ANTIOKSIDANSIOKSIDANSI

Oksidativni stresi antioksidansi

•Zrak sadrži 21% kisika, O2

•Životinje, biljke i aerobne bakterije trebaju kisik za stvaranje energije (ATP)

•Kisik je toksičan za sve žive oblike, bilo anaerobne ili aerobne

•Život na Zemlji postoji u sprezi s antioksidacijskim staničnim sustavom koji zamjenjuje i uklanja produkte oksidacijskog stresa u in vivo sustavima

Kisik i oksidativni stres

Slobodni radikali i antioksidansi

• Što su slobodni radikali?• Što su reaktivni kisikovi i dušikovi spojevi (reactive

oxigen species, ROS i reactive nitrogen species, RNS)

• Jesu li ROS/RNS uvijek opasni?• Dobro poznati pojam „oksidativni stres“ – što je to?• Poremećaji vezani uz oksidativni stres• Markeri oksidacijskog stresa• Antioksidansi

Slobodni radikali – što su to?

• čestice s nesparenim elektronom (može biti atom, ion ili molekula)

• nastaju npr. homolitičkim cijepanjem veze

HO-OH HO· + ·OH

• nastoje postići ravnotežno stanje, te reagiraju s elektronom najbliže molekule

• većina biomolekula nisu radikali

Povećano stvaranje slobodnih radikala uPovećano stvaranje slobodnih radikala urazličitim stanjimarazličitim stanjima

AIDS

Akutni respiratorni sindrom

Starenje

Alkoholizam

Alzheimerova bolest

Ateroskleroza

Diabetes

Karcinom

Hipertenzija

Preopterećenje željezom

Infarkt miokarda

Parkinsonova bolest

Terapija zračenjem

Moždani udar

Vježbanje

ROS (reaktivni kisikovi spojevi)

Slobodni radikali

superoksid, O2· -

hidroksilni radikal, ·OH

peroksilni radikal, ROO·

alkoksilni radikal, RO·

hidroperoksilni radikal, HO2

·

Spojevi koji nisu slobodni radikali

vodikov-peroksid, H2O2

hipokloritna kiselina, HClO

ozon, O3

singletni kisik, 1O2

Kisik nije molekula koja izravno izaziva oksidativni stres, ali je prekursor svih ROS.

Hidroksilni radikal, HO .

•najreaktivnija poznata ROS vrsta •nastaje reakcijom H2O2 s reduciranim željezom ili bakrom (Fentonova reakcija).

Fe2+ + H2O2 + H+ Fe3+ + H2O + HO.

Cu+ + H2O2+ H+ Cu2+ + H2O + HO.

•hidroksilni radikali mogu reagirati kao inicijatori autooksidacije lipida, mogu izazvati i oštećenje proteina, nukleinskih kiselina, ugljikohidrata te drugih organskih molekula ukoliko dolazi do sinteze u njihovoj blizini.

HO. + H-X H2O + X.

RNS (reaktivni dušikovi spojevi)

Slobodni radikali

dušikov-(II)- oksid, .NO

dušikov-(IV)-oksid, .NO2

Spojevi koji nisu slobodni radikali

nitrozil, NO+

nitritna kiselina, HNO2

peroksinitrit, ONOO -

alkilperoksinitrit, ROONO

Jesu li ROS/RNS uvijek opasni?

Posljedice djelovanja ROS Regulacija

-rasta stanica -diferenciranja stanica -apoptoze

Aktivacija -prijenosa signala -proliferacije stanica

Smanjena učinkovitost -DNA polimeraze -popravljanja DNA

Oksidacijsko oštećenje proteina

Promjena stresom induciranih proteina

i gena

Lipidna peroksidacija

ROS

Pogreške u replikaciji

Promjena konformacije DNA

Kemijske promjene

u b azama

MUTACIJA

Uloga .NO u metabolizmu

• u stanicama vaskularnog endotela djeluje vazodilatacijski i

regulira krvni tlak

• u SŽS-u kao neurotransmiter djeluje na više funkcija, uključujući

pamćenje

• na periferiji djeluje preko neadrenergičnih nekolinergičnih živaca

regulirajući funkcije raznih organa

• stvara se u makrofagima njihovom aktivacijom i djeluje

citotoksično na bakterije, gljivice, protozoe i tumorske stanice

• nadzire i sprječava agregaciju trombocita

Uloga O2· - u metabolizmu

• Superoksid nastao djelovanjem NADPH oksidaze i njegov derivat, peroksinitrit, imaju ulogu u regulaciji krvnog tlaka

• Dio je citotoksičnog mehanizma pojedinih stanica imunološkog sustava

Poremećaj ravnoteže između stvaranja i eliminacije ROS uzrokuje

Oksidativni stres

Oksidativni stres nastaje kao posljedica 3 čimbenika:

1) povećano stvaranje oksidansa2) smanjenje antioksidativne zaštite3) neuspješan popravak oštećenja

Glavni izvori slobodnih radikala Enzimi ili/i koenzimi s flavinskim strukturama,

hemski koenzimi, enzimi koji sadrže Cu i Fe u aktivnom središtu

-reakcije prijenosa elektrona

1. respiratorni lanac u mitohondriju: uglavnom superoksid, a zatim H2O2

Uloga kisika u respiracijskom procesu

O2.-

O2.-

Glavni izvori slobodnih radikala

2. posebne stanice (leukociti, makrofagi i dr.)

stvaranje superoksida putem NADPH-oksidaze

superoksid može reagirati s vodikom i stvoriti vodikov peroksid a potom i hipokloritnu kiselinu

H2O2 + Cl- + H+ = HClO + H2O

2

Glavni izvori slobodnih radikala

3. endoplazmatski retikulum

citokrom P- 450 (CYP)

4. oksidacija hemoglobina

glutation

5. enzimi

ksantin oksidaza ksantin mokraćna kiselina

Štetan učinak slobodnih radikala

Oksidacijsko oštećenje DNA

Oštećenje

• disocijacija šećernih komponenti

• modifikacija baza• pucanje prstena

Posljedica

• pogreške pri translaciji• inhibicija sinteze

proteina• mutacije• kancerogeneza

Oksidacija DNA baze: oksidacija gvanina s OH•

HN

N N

N

H2N

O

R

HN

N N

N•

H2N

O

R

OH

H

HN

NN

N•

H2N

O

R

OH

H

HN

N N

HN

H2N

O

R

O

gvan(oz)in

FAPy-gvanin

HN

NN

N

H2N

O

R

OH

8-OH-gvanin (8-OHdG)

oksidacijsko otvaranje prstena

redukcija

OH•

Oksidativna oštećenja lipida

Oštećenje

• lipidna peroksidacija• oksidacija lipoproteina

Posljedica

• promjena u fluidnosti i permabilnosti membrana

• utjecaj na integrirane enzime

• stvaranje reaktivnih metabolita (malondialdehida (MDA), 4-hidroksinonenala (HNE), izoprostana i drugih produkata lipidne peroksidacije

Lipidna peroksidacija: inicijacija i propagacija

Linolna kiselina (18:2)

Konjugirani dien

Peroksilni radikal

Lipidni hidroperoksid

R

R

H

H

H

HEtan

LH

R

R

R

R

OO•

R +HOO

••

Aldehid

Eliminacija vodika( inicijacija)OH•-

O2

LH

Konjugacija diena

Adicija kisika

O

Adicija vodika(propagacija)

Fentonova reakcijaFe(II)

O

HH +

•

Fragmentacija

Alkoksilni radikal

H

H •

Oksidacijsko oštećenje proteina

Oštećenje

• agregacija, fragmentacija i raspad

• modifikacija funkcionalnih skupina

Posljedica

• promjene u enzimskoj aktivnosti, ionskom transportu

Opći tipovi oksidacijske modifikacije proteina

• proteinski karbonili (postranični aldehidi, ketoni)• nitrozilacija proteina (3-nitrotirozin, 3-NT)• hidroperoksilni derivati alifatskih aminokiselina• aminokiselinske interkonverzije (npr. His u Asn;

Pro u OH-Pro)• aminokiselinski oksidacijski produkti (npr. p-

hidrokisfenilacetaldehid) • disocijacija peptidnih veza

Biljezi oksidativnog stresa

Detekcija slobodnih radikala• vrlo komplicirano, zbog kemijskih i fizikalnih svojstava

(kratak poluživot)

DPPH ·; 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrat

stabilan radikal

ABTS; 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

Biljezi oksidativnog stresa

Biljezi lipidne peroksidacije:malondialdehid (MDA), konjugirani dieni, 4-hidroksinonenal(HNE), izoprostani

Biljezi oksidativnog oštećenja proteina:proteinski karbonili, 3-NT, proteinski hidroperoksidi

Biljezi oksidativnog oštećenja DNA:modificirani nukleozidi (8-OHdG)

Detekcija produkata oksidacijskog stresa

Biljezi oksidativnog stresa

Kako djeluju antioksidansi

1) izravno enzimskom katalizom uklanjaju ROS-SOD, GSHPx, CAT

2) reagiraju sa slobodnim radikalima, pretvaraju ih u neradikale dajući im elektron a sami postaju slabo reaktivni radikali-vitamin C, vitamin E

3) kelatiraju ione željeza i bakra-transferin, metalotioneini

4) štite biomolekule od oštećenja drugim mehanizmima-proteini toplinskog stresa (heat shock proteins, HSP)

Antioksidansi

neenzimatski antioksidansiu membranama ( -tokoferol, -karoten, koenzim Q 10)

izvan membrana (askorbat, transferin, bilirubin)

hvatači slobodnih radikala („scavengers“etici SOD)

prijelazni elementi (Se, Zn)

enzimi (citokrom c, SOD, GSHPx, katalaza)

Enzimski obrambeni sustav

Superoksid-dizmutaze

2O2. - + 2H+ H2O2 + O2

SOD - nalazi se u svim stanicama koje metaboliziraju kisik

3 vrste SOD:

1) mitohondrijska (Mn SOD)2) citosolna (CuZn SOD)3) izvanstanična (EcSOD)

potrebni različiti kofaktori (metali)

Superoksid-dizmutaze

Aktivno mjesto goveđe SOD (CuZnSOD) leži u šupljini koju tvore dvije petlje. Aktivno mjesto sadrži jedan bakrov i jedan cinkov ion, premoštene imidazolnim prstenom His61. Bakar je koordiniran sa sljedeća tri histidinska liganda i molekulom vode, dok je cink koordiniran s dva histidina i aspartatom.

Glutation-peroksidaze (GSHPx)(Se)

Eliminacija hidroperoksida i H2O2

2 GSH + ROOH GSSG + H2O + ROH

2 GSH + HOOH GSSG + 2 H2O

• citosolna i mitohodrijska GSHPx

• izvanstanična GSHPx

• fosfolipid-hidroperoksidna GSHPx

Enzim koristi glutation kao donor elektrona za obnovu reduciranog oblika selenocisteina

Glutation-reduktaza (GR)

Obnavljanje reduciranog oblika glutationa (GSH)

GSSG + 2 H+ + 2 e- 2 GSH

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHSH

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHS

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHS Glutathiondisulfid

(GSSG)

Glutathion (GSH)

H2O2

2 H2O

Katalaza (CAT)(Fe)

2 H2O2 2 H2O + O2

Prilikom uobičajenog stvaranja peroksida (putem hemoglobina i SOD-a) veću aktivnost pokazuje GPx, dok se katalaza uključuje pri većem stvaranju peroksida

peroksisomi, mitohondriji hepatocita, eritrociti

katalaza

Fentonova reakcija

Neenzimski obrambeni sustav

Visokomolekularni antioksidansi (vezuju ione željeza ili bakra)

• transferin• ceruloplazmin• feritin• haptoglobin• hemopeksin• albumin• metalotioneini

Niskomolekularni antioksidansi

Askorbat (vitamin C)

• redukcijsko sredstvo• sinteza kolagena, karnitina,

neurotransmitera• povećava apsorpciju Fe • regeneracija tokoferilnog

radikala• ponekad prooksidans

Tokoferoli (vitamin E)8 izomera

lokaliziran u membranama; zaštita od oštećenja

Askorbinska kiselina i njezini metaboliti

L-askorbat Semidehidro-askorbatni radikal

dehidroaskorbinska kiselina

O

O OH

OCH

CH2

OH

OH

H

O

O OH

OCH

CH2

OH

OH

O

O O

OCH

CH2

OH

OH

O

O O

OCH

CH2

OH

OH

L-Ascorbat Semidehydro-ascorbatradikal

Dehydroascorbinsäuree-

askorbinska kiselina askorbilni radikal dehidroaskorbinska kiselina

polifenoli, npr. flavonoidi

Niskomolekularni antioksidansi

Niskomolekularni antioksidansi

• ubikinon (koenzim Q)

prijenosnik elektrona u respiratornom lancu

kooperacija sa tokoferolom

• karotenoidi: lutein, -karoten, vitamin A

odstranjivanje radikala s lipida

Niskomolekularni antioksidansi

• glutation (GSH, GSSG)

važan redoks sustav u stanicama sisavaca (1-10 mmol/l)

2 GSH GSSG + 2e- + 2H+

eliminacija ROS, stabilizacija redukcijskih oblika (SH-skupine, regeneracija tokoferola i askorbata)

supstrat glutation-peroksidaze

Niskomolekularni antioksidansi

liponska kiselina

regeneracija tokoferola i askorbata

melatonin

lipofilan; hvatač hidroksilnih radikala

Niskomolekularni antioksidansi

• mokraćna kiselina (urati)

• bilirubin

Metali s antioksidacijskom ulogom

SelenUtječe na resorpciju vitamina E, dio je selenoproteina

CinkStabilizira staničnu membranu, povećava imunitet