OBRANNÉ MECHANISMY U HMYZU A HMYZÍ IMUNITA1. mechanické- mesenteron je nejcitlivější částí trávicí soustavy, není vystlán chitinem, jednořadý trávicí epitel- proto využití peritrofické matrix- její tvorba je postupný děj: vyloučí se chitinové fibrily (neorientované), na ně se nachytávají speciální proteiny – peritrofiny tvorba tenké vrstvy- 24 hod. po sání je peritrofická matrix plně vyvinutá, je relativně tlustá a vychytává se na ní hem- uvnitř je krev trávená pomocí trypsinu, chymotrypsinu – postupně je krev trávena, peptidické štěpy prochází přes matrix do ektoperitrofického prostoru – štěpení exopeptidázami vstřebání buňkami střevního epitelu- matrix se pak rozpadá a je vydefekována- prvoci přizpůsobení pro přenos tímto hmyzem to řeší různým způsobem:1. plasmodia mají chitinázu (uniknou skrz tenkou peritrofickou matrix)2. filárie musí uniknout ještě před vytvořením matrix3. leishmanie přetrvávají v matrix a čekají, až se v ní objeví trhlina ke konci trávení

2. imunologické bariéry: - mnohé součásti imunity členovců jsou podobné vrozené imunitě obratlovců- nemají molekuly typu protilátek- rozlišujeme buněčnou a humorální složku imunity- buněčná složka tvořená hlavně hemocyty, humorální složka např. antibakteriálními peptidy- nižší specifita odpovědi než u obratlovců• rozpoznávací molekuly:- nejsou to imunoglobuliny, ale:1. lektiny: proteiny, vážou cukr, nebo cukerné struktury (polysacharidy, oligosacharidy..)2. LPS vázající proteiny (lipopolysacharid) – LPS je hlavní součástí BS gramnegativních bakterií3. β-1,3-glukan vázající proteiny: součást BS u kvasinek- pomocí těchto molekul jsou schopni rozpoznávat vlastní a cizí

BUNĚČNÁ SLOŽKA IMUNITY- místo leukocytů – hemocyty: ničí to, co je rozpoznáno jako cizí- 2 hlavní mechanismy zneškodnění cizí částice:1. když je to malá částice (viry, bakterie) tak fagocytují, stráví tuto částici pomocí antibakteriálních peptidů2. objekty příliš velké na fagocytosu - enkapsulace, označí cíl a další hemocyty se kolem něj nabalí a opouzdří ho- po opouzdření částice se spouští melanizace profenoloxidasovou kaskádou- celý proces imunitní reakce trvá desítky hodin až dny

- některé hemocyty jsou oválné, kulaté, obsahují granule, jiné jsou amébovité s panožkami- 2 základní typy hemocytů: - prohemocyty: „kmenové buňky“, množí se a diferencují do ostatních typů a) plazmatocyty: dělají pseudopodie = panožky, fagocytujíb) granulocyty: jsou plné granulí, když se přiblíží k cizímu cíli tak na něj vylijí granule a označí ho kaskáda

HUMORÁLNÍ SLOŽKA IMUNITY- reprezentována antibakteriálními peptidy a profenoloxidasovou kaskádou1. profenoloxidasová kaskáda: profenoloxidasa fenoloxidasa - spustí se kaskáda proteáz- produkty štěpení polymerizují na melanin – černé barvivo, hromadí se u cizích objektů- černé fleky označují oblasti, kde došlo k melanizaci patogenu- melanizace patogen separuje- některé meziprodukty kaskády jsou pro patogen toxické- pomáhá členovcům přežít v případě poranění (když mouše ustřihneme nohu, udělá si na konci pahýlu špunt z melaninu)

2. spouští se antimikrobiální peptidy a lysozym- můžou patogena zabít- spouští se spolu s kaskádou, často je melanizovaný patogen zabit těmito peptidy (ještě před dokončením opouzdření)a) lysosym: - malý protein (12-14 kDa)- vyskytuje se např. v slzách obratlovců, ve vaječném žloutku - funguje proti G+ bakteriím, protože štěpí peptidoglykan (hlavní složka BS G+ bakterií)

- je to specifický enzym peptidoglykanasab) defensiny, cekropiny, diptericiny: - peptidy ( 4-5 kDa)- liší se strukturou- defensiny: fungují na G+ bakterie, penetrují membrány- cekropiny: fungují na G- bakterie, vkládají se do vnější membrány bakterií, někdy i prvoků- dipterciny: inhibují transkripci genů pro proteiny BS bakterií

INTERAKCE PATOGEN-PŘENAŠEČ-HOSTITEL- př.: Plasmodium je přenášeno komáry rodu Anopheles, způsobuje malárii- životní cyklus komára- larvy komárů potřebují vodu (stojatou nebo tekoucí), různé rody komárů kladou vejce do různých biotopů- Culex, Anopheles: kladou vajíčka přímo na vodní hladinu, larvy žerou fytoplankton, rostou, udělají 4 larvální instary, svléknou se, zakuklí a z kukly přímo na vodní hladině vylézá komár- přenos: Culex: hlavně filariózy, viry (West Nile aj.)

Aedes: hlavně viry (žlutá zimnice, horečka dengue aj.)Anopheles: hlavně malárie

- životní cyklus Plasmodia- komár nasaje gametocyty, které jsou uvnitř červených krvinek - musí dozrát na gamety- 2 typy gamet: a) samičí makrogameta b) samčí mikrogameta: pohyblivé, tenké, vyhledávají samičí gamety- po splynutí gamet vzniká zygota (ookinet): podlouhlá, pohyblivá, je schopna pronikat skrz střevo komára- ve střevě se gametocyty, gamety a ookinet setkávají s trávicími enzymy, které se začnou exprimovat po nasání krve- musí utéct ze střeva dřív, než bude vysoká aktivita trávicích enzymů- ookinet proniká skrz peritrofickou matrix, skrz mezeteron (jednořadý epitel střeva), proniká pod bazální membránu, zapouzdří se tam oocysta- v oocystě vznikají sporozoidi, kteří pronikají do slinných žláz, kde čekají, až bude komár znovu sát, injikují se do hostitele

- proteolytické enzymy jsou nebezpečné, pokud by byly ookinety vystaveny velkému ataku, hrozí nebezpečí, že budou stráveny- na druhou stranu je nutná jistá hladina trávicích enzymů- ookinet musí být vytvořen včas, aby se setkal s určitou hladinou trávicích enzymů - aktivují prochitinázu na chinázu - pomocí ní je ookinet schopen penetrovat vznikající peritrofickou matrix- na ookinet mohou zaútočit i antimikrobiální peptidy (defensiny, cekropiny – in vitro jej zabíjí) - geneticky modifikovaný komár (transgenní komár): 1. gen pro efektorovou molekulu, která je pro Plasmodium letální (cekropin, defensin, nějaká fosfolipasa..) 2. něco, co způsobí, že je tato molekula exprimována ve správnou dobu a na správném místě (promotor reagující na situaci ve střevě), tj. jen po nasátí a jen ve střevě- př. transgenní komár Anopheles gambiae, gen pro fosfolipasu včelího jedu, před ním promotor ze střevní karboxypeptidázy (podílí se na trávení – zajištěna exprimace ve správný čas)

- ookinet se dále musí dostat do buňky (poté co penetroval matrix, vyhnul se enzymům a antibakteriálním peptidům)- rozeznává cukerné epitopy střeva pomocí adhezivních proteinů (rozpoznávají proteoglykany a glykosaminoglykany, které jsou na vnitřním povrchu mezenterálního epitelu)- transgenní komáři syntetizují protilátky, které se naváží na povrchový proteoglykan a zamaskují receptory, na které by se ookinet mohl vázat- ookinet vleze do buňky, následuje reakce buňky (snaží se ho zbavit) - spustí vysokou produkci NO (toxický pro buňku i pro ookinet)- buňka se mění, mění se i její jádro a ookinet musí rychle utéct, často je pro něj jednodušší utéct do vedlejší buňky než aby procházel celou dlouhou buňku na druhou stranu- uteče pod bazální membránu, za ním zbude pár buněk, které zareagovaly sebezničujícím procesem, jsou vypuzeny do lumen střeva a vydefekovány- možnosti různé interpretace tohoto děje:

1. teorie Rossových buněk: plasmodia napadají pouze tzv. Rossovy buňky (podle Rosse, který objevil životní cyklus Plasmodií), liší se od okolních buněk (mají málo mikrovilů, jsou divné), domněnka, že Plasmodium vyhledává tyto buňky2. poté se přišlo na to, že morfologické změny buňky jsou až důsledek toho, že do ní Plasmodium vniklo teorie časované bomby: ve chvíli kdy Plasmodium vleze do b., začne mu odtikávat čas, musí z ní utéct

- pod bazální membránou je Plasmodium chráněné před imunitními reakcemi oocysta sporozoiti- sporozoiti se musí dostat do slinných žláz pomocí chemotaxe- nevnikají do nich náhodně, vnikají pouze do konců bočních laloků- 3 oddíly slinných žláz u Anophelese: 2 boční (laterální) laloky – ty jsou vyhledávány, obsahují na povrchu jiné cukerné epitopy, Plasmodium se na ně naváže pomocí CSP (cirkumsporozoit protein)+ 1 mediální lalok- ve slinných žlazách čekají sporozoiti až budou inokulováni do hostitele při dalším sání- nehoda: sporozoit je rozpoznán hemocyty v hemolymfě (v případě, že je Plasmodium nasáto do špatného komára)- jakmile je sporozoit ve slinné žláze – komár se stává vysoce infekčním pro člověka- snižují syntézu apyráz ve slinách komár hůř saje, pomaleji, hůř nachází cévu komár mění hostitele a saje opakovaně, Plasmodium zvyšuje šanci přenosu

- př. Leishmania přenášena flebotomy- životní cyklus flebotomů- žijí v hnízdech hlodavců, ve škvírách pod podlahou, v půdě kontaminované trusem a organickým odpadem- larvy ve vlhké půdě, kuklí se tam, líhnou se tam dospělci- přenášejí leishmaniózy, Bartonellu (bakterie způsobující smrtelné onemocnění u lidí), některé viry (nejbližší v Itálii) Phlebotomus: Evropa, Asie, AfrikaLutzomyia: S a J Am.

- životní cyklus Leishmanie- flebotom při sání plivne do hostitele bičíkaté stadium – promastigot, ty jsou odchyceny fagocytujícími buňkami, jsou fagocytovány, ale nejsou zničeny! - Leishmanie dokáže přežít i uvnitř neutrofilů a makrofágů (obratlovčí buňky, které jsou jinak schopné velmi efektivně usmrtit vše, co pohltí)- uvnitř buňky jsou bezbičíkatá kulatá stadia – amastigoti - mají jádro, kinetoplast, malý základ bičíku v periflagilární kapse, nepřesahuje přes okraj prvoka- lidé trpí buď:1. kožní leishmaniózou: vřed na kůži, hojí se za několik měsíců až rok (spontánně), je to nepříjemné2. viscelární leishmaniózou: napadá slezinu, játra smrt- napadáni nejsou jen lidé, ale i zvířata

- flebotom nasaje krev s infikovanými buňkami, v jeho střevě vznikají podlouhlí bičíkatí promastigoti- Leishmanie nejdou do slinných žláz, celý cyklus absolvují v trávicí trubici přenašeče

- kritické momenty:1. vývoj uvnitř nasáté krve- nasátá krev je obklopena peritrofickou matrix- uvnitř tohoto endoperitrofického prostoru se Leishmanie transformují do stadia promastigota- musí přežít vysoké koncentrace proteáz flebotoma, nemá kam utéct, čeká, až se začne peritrofická matrix rozpadat (3-4 dny), po celou dobu se exprimují trávicí enzymy- přežije to, protože má na svém povrchu chránící molekuly (chrání proti trávicímu enzymu – trypsinu): a) glykoinositolfosfolipid (GIPLS) - tvoří mechanickou bariéru, proteázy přes něj nemůžou naštípat proteinyb) metaloproteinasa - působí proti přenašečovým enzymům a štěpí je- tyto ochranné molekuly dokážou exprimovat až promastigoti, amastigoti ne

2. únik z peritrofického prostoru, přichycení na epitel mezenteronu- ke konci trávení se peritrofická matrix začíná rozpadat, unikají skrz trhliny a přichytávají se bičíky k mezenteronu- Leishmanie sice mají chitinázu, ale v tento moment není aktivní a neslouží k úniku skrz matrix- přichycení bičíkem mezi mikrovily mezotronu, aby nebyly vydefekovány3. migrace směrem k hlavě, přichycení na stomadeální valvu- když přežijí defekaci, začnou se množit a morfologicky měnit, vytvoří další formy

- změny forem provázeny změnou povrchových molekul!1. nektomonády: ve střevním obsahu, ucpávají trávicí trubici tvorbou gelu obsahujícího filamentózní proteofosfoglykan2. haptomonády: přichycené na stomodeální valvu, poškozují ji chitinázou a metaloproteinázou, udělají tam změny, které zvýší pravděpodobnost přenosu na hostitele3. metacykličtí promastigoti: stádium virulentní pro obratlovce (LPG chrání povrch proti komplementu)- nektomonády mají LPG (lipofosfoglykan) poměrně krátký, metacykličtí promastigoti mají LPG velice dlouhý, chrání je (hustá vrstva dlouhého, tlustého LPG – chrání celou buňku proti lidskému komplementu – povrchový plášť)- LPG se nejen prodlouží, ale zároveň změní povrchové epitopy- Leishmanie, která se poutá na střevní epitel má na konci LPG galaktosu, ta umožňuje přichycení na galektiny (na povrchu střevního epitelu)- dojde k výměně galaktosy za arabinosu, která není vázána galektiny – odpoutání, vyvržení do hostitele při dalším sání (arabinosu má až metacyklický promastigot)

- stomadeální valva pouští potravu jen jedním směrem, co je nasáté už nesmí zpátky- nektomonády vyprodukují gel, mechanicky blokuje valvu – zůstává otevřená- když se flebotom snaží sát, tak zvrací- chitinová výstelka valvy je zničena haptomonádami

• ovlivnění přenašeče1. trávicí trubice ucpaná gelovitou zátkou (nektomonády, filamentózní proteofosfogykan)2. mechanické poškození stomadeální valvy (haptomonády, chitinázy, metaloproteinázy)• ovlivnění hostitele1. imunomodulační účinek slin a proteofosfoglykanu2. zvýšení atraktivity hostitele s viscerální leishmaniózou (potí se, horečka, láká flebotomy na zápach)

- do hostitele jsou vyvrhovány sliny a proteofosfoglykan - mají imunomodulační účinek, mají vliv na přenos patogenu- patogen využívá účinku slin, aby se dokázal uchytit v hostiteli- ve slinách: antikoagulační faktory, apyrázy, vasodilatátory - zabraňují hemostázi, mají anestetický a protizánětlivý účinek- sliny flebotomů ochromují makrofágy v místě sání, Leishmanie přichází do prostředí, kde makrofág není schopen adekvátně zareagovat, vleze do něj a on není schopen spustit obranné mechanismy- sliny mají „enhancing effect“: leishmanie se i v malém počtu za přítomnosti slin dokážou uchytit, sliny snižují infekční dávku nutnou pro vznik onemocnění- slinné žlázy se u různých členovců velmi liší

- enhancing efekt slin funguje pouze u myší, které se s nákazou ještě nesetkaly – „naivní“ myši- pokud je myš imunizovaná, zareaguje imunitní odpovědí, dokáže zabít leishmanie- vývoj „transmission blocking vaccine“ – vakcína založená na tom, že buď hostitele naimunizujeme proteiny ze slinných žláz hostitele, nebo cDNA z genů pro slinné proteiny= efekt preimunizace- problém: různí členovci se liší antigeny ve slinách, složení je druhově specifické