterno en enfermedades recesivas en las que los padres sonportadores de distintas variantes.

Análisis de dosis de haplotipos relativos. Relative Haplotype Dosage Analysis(RHDO) Parejas con riesgo de tener descencencia con enfermedad genéticarecesiva


2018

Muchas gracias por vuestra atención


2018

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